ES2628163T3 - Derivados de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-2-(fenilamino)-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona, síntesis y usos de los mismos - Google Patents

Derivados de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-2-(fenilamino)-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona, síntesis y usos de los mismos Download PDF

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Jordi Teixido Closa
Raimon Puig De La Bellacasa Cazorla
Dolors Colomer Pujol
Gael Roue
Patricia PÉREZ-GALÁN
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Institut Quimic de Sarria CETS Fundacio Privada
Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Hospital Clinic de Barcelona
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Fundacio Clinic per a la Recerca Biomedica FCRB
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Institut dInvestigacions Biomediques August Pi i Sunyer IDIBAPS
Hospital Clinic de Barcelona
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Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en la que R1 se selecciona entre el grupo que consiste en - H; - alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, alcoxicarbonilo C1-C6, ciano y F; - cicloalquilo C3-C8 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, ciano y F; - cicloalquil C3-C8-alquileno C1-C3, en el que el cicloalquilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1- C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6) amino, ciano y F; - arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1- C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilcarboniloxi C1- C6, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino-alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6; - aril C6-C14-alquileno C1-C3, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1- C6, carboxi, alquilcarboniloxi C1-C6, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino- alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6; - heterociclilo saturado o parcialmente saturado monocíclico de 3 a 8 miembros o bicíclico de 5 a 12 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y en el que el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquilo C1-C6)amino, ciano y F; - heterociclil-alquileno C1-C3, en el que el heterociclilo es un sistema de anillo saturado o parcialmente saturado monocíclico de 3 a 8 miembros o bicíclico de 5 a 12 miembros, que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S como se han definido anteriormente, y en el que el heterociclil-alquilo C1-C3 está opcionalmente sustituido en el resto heterociclilo con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1- C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquilo C1-C6)amino, ciano y F; - heteroarilo monocíclico de 5 a 6 miembros o bicíclico de 8 a 14 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S, y en el que el heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1- C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilcarboniloxi C1- C6, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino-alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6; y - heteroaril-alquileno C1-C3, en el que el heteroarilo es un sistema de anillo monocíclico de 5 a 6 miembros o bicíclico de 8 a 14 miembros, que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y en el que el heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilcarboniloxi C1-C6, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1- C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino-alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1- C6; R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H; Cl, Br, I; -NR3R4; y-OR5; donde R3 es H y R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -alquilen C1-C6-NR6R7; o R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclilo, saturado o parcialmente saturado, monocíclico de 3 a 8 miembros o bicíclico de 5 a 12 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y que está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, ciano y F; R5 es -alquilen C1-C6-NR6R7; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C6; R7 es alquilo C1-C6; o R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclilo monocíclico saturado o parcialmente saturado de 3 a 8 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y que está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, ciano y F; o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
R1 H
(I)
5 en la que
R1 se selecciona entre el grupo que consiste en
-H;
10 -alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, alcoxicarbonilo C1-C6, ciano y F;
15 -cicloalquilo C3-C8 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, ciano y F;
-cicloalquil C3-C8-alquileno C1-C3, en el que el cicloalquilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres 20 sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquil C1-C6) amino, ciano y F;
-arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6,
25 alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino-alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6;
30 -aril C6-C14-alquileno C1-C3, en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquil C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1-C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino
35 alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6;
-heterociclilo saturado o parcialmente saturado monocíclico de 3 a 8 miembros o bicíclico de 5 a 12 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y en el que el heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados
40 independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquilo C1-C6)amino, ciano y F;
-heterociclil-alquileno C1-C3, en el que el heterociclilo es un sistema de anillo saturado o parcialmente saturado monocíclico de 3 a 8 miembros o bicíclico de 5 a 12 miembros, que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el anillo
45 seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S como se han definido anteriormente, y en el que el heterociclil-alquilo C1-C3 está opcionalmente sustituido en el resto heterociclilo con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en hidroxi; alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6, di(alquilo C1-C6)amino, ciano y F;
50 -heteroarilo monocíclico de 5 a 6 miembros o bicíclico de 8 a 14 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S, y en el que el heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C6, F, Cl, Br, alcoxicarbonilo C1-C6, alquilcarbonilo C1-C6, cicloalquilcarbonilo C3-C8, alquilcarboniloxi C1-C6, amino, alquilamino C1-C6, di(alquil C1
55 C6)amino, di(alquil C1-C6)aminocarbonilo, ciano, hidroxilo, hidroxi-alquilenoxi C1-C6, carboxi, alquilcarboniloxi C1-C6, alquilsulfonilo C1-C6, alquilsulfinilo C1-C6, di(alquil C1-C6)aminocarboniloxi, di(alquil C1-C6)amino-alquilenoxi C1-C6, alcoxicarbonilo C1-C6 y alcoxi C1-C6-alquilenoxi C1-C6; y
-heteroaril-alquileno C1-C3, en el que el heteroarilo es un sistema de anillo monocíclico de 5 a 6 miembros o
imagen7
que consiste en H y -alquilen C1-C3-NR6R7, más preferentemente -(CH2)2-NR6R7; o R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclilo monocíclico saturado de 5 a 7 miembros que contiene de 1 a 2 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en N, O y S y que está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el
5 grupo que consiste en alcoxi C1-C6, alquiltio C1-C3, alcoxicarbonilo C1-C3, di(alquil C1-C3)amino, ciano y F; R5 es alquilen C1-C3-NR6R7, preferentemente -(CH2)2-NR6R7; y R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclilo monocíclico saturado de 5 a 7 miembros que contiene de 1 a 2 heteroátomos en el sistema de anillo seleccionado entre el grupo que consiste en N y O y que está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alcoxi C1-C3, alquiltio C1-C3, alcoxicarbonilo C1-C3, di(alquilo C1-C3)amino, ciano y F.
En otra realización particular, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H; Br; NR3R4 y -OR5; en la que R3 es H; R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -alquilen C1-C3-NR6R7, preferentemente H o -(CH2)2-NR6R7; o R3 y R4 junto con el átomo de
15 nitrógeno al que están unidos forman un heterociclilo seleccionado entre el grupo que consiste en morfolinilo, piperidinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sin sustituir o sustituido con metilo, piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sustituido con metilo (preferentemente sustituido en un átomo de nitrógeno) y pirrolidinilo; R5 es -alquilen C1-C3-NR6R7, preferentemente -(CH2)2-NR6R7; y R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo seleccionado entre el grupo que consiste en morfolinilo, piperidinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, más preferentemente sustituido con metilo en un átomo de nitrógeno y pirrolidinilo.
En otra realización particular, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -NR3R4 en el que R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están
25 unidos forman un piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente metilo, en el que el sustituyente está unido preferentemente al átomo de nitrógeno.
En otra realización particular, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que, R2 se selecciona entre el grupo que consiste en -NR3R4 y -OR5, en el que R3 es H, R4 es -alquilen C1-C3-NR6R7, o R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo seleccionado entre el grupo que consiste en morfolinilo, piperidinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sin sustituir o sustituido con metilo, piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sustituido con metilo (preferentemente sustituido en un átomo de nitrógeno) y pirrolidinilo; R5 es -alquilen C1-C3-NR6R7; y R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo seleccionado entre el grupo que consiste en
35 morfolinilo, piperidinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sin sustituir, piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sustituido con metilo (preferentemente sustituido en un átomo de nitrógeno) y pirrolidinilo.
En una realización preferente, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que, R2 se selecciona entre el grupo que consiste en -NR3R4 y -OR5, en el que R3 es H, R4 es -alquilen C1-C3-NR6R7, preferentemente -(CH2)2-NR6R7; o R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un piperazinilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente sustituido con metilo (preferentemente sustituido en un átomo de nitrógeno); R5 es -alquilen C1-C3-NR6R7, preferentemente -(CH2)2-NR6R7; y R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un morfolinilo.
45 En otra realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que R2 es un piperazinilo sustituido con alquilo C1-C3, preferentemente metilo. En otra realización R2 es 4-metil-piperazin-1-ilo.
En otra realización particular de la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en la que R1 es alquilo C1-C3, preferentemente metilo; y R2 se selecciona entre el grupo que consiste en -NR3R4 y -OR5, en el que R3 es H; R4 es -(CH2)2-NR6R7; o R3 y R4 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo seleccionado entre el grupo que consiste en morfolinilo, piperidinilo opcionalmente sustituido con metilo, piperazinilo opcionalmente sustituido con metilo (preferentemente sustituido en un átomo de nitrógeno) y pirrolidinilo, preferentemente el heterociclilo es piperazinilo sustituido con metilo, preferentemente en un átomo de nitrógeno; R5
55 es -(CH2)2-NR6R7; y R6 y R7 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo seleccionado entre el grupo que consiste en morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo y pirrolidinilo, preferentemente morfolinilo.
En otra realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) seleccionado entre el grupo que consiste en:
-4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-2-(fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona;
-4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona;
65 -4-amino-8-bencil-6-(2,6-diclorofenil)-2-(fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona;
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Esquema 2
5 Más recientemente, los presentes inventores han desarrollado protocolos para la deshidrogenación de 5,6dihidropirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-onas a pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-onas [Heterocycles 2010, 82, 581-591] y una metodología para la síntesis de 4-amino-5,6-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-onas 2-arilamino sustituidas (XV) a partir de ésteres α,β-insaturados (VII), malononitrilo (VIII) y una guanidina arilsustituida (XI) a través de las piridopirimidinas 3-arilo sustituidas correspondientes (XIV), formadas después del tratamiento de las piridonas (IX)
10 con la guanidina arilsustituida (XI) en dioxano y que posteriormente se sometió al reordenamiento de Dimroth para proporcionar las 4-aminopiridopirimidinas (XV) deseadas con NaOMe/MeOH. Los rendimientos globales de dicho procedimiento de tres pasos son en general más altos que la reacción multicomponente entre un éster α,βinsaturado (VII), un malononitrilo (VIII) y una guanidina arilsustituida (XI) (Esquema 3) [Galve, I., Puig de la Bellacasa, R., Sánchez-García, D., Batllori, X., Teixidó, J., Borrell, J.I. Mol. Diver. 2012, 16, 639-649].
15
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Esquema 3
20 Las 2-arilamino-4-amino-5,6-dihidropirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-onas (XV) o sus análogos (XVI) son una clase interesante de compuestos heterocíclicos, que no se pueden obtener a través de la estrategia general representada en el Esquema 1, ya que el aldehído pirimidínico de partida (V) debería tener dos grupos amino en las posiciones C2 y C4 (véase la estructura (XVII) a continuación) haciendo de este modo imposible la ciclación regioespecífica necesaria para proporcionar los compuestos (XVI). Por consiguiente, hasta ahora, la única metodología capaz de
25 sintetizar las 4-aminopirido [2,3-d]pirimidinas es la notificada por los presentes inventores.
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en la que X se selecciona entre el grupo que consiste en Cl, Br y I;
y
d) cuando en el compuesto de fórmula (I) R2 no es ni H ni X (siendo X un átomo seleccionado entre el grupo que consiste en Cl, Br y I), hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Ic) en presencia de un catalizador de cobre con un compuesto R3R4-NH para proporcionar un compuesto de fórmula (Id)
R1 H
10 (Id),
o hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Ic) con un compuesto R5-OH para proporcionar un compuesto de
fórmula (Ie) 15
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R1 H
(Ie);
20 en la que
R1-R5 son como se han definido anteriormente para los compuestos de fórmula (I).
Los compuestos (Ia)-(Ie) mostrados anteriormente son las definiciones particulares de la fórmula general (I).
25 El material de partida utilizado para la síntesis de los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención, es el compuesto de fórmula (II), es decir el 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-2-(fenilamino)-5,6-dihidropirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona, cuya síntesis se ha descrito previamente [Galve, I., Puig de la Bellacasa, R., Sánchez-García, D., Batllori, X., Teixidó, J., Borrell, J.I. Mol. Diver. 2012, 16, 639-649].
30 La etapa a) es una reacción de aromatización que comprende hacer reaccionar el compuesto de fórmula (II) con un agente de deshidrogenación. Esta reacción se puede realizar usando técnicas convencionales conocidas por un experto en la materia.
35 El agente de deshidrogenación es un compuesto orgánico o inorgánico capaz de retirar los átomos de hidrógeno en los átomos de carbono de las posiciones 5 y 6 del compuesto de fórmula (II) para proporcionar el compuesto correspondiente de fórmula (Ia) representado anteriormente. Dichos agentes son bien conocidos por un experto en la materia.
40 En una realización, el agente de deshidrogenación se selecciona entre el grupo que consiste en MnO2 activado, NaH en dimetilsulfóxido (DMSO), Na2SO3 en dimetilsulfóxido (DMSO), 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ) en diclorometano y Pd sobre carbono en ácido acético, preferentemente, el agente de deshidrogenación se selecciona entre NaH en dimetilsulfóxido y Na2SO3 en dimetilsulfóxido. Se han descrito condiciones de reacción particulares para la etapa a), por ejemplo, para MnO2 activado [P. Victory, A. Crespo, R. Nomen y J. I. Borrell,
45 Afinidad, 1989, 46, 107], NaH en DMSO o Na2SeO3 en DMSO [Pérez-Pi, I.; Berzosa, X.; Galve, I.; Teixido, J.; Borrell,
J.I. Heterocycles 2010, 82, 581-591]. Las condiciones de reacción preferidas son NaH (dispersión al 60 % en aceite mineral) en DMSO como disolvente, preferentemente entre 80 ºC y 120 ºC, más preferentemente a 100 ºC, preferentemente entre 3 h a 6 h, más preferentemente durante 4 horas y preferentemente protegido de la humedad.
50 El MnO2 activado se puede obtener de proveedores comerciales o bien se puede preparar como describe J. Attenburrow [J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1952, 1104]. Se considera que el MnO2 activado es un hidrato amorfo, que contiene aproximadamente el 4-7 % de exceso de humedad (documento US 3702889).
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La etapa b) se realiza cuando en el compuesto de fórmula (I) R1 es diferente de H. Esta etapa comprende hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Ia) en presencia de una base con un compuesto R1-GS, en el que R1 es como se ha definido anteriormente y GS se selecciona entre el grupo que consiste en Cl, Br, I, O-tosilo y O-triflato, para proporcionar un compuesto de fórmula (Ib). Esta etapa puede realizarse mediante una diversidad de métodos tales
5 como el tratamiento con una base (por ejemplo, NaH, Na2CO3, CsCO3 y similares) en un disolvente apropiado (por ejemplo, DMSO, DMF y similares) seguido de la adición de R1-GS. Preferentemente, la etapa b) se realiza usando DMSO como disolvente y NaH como base. Los compuestos R1-X particularmente preferidos son aquellos en los que GS se selecciona entre el grupo que consiste en I, Br, Cl, tosilato, mesilato o triflato, tal como el yoduro de metilo. En una realización particular, la etapa b) se realiza a temperatura ambiente.
En el caso de que R1 sea un radical arilo opcionalmente sustituido o un radical heteroarilo opcionalmente sustituido, la etapa b) debería realizarse mediante la reacción del compuesto de fórmula (Ia) con un yoduro de arilo o heteroarilo, en presencia de Cu2I2 y 8-hidroxiquinolina como catalizador en DMSO como disolvente [Filipski, KJ; Kohrt, JT, Casimiro García, A.; Van Huis, CA; Dudley, DA; Cody, WL; Bigge, CF; Desiraju, S.; Sun, S.; Maiti, SN ;
15 Jaber, MR; Edmunds, J.J., Tet. Lett. 2006, 47, 7677-7680].
La etapa c) se realiza cuando en el compuesto de fórmula (I) R2 es diferente de H. Esta etapa es una halogenación regioespecífica en la posición para del sustituyente 2-fenilamino en el compuesto de fórmula (Ib). Esta etapa comprende hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Ib) con un agente de halogenación para proporcionar un compuesto de fórmula (Ic). Los agentes de halogenación son conocidos en la técnica y normalmente consisten en el uso de N-halo succinimida o el correspondiente X2, en los que X y "halo" se seleccionan entre el grupo que consiste en I, Br, Cl, preferentemente Br. Preferentemente, el agente de halogenación es un agente de bromación, es decir, X es Br. Preferentemente, el agente de bromación se selecciona entre el grupo que consiste en Br2 en ácido acético o N-bromosuccinimida en ácido acético, más preferentemente, Br2 en ácido acético. Las condiciones de reacción
25 preferidas son el uso de cantidades molares entre 0,8:1,5 y 1,5:0,8 de la correspondiente pirido[2,3-d]pirimidina (Ib) con respecto al bromo en ácido acético, preferentemente bromo 2 M en solución de ácido acético, preferentemente cantidades molares entre 0,9:1,1 y 1,1:0,9 de la correspondiente pirido[2,3-d]pirimidina (Ib) con respecto al bromo en ácido acético, preferentemente bromo 2 M en solución de ácido acético, aún más preferentemente cantidades equimolares de la correspondiente pirido[2,3-d]pirimidina (Ib) con respecto al bromo en ácido acético, preferentemente bromo 2 M en solución de ácido acético. Esta reacción se puede realizar en presencia de un disolvente orgánico tal como 1,4-dioxano o THF. En una realización particular, la etapa c) se realiza a temperatura ambiente.
Por último, la etapa d) se realiza cuando en el compuesto de fórmula (I) R2 no es ni H ni X, en el que X se selecciona
35 entre Cl, Br y I, preferentemente X es Br. Esta etapa comprende la sustitución del átomo de bromo en los compuestos de fórmula (Ic) mediante el uso de condiciones de reacción de Ullman. Por tanto, la etapa d) se realiza haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (Ic) en presencia de un catalizador de cobre con un compuesto R3R4-NH, en el que R3 y R4 son como se han definido anteriormente para los compuestos de fórmula (I), para proporcionar un compuesto de fórmula (Id), o hacer reaccionar el compuesto de fórmula (Ic) con un compuesto R5-OH, en el que R5 es como se ha definido anteriormente para los compuestos de fórmula (I), para proporcionar un compuesto de fórmula (Ie). Preferentemente, el catalizador de cobre es de cobre metálico, cobre-bronce, Cu2Br2, Cu2O, Cu2I2, preferentemente Cu2I2 y la reacción se realiza en presencia de una base, tal como K2CO3, Na2CO3, CsCO3 y similares, preferentemente K2CO3 y un ligando seleccionado entre el grupo que consiste en L-prolina, etilenglicol, N,N-dimetilciclohexano-1,2-diamina y N,N-dietilsalicilamida o similares, preferentemente, L-prolina [J. S. Kim y
45 Chang, Chem. Commun. 2008, 3052-3054]. La etapa d) puede realizarse en un disolvente orgánico tal como dimetilsulfóxido, dimetilformamida, preferentemente dimetilsulfóxido. La reacción se realiza preferentemente con calentamiento, por ejemplo, entre 60 ºC y 200 ºC, preferentemente entre 60 ºC y 100 ºC. En una realización particular, el calentamiento se consigue por medio de irradiación de microondas pero también se pueden emplear medios de calentamiento convencionales.
Los compuestos de fórmula (I) pueden sintetizarse usando métodos de síntesis convencionales conocidos en la técnica en combinación con los métodos que se describen en el presente documento. Además, los disolventes, las temperaturas y otras condiciones de reacción presentadas en el presente documento pueden ser variados por los expertos en la materia.
55 Los compuestos intermedios (Ib) y (Ic) como se han definido anteriormente, preferentemente el compuesto (Ib) y el compuesto (Ic) en los que X es Br, son también nuevos compuestos objeto de la presente invención.
Composiciones/formulaciones farmacéuticas y administración
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
65 La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo, diluyente o adyuvante que se administra con el principio activo. Dichos excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y
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anteriormente, o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como un medicamento.
La presente invención también proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido 5 anteriormente, o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente,
o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento y/o prevención de LNH, preferentemente neoplasias de células B maduras, más preferentemente una neoplasia de células B maduras seleccionada entre el grupo que consiste en LLC, LCM, LF y LDCBG.
La presente invención también se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente,
o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el
15 tratamiento y/o prevención de un linfoma no-Hodgkin, preferentemente neoplasias de células B maduras, más preferentemente neoplasias de células B maduras seleccionadas entre el grupo que consiste en LLC, LCM, LF y LDCBG.
La divulgación también se refiere a un método de tratamiento, mejora o reducción del riesgo de linfoma no-Hodgkin, preferentemente neoplasias de células B maduras seleccionadas entre el grupo que consiste en LLC, LCM, LF y LDCBG, en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) como se ha definido anteriormente, o un estereoisómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo a dicho sujeto.
25 Los siguientes ejemplos representan realizaciones específicas de la presente invención. No pretenden limitar en modo alguno el alcance de la invención definida en la presente descripción.
Las siguientes abreviaturas se emplean en el presente documento:
-AcOH: ácido acético
-DMSO: dimetilsulfóxido
-EtOH: etanol
35 -EtOEt: éter dietílico
-MeOH: metanol
-cpm: conteos por minuto
-GI50: concentración de fármaco necesaria para reducir el crecimiento celular en un 50 %
45 Ejemplos
Materiales y métodos
Los espectros de RMN 1H y 13C se registraron en un espectrómetro Varian 400-MR que operaba a una intensidad de campo de 400 y 100,6 MHz, respectivamente. Los desplazamientos químicos aparecen en partes por millón (d) y las constantes de acoplamiento (J) en Hz mediante el uso, en el caso de la espectroscopía de RMN 1H, de TMS como patrón interno, y en el caso de la espectroscopía de RMN 13C el disolvente a 39,5 ppm (d6-DMSO) como referencia interna. Las multiplicidades se designan de la siguiente manera: s, singulete; d, doblete; t, triplete; c, cuarteto; s a, señal ancha.
55 La cromatografía ultrarrápida automática se realizó con un cromatógrafo de líquidos de presión media Combiflash de Isco con columnas de gel de sílice RediSep® (35-70 µm), usando una mezcla adecuada de disolventes como eluyente.
Los experimentos de irradiación de microondas se realizaron en un aparato de microondas InitiatorTM (Biotage), operando a una frecuencia de 2,45 GHz y con una potencia de irradiación continua de 0 a 400 W. Las reacciones se realizaron en tubos de vidrio de 0,5, 2,5, 5, 20 ml, cerrados herméticamente con tapones corrugados de aluminio/teflón, que pueden exponerse hasta a 250 ºC y 20 bar (2000 kPa) de presión interna. La temperatura se midió con un sensor de IR en la superficie exterior del vial del proceso. Después del período de irradiación, el
65 recipiente de reacción se enfrió rápidamente a 50 ºC por enfriamiento con chorro de aire.
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Una mezcla de 98,2 mg (0,2 mmol) de 2-(4-bromofenilamino)-4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metilpirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona, 46,0 mg (0,4 mmol) de L-prolina, 38,0 mg (0,2 mmol) de yoduro de cobre, 31,7 mg (0,23 mmol) de carbonato de potasio y 513,15 µl (3,91 mmol) de 4-(aminoetil)morfolina en 2,3 ml de DMSO se calentó en el microondas durante 16 horas a 80 ºC. La solución resultante se enfrió y se añadió agua (400 ml). El
5 precipitado resultante se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío sobre pentóxido de fósforo para proporcionar 82,9 mg (0,15 mmol, 77 %) de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(2-morfolinoetilamino)-fenilamino)-pirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona en forma de un sólido de color parduzco.
RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 9,02 (s a, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,56 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,47 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 7,42
10 (dd, J = 8,6, 7,5 Hz, 1H), 7,24 (s a, 2H), 6,56 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 5,13 (t a, J = 5,5 Hz, 1H), 3,59 (t, J = 4,6 Hz, 4H), 3,55 (s, 3H), 3,11 (dt, J = 6,3, 6,2 Hz, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,41 (m, 4H). RMN 13C (100,6 MHz, d6-DMSO) δ 161,6, 160,5, 159,2, 156,2, 144,5, 135,5, 134,0, 130,2, 129,4, 128,0, 121,9, 119,1, 112,0, 91,2, 66,2, 57,3, 53,4, 40,5, 28,2.
Ejemplo 7: 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(2-morfolinoetoxi)-fenilamino)-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)15 ona
H
imagen17 ONNNCl
imagen18O N
imagen19Nimagen20
O NH2Cl
Una mezcla de 98,2 mg (0,2 mmol) de 2-(4-bromofenilamino)-4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metilpirido[2,3
20 d]pirimidin-7(8H)-ona, 38,0 mg (0,2 mmol) de yoduro de cobre, 128,0 mg (0,4 mmol) de carbonato de cesio y 1,25 ml (8,80 mmol) de 4-(2-hidroxietil)morfolina se calentó en el microondas durante 18 horas a 180 ºC. La solución se enfrió y se añadió agua (400 ml). El precipitado resultante se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío sobre pentóxido de fósforo. El residuo se separó por cromatografía ultrarrápida (sílice, CH2Cl2-MeOH, de 100:0 a 90:10 en 18 min) para proporcionar 18,9 mg (0,036 mmol, 18 %) de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(2-morfolinoetoxi)
25 fenilamino)-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona en forma de un sólido de color blanco.
RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 9,28 (s a, 1H), 8,08 (s, 1H), 7,70 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 7,60-7,54 (m, 2H), 7,43 (dd, J = 8,7, 7,5 Hz, 1H), 7,33 (s a, 2H), 6,89 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 4,06 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,65-3,53 (m, 7H), 2,68 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,49-2,44 (m, 4H). RMN 13C (100,6 MHz, d6-DMSO) δ 161,6, 160,5, 159,1, 156,1, 153,6, 135,4, 134,0,
30 133,5, 130,2, 128,0, 121,3, 119,6, 114,3, 109,6, 91,4, 66,2, 65,5, 57,1, 53,7, 28,3.
Ejemplo 8: 4-amino-2-(4-aminofenilamino)-6-(2,6-diclorofenil)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona
H
imagen21ONNN
Cl N
imagen22 NH2 NH2Cl
35 Una mezcla de 98,2 mg (0,2 mmol) de 2-(4-bromofenilamino)-4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metilpirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona, 46,0 mg (0,4 mmol) de L-prolina, 38,0 mg (0,2 mmol) de yoduro de cobre, 82,7 mg (0,6 mmol) de carbonato de potasio y 0,23 ml (3,91 mmol) de solución de amoníaco al 30 % en 2,3 ml de DMSO se calentó en el microondas durante 16 horas a 80 ºC. La solución se enfrió y se añadió agua (400 ml). El precipitado resultante se
40 filtró, se lavó con agua y se secó al vacío sobre pentóxido de fósforo. El residuo se separó por cromatografía ultrarrápida (sílice, CH2Cl2-MeOH, de 100:0 a 90:10 en 18 min) para proporcionar 33,6 mg (0,08 mmol, 40 %) de 4amino-2-(4-aminofenilamino)-6-(2,6-diclorofenil)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona en forma de un sólido de color blanco.
45 RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,98 (s a, 1H), 8,04 (s, 1H), 7,60-7,53 (m, 2H), 7,42 (dd, J = 8,7, 7,5 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,24 (s a, 2H), 6,53 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 4,79 (s a, 2H), 3,54 (s, 3H).
Ejemplo 9: dimesilato de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona
H
imagen23 ONNNCl
imagen24· 2 MsOH N
N NH2 imagen25 NCl
imagen26
5 En primer lugar se disolvieron 382,8 mg (0,75 mmol) de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona en 50 ml de acetona y después se añadieron 144,3 mg (1,5 mmol) de ácido metanosulfónico. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y, después, se añadió éter dietílico frío y el precipitado resultante se filtró, se lavó con éter dietílico frío y se secó al vacío sobre
10 pentóxido de fósforo para proporcionar 456,7 mg (0,65 mmol, 87 %) del dimesilato de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona en forma de un sólido de color amarillento.
RMN 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 9,53 (s a, 2H), 9,34 (s a, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,70 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 7,59-7,56 (m, 2H), 7,44 (dd, J = 8,7, 7,5 Hz, 1H), 7,43 (s a, 2H), 6,98 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 3,77 (d, J = 13,5 Hz, 2H) 3,59 (s, 3H), 15 3,52 (d, J = 11,9 Hz, 2H), 3,24-3,11 (m, 2H), 2,98-2,84 (m, 5H), 2,34 (s, 6H).
Pruebas Biológicas
Perfil de inhibición de cinasas
20 El perfil de inhibición de cinasas de los compuestos de fórmula (I) se evaluó en Proqinase (http://www.proqinase.com) mediante una única medición de los valores de actividad residual a una concentración de 10 µM del compuesto de ensayo frente las siguientes cinasas: BTK, LYN, SYK aa1-635, usando el siguiente protocolo:
25 Los compuestos se disolvieron en DMSO al 100 % a soluciones madre 1 x 10-03 M. Posteriormente, se transfirieron 100 µl de cada solución madre a pocillos A3-F12 de una placa de microtitulación ("placa maestra"). Los pocillos A1-F2 se llenaron con 100 µl de DMSO al 100 % como control. Se dividieron en alícuotas 5 x 10 µl de la placa maestra en 5 placas de copia, que se almacenaron a -20 ºC hasta su uso. Para en ensayo de cada grupo de hasta 8 cinasas,
30 se usó una placa de copia.
En el proceso, se añadieron 90 µl de H2O a cada pocillo de una placa de copia. Para minimizar la precipitación, se añadió H2O a cada pocillo solo unos pocos minutos antes de la transferencia de las soluciones de los compuestos en las placas de ensayo. La placa se agitó minuciosamente, dando como resultado una "placa de dilución del
35 compuesto" con una concentración de compuesto de 1 x 10-04 M/DMSO al 10 %. Esta placa se usó para la transferencia de 5 µl de la solución del compuesto en las placas de ensayo. El volumen final del ensayo fue de 50 µl. Todos los compuestos se sometieron a ensayo a 1 x 10-05 M una única vez. La concentración final de DMSO en los cócteles de reacción fue del 1 % en todos los casos. Las placas de dilución del compuesto se desecharon al final de cada día de trabajo.
40
Ensayos de proteína cinasas
Se usó un ensayo radiométrico de proteína cinasa (Ensayo de actividad 33PanQinase®) para medir la actividad cinasa de las correspondientes proteínas cinasas. Todos los ensayos de cinasas se realizaron en FlashPlatesTM de 45 96 pocillos de Perkin Elmer (Boston, MA, EE.UU.) en un volumen de reacción de 50 µl. El cóctel de reacción se pipeteó en 4 pasos en el siguiente orden:
10 µl de solución no radiactiva de ATP (en H2O)
50 25 µl de mezcla tampón de ensayo/[γ-33P]-ATP
5 µl de muestra de ensayo en DMSO al 10 %
10 µl de mezcla de enzima/sustrato
55 El ensayo para todas las proteínas cinasas contenía HEPES-NaOH 70 mM pH 7,5, MgCl2 3 mM, MnCl2 3 mM, Naortovanadato 3 µM, DTT 1,2 mM, ATP (cantidades variables, correspondientes al ATP-Km aparente de la respectiva cinasa), [γ-33P]-ATP (aproximadamente 8 x 1005 cpm por pocillo), proteína cinasa (cantidades variables) y sustrato (cantidades variables).
Los cócteles de reacción de proteína cinasas se incubaron a 30 ºC durante 60 minutos. La reacción se paró con 50 µl de H3PO4 al 2 % (v/v), las placas se aspiraron y se lavaron dos veces con 200 µl de NaCl al 0,9 % (p/v). Todos los ensayos se realizaron con un sistema robótico Biomek 2000/SL BeckmanCoulter. La incorporación de 33Pi (recuento de "cpm") se determinó con un contador de centelleo de microplacas (Microbeta, Wallac).
5 Todos los ensayos de proteína cinasa se realizaron con un sistema robótico BeckmanCoulter Core.
Cinasas recombinantes
Todas las proteínas cinasas proporcionadas por ProQinase se expresaron en células de insecto Sf9 o en E. coli como proteínas de fusión de GST recombinantes o proteínas etiquetadas con His. Todas las cinasas se produjeron a partir de ADNc humanos y se purificaron por cromatografía de afinidad a GSH o metal inmovilizado. Las etiquetas de afinidad se retiraron de una serie de cinasas durante la purificación. La pureza de las proteína cinasas se examinó mediante tinción SDS-PAGE/Coomassie, la identidad se comprobó por espectroscopia de masas.
15 Se expresaron cinasas de proveedores externos (CAR = Carna Biosciences Inc.; INV = Life Technologies (Invitrogen Corporation); MIL = Merck-Millipore (Millipore Corporation)), se purificaron y se controló su calidad en virtud de las lecturas de los proveedores.
Evaluación de los datos en bruto
Para cada cinasa, el valor de la mediana de los cpm de seis pocillos de la columna 1 de cada placa de ensayo se define como "control bajo" (n = 6). Este valor refleja la unión inespecífica de la radiactividad a la placa en ausencia de una proteína cinasa, pero en presencia del sustrato. Además, para cada cinasa el valor de la mediana de los cpm
25 de los seis pocillos de la columna 2 de cada placa de ensayo se tomó como el "control alto", es decir, la plena actividad en ausencia de cualquier inhibidor (n = 6). La diferencia entre el control alto y el bajo para cada enzima se tomó como el 100 % de actividad.
Como parte de la evaluación de los datos se restó el control bajo de cada cinasa del valor de control alto, así como de sus correspondientes "valores compuestos". La actividad residual (en %) para cada compuesto se calculó mediante la siguiente fórmula:
Actividad residual (%) = 100 x [(señal de compuesto -control bajo)/(control alto -control bajo)]
35 Resultados
Se proporcionan los valores de actividad residual de los compuestos sometidos a ensayo a una concentración (1 x 10-05 M), sin réplica, en los ensayos de proteína cinasas requeridos.
Controles de calidad
Como parámetro para la calidad del ensayo, se usó el factor de Z' (Zhang et al., J. Biomol. Screen. 2: 67-73, 1999) para los controles bajo y alto de cada placa de ensayo (n = 8). El criterio de ProQinase para la repetición de una placa de ensayo es un factor de Z' por debajo de 0,4 (Iversen et al., J. Biomol. Screen. 3: 247-252, 2006). Los
45 factores Z' no cayeron por debajo de 0,51, lo que indica una excelente calidad del ensayo.
La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos para algunos de los compuestos de la presente invención.
Tabla 2
Compuesto
BTK LYN SYK aa1-635
Ejemplo 5
3 -1 9
Ejemplo 6
10 0 31
Ejemplo 7
16 0 44
Ensayos en líneas celulares de linfomas no Hodgkin y sobra la actividad de las cinasas BCR
Métodos
55 Cultivo de células: las líneas celulares se cultivaron en medios de cultivo adecuados a 37 ºC en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Se usaron las siguientes líneas celulares de LCM en los ensayos: Rec-1, HBL-2, UPN-1, Jeko-1, JVM-2, Maver-1, Mino, Granta-519 y Z-138. Se usaron las siguientes líneas de LLC en los ensayos: MEC-2, JVM-13 y MEC-1. Se usaron las siguientes líneas celulares de LF en los ensayos: DoHH-2, WSU-NHL, WSU-FSCCL y SC-1. Se usaron las siguientes líneas celulares de LDCBG en los ensayos: OCI-LY8, SUDHL-8, U2932 y SUDHL-16. Se usaron los siguientes medios para las líneas celulares indicadas: RPMI 1640 + suero fetal bovino al 10 % (SFB) para Rec-1, HBL-2, UPN-1, JVM-2, MAVER, Z138, Mino, JVM-13, WSU-NHL, WSU-FSCCL,
DOHH2, SC-1 y U2932, RPMI 1640 + SFB al 20 % para Jeko-1, SUDHL-8 y SUDHL-16; DMEM + SFB al 10 % para Granta-519; IMDM + SFB al 10 % para MEC-1 y MEC-2; IMDM + SFB al 20 % para OCI-LY8.
El análisis de la inhibición del crecimiento se realizó usando el ensayo de proliferación de MTT (bromuro de
5 tetrazolio de azul de tiazolilo): se sembraron células cultivadas en fase exponencial en placas de 96 pocillos a 0,5 x 106 células/ml y se trataron con 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirido[2,3d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5) a las dosis de 0,5, 1,5, 10, 20, 50 y 100 µM. Después de 24 h o 48 h, se añadió reactivo MTT a cada pocillo, se incubaron durante 2 h y las placas se leyeron en un Lector de Microplacas Multi-Modo Synergy-HT (Biotek). El GI50 (concentración de fármaco necesaria para reducir el crecimiento celular en un
10 50 %) se calculó a partir de los valores citotóxicos obtenidos mediante la incubación de las células con las dosis indicadas del fármaco usando el software GraphPad Prism versión 4.0.
El análisis de las moléculas de señalización de activación del receptor de células B (BCR) se realizó mediante Transferencia de Western y citometría de flujo. Se hicieron extractos de proteínas totales en Triton X-100 al 1 % más 15 proteasa e inhibidores de fosfatasa a partir de células tratadas con un intervalo de dosis del compuesto indicado (0,1, 1, 5 y 10 µM). Estos lisados de células se resolvieron mediante SDS-PAGE convencional (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio), se transfirieron a membranas de PVDF (difluoruro de polivinilideno) y se incubaron durante la noche con los anticuerpos primarios indicados (pSyk, pLyn y β-actina) seguidos de anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante (HRP) secundarios emparejados por especies. Se 20 desarrolló quimioluminiscencia añadiendo reactivo ECL (quimioluminiscencia potenciada) y la señal se capturó en un dispositivo LAS4000 usando el software Image Gauge (Fujifilm). La cantidad intracelular de FosfoY223-Btk se determinó por tinción inmunológica con un anticuerpo anti-fosfoY223-Btk-PE (clon N35-86), usando PE isotipo Κ de IgG1 como control negativo (BD Biosciences). Después de los diferentes tratamientos, las células (5 x 105) se fijaron en paraformaldehído al 4 % en PBS (15 min, 4 ºC), se permeabilizaron con metanol frío (10 min, -20 ºC), se lavaron 25 con PBS que contenía BSA al 1 % y se incubaron con los anticuerpos indicados a temperatura ambiente durante 15 min. Por último, las células se lavaron con PBS que contenía BSA al 1 %, se resuspendieron en 500 µl de PBS y se analizaron por citometría de flujo en un citómetro de enfoque acústico Attune (Life Technologies). La relación de fluorescencia media (MFIR, del inglés Mean Fluorescence Ratio) entre la intensidad de fluorescencia media de la señal de Btk-PE y el control isotípico se calculó después para las afecciones tanto tratadas como no tratadas. Estas
30 MFIR después se refirieron al control sin tratar (r).
Resultados
Actividad antitumoral de un compuesto de Fórmula (I) en líneas celulares de linfomas no Hodgkin que implica la
35 inhibición de cinasas relacionadas con el receptor de células B (BCR): la actividad de un compuesto de Fórmula I, 4amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5), contra un panel de 20 líneas celulares de LNH se evaluó mediante el ensayo MTT. Las células se expusieron durante 24 h o 48 h a dosis crecientes del compuesto y se calcularon los valores de GI50 representados en la Figura
1. El compuesto mostró una actividad antiproliferativa comparable a las 24 h y 48 h en las líneas celulares sometidas
40 a ensayo, variando GI50 de 1,3 a 6,9 µM (media = 4,3) a las 24 h y de 1,4 a 7,2 µM (media = 3,6) a las 48 h. La Tabla 3 muestra el Intervalo detallado de valores de GI50 para cada patología.
Tabla 3. Valores medios de GI50 de 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5) en líneas celulares de LCM, LLC, LF y LDCBG a las 24 y 48
45 horas.
LCM (n = 9 líneas celulares)
LLC (n = 3 líneas celulares) LF (n = 4 líneas celulares) LDCBG (n = 4 líneas celulares)
GI50 medio a las 24 h (µM)
3,6 (Intervalo: 1,3-5,9) 5,9 (Intervalo: 5,3-6,8) 3,7 (Intervalo: 2,6-4,9) 5,4 (Intervalo: 4,3-6,9)
GI50 medio a las 48 h (µM)
3,0 (Intervalo: 2,2-3,6) 4,9 (Intervalo: 4,5-5,5) 2,7 (Intervalo: 1,4-4,4) 5,0 (Intervalo: 3,8-7,2)
Para evaluar adicionalmente el efecto inhibidor de la 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5) sobre la actividad de las cinasas de BCR, se expuso un conjunto de 4 líneas celulares representativas de cada entidad durante 6 h a dosis aumentadas de 4-amino-6-(2,650 diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5) y se analizaron los contenidos celulares en fosfo-Syk y fosfo-Lyn mediante SDS-PAGE y transferencia Western con anticuerpos específicos, usando β-actina como control de carga. La Figura 2 muestra que el compuesto inhibió la fosforilación de Syk y Lyn después de 6 h de tratamiento en las 4 líneas celulares analizadas y de una manera dependiente de la dosis. La inhibición de la fosforilación por la 4-amino-6-(2,6-diclorofenil)-8-metil-2-(4-(4-metilpiperazin-155 il)fenilamino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (Ejemplo 5) ya fue detectable a una dosis de 1 µM, significativamente potenciada a 5 µM y casi completa a 10 µM. Para la evaluación de los niveles de proteína fosfo-Btk, se trataron
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