ES2627007B2

ES2627007B2 - Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microorganismos utilizando disoluciones de glicerol

Info

Publication number: ES2627007B2
Application number: ES201600100A
Authority: ES
Inventors: Tania MAZZUCA SOBCZUK; María José IBÁÑEZ GONZÁLEZ; Emilio Molina Grima; Ana HUERTAS SÁNCHEZ; Marcia MAZZUCA
Original assignee: Universidad de Almeria
Current assignee: Universidad de Almeria
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2018-02-15
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: ES2627007A1

Abstract

Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microorganismos utilizando disoluciones de glicerol. El objeto consiste en obtener extractos de ficobiliproteínas a partir de cultivos de microorganismos (como microalgas o cianobacterias) utilizando un solvente ecológico e inocuo para la salud humana con mayores rendimientos de extracción, menor número de etapas y menores requerimientos energéticos que los actualmente utilizados ya que funciona incluso con biomasa húmeda.#Se sumerge la biomasa en una disolución de glicerol a temperatura ambiente o temperatura controlada durante al menos 4 horas, se centrifuga y se obtiene el extracto rico en ficobiliproteínas directamente o bien mediante la adición, previo a la centrifugación, de un pequeño volumen de disolución buffer adecuada (como el buffer de disolución de ácido acético acetato de sodio pH 5.5 250 mM).

Description

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DESCRIPCIÓN

MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE BILIPROTEÍNAS EN CULTIVOS DE MICROORGANISMOS UTILIZANDO DISOLUCIONES DE GLICEROL.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención, se encuadra en el sector de la obtención de extractos de ficobiliproteínas a partir de biomasa de microorganismos como las microalgas o cianobacterias que son los más utilizados actualmente. Las ficobiliproteínas tienen aplicaciones en la industria química, cosmética, farmacológica y alimentaria.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Existen diversos procesos para extraer biliproteínas a partir de microalgas y cianobacterias cuya utilización depende principalmente de la especie de microalga que sirva como materia prima así como del posterior método de purificación a emplear. La etapa inicial suele consistir en la ruptura de la pared celular de la microalga en cuestión y se suele partir de biomasa seca y liofilizada. Los tratamientos mecánicos de ruptura celular (congelación-descongelación, ultrasonidos, etc...) pueden a veces reemplazarse por métodos enzimáticos o químicos (utilizando enzimas como por ejemplo la lisozima, o tritón X-100). El principio fundamental de los métodos de extracción es el choque osmótico y la fuerza iónica, para lo cual se han utilizado extracciones utilizando tampón de acetatos, tampón de fosfatos e incluso acetona (Gombos, Csizmadia et al. 1984, Saxena 1988, Duerring, Schmidt et al. 1991, Tchernov, Minkova et a!. 1999, Campanella, Crescentini et al. 2000, Bermejo, Acién et al. 2003, Ruiz 2012).

Dependiendo de la técnica de purificación que se vaya a emplear en la etapa posterior un método resulta más atractivo que otro. Por ejemplo, para la purificación mediante adsorción en lecho expandido, método que reduce el número de etapas necesarias con respecto a otros métodos convencionales, es necesario ajustar el pH a 5,5, de modo que a priori parecería interesante realizar la extracción a este pH para evitar tener que diluir el extracto. Sin embargo, aplicando la técnica que se propone en esta invención, la obtención de extractos proteicos mucho más concentrados y con un mayor rendimiento permitiría trabajar con menores cantidades de cultivo en las etapas

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previas, y esto redundaría también en los costes económicos de obtención del bioproducto.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Método de extracción de biliproteínas en cultivos de microrganismos utilizando disoluciones de glicerol. El objeto consiste en obtener extractos de ficobiliproteínas a partir de cultivos de microorganismos (como microalgas o cianobacterias) utilizando un solvente ecológico e inocuo para la salud humana con mayores rendimientos de extracción, menor número de etapas y menores requerimientos energéticos que los actualmente utilizados ya que funciona bien con biomasa seca e incluso con biomasa húmeda.

Se sumerge la biomasa en una disolución de glicerol a temperatura ambiente o temperatura controlada durante al menos 4 horas, se centrifuga y se obtiene el extracto rico en ficobiliproteínas directamente o bien mediante la adición, previo a la centrifugación, de un pequeño volumen de disolución buffer adecuada (como el buffer de ácido acético-acetato de sodio pH 5.5 250 mM).

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Modo de realización preferente 1.

Se depositan 5±2 g de biomasa húmeda de la microalga Porphyridium cruentum en un tubo Falcon de 50 mi, añadiéndosele con 20±5 mi de Glicerol (98% pureza) . Se realizan dos extracciones similares mediante el procedimiento siguiente: la mezcla homogenizada obtenida se deja en agitación continua durante 24 horas a 4°C. Después de esto, la mezcla se centrifuga. Del sobrenadante centrifugado se extrae 1 mi para la determinación de p-ficoeritrina midiendo mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 280nm, 545nm, 565nm, 620nm y 650nm cada extracto. La concentración de p-ficoeritrina (B-PE), en mgmL-1) se calcula utilizando la siguiente ecuación:

(°D- ~2-^H^CD

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Donde OD¡ indica densidad óptica del cultivo medida a la longitud de onda i en el espectrofotómetro y R_PC y APC se calculan utilizando las siguientes ecuaciones:

APc[mgrri~']=^2Rl

650 nm

-0.190P620)

5.65

R - Pc[mg-mr'} = °°™nm OJOD™)

7.38

El porcentaje de B-ficoeritrina extraída sobre la biomasa seca se calcula como:

%BPEen ¡a biomasa =

^BPE extraída

m

biomasa húmeda

■0-*)

10 Siendo x los gramos de agua por gramo de biomasa húmeda y siendo mBPE la masa de B- ficoeritrina extraída a partir de la biomasa.

La pureza de B ficoeritrina en el extracto obtenido se puede estimar utilizando el cociente de las densidades ópticas del extracto medidas a 545nm y 280nm, siendo mayor la pureza cuanto mayor sea ese cociente.

15 Para observar la ventaja de utilizar glicerol como solvente extractor estos resultados se han comparado con los de una extracción que sigue los mismos pasos pero utiliza tampón de acetatos de pH 5,5 concentración 250 mM, partiendo de la misma cantidad de biomasa.

20 Los resultados son los que se indican en la tabla 1.

: Solvente BFE (mg) % BFE Extraído con respecto a la biomasa seca A545/A280

: Tampón Acetato pH 5'5 250 mM 4,93±0,42 1,39% 2,00±0,32

: Glicerol 27,67±4,9 5,42% 1,40±0,34

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Tabla 1. Extracción de B-ficoeritrina mediante el ampliamente utilizado buffer de acetatos 250 mM (pH 5.5) y extracción utilizando glicerol tal como se propone en la presente patente de invención. Datos obtenidos a partir de la extracción con biomasa húmeda de Porphyridium cruentum.

La utilización de glicerol al 98% de pureza para obtener extractos proteicos de B- ficoeritrina muestra una clara ventaja frente al uso del buffer de acetatos pH 5,5 250 mM tal como se aprecia en la tabla 1. A modo de ejemplo, cuando inicialmente se pesaron 5+0.1 g de biomasa húmeda centrifugada de la microalga, con un 93,5% de humedad, los 27,67±4,9 mg de ¡B-ficoeritrina extraída suponen un 5,42% sobre masa seca. Este porcentaje es muy superior al obtenido cuando se utiliza el ampliamente referenciado tampón de acetatos pH 5'5 (250mM), donde la cantidad de (B-ficoeritrina extraída es de 4,93±0,42 mg que representan un 1,39% sobre la masa de biomasa seca.

Modo de realización preferente 2.

Se depositan1±0.2 g de biomasa húmeda de cianobacteria en un tubo Falcon de 50 mi, añadiéndosele con 10±1 mi de Glicerol (98% pureza). Se realizan dos extracciones similares mediante el procedimiento siguiente: la mezcla homogenizada obtenida se deja en agitación continua durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de esto, se añaden 5 mi de tampón de acetatos 250 mM pH 5,5 y la mezcla se centrifuga inmediatamente. Del sobrenadante centrifugado se extrae 1 mi para la determinación de C-ficocianina midiendo mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 280nm, 615nm, 620 nn, 650 nm y 652 nm. La concentración de C-ficocianina (B-PC), en mg-mL-1) se calcula utilizando la siguiente ecuación:

El porcentaje de C ficocianina extraído sobre la biomasa seca se calcula como:

imagen1

5.34

%CPCen la biomasa =

mCPC extraída

ffj

biomasa húmeda

(1-x)

Siendo mCPC la masa de C ficocianina extraída a partir de la biomasa.

La pureza de C ficocianina en el extracto obtenido se puede estimar utilizando el cociente de las densidades ópticas del extracto medidas a 620nm y 280nm, siendo mayor la pureza cuanto mayor sea ese cociente.

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Para observar la ventaja de utilizar glicerol como solvente extractor estos resultados se han comparado con los de una extracción que sigue los mismos pasos pero utiliza tampón de acetatos de pH 5,5 concentración 250 mM, partiendo de la misma cantidad de biomasa.

10 Los resultados son los que se indican en la tabla 2:

: Solvente CPC (mg) % CPC Extraído con respecto a la biomasa seca A62o/A280

: Tampón Acetato pH 5'5 250 mM 0,15±0,02 1% 6

: Glicerol 4,95±0,5 33% 21

La utilización de glicerol al 98% de pureza para obtener extractos proteicos de C- ficocianina muestra una clara ventaja frente al uso del buffer de acetatos pH 5,5 250 mM tal se aprecia en la tabla 2. A modo de ejemplo, cuando inicialmente se pesaron

15 1,4±0.2 g de biomasa húmeda centrifugada de la microalga, con un 90,0% de

humedad, los 4,95±4,9 mg de C-ficocianina extraída suponen un 33% sobre masa seca. Este porcentaje es muy superior al obtenido cuando se utiliza el ampliamente referenciado tampón de acetatos pH 5'5 (250mM), donde la cantidad de C ficocianina extraída es de 0,15 mg que representan apenas el 1 % del peso de la biomasa seca.

20 La pureza del extracto de C ficocianina obtenido con glicerol es también mayor que la pureza del extracto obtenido con disolución de acetatos.

Claims

ES 2 627 007 A1

REIVINDICACIONES

1. Proceso de extracción de ficobiliproteínas a partir de biomasa de 5 microrganismos como son las microalgas o cianobacterias que consiste en poner en

contacto la biomasa con una disolución de glicerol que inicia el proceso de extracción.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque las células a extraer pueden o no haber sufrido procesos de rotura celular previos a la extracción

10 con glicerol.
3. Procedimiento, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células a extraer pueden o no haber sufrido un proceso de secado previo a la extracción con glicerol.

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4. Procedimiento, según la reivindicación 1 en el cual a continuación o bien se separa la disolución de glicerol conteniendo las ficobiliproteínas (extracto de biliproteínas) o bien se adiciona a dicha mezcla una disolución capaz de disolver las ficobiliproteínas para proceder a separarlas de la biomasa, como puede ser por

20 ejemplo el buffer de acetatos pH 5,5 250 mM.