ES2632638T3 - Ladostigilo de baja dosis para el tratamiento de la deficiencia cognitiva - Google Patents

Abstract

R(+)-6-(N-metilo,N-etilo-carbamoiloxi)-N'-propargilo-1-aminoindano o una sal del mismo para uso en el tratamiento de deterioro definitivo leve COG (MCI) en un sujeto humano, en una cantidad eficaz para tratar MCI siendo no mas que 0,37 mg/kg/dia R(+)-6-(N-metilo, N-etilo-carbamoiloxi)-N'-propargilo-1-aminoindano de la presente, o una cantidad correspondiente de la sal del mismo.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

Análisis estadístico

[0050] Los datos densitométicos se analizaron por univariante ANOVA seguida de la prueba post hoc de Duncan. Tabla 1*

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Rata

Tratamiento Nitrotirosina Inmunorreactividad

CSF n = 6

Alveus Stratum oriens Stratum radiatum

C1

0 0 0

C2

14,5 5,5 4

C3

2,5 5 5

C4

12 7 1,5

C5

6,5 11,5 0,5

C6

0 1 0,5

Media ± SEM

5,9 ± 2,5 5,0 ± 1,7 1,9 ± 0,8

STZ n = 7

S1

30 40 46

S2

33,5 60 48

S3

22 33 52

S4

23,5 55,5 69,5

S5

20 43 40,5

S6

20 28 25,5

S7

38,5 50,5 53

CSF Mean 6 SEM

Alveus Stratum oriens Stratum radiatum

26,8 ± 2,8

44,3 ± 4,4 47,8 ± 5,0

STZ + ladostigilo n = 5

SL1

4 14,5 1,5

SL2

9,5 19 22

SL3

7 5,5 3

SL4

9 8,5 7,5

SL5

15 20,5 11,5

Media ± SEM

8,9 ± 1,8 13,6 ± 2,9 9,1 ± 3,7

* Los datos representan la media de dos secciones por rata

imagen7

15

25

35

45

55

65

VAChT (Sigma, Rehovot, Israel) 1 : 100, y para el receptor de factor de crecimiento nervioso (NGFR) de conejo anti NGFR (Alomone labs, Jerusalén, Israel) 1: 100. Las soluciones de anticuerpos secundarios fueron burro anti cabra y burro anti conejo 1: 200, cada uno conjugado con peroxidasa de rábano (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). La reacción de color final se desarrolló como se describió anteriormente en Shoham et al., Supra.

Microscopia confocal

[0059] Para detectar pruebas de estrés oxidativo-nitrativo en astrocitos activados, las secciones del cerebro se incubaron con tanto conejo anti NT como ratón anti GFAP. En lugar de la reacción de color DAB-peroxidasa, los anticuerpos secundarios fueron conjugados con isotiocianato de fluoresceína para NT o con isotiocianato de rodamina para GFAP. Para investigar la influencia de la inyección de STZ en microglial y astrocitos, las secciones del cerebro se incubaron con tanto ratón anti-GFAP (por astrocitos) como isolectina B4 marcada con biotina (por microglia). Los anticuerpos secundarios fueron isotiocianato de fluoresceína para GFAP y estreptavidina Cy3 para isolectina B4.

Cuantificación con análisis de imagen

[0060] Tres zonas distintas se distinguieron en la proximidad del sitio de inyección cortical después de la inyección icv STZ que contiene astrocitos y microglia con diferente morfología. La cuantificación de la microglia y astrocitos en las tres zonas se realizó en secciones de la muestra en un intervalo de P0.2-0,8 desde el bregma. El área de cada zona que contiene los diferentes tipos de astrocitos se midió y el porcentaje que cada zona ocupaba en el área de la herida se calculó (Statistica software, StatSoft, EE.UU.). Las clases de microglia se contaron por separado en cada zona. El número de células se dividió por el área de la zona para obtener una medida de la densidad celular.

[0061] Para cada análisis cuantitativo de los astrocitos NT-inmunorreactivos, 3 secciones se muestrearon de cada rata. En 4 regiones cerebrales que bordean los ventrículos laterales y en la región CA1 de la inmunorreactividad NT de hipocampo se evaluó según el siguiente sistema de puntuación: 0 = No astrocitos NT-positivos; 1 = Tinción NTpositiva en fibras astrocíticas pero no en los cuerpos celulares; aproximadamente 7 astrocitos por 40 x campo; 2 = tinción NT-positiva en fibras astrocíticas y en los cuerpos celulares; aproximadamente 20 astrocitos por 40x campo; 3 = astrocitos NT-positivos están presentes en toda la región; 4 = astrocitos NT-positivos están presentes en toda la región e intensamente teñidos.

Actividad de la colinesterasa y oxidasa de monoamina

[0062] Se determinó el efecto del tratamiento de ladostigilo crónico en la actividad ChE en la corteza y el hipocampo de las ratas una semana después de icv STZ en 12 ratas (3 tratadas con agua y 9 con ladostigilo). El efecto del tratamiento agudo con ladostigilo 1 o 17 mg/kg se determinó 2 horas después de la administración del fármaco. Las ratas se sacrificaron por dislocación cervical, 120 min después de la última dosis del fármaco al encontrarse la inhibición máxima de ChE en este momento (Weinstock et al., 2000). El cerebro se eliminó rápidamente, se lavó con solución salina en hielo y la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado se diseccionaron, se pesaron rápidamente y se almacenaron a -70°C hasta el ensayo. La actividad total de ChE en la corteza y el hipocampo se midió como se describe en Wang et al., Gender differences in the effect of rivastigmine on brain cholinesterase activity and cognitive function in rats, Neuropharmacology (2000) 39:. 497-506, utilizando el método espectrofotométrico de Ellman et al., A new and rapid color-imetric determination of acetylcholinesterase activity, Biochem. Pharmacol. (1961) 7: 88-95 con acetiltiocolina (Sigma Ltd) como sustrato usando homogeneizado de 100 mg de tejido en 1 ml de tampón de fosfato. Para determinar solamente la actividad de butirilcolinesterasa (BuChE) se incrementaron 3 veces las cantidades de tejido/ml de tampón y butiriltiocolina (Sigma Ltd) se utilizó como sustrato. La actividad de MAO A y B se midió en homogeneizados de cuerpo estriado como se describe en Weinstock et al., Limited potentiation of blood pressure response to oral tyramine by brain-selective monoamine oxidase A-B inhibitor, TV-3326 in conscious rabbits, Neuropharmacology (2002) 43: 999 a 1.005.

Reconocimiento de objetos y el lugar

[0063] La memoria episódica en la prueba de reconocimiento de objetos fue todavía intacta 2, pero no 4 semanas después de una única inyección icv STZ (Tabla 3). Por lo tanto, las ratas que fueron tratadas con ladostigilo o agua se ensayaron para el objeto y el lugar de reconocimiento de 4 semanas después de la inyección icv de STZ o CSF. La prueba de reconocimiento de objetos midió la memoria de trabajo no espacial con las características de la memoria episódica que se ve afectada principalmente en la demencia de senilo (Bartolini et al., Aniracetam restores object recognition impaired by age, scopolamine, and nucleus basalis lesions, Pharmacol. Biochem. Behav. (1996)

53: 277-83). La prueba depende de la función cortical y del hipocampo intacto (Winters et al., Double dissociation between the effects of peripostrhinal cortex and hippocampal lesions on tests of object recognition and spatial memory: heterogeneity of function within the temporal lobe, J. Neuroscience (2004) 24: 5901-8), mientras que el reconocimiento del lugar, otra manifestación de la memoria espacial, dependía de la función del hipocampo intacto. Los experimentos se llevaron a cabo como se describe anteriormente en Mumby et al., Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts, Learning Memory (2002) 9: 49-57, en una caja hecha de Perspex oscuro (60 x 60 cm y 50 cm de altura), cubierto con una tapa Perspex oscura. Con el fin de

15

25

35

45

55

65

aumentar su interés en los objetos, las ratas se familiarizaron con la arena de ensayo colocándolos en ella durante 5 min en cada uno de 3 días sucesivos y la prueba de reconocimiento de objetos realizada en el 4° día. Dos objetos idénticos fueron colocados en la arena y se registró el tiempo tomado por las ratas para explorar cada objeto durante un período de 3 min. Una hora más tarde, los objetos fueron sustituidos por uno que era idéntico al de dos utilizados en la primera prueba y un segundo que era diferente de ellos y el tiempo necesario para explorar cada uno de ellos se registró de nuevo. Al día siguiente, la prueba de reconocimiento de lugar se llevó a cabo con dos objetos idénticos, como se describe más arriba, pero diferentes de los utilizados previamente. Una hora más tarde, el uno de los dos objetos se trasladó a otra posición en la arena como se describe en Mumby et al., Supra.

Memoria espacial en el laberinto de agua

[0064] Dos semanas después de la tarea de reconocimiento de lugar las ratas se probaron para la memoria espacial en el laberinto de agua de Morris (MWM), que consistía en un depósito circular (150 cm de diámetro, 60 cm de alto) lleno a profundidad de 30 cm con agua a una temperatura de 22 ± 1°C. Una plataforma de escape de vidrio transparente (20 cm de diámetro) se colocó 1 cm por debajo de la superficie, a medio camino entre el centro y el borde del depósito en un cuadrante donde se mantuvo para todos los ensayos de adquisición. Para el análisis de los datos del tanque se divide en cuatro cuadrantes, al norte (N), sur (S), este (E) y al oeste (W). Tanto la recogida como el análisis de los datos se realizaron usando un sistema de seguimiento de vídeo automatizado (HVS, Ltd). Para empezar cada ensayo la rata se colocó en el agua, frente a la pared de laberinto, de una de las cuatro posiciones de inicio espaciadas uniformemente alrededor del depósito (N, S, E & W). Las posiciones de inicio se eligieron al azar al comienzo de cada día para todas las ratas. Si la rata no logró encontrar la plataforma de escape dentro de 120 s se colocó en él durante 10 segundos y luego se retiró del depósito. A la rata se le dio dos ensayos al día durante 5 días 10:00-14:00 h con un intervalo entre ensayos de 15 min.

Análisis de los datos

[0065] Medias de grupo de 3 medidas en pruebas de reconocimiento de objeto y lugar, la duración de la exploración en las fases primera y segunda y el índice de discriminación fueron sometidos a ANOVA de una vía. Latencias de escape diarias medias para el ensayo 1 y el ensayo 2 en el MWM en cada grupo se analizaron por medidas de ANOVA repetidas para DÍA y GRUPO seguido por prueba post hoc de Duncan en su caso. Datos histológicos se analizaron por ANOVA univariante seguido por prueba post hoc de Duncan. Todos los valores representan las medias ± SEM.

Resultados

Los cambios en la microglia y astrocitos en la zona de lugar de penetración de la cánula.

[0066] Las tres zonas de gliosis que podrían ser distinguidas en el motor y la corteza cingulada cerca del sitio de la penetración de la cánula siete días después de icv STZ se muestran en la Figura 2. Zona i) contenía microglia con soma redonda desprovista de los procesos que se asemejaban a macrófagos pero estaba casi libre de astrocitos; zona ii) había activado microglia con soma polimórfico y una variedad de procesos fibrosos y astrocitos activados con procesos alargados pero no soma; Zona iii) tenía microglia residente que se asemejaba a los de los controles de CSF-inyectado y astrocitos reactivos con procesos engrosados y soma lleno. Ladostigilo evitó los cambios tanto en microglia como en astrocitos en las zonas i) y iii) que resultaron de la inyección icv de STZ pero no tuvo ningún efecto sobre la densidad de microglia fibrosa en la zona i) que era similar a la de los controles de CSF-inyectado (Figuras 3a, b).

[0067] En el hipocampo, el efecto de STZ en las células gliales se definió menos bien. Reactivos de astrocitos estaban presentes en grupos dispersos, la mayoría de los cuales se encontraron en la región CA1. También se observaron en el cuerpo calloso, medial y septum lateral cerca del ventrículo lateral, mientras que otras áreas eran casi desprovistas de astrocitos. En todas estas áreas los astrocitos mostraron un aumento significativo en inmunorreactividad NT (Figuras 4 y 5). El tratamiento de ladostigilo redujo tanto la activación de astrocitos como la inmunorreactividad NT en estas regiones del cerebro al nivel de la observada en los controles de CSF-inyectado (Figs 4 y 6).

[0068] Ocho semanas después de la inyección icv STZ, el sitio de penetración de la cánula contenía tejido de la cicatriz que estaba lleno de fibras astrocíticas estrechamente empaquetadas, incluyendo la zona previamente desprovista de ellas, que no fueron reactivos. Alrededor de la cicatriz había unos pocos astrocitos reactivos pero ninguna microglia reactiva, redondeada o fibrosa, en o alrededor de la cicatriz. No se detectaron diferencias en la morfología de la cicatriz en ratas inyectadas con icv STZ con o sin ladostigilo. Tampoco hubo signos de inmunorreactividad NT en los astrocitos en cualquiera de las regiones del cerebro en las que estaba presente antes.

Marcadores colinérgicos

[0069] No se detectó cambio en el número o la morfología de las neuronas colinérgicas en cualquiera de los núcleos del prosencéfalo basal, el tabique medial, banda diagonal y núcleo basal magnocelular una u ocho semanas

imagen8

Tabla 3: índices de discriminación de objeto§ y pruebas de reconocimiento de lugar‡ con diferentes tratamientos

5

15

25

Tratamiento y prueba (semanas después de STZ)

Objeto Lugar

CSF (2)

0,342 ± 0,09 ** 0,292 ± 0,08 **

CSF (4)

0,397 ± 0,05 ** 0,274 ± 0,06 **

"“ dos días después

0,339 ± 0,06 ** NT

STZ (2)

0,281 ± 0,11 * 0,231 ± 0,08 *

STZ (4)

-0,175 ± 0,07 # 0,000 ± 0,08 #

STZ (4) + ladostigilo 1 mg/kg crónico

0,238 ± 0,05 ** 0,211 ± 0,07 *

STZ (4) + ladostigilo 1 mg/kg agudo

0,010 ± 0,08 # NT

STZ (4) + 17 mg/kg aguda

0,348 ± 0,112 ** NT

"“ dos días después

-0,112 ± 0,08 # NT

Los datos representan la media ± s.e.m. § Índice de discriminación = tiempo para explorar el nuevo objeto -tiempo para explorar objeto familiar/tiempo de exploración total de ambos objetos ‡ tiempo para explorar nueva posición ob objeto -tiempo para explorar posición original del objeto de tiempo/exploración total de ambos objetos. NT = no ensayado. Significativamente diferente de 0, ** P <0,01, * <0,05; significativamente diferente de CSF, #P <0,01

[0074] No hubo diferencias entre los grupos en el tiempo total empleado por las ratas que exploran los dos objetos en la fase de la discriminación de las pruebas de reconocimiento de objetos y el lugar. Sin embargo, las ratas

35 tratadas con CSF icv o icv STZ con ladostigilo mostraron un índice de discriminación significativa en ambos ensayos (significativamente >0, P<0,05), mientras que las que recibieron icv STZ solo no lo hicieron. Esto indica que ladostigilo impide el deterioro de la memoria episódica y espacial inducida por STZ icv.

[0075] Ladostigilo no tuvo ningún efecto sobre el déficit en la memoria episódica cuando se administra en una dosis única de 1 mg/kg, cuatro semanas después de la inyección icv de STZ. Sin embargo, cuando está aumentado a 17 mg/kg el déficit de memoria se abolió pero regresó dos días más tarde, cuando ChE ya no se inhibió.

Prueba de memoria espacial

45 [0076] ANOVA de medidas repetidas para el ensayo 1 reveló un efecto significativo del DÍA (F4,26 = 25,67, P<0,0001), pero ninguna interacción significativa GRUPO x DÍA. La prueba Post hoc para medios para grupos de más de 5 días mostró que las ratas tratadas con icv STZ sólo tenían latencias significativamente más altas que las inyectadas con CSF o STZ y se trató con ladostigilo. En el ensayo 2 también había un efecto altamente significativo del DÍA (F4,26 = 23,0, P<0,0001), pero ninguna interacción DÍA x GRUPO (Figura 6). Tampoco hubo diferencias significativas entre el ensayo 1 y ensayo 2 en las latencias de escape para cualquier día en los diferentes grupos de ratas, lo que indica que ICV-STZ no afectó significativamente la memoria de trabajo en esta prueba.

Discusión

55 [0077] Inyección Icv de STZ en ratas, que se ha propuesto como modelo de los primeros cambios fisiopatológicos en EA (Arnaiz et al., Impaired cerebral glucose metabolism and cognitive functioning predict deterioration in mild cognitive impairment, Neuroreport (2001) 12: 851-5), induce la gliosis reactiva y el estrés oxidativo-nitrativo antes de la inducción de los déficits de memoria y el tratamiento previo con ladostigilo puede prevenir estos efectos. La gliosis reactiva implica tanto microglia como astrocitos en la corteza cingulada y corteza motora cerca del sitio de la penetración de la cánula, en la región CA1 del hipocampo, y en el cuerpo calloso, medial y septum lateral cerca de la ventrical lateral. Evidencia de estrés oxidativo nitrativo es vista como inmunoreactividad NT en astrocitos en la zona de la penetración de la cánula, el área CA1 del hipocampo y regiones limítrofes de los ventrículos laterales. Esto es seguido de 2-5 semanas más tarde por el deterioro de la memoria episódica y espacial, aunque no hay signos de daño neuronal o reducción en los marcadores colinérgicos específicos en la corteza o el hipocampo están presentes.

65 [0078] El tratamiento previo durante una semana antes y una semana después de la inyección icv de STZ con

15

25

35

45

55

65

ladostigilo (1 mg/kg), una novela bifuncional ChE y el inhibidor de MAO que protege contra la citotoxicidad inducida por un donador ON en cultivo celular, impide la activación microglial y la pérdida de los astrocitos en el entorno de la penetración de la cánula y áreas del hipocampo y previene el aumento de inmunorreactividad NT. El desarrollo de los déficits de memoria se evitó tres semanas más tarde.

[0079] La microglía es muy sensible a los cambios en su microambiente y se activa fácilmente en respuesta a la infección, lesión cerebral y cuando la barrera hematoencefálica se rompe (McGeer et al., Inflammatory processes in Alzheimer’s disease, Prog. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry (2003) 27: 741-9). Se demostró que la inyección icv de STZ aumentó considerablemente el número de microglia activada, caracterizado por el acortamiento de sus procesos celulares y ampliación de soma, en los alrededores del sitio de penetración de la cánula, en el hipocampo y en regiones limítrofes de los ventrículos laterales. Las áreas de la corteza y el hipocampo que muestran la mayor concentración de microglia activada tenían una densidad mucho más baja de astrocitos que en las ratas inyectadas de CSF. Su desaparición podría haber sido causado por la secreción por microglia de citoquinas proinflamatorias y neurotóxicas, ON y superóxido que también son perjudiciales para las neuronas (McCarty et al. 2006). Al ser astrocitos importantes para secuestrar glutamato, su pérdida puede haber resultado en la actividad del glutamato exceso y el estrés excitotóxico (Lipton y Rosenberg, 1994). En apoyo de esta sugerencia se ha demostrado que el antagonista de glutamato, la memantina redujo la activación de la microglia y los astrocitos y los déficits de memoria vistos después de la inyección icv de Aβ(1-40) en ratas (Miguel-Hidalgo et al., Neuroprotection by memantine against neurodegeneration induced by beta-amyloid (1-40), Brain Res (2002) 958:. 210-21).

[0080] En una zona de penetración cortical adyacente a la forma predominante de microglia tenían soma polimórfica con una variedad de procesos fibrosos. Estos contenían un gran número de astrocitos activados con procesos fibrosos largos que mostraron un aumento de la inmunorreactividad de GFAP reminiscente de los inducidos por ROS y en ratas de edad avanzada (Finch, Neurons, glia, and plasticity in normal brain aging, Neurobiol. Aging (2003) 24:. S123-7). La microglia en esta zona no difirió en la densidad de los de ratas de CSF-inyectado, y sugirió que estimularon la producción de GFAP pero no la liberación de citoquinas que eran tóxicas para astrocitos.

[0081] Astrocitos activados también se observaron en diferentes regiones del hipocampo de ratas inyectadas por STZ y contenían cantidades significativamente mayores de NT que después de icv CSF. Esto puede haber resultado de la inducción de ROS por STZ, como la que se observa en el páncreas después de su administración parenteral (Takasu et al., 1991) y también se observa en roedores envejecidos y seres humanos. Se ha demostrado que ON y superóxido alteran la función mitocondrial y la energía celular en astrocitos y en las neuronas vecinas (Bolanos et al., Regulation of glucose metabolism by nitrosative stress in neural cells, Mol. Aspects Med. (2004) 25: 61-73). Cambios similares incluyendo el aumento de la inmunorreactividad NT y la función mitocondrial deprimida se ven en los cerebros de los sujetos con EA (Finch, 2003). Esto podría explicar la alteración en el metabolismo de la glucosa inducida por icv STZ descrito previamente (Nitsch et al., The intracerebroventricularly streptozotocin-treated rat: impair-ment of cerebral glucose metabolism resembles the alterations of carbohydrate metabolism of the brain in Alzheimer’s disease, J. Neural Transm. (1989) 1:109-10). El aumento en la expresión de GFAP en astrocitos activados puede también contribuir a una reducción en la función sináptica, en última instancia afecta a la memoria espacial y episódica. Se ha informado de la presencia de gliosis asociada con el estrés oxidativo-nitrativo en la EA (Griffin et al., Glialneuronal interactions in Alzheimer’s disease: the potential role of a ’cytokine cycle’ in disease progression, Brain Pathol. (1998) 8:65-72) y podría resultar en una supresión de la función mitocondrial. El aumento de expresión de GFAP en astrocitos activados se ha asociado con una reducción en la función sináptica (Finch, 2003). Por lo tanto, el incremento de GFAP visto después de icv STZ podría haber contribuido a la alteración de la memoria espacial (reconocimiento de lugar) y episódica (prueba de reconocimiento de objetos) sin causar una pérdida medible de los marcadores colinérgicos. El aislamiento parcial de la corteza cingulada (situada entre las cánulas bilaterales) inducida por icv STZ también podría explicar el déficit de la memoria episódica, ya que la cicatriz glial formada alrededor del sitio de la penetración de la cánula incluye todas las capas corticales y del cuerpo calloso. Esta cicatriz podría interrumpir las conexiones de la corteza cingulada a la corteza peri-rhinal lo cual es importante para el reconocimiento de la objeción (Winters et al., 2004). La constelación de la activación microglial, cambios en la morfología de astrocitos y el estrés oxidativo-nitrativo que preceden a la aparición de deficiencias en el metabolismo de la glucosa y la memoria apoya la validez de la rata inyectada por icv STZ como modelo de los primeros cambios fisiopatológicos en EA.

[0082] Aunque ladostigilo no es un antioxidante, se ha demostrado que bajas concentraciones previenen la citotoxicidad inducida por ROS y no en las células neuronales cultivadas (Youdim y Weinstock, 2001). En el presente estudio, la administración crónica de una dosis baja de ladostigilo antes y después de la inyección de STZ reduce significativamente las alteraciones en la microglía y astrocitos previenen el aumento de la inmunorreactividad NT, y tres semanas más tarde, el desarrollo de los déficits de memoria episódica. Es posible que la prevención por ladostigilo de la pérdida de reconocimiento de objetos resultó de la inhibición de ChE de 28% en la corteza. Sin embargo, esto no puede explicar su efecto sobre el reconocimiento de lugar, que depende de la actividad colinérgica del hipocampo y en el que no se produjo ninguna inhibición de la colinesterasa. Por tanto, es probable que el efecto neuroprotector de ladostigilo resultó de otras acciones de la droga. Éstas podrían incluir un efecto directo en microglia como se muestra en los datos preliminares de experimentos en nuestro laboratorio en el que las concentraciones de 0,1-10 µM redujeron en 20-40% la liberación de ON a partir de microglia cultivadas inducida por LPS. Estas concentraciones son demasiado bajas para inhibir la ChE en microglia. Ladostigilo (0,1-10 m M) también

15

25

35

45

55

65

impidió apoptosis en células SH-SY5Y de neuroblastoma dopaminérgico expuestas al donador ON de SIN1, mediante la reducción 14 la caída en el potencial de membrana mitocondrial (Maruyama et al., 2003). Esta acción probablemente no se debe a la inhibición de la MAO o la colinesterasa, ya que es compartida por otros derivados de aminoindano que contienen propargilamina que no tienen ningún efecto sobre estas enzimas.

[0083] El tratamiento crónico una vez al día con ladostigilo (1 mg/kg) redujo el número de microglia activada y astrocitos restaurados en la zona (i) del sitio de la penetración de la cánula después de la inyección icv STZ a los observados después de la inyección de CSF. También evitó el aumento de la inmunorreactividad NT y el desarrollo de los déficits de memoria, proporcionando con ello una conexión etiológica entre ellos. El mecanismo por el cual ladostigilo produce estos efectos antiinflamatorios y neuroprotectores no se entiende completamente. Una posibilidad es que se activa receptores nicotínicos alfa 7 indirectamente como resultado de la inhibición de AChE (Shytle et al., Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors, J. Neurochem. (2004) 89:337-43). Aunque tal acción podría contribuir a la prevención de la gliosis en la corteza en la que se produjo aproximadamente un 20% de inhibición de AChE, no se puede explicar la reducción marcada en inmunorreactividad NT y activación de astrocitos en el hipocampo en la que no se produjo ninguna inhibición de AChE significativa. La neuroprotección tampoco resultó de la inhibición de MAO-B, que no excede del 15%. Una explicación más probable es que ladostigilo reduce la apoptosis y la muerte celular en las neuronas y astrocitos mediante la prevención de la caída del potencial de membrana mitocondrial inducida por ON y anión de superóxido liberado de microglia (Takuma et al., Astrocyte apoptosis: implications for neuroprotection, Prog. Neurobiol. (2004) 72:111-127). Tal acción de ladostigilo se demostró en células SH-SY5Y de neuroblastoma dopaminérgico expuestas al donador de ON, Sin1.

[0084] La administración aguda de ladostigilo (1 mg/kg), que sólo inhibe ChE en alrededor de 8% fue incapaz de revertir los déficits de memoria una vez que se habían producido. Esto se logró mediante una dosis más grande que inhibía ChE cortical en un 40%. Los datos sugieren que la prevención de gliosis, el estrés oxidativo-nitrativo y déficits de memoria inducidos por la administración crónica de una dosis baja de ladostigilo resulta de una combinación de acciones sobre las células neuronales y gliales. La capacidad de inhibir ChE puede contribuir al efecto sobre la memoria episódica.

Ejemplo 3

[0085] La condición clínica del deterioro cognitivo leve (DCL) es uno en el cual las personas experimentan pérdida de memoria que es mayor que lo que se esperaría para su edad (Petersen et al., 2001). Una proporción significativa de los sujetos con deterioro cognitivo leve desarrollan demencia de tipo Alzheimer (EA) dentro de unos pocos años. Inhibidores de la colinesterasa retardan la progresión del deterioro cognitivo en la EA, pero aún no se sabe si pueden retrasar o prevenir la progresión de MCI a EA. Como los humanos, ratas desarrollan una pérdida de memoria relacionada con la edad que se asocia con una reducción en el número y tamaño de las terminaciones nerviosas colinérgicas en células piramidales corticales (Turrini et al., 2001, Casu et al., 2002). A la edad de 18 meses, las ratas ya muestran una reducción del 40-50% en la liberación de ACh en la corteza y el hipocampo. Esto se puede aumentar a niveles normales por la administración aguda de los inhibidores de ChE en dosis que mejoran sus déficits de memoria (Scali et al., 2002). Sin embargo, no se sabe si cualquier inhibidor de ChE, y ladostigilo en particular, pueden prevenir la progresión a deterioro de la memoria en ratas de edad avanzada; ni se sabe qué dosis sería eficaz.

[0086] Los experimentos se realizaron en 30 ratas macho de la cepa Wistar. A la edad de 16 meses el 80% de ellas mostró el reconocimiento de objetos intactos, en comparación con el 90% de los mayores de 3 meses. Las ratas se alojaron en pares a una temperatura ambiente de 21°C. Se pesaron una vez por semana y su ingesta de líquidos se midió diariamente durante dos semanas y luego dos veces por semana para los restantes 4 meses. Diez de las ratas fueron iniciadas en ladostigilo 1 mg/kg/día en el líquido de beber a los 16 meses de edad y dado el fármaco durante cuatro meses. A las 10 ratas restantes de la misma edad se les dio agua potable regular. Al final de los cuatro meses de memoria espacial de estas 20 ratas y de otros 10 años de edad de 3 meses se ensayó en el laberinto de agua de Morris como se ha descrito previamente (Shoham et al., 2006).

[0087] Las ratas de edad sin tratamiento mostraron una adquisición significativamente más lenta de aprendizaje espacial que las ratas jóvenes. La diferencia en el aprendizaje entre ratas jóvenes y viejas fue abolida sustancialmente por una baja dosis de tratamiento de ladostigilo (Fig. 1a, b). Los datos muestran que el tratamiento crónico con una dosis baja de ladostigilo puede prevenir el desarrollo de los déficits de memoria en ratas de edad avanzada.

Discusión

[0088] El deterioro cognitivo leve (MCI) es una condición en general caracterizada por la pérdida de memoria reciente leve sin demencia o deterioro significativo de otras funciones cognitivas. MCI causa problemas de memoria que son mayores que normalmente se espera con el envejecimiento, pero una persona con MCI no muestra otros síntomas de demencia, como el juicio o razonamiento deteriorados. Las causas de la MCI no se entienden bien. Un panel asesor de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos dictaminó en 2001 que MCI, una condición separada de la enfermedad de Alzheimer, es un objetivo válido para nuevos tratamientos

farmacológicos. El Comité Asesor sobre Fármacos del Sistema Nervioso Central y Periférico ha indicado que más del 80% de los pacientes con deterioro cognitivo leve desarrollan la enfermedad de Alzheimer dentro de 10 años. Los científicos todavía están trabajando para entender MCI y su relación con la enfermedad de Alzheimer. Debido a que cuestiones básicas sobre este trastorno siguen sin respuesta, la definición de MCI sigue evolucionando.

5 (deterioro cognitivo leve-Alzheimer, parte XVI, Harold Rubin, MS, ABD, CRC, 14 de noviembre de 2006).

[0089] Recientemente se ha demostrado que el deterioro cognitivo leve existe en dos subtipos distintos: MCI neurodegenerativa y MCI vascular. Los sujetos con MCI neurodegenerativa exhiben atrofia medial del lóbulo temporal, mientras que los sujetos con MCI vascular se presentan con lesiones vasculares, ambas de las cuales 10 pueden ser observadas por resonancia magnética (MRI). Recientemente se ha informado de que los sujetos MCI neurodegenerativos poseen dominios cognitivos deteriorados que involucran la memoria, lo cual es predictivo para la conversión a la demencia o la enfermedad de Alzheimer (Meyer et al., 2005). Hasta hace poco tiempo, existía poca evidencia para apoyar la hipótesis de que MCI era un precursor de la enfermedad de Alzheimer; sin embargo, Meyer et al. enseñan claramente que MCI puede tomar la forma de un trastorno neurodegenerativo y posteriormente tomar

15 la forma de demencia o de Alzheimer.

20

25

30

35

40

45

50

55

Claims (1)

1. imagen1