ES2627952T3 - Métodos, reactivos y kits para inmunofenotipado por citometría de flujo - Google Patents

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Julia Maria Almeida Parra
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Sebastian Böttcher
Andrew Craig Rawstron
Ruth Mary De Tute
Ludovic Bernard Simon Lhermitte
Vahid Asnafi
Ester Mejstríková
Tomasz Szczepanski
Paulo Jorge Monteiro Da Silva Lucio
Marta Marín AYUSO
Carlos Eduardo Pedreira
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Abstract

Una composición reactiva para inmunofenotipado por citometría de flujo de leucocitos que comprende al menos ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes que comprende un conjunto de al menos tres anticuerpos de identificación para la identificación de una población de leucocitos de interés y al menos cuatro anticuerpos de caracterización para una caracterización adicional y/o la clasificación de dicha población de leucocitos, en donde los anticuerpos están dirigidos contra la siguiente combinación de marcadores: CD45, CD138, CD38, CD56, β2micro, CD19, CyIgκ y CyIgλ

Description

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DESCRIPCION
Metodos, reactivos y kits para inmunofenotipado por citometna de flujo
La invencion se relaciona con el campo de la citometna de flujo y mas particularmente con un panel de reactivos de anticuerpo conjugado con compuestos fluorescentes. Encuentran su uso en la caracterizacion inmunofenotfpica de celulas normales, reactivas, regeneradoras y neoplasicas en sangre periferica (PB), medula osea (BM), derrame pleural, ascitis, fluido cerebroespinal (CSF), humor vftreo, fluido sinovial, lavado broncoalveolar, orina, bazo, Idgado, nodulos linfaticos, y otras muestras de tejido. El inmunofenotipado por citometna de flujo de celulas normales, reactivas, regeneradoras y malignas (particularmente leucocitos) actualmente se usa para muchas aplicaciones en medicina, que incluyen inmunologfa, hematologfa y oncologfa. Entre otras, dichas aplicaciones incluyen el monitoreo del sistema inmune; diagnostico y clasificacion de inmunodeficiencias primarias; inmunofenotipado de leucemias, linfomas y discrasias de celulas plasmaticas; monitoreo de frecuencias bajas de leucocitos malignos como medida de la efectividad del tratamiento; diagnostico y monitoreo de trastornos clonales tales como hemoglobinuria paroxfstica nocturna (PNH) y mastocitosis; evaluacion de la hematopoyesis o linfopoyesis en diferentes afecciones clmicas, por ejemplo, en individuos sanos, despues de trasplante de celulas madre o terapia genica (por medio del uso de celulas precursoras hematopoyeticas como objetivo); y la evaluacion de la composicion y la calidad de los productos celulares que se usaran para fines terapeuticos.
El proceso de diagnostico convencional en el inmunofenotipado por citometna de flujo tfpicamente se basa en el uso de paneles de anticuerpos. En la actualidad se recomiendan para aplicaciones espedficas diferentes paneles de anticuerpos de superposicion. Estos paneles se accionan ya sea por indicacion medica (por ejemplo: deteccion de citopenias, caracterizacion de linfocitosis), por enfermedad (por ejemplo: diagnostico de la leucemia aguda, diagnostico de linfoma) o estado de la enfermedad (por ejemplo: clasificacion diagnostica de ALL vs. monitoreo de ALL para la evaluacion de la efectividad del tratamiento). Ejemplos de paneles de anticuerpos recomendados estan en la Red de Leucemia Europea (ELN) (1), los paneles del Consenso Internacional de Bethesda de 2006 (2) para diferentes subtipos de neoplasias malignas hematologicas, los paneles de EGIL para la asignacion de linaje y subclasificacion de las leucemias agudas (3), los paneles de la Red Europea de Mieloma (EMN) para el diagnostico, clasificacion y monitoreo de discrasias de celulas plasmaticas (4), los paneles de puntuacion de ERIC (5) y Matutes (6) para la subclasificacion inmunofenotfpica de leucemia linfodtica cronica y leucemia de celulas peludas vs. otros trastornos linfoproliferativos cronicos.
Estos paneles de anticuerpos recomendados son en su mayona comparables entre los diferentes pafses y grupos de estudio, pero nunca totalmente identicos. Es importante destacar que las distintas redes y grupos de estudio han proporcionado poca o ninguna informacion sobre como los anticuerpos se deben combinar preferentemente en un panel de reactivos de anticuerpos conjugados con compuestos de fluorescencia espedficos. Solo se han propuesto listas simples de anticuerpos, incluso cuando los laboratorios de diagnostico pueden tenir simultaneamente una almuota de la muestra con 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o mas anticuerpos conjugados con diferentes colorantes fluorescentes que tienen emisiones de fluorescencia que se pueden medir por separado. Las variaciones entre centros de todo el mundo se deben al uso de:
- Listas comparables pero no identicas de anticuerpos y clones de anticuerpos;
- Los mismos anticuerpos conjugados con diferentes fluorocromos que muestran diferentes sensibilidades. Por ejemplo, un reactivo de anticuerpo podna proporcionar un resultado negativo si el anticuerpo se combina con un fluorocromo de baja sensibilidad, mientras que un resultado positivo se podna obtener si un reactivo de anticuerpo que consiste en el mismo anticuerpo combinado con un fluorocromo diferente, mas sensible, se usa para tenir las mismas celulas.
- Evaluacion simultanea de diferentes combinaciones de reactivos de anticuerpo.
- Estrategias variables y frecuentemente suboptimas o inadecuadas para la identificacion de la poblacion(s) de celulas de interes, tales como la seleccion de CD45 en leucemias mieloblasticas agudas.
Como consecuencia, los paneles de anticuerpos aparentemente comparables no resultan en un diagnostico comparable de muestras clmicas. De hecho, la reproducibilidad entre laboratorios de diagnostico no es mayor que 70%. Desafortunadamente, los diagnosticos fallan debido a la distincion inapropiada entre celulas normales y malignas o la regeneracion de la medula osea se diagnostica erroneamente como recurrencia de la leucemia aguda.
En la patente de Estados Unidos num. 5,047,321, Loken y Terstappen describen un procedimiento para el analisis multiparametrico de componentes celulares en PB y bM. Con el procedimiento descrito, estos inventores podnan distinguir varios componentes celulares de PB y BM, contar el numero de celulas dentro de cada componente, y proporcionar un analisis diferencial de cada uno de ellos basado en el uso combinado del colorante de ADn LDS-751 (exciton), el colorante de ARN tiazol naranja (TO, Molecular
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Probes, Inc), un anticuerpo monoclonal anti-CD45 marcado fluorescentemente, dispersion frontal de la luz (FSC) y dispersion lateral de la luz (SSC). Este enfoque permite la identificacion espedfica de las celulas rojas nucleadas, eritrocitos, reticulocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrofilos, granulocitos basofilos, granulocitos eosinofilos y precursores de todas las celulas hematopoyeticas nucleadas. Sin embargo, el analisis multiparametrico descrito no podna diferenciar espedficamente entre las celulas normales, reactivas, regeneradoras y neoplasicas que coexisten en la misma muestra, ni este procedimiento podna caracterizar adicionalmente estos grupos de celulas. Un perfeccionamiento adicional de esta patente se describio despues en la patente de los Estados Unidos num. 6,287,791 de Terstappen y Chen, pero ellos no demostraron ninguna mejora en la caracterizacion de diferentes poblaciones de leucocitos.
Mas recientemente, Orfao y otros describieron en la patente de Estados Unidos num. 7,332,295 un procedimiento para el analisis diferencial de leucocitos multidimensional de PB, BM y otros fluidos corporales, que permiten espedficamente la identificacion de celulas dendnticas y sus subconjuntos adicionalmente a las celulas rojas nucleadas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrofilos, granulocitos basofilos, granulocitos eosinofilos y precursores hematopoyeticos de todas las celulas nucleadas. Ademas, en la patente de los Estados Unidos num. 5,538,855, Orfao y otros describen un procedimiento que permite un analisis mas detallado de los compartimentos linfoides a traves de la identificacion simultanea de hasta 12 subconjuntos diferentes de muestras de celulas T, B y NK en PB, BM y nodulos linfaticos. En la patente, Orfao y otros usaron una tincion combinada para los antfgenos CD3, CD19, CD56 (y/o CD16), CD4 y CD8 en una unica tincion de 3 colores, donde se usaron pares de anticuerpos monoclonales conjugados con el mismo fluorocromo. Sin embargo, a traves de este enfoque ni podnan caracterizar adicionalmente los subconjuntos de celulas identificadas ni distinguir entre las celulas normales y neoplasicas; ademas, algunos subconjuntos relevantes de celulas linfoides y no linfoides (por ejemplo, las celulas T-TCRy§+ ) presente en un PB, BM u otros tejidos y fluidos corporales normales, no se podnan detectar espedficamente.
Ninguno de los procedimientos mencionados admite directamente una caracterizacion mas detallada de las celulas identificadas, que incluye la distincion entre las poblaciones de celulas normales, reactivas, regeneradoras, y neoplasicas/clonales. Tal caracterizacion y distincion requiere el uso de un mayor numero de tinciones asociadas con emisiones de fluorescencia distinguibles y de instrumentos de citometna de flujo capaces de medir un mayor numero de emisiones de fluorescencia diferentes.
Muchas otras publicaciones muestran que, basado en perfiles inmunofenotipicos espedficos, las celulas normales se pueden distinguir a partir de sus homologas neoplasicas, y que las capacidades de distincion (sensibilidad para distinguir celulas normales de clonales/malignas) aumentan con el numero de reactivos de anticuerpo conjugados con fluorocromos usados para tenir la misma muestra. Algunos informes ademas muestran que las celulas normales y reactivas asf como celulas de maduracion durante la regeneracion de BM, pueden mostrar perfiles inmunofenotipicos diferentes, pero estas celulas no se podnan distinguir claramente de las celulas malignas. Es importante destacar que, los paneles de combinaciones de anticuerpos que se han propuesto hasta ahora no pueden distinguir eficazmente entre las poblaciones de celulas normales, reactivas, regeneradoras y sus homologas neoplasicas de una manera sistematica y, al mismo tiempo, permitir una clara distincion entre las diferentes categonas de diagnostico de enfermedades a traves de una caracterizacion inmunofenotfpica prolongada de las celulas malignas.
Con la introduccion de la nueva generacion de citometros de flujo multi-laser en los laboratorios de diagnostico, el espacio potencial para la construccion de diferentes paneles, aun con la misma lista de anticuerpos, ha aumentado de manera exponencial debido a la posibilidad de usar un mayor numero de diferentes compuestos fluorescentes y simultaneamente medir un mayor numero de emisiones de fluorescencia en las celulas individuales. En la patente de Estados Unidos num. 7,321,843, Orfao, Pedreira y Sobral da Costa proponen un nuevo enfoque basado en los procedimientos de calculo matematico (por ejemplo, el principio del vecino mas cercano), donde los archivos de datos en modo de lista de citometna de flujo que conteman informacion de cada celula individual medida sobre un numero ilimitado de parametros que se podnan generar, despues de varias alfcuotas de una muestra tenida con diferentes combinaciones de anticuerpos monoclonales que se superponen parcialmente se midieron en un citometro de flujo. La utilidad de este procedimiento se podna maximizar solo con el aumento de las capacidades multicolor de los citometros de flujo mas recientes. Esto es porque estos procedimientos requieren el diseno de paneles eficientes de combinaciones de reactivos de anticuerpos monoclonales donde marcadores del esqueleto comunes se combinan con otros marcadores adicionales que vanan para cada combinacion de anticuerpos monoclonales en un panel. En paralelo, los mismos autores ademas describieron (patente de Estados Unidos num. 7,507,548) un procedimiento de comparacion de datos de citometna de flujo a partir de un caso contra un archivo de datos de referencia que permitina la comparacion directa de por ejemplo, celulas normales vs. neoplasicas. Sin embargo, en ambas patentes, los autores dejaron de proponer un amplio panel de anticuerpos que se pudiera aplicar total y sistematicamente al diagnostico, clasificacion, estadificacion y/o monitoreo de leucemia, linfoma y discrasias de celulas plasmaticas.
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Braylan RC y otros, (Cytometry, Vol. 46, no. 1, pp.23-27, 2001) proporciona un inventario de marcadores que pueden usarse para evaluar neoplasias hematolinfoides. Se divulgan clasificaciones de marcadores para cuatro enfermedades diferentes. Sin embargo, Braylan et al. no divulga el uso del marcador p2micro, y mucho menos una unica composicion reactiva que comprende la combinacion de marcadores espedficos de la presente invencion.
El documento US 5,538,855 divulga un panel de cinco anticuerpos distintos conjugados con fluorocromo para el inmunofenotipado por citometna de flujo de linfocitos con un citometro de flujo de tres colores. Entre los marcadores se encuentran CD56, Cd3, CD4, CD8 y CD19, en donde los anticuerpos CD8/CD19 se conjugan a un primer fluorocromo, los anticuerpos CD3/CD56 se conjugan con un segundo fluorocromo y el anticuerpo CD4 con un tercer fluorocromo. El documento US5,538,855 no divulga anticuerpos contra CD45, CD138, CD38, p2micro, CylgK y CylgA.
Asf, los protocolos existentes no ensenan sobre como combinar espedficamente los anticuerpos monoclonales ampliamente recomendados en un panel; proponen diferentes paneles para la clasificacion diagnostica y monitoreo de la enfermedad minima; se enfocan en grupos de enfermedades individuales, uniformes; muestran una eficacia limitada una vez que se han probado ampliamente; no proporcionan un modo de combinacion directa de la informacion medida para varias almuotas de una sola muestra; y/o han fracasado en distinguir sistematicamente celulas normales/reactivas vs. clonales/neoplasicas basados en sus propiedades inmunofenotfpicas, en enfermedades espedficas, tales como trastornos linfoproliferativos T y NK cronicos (por ejemplo, en el diagnostico diferencial de la leucemia linfodtica granular grande).
Los presentes inventores reconocieron estas dificultades, y salieron a disenar paneles de anticuerpos bien definidos, mejorados, que eviten interpretaciones erroneas y mala interpretacion de los resultados. Despues de una cuidadosa seleccion de los marcadores pertinentes, el diseno de las combinaciones adecuadas de anticuerpos en tubos de multiples colores, y la seleccion de fluorocromos adecuados (en base a la necesidad de brillo, compensacion, estabilidad, etc.), se desarrollo un conjunto de reactivos de anticuerpos. Los estudios se complementaron con una extensa evaluacion multicentrica de los paneles de consenso con el fin de remodelar y lograr una eficiencia optima.
Por consiguiente, la invencion proporciona en una realizacion una composicion reactiva para inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos que comprende al menos ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes que comprende un conjunto de al menos tres anticuerpos de identificacion para la identificacion de una poblacion de leucocitos de interes y al menos cuatro anticuerpos de caracterizacion para una caracterizacion adicional y/o la clasificacion de dicha poblacion de leucocitos. Una composicion reactiva como se proporciona en la presente descripcion comprende un panel de anticuerpos dirigidos contra la siguiente combinacion de marcadores: (a) CD45, CD138, CD38, CD56, p2micro, CD19, cylgK y cylgA (composicion reactiva de PCST).
En una realizacion preferida, la composicion comprende anticuerpos monoclonales. El CD esta para la designacion del agregado y es una nomenclatura para la identificacion de antfgenos de superficie celular espedficos, definidos por los anticuerpos monoclonales. Las abreviaturas usadas son como sigue: cylgK = cadena de IgG kappa citoplasmatica; cylgA = cadena de IgG lambda citoplasmatica; p2micro =p2microglobulina; cyMPO = mieloperoxidasa citoplasmatica. Los anticuerpos (monoclonales) contra los marcadores indicados pueden obtenerse comercialmente de varias compares, que incluyen Becton/Dickinson (BD) Biosciences, Dako, Beckman Coulter, CYTOGNOS, Caltag, Pharmingen, Exbio, Sanquin, Invitrogen, y similares.
Los fluorocromos adecuados para conjugar los anticuerpos se conocen en la tecnica. Como se entendera, los fluorocromos usados dentro de una composicion reactiva deben ser distinguibles por citometna de flujo. Los fluorocromos se seleccionan preferentemente por su brillo, superposicion espectral limitada y necesidad limitada de compensacion, estabilidad, etc. El siguiente panel de fluorocromos es de uso particular en una composicion reactiva de acuerdo con la invencion: (1) azul padfico (PacB) u Horizon V450, (2) naranja padfico (PacO) o AMCA, (3) isotiocianato de fluorescema (FITC) o Alexa488, (4) ficoeritrina (PE), (5) protema clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed, (6) ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), (7) aloficocianina (APC) o Alexa647, y (8) aloficocianina/H7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680 o Alexa700. Despues de varias rondas de pruebas, los presentes inventores observaron que se pueden obtener muy buenos resultados si se eligen los siguientes fluorocromos: azul padfico u Horizon V450, naranja padfico, isotiocianato de fluorescema (FITC), ficoeritrina (PE), protema clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCp-Cy5.5), PE-Cy7, aloficocianina (APC), y APC-H7.
La expresion "en donde el anticuerpo dentro de los pares se conjuga al mismo fluorocromo" pretende indicar que ambos anticuerpos del primer par estan conjugados al fluorocromo A y que ambos anticuerpos del segundo par estan conjugados al fluorocromo B. Asf, dentro de cada par los fluorocromos son los mismos pero entre los diferentes pares los fluorocromos son distinguibles.
La composicion reactiva se puede usar tal como, por ejemplo, para la deteccion de una enfermedad linfoide. Ver la Figura 2 para una vision general esquematica de aplicaciones ilustrativas de las distintas
composiciones reactivas. La invencion as^ ademas se refiere a kits diagnosticos que comprenden una o mas composiciones reactivas. Sin embargo, las composiciones ademas se usan favorablemente en conjunto con una o mas composiciones reactivas adicionales, particularmente las composiciones reactivas disenadas para la deteccion y clasificacion adicional de la enfermedad. La expresion "en 5 conjunto con" no se refiere a la combinacion ffsica o mezcla de las composiciones reactivas, sino a su aplicacion en sus etapas de analisis por separado (consecutivo) y la combinacion de los datos obtenidos asu Por ejemplo, un tubo de deteccion usado en conjunto con un tubo de caracterizacion implica dos etapas de analisis separadas en alfcuotas separadas de la misma muestra biologica, cada una por medio del uso de una de las composiciones reactivas, seguido por el registro y evaluacion de datos.
10 Por lo tanto, la invencion ademas se refiere a un conjunto de al menos dos composiciones reactivas, dicho conjunto que comprende una composicion reactiva como la descrita en la presente descripcion anteriormente, y al menos una composicion reactiva adicional que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes. Asf, ambas composiciones reactivas comprenden un panel de anticuerpos diferentes, aunque algunos anticuerpos pueden estar presentes en ambas composiciones. Es muy 15 conveniente si el panel de fluorocromos diferentes es practicamente el mismo para cada una de las composiciones reactivas, y que hasta ocho fluorocromos diferentes se usan en total.
En una realizacion, un conjunto de al menos dos composiciones reactivas comprende una composicion reactiva definida en la presente descripcion anteriormente (es decir, reactivo de PCST), junto con al menos una composicion reactiva adicional que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo 20 diferentes, preferentemente dirigidos contra una de las siguientes combinaciones de marcadores:
(i) CD20, CD45, CD23, CD10, CD79b, CD19, CD200 y CD43;
(ii) CD20, CD45, CD31, LAIR1, CD11c, CD19, IgM y CD81
(iii) CD20, CD45, CD103, CD95, CD22, CD19, CXCR5 y CD49d
(iv) CD20, CD45, CD62L, CD39, HLADR, CD19, CD27 y CD31
25 (v) CD4, CD45, CD7, CD26, CD3, CD2, CD28 y CD8
(vi) CD4, CD45, CD27, CCR7, CD3, CD45RO, CD45RA y CD8
(vii) CD4, CD45, CD5, CD25, CD3, CD11c y CD8
(viii) CD4, CD45, CD57, CD30, CD3, CD11c y CD8
(ix) CD4, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD16, CD94 y CD8
30 (x) CD4, CD45, CD279, CD3 y CD8
(xi) CD2, CD45, CD7, CD26, CD3, CD56, CD5 y CD19
(xii) CD16, CD45, CD57, CD25, CD3, CD56, CD11c y CD19
(xiii) HLADR, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD56, CD94 y CD19; o
(xiv) CD45, CD138, CD38, CD28, CD27, CD19, CD117 y CD81
35 Conjuntos ilustrativos de composiciones reactivas incluyen al menos una composicion reactiva segun se expone en el tubo #3 de la Tabla 1 en la presente descripcion mas abajo, junto con al menos una composicion reactiva segun se expone en una cualquiera de las Tablas 2 -5.
Un aspecto adicional se refiere a un kit diagnostico para inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos, en donde el kit comprende uno o mas conjuntos de al menos dos composiciones reactivas 40 descritas anteriormente. El kit puede comprender adicionalmente otros componentes utiles, tales como instrucciones para el uso, reactivo de preparacion de la muestra, amortiguador, y/o muestras de control.
Las composiciones reactivas, conjuntos y kits diagnosticos proporcionados en la presente descripcion encuentran su aplicacion en distintos campos. Por ejemplo, los paneles propuestos se pueden aplicar en su totalidad o solo en parte en dependencia de la naturaleza de la muestra, la indicacion medica o el 45 objetivo espedfico. El panel puede usar reactivos de anticuerpos monoclonales espedficos de uno solo o varios fabricantes diferentes, en conjunto con diferentes tecnicas de preparacion de celulas para la tincion solo de la superficie celular y/o la superficie celular mas los marcadores intracelulares. De manera similar, las composiciones reactivas se pueden mejorar en un panel que incluye combinaciones que contienen reactivos de anticuerpos monoclonales conjugados con > 8 fluorocromos diferentes donde los mismos 50 marcadores del esqueleto se mantienen y se combinan con marcadores adicionales o similares. Una composicion de anticuerpo ademas puede actuar como un panel de base al cual se anaden nuevas combinaciones con diferentes objetivos, que incluyen el monitoreo del sistema inmune.
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En una realizacion, se proporciona un kit diagnostico para la identificacion y caracterizacion de celulas linfoides maduras, que comprende la composicion reactiva de PCST junto con al menos una composicion reactiva para detectar trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas B (B-CLPD) que comprende anticuerpos contra CD20, CD45, CD23, CD10, CD79b, CD19, CD200 y CD43; CD20, CD45, CD31, LAIR1, CD11c, CD19, IgM y CD81; CD20, CD45, CD103, CD95, CD22, CD19, CXCR5 y CD49d; o CD20, CD45, CD62L, CD39, HLADR, CD19, CD27 y CD31.
Por ejemplo, se proporciona un kit diagnostico para la identificacion y caracterizacion de celulas linfoides maduras, que comprende la composicion reactiva de PCST junto con al menos una composicion reactiva para detectar trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas T (T-CLPD) que comprende anticuerpos contra CD4, CD45, CD7, CD26, CD3, CD2, CD28 y CD8; CD4, CD45, CD27, CCR7, CD3, CD45RO, CD45RA y CD8; CD4, CD45, CD5, CD25, CD3, CD11c y CD8; CD4, CD45, CD57, CD30, CD3, CD11c y CD8; CD4, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD16, CD94 y CD8; o CD4, CD45, CD279, CD3 y CD8.
Otro kit diagnostico ilustrativo para la identificacion y caracterizacion de celulas linfoides maduras comprende la composicion reactiva de PCST junto con al menos una composicion reactiva para detectar trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas NK (NK-CLPD) que comprende anticuerpos contra CD2, CD45, CD7, CD26, CD3, CD56, CD5 y CD19; CD16, CD45, CD57, CD25, CD3, CD56, CD11c y CD19; HLADR, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD56, CD94 y CD19; CD45, CD138, CD38, CD56, p2micro, CD19, cylgk y cylgA; o CD45, CD138, CD38, CD28, CD27, CD19, CD117 y CD81.
En otra realizacion, se proporciona un kit diagnostico para la identificacion y caracterizacion de celulas linfoides maduras, que comprende la composicion reactiva de PCST junto con al menos una composicion reactiva para detectar discrasias de celulas plasmaticas (PCD) que comprende anticuerpos contra CD45, CD138, CD38, CD56, p2micro, CD19, cylgk y cylgA; o CD45, CD138, CD38, CD28, CD27, CD19, CD117 y CD81.
La invencion se relaciona ademas con un metodo para el inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos, que comprende las etapas de proporcionar una muestra biologica que comprende leucocitos y contactar al menos una porcion (alfcuota) de la muestra con una composicion reactiva proporcionada en la presente descripcion. Se puede usar cualquier tipo de muestra (humana) conocida o que se sospecha que contiene leucocitos. Por ejemplo, la muestra es sangre periferica, medula osea, muestra de tejido tal como nodulos linfaticos, adenoide, bazo, o fngado, u otro tipo de fluido corporal tal como fluido cerebroespinal, fluido vftreo, fluido sinovial, efusiones pleurales o ascitis. Preferentemente, el metodo comprende contactar una primera alfcuota de dicha muestra con una primera composicion reactiva de un conjunto de acuerdo con la invencion y contactar al menos una segunda alfcuota de dicha muestra con una composicion reactiva adicional de dicho conjunto; analizar los leucocitos en dichas alfcuotas en citometro de flujo; y almacenar y evaluar los datos obtenidos. Tfpicamente, la etapa (c) comprende el uso del software para la integracion de datos y el analisis multidimensional de los archivos de citometna de flujo. El software disponible comercialmente de CYTOGNOS SL (Salamanca, Espana) bajo el nombre comercial INFINICYT™ es muy adecuado para el uso en un procedimiento de la invencion. El software INFINICYT™ puede combinar automaticamente la informacion inmunofenotfpica de las poblaciones de celulas seleccionadas a partir de multiples tubos de acuerdo con los llamados calculos de vecinos mas cercanos en los que las celulas individuales a partir de una alfcuota de una muestra se comparan con las correspondientes celulas individuales a partir de otra alfcuota de la misma muestra, de acuerdo con sus marcadores del esqueleto y el perfil de dispersion. El procedimiento INFINICYT puede transformar los paneles EuroFlow de 8 colores presentados en la presente descripcion en inmunotinciones de 12, 16, o > 20 colores, dependiente del numero de tubos por panel y el numero de marcadores del esqueleto por tubo. Los paneles de anticuerpos y el software INFINICYT se puede usar en conjunto con todos los citometros de flujo actualmente disponibles que permiten inmunotinciones de 8 colores, tales como FACSCanto™ II, FACSAria, LSRII, DAKO CyAn™, Gallio, etc.
Leyenda de las figuras
Figura 1. Composicion de tres categonas de los paneles de anticuerpo
Figura 2. Diagrama de proceso diagnostico que muestran las aplicaciones potenciales de los paneles de anticuerpo EuroFlow.
Descripcion detallada
1. Introduccion
El presente estudio se realizo por el Consorcio EuroFlow (LSHB-CT-2006-018708) quien inicio el proyecto "citometna de flujo para el diagnostico rapido y sensible y el seguimiento de neoplasias malignas hematologicas", que incluye el diseno de protocolos de inmunofenotipado multicolor estandarizados para el diagnostico, clasificacion, y monitoreo de leucemias, linfomas y discrasias de celulas plasmaticas. Un componente innovador clave de estos protocolos son los paneles EuroFlow de combinaciones de anticuerpos (paneles EuroFlow). Esta invencion EuroFlow se refiere entre otros a los paneles de
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combinaciones de reactivos de anticuerpos (composiciones reactivas), que se pueden usar para definir las celulas normales, reactivas, regeneradoras y hematopoyeticas malignas de una manera estandarizada. Como tal, permiten un diagnostico inmunofenotfpico extenso, clasificacion, estadificacion y monitoreo de leucemias tanto cronicas como agudas, smdromes mielodisplasicos, trastornos mieloproliferativos, mastocitosis, hemoglobinuria paroxfstica nocturna, linfomas y discrasias de celulas plasmaticas. Por primera vez, los paneles propuestos no se basan en opiniones subjetivas de expertos, sino que se han probado de forma prospectiva y modificado para mejorar la respuesta a las indicaciones medicas mas frecuentes de inmunofenotipado por citometna de flujo. A su vez, estos paneles estan disenados de una manera innovadora para aplicarse en conjunto tanto con el enfoque de analisis de datos convencional y nuevos procedimientos de analisis de datos interactivos y semiautomaticos en los que la informacion sobre las celulas individuales se combina para todos los parametros derivados a partir de la medicion de la tincion de una muestra con el panel de anticuerpo.
Para establecer estos paneles, se realizaron las siguientes etapas secuenciales:
1. Evaluacion de todos los marcadores relevantes usados en el campo por su utilidad o valor anadido -Marcadores propuestos por las redes europeas, tales como ELN, EMN, ERIC;
-Marcadores propuestos por el Consenso Internacional de Bethesda de 2006 en Estados Unidos;
-Nuevos marcadores de neoplasias malignas de celulas B maduras como los propuestos por Rawstron y otros.
2. Diseno y seleccion de combinaciones de marcadores (>6), que pueden reconocer celulas normales vs. reactivas vs. regeneradoras vs. anormales/malignas dentro de un compartimento espedfico de celulas hematopoyeticas (linaje celular, via de diferenciacion, estadio de maduracion, y/o subconjunto funcional).
3. Evaluacion de los paneles de combinaciones de reactivos de anticuerpos propuestos en muestras primarias de sujetos sanos y pacientes.
4. Repeticion de las pruebas y optimizacion de las combinaciones de reactivos de anticuerpos (eleccion de marcador, eleccion de clones de anticuerpos, y eleccion del fluorocromo) basado en los objetivos no comprometido y margen de mejora.
5. Evaluacion de las versiones optimizadas de los paneles EuroFlow en gran serie de muestras de pacientes bien definidos y muestras de controles sanos.
En comparacion con los conocimientos previos, este es el primer diseno de un panel integral (despues de evaluado prospectivamente de forma multicentrica), que permite tanto la discriminacion entre celulas normales, reactivas, regeneradoras y clonales/neoplasicas y la clasificacion, estadificacion y monitoreo de los trastornos hematopoyeticos clonales/neoplasicos, que proporcionan una indicacion clara sobre: 1) los marcadores necesarios para tenirlos en comun para la identificacion adecuada y reproducible de todas las poblaciones de celulas de interes en todas las alfcuotas de una muestra, y 2) la forma en que deben combinarse con otros marcadores de caracterizacion adicionales en combinaciones espedficas de reactivos de anticuerpos conjugados con fluorocromo. Adicionalmente, la informacion sobre los objetivos de cada combinacion ademas se da como indicacion sobre cuando y como aplicarla. La invencion se hizo solo despues de la prueba del panel de anticuerpo extensa y varios ciclos de rediseno.
Los paneles EuroFlow de reactivos estan compuestos de subconjuntos de uno o multiples combinaciones (llamados tubos) de anticuerpos conjugados con ocho o mas compuestos fluorescentes, cada una de dichas combinaciones de reactivos tienen diferentes objetivos. Los paneles EuroFlow consisten en tres categonas diferentes: paneles de anticuerpos Categona 1 Categona 2 y Categona 3 (Figura 1).
2. Categonas de paneles de anticuerpo
Los paneles EuroFlow de combinaciones de anticuerpos persiguen los siguientes propositos:
Los paneles de anticuerpo de la Categona 1 estan dirigidos a la identificacion y caracterizacion de diferentes subconjuntos de celulas linfoides maduras, que incluyen celulas normales, reactivas, regeneradoras y neoplasicas B, T, NK y celulas plasmaticas, particularmente en muestras donde se sospeche un trastorno linfoide clonal y/o neoplasico debido a por ejemplo, linfocitosis, aumento de los nodulos linfaticos, esplenomegalia, componente monoclonal en suero, smtomas neurologicos inexplicables, etc. Los paneles de anticuerpo de la Categona 2 estan dirigidos a la identificacion y caracterizacion de celulas normales, reactivas, regeneradoras y linfoides T y/o B neoplasicas inmaduras (o maduracion temprana), particularmente en muestras que se sospecha que contienen precursores linfoides neoplasicos. Los paneles de anticuerpo de la Categona 3 estan dirigidos a la identificacion y caracterizacion de celulas normales, reactivas, regeneradoras e inmaduras neoplasicas, mieloides maduras y en maduracion, particularmente en muestras que se sospecha que contienen celulas mieloides neoplasicas o celulas neoplasicas que expresan marcadores de asociacion mieloide.
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Dentro de cada una de dichas tres categonas, algunas de las combinaciones de reactivos de anticuerpos estan dirigidas a usarse en una etapa de deteccion de un solo tubo con objetivos mas amplios, mientras que otros se aplican muy probablemente en etapas de clasificacion de multiples tubos cuando las poblaciones objetivo mas espedficas ya se han identificado en la etapa de deteccion.
2.1 Paneles de anticuerpo Categona 1
Los paneles de anticuerpo de la Categona 1 se componen de tres tubos de deteccion que estan dirigidos a la identificacion y caracterizacion inicial de los subconjuntos espedficos de celulas linfoides maduras presentes en muestras que contienen recuento de celulas normal o alto (por ejemplo, sangre periferica normal) y recuento de celulas bajo (por ejemplo, humor vttreo), respectivamente, y cuatro conjuntos diferentes de combinaciones de anticuerpos de multiples tubos dirigidos a una caracterizacion adicional de las celulas B-, T-, NK- y las celulas plasmaticas. Los tubos de deteccion de la Categona 1 se pueden usar para detectar la presencia de celulas clonales y neoplasicas T, B- o NK- y celulas plasmaticas en muestras con recuentos relativamente alto y bajo de celulas, respectivamente. Ejemplos tfpicos de muestras de recuentos de celulas bajos son las aspiradas con aguja fina (FNA), fluido cerebroespinal (CSF), y humor vftreo.
El tubo de deteccion mencionado anteriormente ahora se denomina tubo de deteccion de celulas plasmaticas (PCST). A su vez, los otros cuatro conjuntos de tubos se dedican, entre otros usos, a caracterizar adicionalmente las celulas clonales o neoplasicas B-, T-, NK- y las celulas plasmaticas en pacientes con diferentes trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas B-, T- y NKs (abreviados como BCLPD, TCLPD y NKCLPD, respectivamente) y discrasias de celulas plasmaticas (abreviado como PCD), respectivamente.
2.2 Tipos de marcadores usados en los paneles EuroFlow
En cada tubo de los paneles EuroFlow, dos tipos de reactivos de anticuerpos se combinan: 1) reactivos que se dirigen principalmente a la identificacion de las poblaciones celulares precisas de interes presentes en la muestra (marcadores del esqueleto), que ademas proporcionan informacion adicional sobre las caractensticas fenotfpicas de dichas poblaciones de celulas, y; 2) reactivos dedicados principalmente a la caracterizacion/clasificacion adicional de dichas poblaciones de celulas, asf como otros grupos de celulas en la muestra (marcadores de caracterizacion).
Tfpicamente, los marcadores del esqueleto se repitieron en cada tubo de los siguientes conjuntos de tubos: AML/MDS/MPD, BCP-ALL, T-ALL, B-CLPD, T-CLPD, NK-CLPD, PCD). Adicionalmente, los marcadores del esqueleto del conjunto de tubos B-CLPD ademas son comunes a los tubos de deteccion de LST y SST, los marcadores del esqueleto del conjunto de tubos PCD son comunes al PCST, y los marcadores del esqueleto del conjunto de tubos BCP-ALL y el T-ALL ademas son comunes al ALOT; finalmente, dos de los marcadores del esqueleto en el panel AML (es decir.: CD34 y CD45) ademas son comunes al tubo ALOT.
A su vez, los marcadores de caracterizacion se combinan de una manera integral en cada tubo, de modo que permitinan distinguir las celulas normales, reactivas, regeneradoras vs clonales/neoplasicas, aun cuando esten presentes en numeros bajos y en el caso de las celulas neoplasicas que permitinan un diagnostico adicional, subclasificacion, estadificacion y monitoreo de leucemias agudas y cronicas, linfomas y discrasias de celulas plasmaticas. Para este proposito en los paneles de multiples tubos, cada tubo esta dirigido a un objetivo espedfico relacionado a la completa caracterizacion y monitoreo de una entidad de enfermedad si se combina con la informacion del correspondiente tubo de deteccion (por ejemplo, para el diagnostico, la estadificacion y el monitoreo de CLL, el tubo #4 del panel de multiples tubos de B-CLPD en conjunto con el LST sera suficiente).
2.3 Herramientas del software INFINICYT para aplicacion optima de los paneles EuroFlow
Los paneles de anticuerpos de acuerdo con la invencion se pueden usar en conjunto con las herramientas del software INFINICYT que estan disponibles comercialmente. El software se basa en los procedimientos descritos recientemente para la generacion de archivos con un numero ilimitado de parametros a traves de la fusion de los archivos de datos y el calculo de la informacion derivada de la medicion de marcadores en una alfcuota de la muestra a las celulas individuales medidas en otras alfcuotas de la misma muestra, por medio del uso de diferentes combinaciones de reactivos de anticuerpos que solo tienen superposicion parcial (US 7,321,843), asf como para las comparaciones entre diferentes muestras o diferentes grupos de muestras (US 7,507,548).
3. Composicion de los paneles de anticuerpos de la Categona 1 para celulas linfoides maduras
En las combinaciones de multiples tubos de reactivos de anticuerpo de los paneles de anticuerpo Categona 1 para celulas linfoides maduras los marcadores del esqueleto comunes seleccionados vanan entre los cuatro paneles diferentes y consisten de (anticuerpo CD mas compuesto de fluorocromo numero): 1) CD20-1, CD45-2 y CD19-6 para B-CLPD; 2) CD4-1, CD45-2, CD3-5 y CD8-8 para T-CLPD; 3)
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CD45-2, CD3-5, CD56-6 y CD19-8 para NK-CLPD, y; 4) CD45-1, CD138-2, CD38-3 y CD19-6 para PCD. Adicionalmente, los marcadores del esqueleto usados en el tubo B-CLPD ademas se usan en los tubos de deteccion de LST y SST, y los marcadores del esqueleto de los tubos de PCD ademas se usan en la PCST.
Los marcadores del esqueleto en cada una de estas combinaciones de reactivos de anticuerpos de multiples tubos se dirigen a proporcionar la delimitacion de los grupos de celulas de interes y la identificacion espedfica de las celulas neoplasicas en el diagnostico y seguimiento de muestras que contienen suficientes cantidades de celulas tumorales. Adicionalmente, para cada una de las cuatro combinaciones de multiples tubos, los marcadores del esqueleto se combinan con un numero variable de marcadores de caracterizacion adicionales que contribuyen adicionalmente a la distincion entre celulas normales, reactivas, regeneradoras y neoplasicas/clonales B-, T, NK- y celulas plasmaticas, respectivamente, aun cuando estas estan presentes en una cantidad minima (por ejemplo, monitoreo de la enfermedad residual minima y estadificacion de la enfermedad), asf como para la distincion entre celulas clonales/neoplasicas de diferentes categonas de enfermedad.
3.1. El tubo de deteccion linfoide (LST), el tubo de muestra pequena (SST), y el tubo de deteccion de celulas plasmaticas (PCST)
La composicion reactiva de LST de EuroFlow se diseno y aprobo para la evaluacion de una serie de afecciones clmicas sospechosas, tales como linfocitosis, aumento de los nodulos linfaticos, esplenomegalia, componentes del suero monoclonales, smtomas neurologicos inexplicables, citopenias inexplicables, etc. (Figura 2). La composicion de un tubo LST ilustrativo se proporciona en la Tabla 1. Este tubo detecta poblaciones de linfocitos maduros aberrantes del linaje B, T y NK. Sin embargo, esta tubo de 8 colores no permite el diagnostico preciso y la clasificacion de las poblaciones de linfocitos aberrantes detectados. Este tfpicamente necesita la caracterizacion adicional con tubos B-CLPD, T-CLPD, NK-CLPD y/o PCD (vease Secciones 3.2, 3.3 y 3.4).
La composicion reactiva de SST de EuroFlow es una version modificada de LST de EuroFlow, especialmente disenada para la evaluacion de las pequenas muestras y muestras con (muy) bajos recuentos de celulas, tales como las aspiradas con aguja fina (FNA), fluido cerebroespinal (CSF), humor vftreo, etc. Para este objetivo especial, el tubo permite el reconocimiento inequvoco de los leucocitos normales presentes en estas muestras, por ejemplo, celulas B, T, NK y monocitos asf como cualquier poblacion celular aberrante coexistente. La composicion de un reactivo SST ilustrativo se proporciona en la Tabla 1.
La composicion reactiva PCST de EuroFlow esta especialmente disenada para la deteccion de celulas plasmaticas con el fin de detectar aberraciones o clonalidad. En el caso de las celulas plasmaticas aberrantes o clonales, la caracterizacion fenotfpica complementaria se logra a traves del panel de anticuerpo PCD de 2 tubos.
En cualquiera de las Tablas de la presente solicitud, el fluorocromo numero 1 corresponde a azul padfico (PacB) u Horizon V450, el numero 2 a naranja padfico (PacO) o AMCA, el numero 3 a isotiocianato de fluorescema (FITC) o Alexa488, el numero 4 a ficoeritrina (PE), el numero 5 a protema clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-Texas Red, el numero 6 a ficoeritrina/cianina7 (PE- Cy7), el numero 7 a aloficocianina (APC) o Alexa647, y el numero 8 a aloficocianina/H7 (APC-H7), APC- Cy, Alexa680 o Alexa700. Una combinacion preferida es azul padfico (PacB), naranja padfico (PacO), isotiocianato de fluorescema (FITC), ficoeritrina (PE), protema clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCP- Cy5.5), ficoeritrina/cianina7 (PE-Cy7), aloficocianina (APC), y aloficocianina/H7 (APC-H7).
TABLA 1. Combinaciones de deteccion de un solo tubo de EuroFlow para celulas linfoides maduras normales y malignas/aberrantes
Fluorocromo
1 2 3 4 5 6 7 8
Tubo#
1
(LST)
CD20BB y CD4 CD45BB IgA y CD8 CD LO ^ Q O CD5 CD19BB y TCRy5 CD3 CD38
2
(SST)
CD20BB CD45BB CD8 y IgA CD56 y CD4 CD19BB CD3 y CD38
Fluorocromo
1 2 3 4 5 6 7 8
Tubo#
igK CD14
3
(PCST)
CD45BB CD138BB CD38BB CD56 p2micro CD19BB CylgK CylgA
BB =Estos marcadores actuan como marcadores del esqueleto cuando los resultados de LST o SST se combinan con los resultados obtenidos con la combinacion de clasificacion de EuroFlow de multiples tubos para B-CLPD (vease la Tabla 2) o cuando los resultados de PCST se combinan con la combinacion de clasificacion de EuroFlow de 2 tubos para PCD (vease la Tabla 5); LST = tubo de deteccion linfoide; SST = tubo de muestra pequena; PCST= tubo de deteccion de celulas plasmaticas.
3.2. El panel de anticuerpo de multiples tubos para el trastorno linfoproliferativo cronico de las celulas Bs (B-CLPD)
El B-CLPD esta disenado para clasificar las neoplasias malignas de celulas B maduras de acuerdo con 5 las entidades de la OMS basado en los datos de citometna de flujo solamente (vease la Tabla 2). La informacion obtenida por medio del uso de LST de forma simultanea o secuencial se tiene que integrar en el panel B-CLPB (por ejemplo, a traves del software INFINICYT). El panel B-CLPD esta disenado para trabajar en los casos en los que la poblacion de celulas B malignas se puede purificar a > 90% por medio del uso de los marcadores del esqueleto CD20, CD19, y CD45, independientemente del material celular 10 analizado.
El panel esta disenado para trabajar de forma modular, es decir, no es necesario tenir todo el panel si la probabilidad de pre-prueba para una enfermedad maligna de celulas B en particular es alta. En esos casos el panel permitira diagnosticar una entidad en particular por medio del uso de un numero reducido de tubos. Por ejemplo, el tubo #1 de LST mas tubo # 5 son suficientes para diagnosticar CLL con un alto 15 valor predictivo positivo (PPV).
TABLA 2. Combinaciones de clasificacion de EuroFlow de multiples tubos para el trastorno linfoproliferativo cronico de las celulas Bs (B-CLPD)
Tubo#
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo
4
CD20BB y CD4 CD45BB 00 •< Q O CD LO ^ Q O CD5 CD19BB y TCRy5 CD3 CD38 LST: Deteccion de (casi) todas las neoplasias malignas de celulas B maduras
5
CD20BB CD45BB CD23 CD10 CD79b CD19BB CD200 CD43 identificacion, de todos los casos de CLL
6
CD20BB CD45BB CD31 LAIR1 CD11c CD19BB IgM CD81 identificacion de todos los casos de HCL; caracterizacion de celulas B-, T-, NK- benignas
7
CD20BB CD45BB CD103 CD95 CD22 CD19BB CXCR5 CD49d identificacion de DLBCL, FL, MZL, LPL
8
CD20BB CD45BB CD62L CD39 HLADR CD19BB CD27 CD31 identificacion de DLBCL, FL, MZL, LPL
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo
Tubo#
BB = Marcador del esqueleto; Tubo 4 es identico al LST (vease Tabla 1). Los tubos descritos pueden ademas aplicarse exitosamente para la estadificacion y monitoreo de la enfermedad.
3.3. El panel de anticuerpo de multiples tubos para los trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas T (T-CLPD)
El T-CLPD de EuroFlow esta dirigido al diagnostico y clasificacion de neoplasias malignas de celulas T 5 maduras. Ademas para este panel, la informacion obtenida con LST de forma simultanea y secuencial se integra preferentemente con los tubos de T-CLPD (por ejemplo, a traves de la armonizacion con el software INFINICYT). El panel esta disenado para trabajar en los casos en los que la poblacion de celulas T malignas se puede purificar a > 90% por medio del uso de los marcadores del esqueleto CD3, CD4, CD8, y CD45, independientemente del material celular analizado. La combinacion de tubos LST y T-CLPD 10 puede detectar neoplasias malignas de celulas T tanto de los linajes TCRap y TCRy§.
TABLA 3. Combinaciones de clasificacion de EuroFlow de multiples tubos para trastornos linfoproliferativos cronicos de las celulas T (T-CLPD)
Tubo #
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo
9
CD4BB CD45BB CD7 CD26 CD3BB CD2 CD28 CD8BB Caracterizacio n fenotfpica;
Identificacion del smdrome de Sezary
10
CD4BB CD45BB CD27 CCR7 CD3BB CD45RO CD45RA CD8BB Caracterizacio n fenotfpica;
Evaluacion de la etapa de maduracion
11
CD4BB CD45BB CD5 CD25 CD3BB HLADR cyTCL1 CD8BB Caracterizacio n fenotfpica;
Identificacion de T-PLL
12
CD4BB CD45BB CD57 CD30 CD3BB CD11c CD8BB Caracterizacio n fenotfpica;
Fenotipo citotoxico e identificacion del linfoma anaplasico
13
CD4BB CD45BB cyPerforin cyGranzyme CD3BB CD16 CD94 CD8BB Caracterizacio n fenotfpica;
Evaluacion de fenotipos citotoxicos
Tubo #
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo
asociados;
Identificacion de T-LGL
14
CD4BB CD45BB CD279 CD3BB CD8BB Identificacion de linfomas derivados de celulas T auxiliadoras foliculares (linfomas angloinmunobl asticos de celulas T)
BB = Marcador del esqueleto; los tubos pueden ademas aplicarse exitosamente para la estadificacion y monitoreo de la enfermedad.
3.4. El panel de anticuerpo de multiples tubos para los trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas NK (NK-CLPD)
El tubo NK-CLPD de EuroFlow esta dirigido a la distincion entre celulas NK aberrantes y 5 normales/reactivas. El panel NK-CLPD usa cuatro marcadores del esqueleto: CD45-2, CD3-5, CD56-6 y CD19-8. (NK-CLPD)
TABLA 4. Combinaciones de clasificacion de EuroFlow de multiples tubos para trastornos linfoproliferativos cronicos de celulas NK (NK-CLPD)
Tubo#
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo; MRD
15
CD2 CD45BB CD7 CD26 CD3BB CD56BB CD5 CD19BB Deteccion del fenotipo aberrante de celula NK
16
CD16 CD45BB CD57 CD25 CD3BB CD56BB CD11c CD19BB Deteccion del fenotipo aberrante de celula NK
17
HLADR CD45BB cyPerforin cyGranzyme CD3BB CD56BB CD94 CD19BB Deteccion del fenotipo aberrante de celula NK
Evaluacion de fenotipo efector citotoxico
BB = Marcador del esqueleto; los tubos pueden ademas aplicarse exitosamente para la estadificacion y monitoreo de la enfermedad.
10 3.5. El panel de anticuerpo de multiples tubos para discrasias de celulas plasmaticas (PCD)
El panel EuroFlow PCD comprende dos tubos con cuatro marcadores del esqueleto: CD45-1, CD138-2, CD38-3 y CD19-6 para PCD. (Tabla 5); tubo #18 es identico al PCST (tubo #3) en la Tabla 1. El panel PCD esta dirigido a la identificacion y enumeracion de celulas plasmaticas asf como a la distincion entre las celulas plasmaticas policlonales normales tales como en la plasmocitosis reactiva vs. celulas 15 plasmaticas monoclonales aberrantes tales como en gammapatias monoclonales de importancia incierta
5
10
15
20
25
30
(MGUS), mieloma multiple latente y sintomatico (MM), leucemias de celulas plasmaticas (PCL), amiloidosis y plasmocitoma extramedular, y el diagnostico diferencial entre estas discrasias de celulas plasmaticas. En combinacion con los paneles EuroFlow LST y B-CLPD, este panel de anticuerpos de multiples tubos contribuira ademas al diagnostico de otras discrasias de celulas plasmaticas tales como macroglobulinemia de Waldenstrom y linfoma linfoplasmadtico (LPL).
Tabla 5 Combinaciones de clasificacion EuroFlow de multiples tubos para discrasias de celulas plasmaticas (PCD)
Tubo#
1 2 3 4 5 6 7 8 Objetivo;
18
CD45BB CD138BB CD38BB CD56 p2micro CD19BB cylgK cylgA PCST: Deteccion de celulas plasmaticas aberrantes y clonales
19
CD45BB CD138BB CD38BB CD28 CD27 CD19BB CD117 CD81 Caracterizacion fenotfpica complementaria y evaluacion de marcadores con impacto potencial en el pronostico
BB = Marcador del esqueleto. Los tubos descritos ademas se pueden aplicar con exito para la estadificacion y el monitoreo de la enfermedad; Tubo #18 es identico al PCST (Tubo #3 en la Tabla 1).
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Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    Reivindicaciones
    1. Una composicion reactiva para inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos que comprende al menos ocho anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes que comprende un conjunto de al menos tres anticuerpos de identificacion para la identificacion de una poblacion de leucocitos de interes y al menos cuatro anticuerpos de caracterizacion para una caracterizacion adicional y/o la clasificacion de dicha poblacion de leucocitos, en donde los anticuerpos estan dirigidos contra la siguiente combinacion de marcadores:
    CD45, CD138, CD38, CD56, p2micro, CD19, CylgK y CylgA.
  2. 2. Un conjunto de al menos dos composiciones reactivas, dicho conjunto que comprende una composicion reactiva de acuerdo con la reivindicacion 1 y al menos una composicion reactiva adicional que comprende anticuerpos conjugados con fluorocromo diferentes dirigidos contra una de las siguientes combinaciones de marcadores:
    (i) CD20, CD45, CD23, CD10, CD79b, CD19, CD200 y CD43
    (ii) CD20, CD45, CD31, LAIR1, CD11c, CD19, IgM y CD81
    (iii) CD20, CD45, CD103, CD95, CD22, CD19, CXCR5 y CD49d
    (iv) CD20, CD45, CD62L, CD39, HLADR, CD19, CD27 y CD31
    (v) CD4, CD45, CD7, CD26, CD3, CD2, CD28 y CD8
    (vi) CD4, CD45, CD27, CCR7, CD3, CD45RO, CD45RA y CD8
    (vii) CD4, CD45, CD5, CD25, CD3, HLADR, cyTCLI y CD8
    (viii) CD4, CD45, CD57, CD30, CD3, CD11c y CD8
    (ix) CD4, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD16, CD94 y CD8
    (x) CD4, CD45, CD279, CD3 y CD8
    (xi) CD2, CD45, CD7, CD26, CD3, CD56, CD5 y CD19
    (xii) CD16, CD45, CD57, CD25, CD3, CD56, CD11c y CD19
    (xiii) HLADR, CD45, cyPerforin, cyGranzyme, CD3, CD56, CD94 y CD19; o
    (xiv) CD45, CD138, CD38, CD28, CD27, CD19, CD117 y CD81.
  3. 3. Composicion reactiva o conjunto de composiciones reactivas de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde cada composicion reactiva comprende anticuerpos conjugados con azul padfico (PacB) u Horizon V450, naranja padfico (PacO) o AMCA, isotiocianato de fluorescema (FITC) o Alexa488, ficoeritrina (PE), protema clorofila peridinina/cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5), PerCP o PE-TexasRed, ficoeritrina/cianina7 (PE- Cy7), aloficocianina (APC) o Alexa647, y aloficocianina/H7 (APC-H7), APC-Cy7, Alexa680 o Alexa700.
  4. 4. Conjunto de composiciones reactivas de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende al menos una composicion reactiva como se describe en el Tubo#3 de la Tabla 1 junto con al menos una composicion reactiva como se describe en cualquiera de las Tablas 2 -5.
  5. 5. Un kit diagnostico para el inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos que comprenden un conjunto de al menos dos composiciones reactivas de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, opcionalmente junto con instrucciones para usar, tampon, y/o muestras de control.
  6. 6. Kit diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 5 para la identificacion y caracterizacion de celulas linfoides maduras, que comprende un conjunto de composiciones reactivas mencionadas en la reivindicacion 2 en el inciso (i) a (v); (vi) a (x) ; (xi) a (xiii); y/o (xiv).
  7. 7. Un metodo para el inmunofenotipado por citometna de flujo de leucocitos, que comprende las etapas de
    (a) proporcionar una muestra biologica que comprende leucocitos;
    (b) contactar una primera alfcuota de dicha muestra con una primera composicion reactiva de un conjunto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y contactar al menos una segunda alfcuota de dicha muestra con una composicion reactiva adicional de dicho conjunto;
    (c) analizar los leucocitos en dichas alfcuotas en un citometro de flujo; y
    (d) almacenar y evaluar los datos obtenidos.
  8. 8. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde dicha muestra es sangre periferica, medula osea, muestra de tejido tal como, nodulos linfaticos, adenoide, bazo, o hngado, u otro tipo de fluido corporal tal como fluido cerebroespinal, fluido vftreo, fluido sinovial, efusiones pleurales o ascitis.
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