ES2623765T3 - Uso de lipo-quitooligosacáridos para aumentar la fotosíntesis en plantas y procedimientos y composiciones correspondientes - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende uno o más lipo-quitooligosacáridos para potenciar la tasa fotosintética de una planta.

Description

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Durante el curso del trabajo sobre la capacidad de los LCO para estimular la germinación de semillas de las plantas, se observó que plántulas que quedaban expuestas a una composición que comprende LCO, después de la germinación, seguían creciendo más rápido. Por tanto, se estudió anteriormente la posibilidad de que una aplicación de LCO a las hojas de las plántulas aumentara sus tasas fotosintéticas, conduciendo a tasas más rápidas de crecimiento. De ese modo, se demostró que los LCO aumentan las tasas fotosintéticas y/o el rendimiento de plantas en general, como se ejemplifica tanto en condiciones de invernadero como en condiciones de campo con varias plantas evolutivamente divergentes.

El oligosacárido de lipoquitina (LCO) nod Bj V (C18:1, MeFeu) aislado de Bradyrhizobium japonicum 532C se evaluó para su efecto sobre las tasas fotosintéticas de varias plantas de cultivo que pertenecen a diversas familias botánicas: soja (Fabaceae), maíz, arroz (Poaceae), melón (Cucurbitaceae), colza (Brassicaceae), manzana (Rosaceae) y uva (Vitaceae). El LCO potenció la fotosíntesis de todas las plantas ensayadas. Sin embargo, el grado de las respuestas dependía de la especie de la planta y de la concentración de LCO usada. En condiciones de invernadero, la soja (Fabaceae) mostró el mayor aumento en la fotosíntesis debido a pulverización con LCO; de promedio, hubo un aumento del 50 % en la tasa fotosintética. Como la aplicación de LCO provocaba la abertura aumentada de los estomas sin ningún aumento en la concentración interna de CO2 en las hojas, los datos indican que había un aumento en la captación de CO2 por los cloroplastos, que conduce a abertura aumentada de los estomas. Las plantas pulverizadas con LCO tenían más área foliar y peso seco que los controles pulverizados con agua. En condiciones de campo, se ensayó la pulverización con LCO en plantas de soja, maíz, manzana y uva. En el caso de soja, la pulverización aplicada en la fase de plántula, floración y llenado de las vainas, produjo una cantidad aumentada de ramas, área foliar, cantidad de vainas, materia seca de la planta y producción de grano. La aplicación de LCO potenció la producción de grano en un 33-44 %. Los datos ilustran que los LCO pueden usarse para aumentar la productividad de un amplio intervalo de cultivos.

La presente invención se ilustra en detalle adicional por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Producción, extracción y purificación de lipo-quitooligosacáridos (LCO)

Cultivo bacteriano

Se cultivó Bradyrhizobium japonicum (cepa 532C) a 28 ºC en medio de manitol de levadura (YEM) (manitol 10 g, K2HPO4 0,5 g, MgSO4 7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, extracto de levadura 0,4 g y agua destilada 1000 ml), pH 6,8, se agitó a 150 rpm hasta que se alcanzó DO620 0,4-0,6 (4-6 días) en la oscuridad. Después de ello, se iniciaron 2 l de subcultivo bacteriano inoculando el material del primer cultivo (5 ml del primer cultivo por 250 ml de medio YEM), durante 5-7 días (DO620 -0,8-1,0), como anteriormente. En esta fase, se añadieron 0,25 ml de genisteína 50 µM (en metanol) a cada 250 ml de subcultivo bacteriano (concentración de genisteína de 5 µM) y el cultivo se incubó durante 48-96 horas.

Extracción de LCO

Dos litros de subcultivo bacteriano se repartieron en fases frente a 0,8 l de 1-butanol de calidad HPLC agitando durante una noche. La capa superior de butanol se transfirió a un matraz de evaporación de 1 l y se concentró hasta 2-3 ml de material viscoso marrón claro con un rotavapor funcionando a 80 ºC (Yamota RE500, Yamato, EE. UU.). Este extracto se resuspendió en 4 ml de acetonitrilo al 18 % y se mantuvo en la oscuridad a 4 ºC en un vial de vidrio sellado hasta su uso. El análisis por HPLC (Waters, MA, EE. UU.) se realizó con una columna en fase inversa Vydac C18 (Vydac, CA, EE. UU.; catálogo n.º 218TP54) con un caudal de 1,0 ml min-1 y una columna de protección Vydac (catálogo n.º 218GK54). Como medida inicial se procesó acetonitrilo al 18 % (AcN/ H2O; p/p) a través del sistema durante al menos 10 min. antes de la inyección. La muestra se cargó y se realizó elución isocrática con AcN al 18 % durante 45 min. para retirar todas las fracciones ligeras no polares. Después de ello, se realizó elución en gradiente durante 90 min. con AcN al 18-82 %. El LCO se eluyó a los 94-96 min. de tiempo de procesamiento por HPLC.

La identidad química del LCO se confirmó por análisis en espectrómetro de masas (EM-EM) como Nod Bj V (C18:1 MeFeu) (R. Carlson, Complex Carbohydrate Research Centre, University of Georgia, Athens, EE. UU.) y por ensayo de deformación de los pelos de la raíz (Prithiviraj y col., 2000).

Material vegetal

En resumen, se esterilizaron de forma superficial semillas de soja (cv AC Bravor) con hipoclorito sódico al 2 % durante 2 min. y se lavaron con al menos cuatro cambios de agua destilada estéril. Las semillas después se colocaron en agar con agua al 1,5 % (20 ml) en placas Petri de 9 cm de diámetro (dos semillas por placa). Las placas Petri se incubaron en la oscuridad a 25 ºC durante 7-8 días; durante este tiempo, las semillas germinaron y desarrollaron raíces primarias y laterales en la superficie de agar. Las raíces laterales con abundantes pelos absorbentes, que podían distinguirse fácilmente por el aspecto esponjoso que conferían a las raíces laterales, se escindieron con un escalpelo estéril. Estas raíces laterales se colocaron en portaobjetos de vidrio sin engrasar estériles que contenían 40-60 µl de solución de LCO. Los portaobjetos después se colocaron en una cámara húmeda y se incubaron durante 24 h a 25 ºC en la oscuridad. Al final del tiempo de incubación, los portaobjetos se

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retiraron y se fijaron las raíces en una solución de tinción [azul de metileno (0,02 % p/v) + glicerol (20 % v/v) + fenol (10 % p/v)]. Los portaobjetos se observaron en un microscopio óptico para la deformación de los pelos de la raíz.

Ejemplo 2

Tratamiento con LCO y recogida de datos para los experimentos en invernadero

Tratamiento de las plantas

Se esterilizaron superficialmente semillas de soja (cv Bayfield) con hipoclorito sódico al 2 % durante 3-4 min., se lavaron con varios cambios de agua destilada estéril y germinaron en placas de plástico que contenían vermiculita estéril. Las plántulas en la fase de dos hojas, aproximadamente siete días después de plantarlas, se trasplantaron a macetas de plástico de 15 cm que contenían Promix (Premier Brands Inc., New Rochelle, NY, EE. UU.). Las macetas se colocaron en un invernadero mantenido a 25±2 ºC con un ciclo de día/noche de 16/8 horas. Las plantas se regaron según lo necesario.

Se esterilizaron superficialmente semillas de arroz (Oryza sativa cv Cypress), colza (Brassica napus cv Springfield), maíz (Zea mays cv Pioneer 3921) y melón (Cucumis melo cv Nova) con hipoclorito sódico al 2 % durante 3-4 min, se lavaron con varios cambios de agua destilada estéril y se plantaron en macetas de plástico (15 cm de diámetro) que contenían Promix (Premier Brands Inc., New Rochelle, NY, EE. UU.).

Tratamiento con LCO

Se prepararon concentraciones de LCO (10-6 M -10-12 M) con agua destilada que contenía Tween 20 al 0,02 %. También se aplicó un tratamiento de control, que contenía Tween 20 al 0,02 %, pero no LCO. Como las tasas de crecimiento y de desarrollo diferían entre las especies de plantas usadas en los experimentos, se realizó tratamiento por pulverización en diferentes momentos después de la siembra. En general, la pulverización se aplicó cuando las plantas eran suficientemente grandes para permitir mediciones fáciles de las tasas fotosintéticas foliares. A continuación, se dan las edades de las plantas cuando se realizaron las pulverizaciones: soja 21 días después de la siembra (DAP), maíz 25 DAP, arroz 45 DAP, melón (35 DAP) y colza 30 DAP. Las plantas se pulverizaron con soluciones de LCO hasta empaparlas. Las pulverizaciones se aplicaron con un atomizador (Nalgene, EE. UU.). Cada planta requirió 2-3 ml de solución de pulverización. Cada tratamiento se replicó al menos cinco veces y se organizó en una bancada del invernadero en un diseño de bloque completamente aleatorio. Cada experimento (con cada especie de cultivo) se repitió al menos dos veces.

Recogida de datos

La fotosíntesis se registró cada 24 h usando un sistema de fotosíntesis portátil Li-Cor 6400 (Li-Cor Inc., Lincoln, Nebraska, EE. UU.) durante 6 días. En el caso de la soja, la fotosíntesis en la segunda hoja nodal de la parte superior se registró mientras en las otras especies usadas en la tasa fotosintética se midió para la hoja totalmente expandida más superior. Las plantas de soja se recogieron después de 7 días de tratamiento con LCO y se secaron a 80 ºC durante 48 h. Los datos se analizaron con el sistema de análisis estadístico (SAS Inc., NC, EE. UU.). Se calculó el porcentaje de aumento en la fotosíntesis sobre el control. Se realizaron múltiples comparaciones de las medias con un ensayo LSD protegido por ANOVA, por tanto, el ensayo LSD no se realizó si el ensayo ANOVA no indicaba la presencia de diferencias debido al tratamiento.

Ejemplo 3

Experimentos de campo (año 1999)

Soja

El experimento con soja se realizó en el Lods Agronomy Research Centre, McGill University, Macdonald Campus, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec, Canadá durante el periodo de junio a septiembre, 1999. Se siguió un diseño de bloques completamente aleatorio con tres bloques. El tamaño de maceta era de 2 x 4 m con un espaciado de una fila a otra de 25 cm y 10 cm entre las plantas dentro de una fila. Las semillas de soja (cv OAC Bayfield), tratadas con inoculante de Bradyrhizobium japonicum comercial (Bios Agriculture Inc., Quebec, Canadá) a la tasa de 3 g por kilogramo de semilla, se plantaron a mano.

A los 25 días después de la siembra, se marcaron de forma aleatoria veinte plantas en cada maceta y se pulverizaron hasta empaparlas con soluciones de LCO (10-6, 10-8 y 10-10 M) que contenían Tween 20 al 0,02 % con un pulverizador manual. Las plantas en cada lado, dentro de la fila, de las plantas marcadas también se pulverizaron. Se realizó una segunda pulverización en la fase de floración y una tercera pulverización en el llenado de las vainas.

Manzana, uva y maíz

Estos experimentos se realizaron en la instalación de investigación hortícola de McGill University, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec, Canadá durante julio de 2000. Se prepararon LCO de diferentes concentraciones (10-8 y 10-10 M)

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eficaz de LCO diferían entre las especies. En general, era común un aumento del 10-20 % en la fotosíntesis. Para las plantas C3 (arroz, melón, colza) las tasas fotosintéticas aumentadas estaban siempre acompañadas por un aumento concomitante en la conductancia estomática y la transpiración mientras que la concentración de CO2 intercelular no se veía afectada por los tratamientos. Para el maíz (una planta C4) la aplicación de LCO aumentaba la tasa fotosintética, disminuía la concentración de CO2 interno foliar y no alteraba significativamente la abertura de los estomas. Estos datos respaldan que el aumento en la tasa fotosintética se debía a un aumento en la captación fotosintética de CO2 dentro de las hojas que, en el caso de plantas C3, desencadenaba un aumento en la abertura de los estomas. Si hubiera sido el caso de que la abertura aumentada de los estomas fuera la causa principal de las tasas fotosintéticas aumentadas se habría esperado aumentos en la concentración de CO2 interno de las hojas (Morison, 1998).

Ejemplo 5

Efecto de los LCO sobre la tasa fotosintética, el crecimiento y el rendimiento de soja y de plantas no leguminosas cultivadas en condiciones de campo (año 1999)

Uva; manzana y maíz

La pulverización con LCO también causó aumentos en las tasas fotosintéticas de manzana y uva cultivadas en campo (Fig. 8 y 9). En el caso de la manzana, el aumento de la fotosíntesis conseguía su máximo a los cinco días después del tratamiento; el tratamiento con LCO 10-8 M producía una tasa fotosintética de 14,1 µmol CO2 m-2s-1, mientras que la tasa era de 10,8 µmol CO2 m-2 s-1 para el control. Como con los otros cultivos, hubo aumentos en la conductancia estomática son ningún efecto sobre el Ci. El tratamiento con LCO también aumentó la transpiración (Fig. 6) En uvas, el aumento máximo en la tasa fotosintética se producía tres días después del tratamiento con el tratamiento con LCO 10-9 M, y esto producía un aumento concomitante en la conductancia estomática. La aplicación de LCO aumentaba la tasa fotosintética de maíz cultivado en campo en un máximo de aproximadamente el 10 % (Fig. 10) a los dos días después de la aplicación del tratamiento. Aunque la aplicación de LCO causaba niveles reducidos de Ci en invernadero (p = 0,05) no hubo dicho efecto en Ci en plantas cultivadas en campo.

Soja

En general, las respuestas fotosintéticas de la soja en el campo fueron similares a las observadas en condiciones de invernadero. El tratamiento con LCO produjo aumentos en las tasas fotosintéticas desde el día uno hasta el día cuatro después de la aplicación. La concentración más eficaz fue 10-6 M, que produjo una tasa fotosintética de 24 mmol m-2 seg-1 en el día tres en comparación con 20 mmol m-2 seg-1 para el control (Fig. 10). El aumento en la tasa fotosintética estuvo acompañado por aumentos en la conductancia estomática; de nuevo el tratamiento de LCO 106 M producía los mayores valores de conductancia estomática. Sin embargo, el efecto del LCO en las plantas cultivadas en campo era menos pronunciado que para las plantas cultivadas en invernadero y requería una mayor concentración para efectos mejores. La necesidad de concentraciones mayores puede deberse a diferencias anatómicas de las hojas; las plantas cultivadas en campo habitualmente tienen cutículas más gruesas que las plantas cultivadas en invernadero. También puede haber sido el caso de que los microorganismos epífitos, o las propias hojas, puedan haber producido quitinasas que degradaban el LCO. Dada la probabilidad de niveles inferiores de actividad microbiana en condiciones de invernadero, ambas podían haber contribuido a la necesidad de concentraciones de LCO en el campo mayores que en el invernadero. El menor grado de respuesta en condiciones de campo puede haberse debido a la mayor variabilidad ambiental, una probabilidad aumentada de al menos alguna otra limitación estresante, al menos en algún momento, en las condiciones de campo. Raschke y col., (1979) observaron diferencias en la sensibilidad de los estomas al nivel de CO2 entre maíz cultivado en invernadero y en campo. Asimismo, Talbott y col. (1996) mostraron diferencias en la sensibilidad de los estomas a CO2 entre plantas cultivadas en vitrina y en invernadero. El tratamiento con LCO produjo una transpiración aumentada, probablemente debido a una abertura aumentada de los estomas.

La pulverización con LCO produjo un crecimiento aumentado de las plantas de soja. Hubo aumentos en las siguientes variables de crecimiento: cantidad de ramas, cantidad de hojas y área foliar. Sin embargo, la altura de la planta no se vio afectada por el tratamiento con LCO. También hay aumentos en las variables de rendimiento, cantidad de racimos de vainas por planta, cantidad de vainas y cantidad total de semillas por planta. Lo último produjo aumentos en la producción de semillas que variaban del 33,7 al 44,8 % (Tabla 2).

Tabla 2. Efecto del oligosacárido de lipo-quitina (Nod Bj V (C18:1, MeFeu)) sobre el área foliar y el peso seco de los brotes de soja en condiciones de invernadero

Tratamiento

Área foliar (cm2) Peso seco de los brotes (mg)

Control

188,0 ab@ 951,6 b

10-6

223,6 a 1065,8 ab

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193,6 ab 1135,2 a

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217,6 ab 1095,7 ab

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194,3 ab 999,9 ab

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195,3 b 1012,3 ab

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202,6 ab 931,6 b

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230,3 a 1060,8 ab

LSD (p<0,05)

36,2 168,3

@ las medias, dentro de la misma columna, seguidas por la misma letra son no significativamente diferentes (p < 0,05) por ensayo LSD protegido por ANOVA

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Los rendimientos se calcularon muestreando 10 plantas seleccionadas aleatoriamente por maceta, determinando el rendimiento por planta y asumiendo una masa promedio de 500.000 plantas por ha.

Tomados en conjunto, los resultados de las Tablas 4 y 5 muestran que los efectos promotores de la tasa fotosintética observados con el LCO NodBj-V(C18.1, MeFeu) de B. japonicum durante los experimentos del año 1999 también son observables con los LCO obtenidos de otros rizobios. Por tanto, la adición de la cepa de rizobio promiscua NGR234, que se sabe que promueve la nodulación de una amplia gama de legumbres u otras, también se espera que potencie la tasa fotosintética de plantas de forma similar a los datos presentados en el presente documento.

Los datos sobre el efecto de la pulverización foliar de LCO sobre el rendimiento de soja durante el año 2000 también muestran un efecto de aumento del rendimiento, similar al mostrado en el año 1999. Más específicamente, en el año 2000, la aplicación de LCO potenció las vainas por planta y la producción de semillas. Los datos sugieren que (1) el LCO a 10-6 M mostraba el efecto máximo; (2) el LCO a 10-6 M mejoraba el rendimiento en más del 100 %; y (3) el aumento en el rendimiento se debía al aumento en la cantidad de vainas por planta.

Cabe señalar que las temporadas de cultivo del año 1999 y 2000 fueron muy diferentes. En comparación con una temporada de cultivo promedio, 1999 fue un año caluroso y seco mientras que el 2000 fue un año frío y húmedo.

Tomados junto con los resultados del año 1999 de los efectos de la aplicación de LCO sobre la tasa fotosintética y sobre el rendimiento, los del año 2000 muestran que el efecto de LCO sobre los mismos es robusto sobre una amplia gama de condiciones ambientales.

También debe observarse que la aplicación de LCO en los experimentos de campo en el año 2000 fue pulverizando parcelas completas, en oposición a plantas individuales (1999). Por tanto, los efectos del LCO descritos en la presente divulgación también son observables cuando se usan procedimientos de aplicación de gran producción.

Conclusión

La presente divulgación demuestra que la composición de LCO puede potenciar significativamente la tasa fotosintética de plantas leguminosas y no leguminosas cultivadas en condiciones de laboratorio (por ejemplo, condiciones de invernadero). Además, estos resultados de condiciones de invernadero se validan en campo usando soja, uva, maíz y manzana. Se demuestra adicionalmente que el efecto del LCO es observable con diferentes LCO, validando de ese modo la actividad potenciadora de la tasa fotosintética de los LCO en general. Además, la presente divulgación muestra que el efecto potenciador de la tasa fotosintética de los LCO en plantas es robusto en las condiciones ambientales de campo. Los aumentos similares en las tasas fotosintéticas y el rendimiento para el cultivo ensayado (por ejemplo, soja) implica que se deben esperar aumentos en el rendimiento de la aplicación de LCO en una amplia gama de cultivos. La presente divulgación, por tanto, proporciona composiciones agrícolas y procedimientos por los que pueden usarse LCO para potenciar la tasa fotosintética, el crecimiento y el rendimiento de un cultivo en condiciones de campo controladas y diversificadas.

Referencias

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