ES2623080A1 - Biosensor electrocrómico - Google Patents

Abstract

Biosensor electrocrómico. La presente invención se refiere a un biosensor formado por un ánodo de un material conductor que contiene al menos una enzima inmovilizada sobre su superficie y un mediador redox y un cátodo de un material transparente que contiene una molécula electrocrómica que cambia de color cuando cambia su estado de oxidación. Entre ánodo y cátodo se deposita un medio conductor de iones que puede estar en forma de gel o de membrana permeable. Este biosensor se activa automáticamente cuando se deposita una muestra que contenga el analito cuya oxidación/reducción enzimática genera un flujo de electrones desde el ánodo al cátodo que provoca el cambio de color del material electrocrómico y que da información inmediata al usuario de la presencia de dicho analito en la muestra.

Description

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Biosensor electrocromico

DESCRIPCION

La presente invencion se refiere a un biosensor formado por un primer electrodo de un material conductor que contiene al menos una enzima y un mediador redox inmovilizados sobre su superficie y un segundo electrodo de un material transparente que contiene una molecula electrocromica que cambia de color cuando cambia su estado de oxidacion. Entre ambos electrodos se deposita un medio conductor de iones que puede estar en forma de gel o de membrana permeable. Por tanto, la presente invencion puede englobarse en el campo de la electroquimica.

ESTADO DE LA TECNICA

Existe una creciente necesidad de disponer de herramientas que permitan el diagnostico rapido de determinadas enfermedades (diabetes y problemas cardiovasculares principalmente). La mayoria de estos sistemas para ensayos rapidos se basan en una de dos tecnologias: por un lado encontramos tiras de test colorimetricas, y por otro lado encontramos ensayos basados en una serie de reactivos y un pequeno instrumento de medida o lector. Los tests colorimetricos suelen ser economicos y muy faciles de usar, pero en la mayoria de los casos solo ofrecen informacion cualitativa, y se utilizan sobre todo para discriminar casos positivos de casos negativos. Por otro lado, los sistemas basados en la combinacion de reactivos y un lector, si bien son capaces de ofrecer respuestas cuantitativas o al menos semicuantitativas, tienen el inconveniente de plantear un manejo mas complejo al necesitar un lector que, ademas, puede resultar caro. El ejemplo paradigmatico de estos sistemas de medida, basados en tiras reactivas mas un lector, es el glucometro.

Un gran numero de empresas y grupos de investigation han trabajado en la mejora de ambas tecnologias, aunque siguiendo distintas direcciones. En el caso de los sistemas basados en reactivos y lector, gracias a la disponibilidad de fuentes de energia abundante, tales como baterias y pilas, las mejoras han perseguido simplificar el uso, mejorar la gestion de la informacion, y reducir el volumen de muestra necesario para su analisis. Por otro lado, en el caso de los sistemas basados en ensayos

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colorimetricos, el objetivo mas buscado ha sido el de la cuantificacion de la muestra. Para ello, ineludiblemente, todos los esfuerzos y aproximaciones se han apoyado en tecnicas de deteccion convencionales, principalmente opticas y electroqwmicas. El problema de esto es que en el momento en que se introduce un equipo de medida en el sistema, los costes por analisis se disparan y se pierde el interes comercial. Hasta la fecha, el unico producto en el mercado que permite la cuantificacion de un ensayo de flujo lateral, es un sistema para el control de la natalidad que permite identificar los dias mas fertiles del ciclo menstrual de la mujer. Sin embargo, este sistema, es complejo, caro y tiene un impacto medioambiental importante.

El concepto de los sensores autoalimentados surge por primera vez en los anos 1970s en la industria nuclear. Sin embargo, el primer sensor electroquimico autoalimentado no llega hasta el ano 2001 en forma de biosensor (J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 10752-10753) donde se describieron pilas enzimaticas de combustible capaces de generar electricidad a partir de la glucosa o el lactato presentes en una muestra. Sin embargo, la baja cantidad de energia que dichos sistemas eran capaces de generar, no permitia alimentar las funciones adicionales necesarias: principalmente una electronica de control y alguna forma de poner la information del sensor a disposition del usuario.

En los documentos US2014/0322617 y US2015/0126834 se describe una pila de combustible biologico que comprende un sustrato que se adhiere a la piel del usuario, un anodo que incluye un catalizador que facilita la conversion de un sustrato presente en un fluido biologico con la consiguiente liberation de electrones y un catodo formado por un material electroconductor que contiene un producto capaz de reducir una sustancia oxigenada. El anodo y el catodo estan separados por una interfase que permite el flujo de electrones.

Liu H. et al describieron un sensor para detectar glucosa en orina artificial que utiliza un electrodo con azul de Prusia electrodepositado sobre una capa fina de ITO como indicador electrocromico y un electrodo de tinta de carbono (Anal. Chem. 2012, 84, 2528-2532).

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Jia, W. et al describieron un dispositivo epidermico para detectar determinadas sustancias en la sudoracion formado por un anodo que contiene la enzima lactato oxidasa, CNTs, TTF protegido por una membrana de chitosan y un catodo formado por un material de carbono y platino (Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 7233 -7236).

Zloczeska, A. et al. describieron un biosensor para detectar acido ascorbico basado en un anodo que es un electrodo de ITO modificado con nanomateriales de carbono y un catodo con una matriz de silicato donde se inmoviliza la enzima bilirrubina-oxidasa y que se protege con una membrana permeable (Biosensors and Bioelectronics, 54 (2014) 455-461).

Mas recientemente, Pinyou et al., han presentado un dispositivo autoalimentado consistente en una pila de combustible de glucosa cuya corriente sirve para reducir un electrodo transparente modificado con verde de metileno. El cambio de color, que se mide mediante un espectrofotometro, es proporcional a la concentration de glucosa presente en la muestra dentro de un rango entre 0 y 1mM (Pinyou, P. et al. Coupling of an enzymatic biofuel cell to an electrochemical cell for self-powered glucose sensing with optical readout. Bioelectrochemistry 106, 22-27 (2015)).

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los inventores han desarrollado un biosensor que supera las dificultades existentes en el campo y se compone de una celda galvanica o bateria en la que uno de sus electrodos es un sensor electroquimico y el otro un visor electrocromico. Asi, dada la configuration en forma de pila (el potencial del catodo es superior al potencial del anodo) al anadir una muestra que contenga un sustrato para la enzima presente en el sistema, el sensor se activa automaticamente, dando information directa al usuario al tiempo que se genera una energia electrica disponible para otras funciones.

Por tanto, un primer aspecto de la invention se refiere a un biosensor que comprende los siguientes elementos:

a) un primer electrodo formado por una base de un material conductor que comprende al menos un tipo de enzima inmovilizada sobre su superficie y al

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menos un mediador redox que facilita el intercambio de carga entre la enzima y el electrodo sobre el que esta se halla inmovilizada;

b) un segundo electrodo formado por un material conductor transparente sobre el que se ha depositado un material electrocromico;

c) un medio conductor de iones, situado entre ambos electrodos.

El primer electrodo puede estar fabricado en un material conductor que presente buenas propiedades electrocatalrticas, preferiblemente carbono en cualquiera de sus formas, tales como el grafito, nanotubos de carbono, o grafeno, electrodos basados en metales nobles tales como el oro o el platino, u otros materiales conductores habitualmente empleados en la construction de dispositivos electroquimicos, como el oxido de indio y estano (ITO), o polimeros conductores como el PEDOT:PSS, polianilinas, pirroles, etc.

En una realization preferida, el primer electrodo comprende adicionalmente materiales de carbono como grafeno o nanomateriales de carbono. En una realizacion mas preferida, el primer electrodo comprende nanotubos de carbono. Estos materiales pueden mejorar el rendimiento del biosensor al aumentar el area real disponible para la inmovilizacion y facilitar la transferencia de carga entre el electrodo y las enzimas.

En otra realizacion preferida, el mediador redox de la carga se selecciona de entre ferrocianuros, ferrocenos, complejos de osmio, complejos de rutenio, quinonas, fenotiazinas o fulvalenos. El mediador redox facilita la transferencia de electrones entre el sitio activo de la enzima y la superficie del electrodo sobre el que esta (la enzima) se encuentra localizada.

En una realizacion preferida, el mediador redox esta incorporado a una estructura polimerica, tales como polietileniminas, cloruros de polivinilo, o polimeros basados en vinilimidazol o en vinilpiridina.

En otra realizacion preferida, el material electrocromico se selecciona de entre hexacianometalatos, oxidos metalicos, complejos metalocromicos, polimeros conjugados electrocromicos, viologenos o porfirinas.

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En una realization mas preferida, el material electrocromico es el hexacianometalato azul de Prusia.

En otra realizacion mas preferida, los poKmeros conjugados electrocromicos se seleccionan de entre polianilina, polipirrol, politiofeno, PEDOT, policarbazol, poliazuleno o poliindol.

El medio conductor de iones puede estar en forma de membrana, de solution rica en electrolitos, de gel, o en cualquier forma que permita el intercambio ionico entre los electrodos. Dicho medio esta en contacto con todos los electrodos, y su mision es alojar tanto el electrolito soporte que permite controlar la resistencia interna del dispositivo, como la muestra a analizar. Ademas, en el caso de membranas de flujo laminar, estas permiten el intercambio de las disoluciones empleadas de forma facil y comoda. En una realizacion preferida, este medio conductor de iones comprende Nafion, chitosan, polietilenimina, geles de agar o polihema.

En el biosensor de la invencion, la enzima puede ser una oxidasa, deshidrogenasa, tirosinasa, etc. En una realizacion preferida, la enzima se selecciona de entre glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa, lactato oxidasa, urato oxidasa o colesterol oxidasa.

La inmovilizacion de la enzima sobre la superficie del anodo puede ser covalente o no covalente.

En otra realizacion preferida, el material transparente del catodo se selecciona de entre ITO, FTO, PEDOT, o materiales basados en nanohilos metalicos como, por ejemplo, de plata.

En otra realizacion preferida, el biosensor de la invention adicionalmente comprende un soporte permeable que se selecciona de entre un material textil no tejido o de un polimero no permeable.

En otra realizacion preferida, el biosensor de la invencion adicionalmente comprende una capa adhesiva.

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En otra realization preferida, el biosensor de la invention adicionalmente comprende una capa protectora formada por un poKmero transparente.

En una realizacion preferida, el primer electrodo funciona como anodo y el segundo electrodo funciona como catodo, de forma que en el anodo se produce la reaction del analito sustrato de la enzima que genera una corriente de electrones que se dirigen por el circuito externo hacia el catodo, donde reducen el material electrocromico y provocan su cambio de color.

En otra realizacion preferida, el primer electrodo funciona como catodo y el segundo electrodo funciona como anodo, de forma que en el catodo se produce una reaccion del analito sustrato de la enzima que induce el paso de una corriente de electrones procedente del anodo, donde el material electrocromico cambia de color al oxidarse.

En la presente invencion se aprovecha la naturaleza electroqtimica de tres de los componentes clave en los sistemas de detection, como son el sensor, la fuente de alimentation, y un posible visualizador electrocromico, fusionando los tres elementos en una unica celda galvanica que cumple a la vez las funciones de deteccion y cuantificacion y de visualizacion del resultado. El sistema funciona en base a una medida de carga, ya que la carga que se genera o se consume en el electrodo sensor, es igualada por otra carga de igual magnitud y signo contrario en el electrodo visualizador. El cambio de color es directamente proporcional a la carga circulante y, mediante un diseno geometrico espedfico, se consigue transformar el cambio de color en information a traves de una escala visual. Esto permite al usuario obtener una lectura directa de la concentration de analito presente en la muestra, sin necesidad de emplear lectores u otro tipo de instrumentation externa.

Esta aproximacion es completamente novedosa desde el punto de vista de los dispositivos de analisis para puntos de atencion por varias razones. En primer lugar, elimina por completo la necesidad de disponer tanto de una electronica de control basada en silicio, asi como de una fuente de energia adicional. Ademas, los dispositivos basados en la tecnologia de la invencion pueden fabricarse mtegramente mediante tecnicas de impresion, utilizando para ello materiales biodegradables, con lo que no solo se consigue abaratar los costes de fabrication, sino que se aumenta la

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sostenibilidad del proceso ya que se reduce muchisimo el impacto medioambiental de los dispositivos una vez desechados.

La completa elimination de la necesidad de disponer de electronica de silicio en un dispositivo que lo contenga supone un avance sin precedentes en el area de los sensores autoalimentados, al eliminar una barrera hasta ahora impensable: la integration heterogenea de componentes electronicos, incluidos los circuitos integrados habitualmente empleados para la gestion de la energia y el control de los sensores y el visualizador. Las aplicaciones del biosensor de la invention serian innumerables en medicina (medida de glucosa en pacientes diabeticos) y especialmente ventajoso en formatos no invasivos tales como parches cutaneos para la medida de metabolitos en sudor. Otras aplicaciones son como etiquetas para la detection de patogenos en alimentos envasados, medidores de alcohol en saliva, respiration, sudor y bebidas alcoholicas en general, detectores de gases, e incluso dispositivos para la deteccion rapida de patogenos y sustancias toxicas en entornos sin recursos. En general, la tecnologia es aplicable a la deteccion de cualquier sustancia capaz de actuar como sustrato de enzimas acoplables a un electrodo.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un dispositivo que comprende el biosensor segun se ha descrito anteriormente.

El dispositivo que contiene el biosensor de la invencion presenta tres partes bien diferenciadas: por un lado, la camara para la muestra, en la que se aloja dicho biosensor, la camara del visualizador que contiene un electrolito y un electrodo transparente modificado con una capa de material electrocromico, y en tercer lugar el circuito externo que conecta ambos electrodos. El dispositivo funciona efectivamente como una pila en la que el propio analito es el combustible y, por tanto, sirve para activar el dispositivo. Analogamente a otros dispositivos electroquimicos para generation de energia, para que el presente dispositivo funcione adecuadamente, es necesario que el potencial al que se produzca la reaction de oxidation en el anodo sea inferior al potencial al que tiene lugar la reaccion de reduction en el catodo. Aunque en la presente invencion el anodo cumple las funciones de sensor y el catodo de visualizador, esta configuration no es exclusiva, y podrian darse casos en los que la reaccion de deteccion se produce en el catodo y la funcion de visualization se

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atribuya al anodo. La disposition del sensor respecto al visualizador puede ser de forma que queda desplazado ligeramente en el plano XY con respecto al electrodo transparente que contiene el material electrocromico, o de forma coplanar del sensor y del electrodo transparente sobre el mismo sustrato.

A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1 Muestra el esquema descriptivo del dispositivo basico y las partes que comprende.

FIG. 2 Muestra la respuesta del biosensor de glucosa (utilizando la enzima glucosa deshidrogenasa y tetrethiafulvaleno, TTF, como mediador redox) expresada como densidad de corriente normalizada con respecto al area del electrodo (3x3mm).

FIG. 3 Muestra la respuesta del electrodo de azul de Prusia electrodepositado sobre un electrodo de ITO de 3x15mm expresada como densidad de corriente normalizada con respecto al area del electrodo. La lmea de trazo continuo muestra la respuesta del electrodo recien electrodepositado, mientras la lmea de puntos muestra la respuesta de este mismo electrodo, 24 horas despues de su electrodeposito, en una solution 0,1M KCl y 0,1M HCl. La velocidad de barrido es de 10mV s-1.

FIG. 4. Muestra las imagenes del electrodo electrocromico y como cambia de color de forma progresiva a medida que pasa mas carga. Las lmeas de puntos marcan el extremo del electrodo (izquierda) y la position del frente de color en cada momento (derecha).

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EJEMPLOS

A continuation se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.

Ejemplo 1: medida de la glucosa

Se procedio a la fabrication de un dispositivo biosensor mediante tecnicas de prototipado rapido, usando materiales polimericos laminados con capas adhesivas. Dicho dispositivo conto con electrodos serigrafiados de grafito (electrodo de trabajo y auxiliar) y de plata/cloruro de plata (electrodo de pseudo-referencia), asi como un electrodo transparente de ITO de 3x15mm. Sobre este ultimo, se electrodeposito una capa de azul de Prusia siguiendo un procedimiento descrito en la bibliografia (A. A. Karyakin and E. E. Karyakina, Sensors and Actuators B: Chemical, 1999, 57, 268273). El dispositivo se monto empleando una membrana de flujo lateral (Whatmann 1 o Fusion 5) entre los electrodos serigrafiados y el catodo con azul de Prusia. Para la caracterizacion del electrodo electrocromico, el sistema se completo empleando una disolucion 0,1M KCl y 0,1M HCl. Este electrolito proporciona un medio conductor que limita las perdidas de potencial del sistema, al tiempo que proporciona el medio acido que estabiliza el azul de Prusia y aporta los cationes potasio necesarios para mantener la reversibilidad del proceso electrocromico. La fabricacion y montaje se detallan a continuacion (los elementos mencionados pueden verse en la Figura 1).

Sobre un sustrato plastico (1) se serigrafia un electrodo de carbono en su forma alotropica de grafito, utilizando una tinta comercial (2). Sobre dicho sustrato con el electrodo impreso, se coloca un segundo material adhesivo (3) cortado de manera que permite definir las areas activas del electrodo, el contacto del electrodo, y una zona sobre la que mas adelante descansara una pieza de material poroso (6). A continuacion, se coloca sobre el conjunto anterior otra lamina de material adhesivo (4) sobre la que se ha impreso una banda de material conductor, en este caso cobre (5), que facilitara el contacto electrico entre el electrodo transparente de ITO (11) y la instrumentation de caracterizacion empleada en el estudio (no mostrada en la figura 1). Notese que el electrodo de contacto (5) puede imprimirse directamente sobre una capa de material unica que sustituya a las capas (3) y (4). En el montaje descrito aqu se emplean dos capas de material porque dicho material tiene 130-160 micras de

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espesor, pero la membrana de flujo lateral (6) puede tener grosores de entre 100 y 500 micras. Tras colocar la pieza representada por (4), se procede a colocar la pieza (6). Esta pieza comprende dos partes: por un lado presenta un extremo estrecho y alargado (7), y por otro lado es mas ancha (8). El lado estrecho de la tira sirve como zona de adicion de la muestra y tambien como zona de separation entre los electrodos del sistema. Mediante la adicion de disoluciones de distinta concentration salina se controla la resistencia interna del dispositivo. El lado ancho de la tira sirve como absorbente, y permite que la muestra anadida en el lado estrecho llene el sistema. Sobre este lado mas ancho es posible colocar un absorbente adicional que permite el establecimiento de un flujo continuo a lo largo de la tira. En ultimo lugar, se coloca el chip transparente (9) con el electrodo transparente (10) sobre el que se ha electrodepositado una fina capa de azul de Prusia en una zona de 3x15mm (11). Tras el montaje, el biosensor queda desplazado ligeramente en el plano XY con respecto al electrodo transparente que contiene el material electrocromico.

Antes de colocar la membrana de flujo lateral (6), el electrodo de grafito se modifica para transformarlo en un biosensor de glucosa. Para ello, sobre el electrodo de carbono serigrafiado, se deposita una mezcla acuosa que contiene una enzima cuyo sustrato es la glucosa, un mediador redox, un nanomaterial de carbono, un agente entrecruzante, y una matriz polimerica. La enzima puede ser una glucosa oxidasa o bien una glucosa deshidrogenasa en concentraciones del orden de 1-50mg mL"1, el mediador redox puede ser un complejo de hierro, de rutenio o, en una configuration preferida, un polimero cargado con osmio con potencial de oxidation proximo a 0V vs. Ag/AgCl. En este caso, se ha empleado tetrathiafulvaleno, TTF, un compuesto redox organico con un potencial de oxidation-reduction cercano a los 50mV vs. Ag/AgCl. El agente entrecruzante empleado en este caso fue el glutaraldehido en una concentracion del 1-1,5% en volumen, y el nanomaterial de carbono nanotubos de carbono a una concentracion de 1-10mg/mL. Dicha mezcla se deposita mediante una gota que se deja secar. Dicho sensor tiene una respuesta a la concentracion de glucosa del tipo mostrado en la Figura 2. Dicha figura muestra la respuesta en corriente de un biosensor como el descrito, medida a un potencial fijo tal que la oxidacion del mediador no esta limitada por fenomenos de transferencia de carga asociados al electrodo, sino que depende directamente de la actividad de la enzima que, a su vez, depende de la concentracion de glucosa en el medio. Si se integra la

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corriente en un intervalo de tiempo se obtiene la carga que ha circulado por el biosensor en dicho intervalo de tiempo. La medida de carga de esta forma constituye una tecnica electroqwmica conocida como coulometria. La coulometria presenta una serie de ventajas frente a la amperometria, como por ejemplo una mayor sensibilidad, lo que permite medir concentraciones mas pequenas de analito que con metodos amperometricos. Ademas, las medidas de carga a potencial constante permiten determinar con un alto grado de precision la concentration de un analito presente en una muestra incluso si el coeficiente de difusion del analito en cuestion es desconocido. La carga total (a tiempo infinito) es tan solo funcion de la cantidad de analito presente y del numero de electrones implicados en el proceso que tiene lugar al potencial de medida, de acuerdo a la ecuacion:

Q=nFNo=nFVCo*(0) Eq. 1

Donde Q es la carga medida en coulombios, n el numero de electrones implicados, F la constante de Faraday (96485 Culombios mol-1) y NO el numero de moles de O inicialmente presentes en la muestra. V es el volumen de muestra y CO* la concentracion de O presente inicialmente en la muestra. A tiempos mas cortos, la carga es directamente proporcional a la cantidad de analito inicial. Asi, en el biosensor propuesto, la medida coulometrica tiene especial sentido ya que se pretende analizar el contenido de glucosa en un volumen de muestra muy reducido. Por ello, al ser la carga un parametro acumulativo, se consigue amplificar la senal y mejorar la sensibilidad del dispositivo.

Por otro lado, la carga que circula por el biosensor se iguala en el electrodo opuesto mediante la reduction de un material electrocromico depositado homogeneamente sobre la superficie de un electrodo transparente de un oxido mixto de indio y estano (ITO, de sus siglas en ingles). Para fabricar el electrodo de ITO de la presente realization se partio de una capa de ITO de moderada conductividad (resistencia cuadro inferior a 15 ohmios) y alta transparencia, depositado mediante la tecnica de deposito de vapor quimico (CVD, de las siglas en ingles de "Chemical Vapour Deposition”) sobre obleas de vidrio de 1mm de espesor. Dichas obleas se cortaron en dados de 20x20 mm, y posteriormente se procedio a la fabrication de los electrodos en cada uno de los chips. Los electrodos se definieron en los chips mediante grabado

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humedo del material no deseado en un bano de agua regia diluida a temperatura ambiente. Se prepararon electrodos con forma rectangular de dimensiones 3x15 mm, unidos a una zona de conexion del mismo tamano mediante una pista de 1mm de ancho. Esta pista es importante porque ayuda a controlar la resistencia interna del dispositivo.

Una vez fabricado el electrodo, se procedio al electrodeposito del material electrocromico, que en esta realization es el azul de Prusia. El metodo de electrodeposito en este caso es la amperometria sin agitation forzada, en un vaso de precipitados, y polarizando el electrodo de ITO a 0,4V vs. Ag/AgCl dentro de una disolucion 0,1M HCl, 2mM de nitrato ferrico, y 2mM de ferricianuro. El metodo sigue el procedimiento descrito por Karyakin en (A. A. Karyakin and E. E. Karyakina, Sensors and Actuators B: Chemical, 1999, 57, 268-273). El electrodo auxiliar esta disenado de forma que la distribution de corriente durante el electrodeposito es homogenea y no resulta impedida por la presencia del electrodo de referencia. La disolucion de electrodeposito puede estar desoxigenada. La carga total aplicada es de entre 1 y 2 mC, y el material resultante presenta un potencial de reduction a partir de 0,25 V vs. Ag/AgCl.

Una vez electrodepositado el azul de Prusia, el electrodo se extrae de la disolucion rica en especies de hierro y se acondiciona, mediante voltametria dclica, en una disolucion de HCl y KCl a pH=1. El potencial se barre entre 0 y 0,5 V vs. Ag/AgCl hasta que las senales de oxidacion y reduccion se estabilizan (permanecen constantes). La figura 3 muestra la respuesta tipica del electrodo de azul de Prusia empleado en la presente realizacion. Tras la estabilizacion del azul de Prusia, el electrodo se seca al aire y se procede al montaje del sistema que incluye el biosensor descrito mas arriba.

Sobre el biosensor se coloca una membranana de flujo lateral, que permitira controlar la separation vertical entre el electrodo biosensor y el electrodo electrocromico, asi como la resistencia interna del sistema cuando se introduzca una disolucion de electrolito tamponador del pH, tal como una mezcla de sales de fosfato, con la muestra. Tras la colocation de esta membrana, se monta el electrodo electrocromico, que dispone de un contacto para poder conectarse, a traves de un circuito externo, al

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electrodo biosensor. En la presente realization, el biosensor y el electrodo electrocromico se hallan ligeramente desplazados en el plano horizontal, y separados verticalmente por la membrana. Sin embargo en otra realizacion preferida, ambos electrodos pudieran ser coplanares, lo que simplificaria la construction del dispositivo. En el caso de la presente realizacion, el circuito externo es un potenciostato que permite caracterizar el sistema. En otra realizacion, el circuito externo puede consistir simplemente en una serie de resistencias conectadas en serie con interruptor que permita conectar ambos electrodos cuando se desee iniciar la medida. Dichas resistencias pueden ser pistas conductoras o hilos, en funcion de la aplicacion.

Cuando se anade una muestra al sistema descrito y se cierra el circuito externo, el sistema genera una fuerza electromotriz (FEM) alrededor de 250mV. Esta FEM se deriva del potencial de reduction del material electrocromico (0,25V) y el de oxidation del mediador empleado en el electrodo biosensor (en este caso proximo a 0V). Aunque este potencial de pila es insuficiente para alimentar practicamente ningun componente electronico por si mismo, el cambio de color producido en el electrodo ya es directamente proporcional a la concentration de analito. Gracias a la geometria del electrodo que contiene el material electrocromico y la distribution de este sobre el electrodo de ITO, asi como a la position relativa entre ambos electrodos, se consigue que el cambio de color se produzca a lo largo del electrodo, obteniendose una indication visual directa de la concentracion de glucosa presente en la muestra. Por otro lado, el cambio de color es una propiedad del material electrocromico, por lo que ademas se dispone de toda la energia electrica producida por el dispositivo. Energia que, por otro lado, emplearse para alimentar otras funciones adicionales.

Ejemplo 2: Demostracion del principio de funcionamiento

Para mostrar el principio de funcionamiento con mayor claridad se diseno un experimento en el que se sustituye el electrodo biosensor por un electrodo inyector de corriente. Esto tiene la ventaja de que permite controlar con precision el nivel de corriente circulante, asi como la carga electrica que atraviesa el dispositivo. El montaje experimental es identico al del ejemplo 1, con la exception de que sobre el electrodo de grafito no se deposita ninguna mezcla de compuestos redox ni enzimas. En esta configuration, el electrodo de grafito se conecta al electrodo de trabajo del potenciostato, mientras que el electrodo transparente que contiene azul de Prusia se

conecta a los terminales del electrodo auxiliar y el de referencia. Se hacen pasar corrientes de 10^A por el sistema, y se van tomando imagenes del dispositivo a lo largo del tiempo. La figura 4 muestra 3 imagenes clave en las que se aprecia que el cambio de color se da progresivamente a lo largo del electrodo en funcion de la carga 5 circulada, y no de forma homogenea en toda la superficie del mismo. El hecho de que el cambio de color se produzca de manera progresiva a lo largo del electrodo indica que la corriente circulante pasa de forma preferente por el camino de menor resistencia interna en cada momento. A medida que el azul de Prusia mas cercano al electrodo de grafito se ha oxidado, cambia de color. Si continua circulando corriente se 10 seguira transformando el material electrocromico, siguiendo siempre el camino de menor resistencia a lo largo del electrodo, hasta agotarse por completo. Dado el diseno geometrico del sistema, dicha transformation se produce a lo largo del electrodo, permitiendo la cuantificacion de la carga circulante de forma visual, y directa sin necesidad de electronicas adicionales. La cantidad de azul de Prusia transformada 15 se corresponde directamente con la carga electrica circulada. Por tanto, mediante el deposito controlado de material electrocromico sobre el electrodo, es posible tener una idea de la carga por unidad de area presente en el electrodo, y por tanto el area afectada por el cambio de color puede utilizarse como un indicador directo de la concentration de analito presente en una muestra.

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   REIVINDICACIONES

   1. Biosensor que comprende los siguientes elementos:

   a) un primer electrodo formado por una base de un material conductor que comprende al menos un tipo de enzima inmovilizada sobre su superficie y al menos un mediador redox de la carga;

   b) un segundo electrodo formado por un material transparente sobre el que se ha depositado un material electrocromico;

   c) un medio conductor de iones, situado entre ambos electrodos.
2. 2. Biosensor segun la reivindicacion 1 donde el primer electrodo comprende adicionalmente grafeno o nanotubos de carbono.
3. 3. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el mediador redox de la carga se selecciona de entre ferrocianuros, ferrocenos, complejos de osmio, complejos de rutenio, quinonas, fenotiazinas o fulvalenos.
4. 4. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el mediador redox esta incorporado a una estructura polimerica.
5. 5. Biosensor segun la reivindicacion anterior donde la estructura polimerica se selecciona de entre polietileniminas, cloruros de polivinilo, polimeros basados en vinilimidazol o polimeros basados en vinilpiridina.
6. 6. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el material electrocromico se selecciona de entre hexacianometalatos, oxidos metalicos, complejos metalocromicos, polimeros conjugados electrocromicos, viologenos o porfirinas.
7. 7. Biosensor segun la reivindicacion anterior donde el material electrocromico es azul de Prusia.
8. 8. Biosensor segun la reivindicacon 6 donde los polimeros conjugados electrocromicos se seleccionan de entre polianilina, polipirrol, politiofeno, PEDOT, policarbazol, poliazuleno o poliindol.

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9. 9. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio conductor de iones comprende Nafion, chitosan, polietilendiamina, gel de agar o polihema.
10. 10. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la enzima se selecciona de entre glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa, lactato oxidasa, urato oxidasa, colesterol oxidasa.
11. 11. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el material transparente del segundo electrodo se selecciona de entre ITO, FTO, PEDOT, o nanohilos metalicos.
12. 12. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende un soporte permeable que se selecciona de entre un material textil no tejido o de un polimero no permeable.
13. 13. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende una capa adhesiva.
14. 14. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores que adicionalmente comprende una capa protectora formada por un polimero transparente.
15. 15. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el primer electrodo funciona como anodo y el segundo electrodo funciona como catodo.
16. 16. Biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde el primer electrodo funciona como catodo y el segundo electrodo funciona como anodo.
17. 17. Dispositivo que comprende el biosensor segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.