ES2618578T3 - Procedimiento para la producción de lípidos a partir de biomasa - Google Patents

Procedimiento para la producción de lípidos a partir de biomasa Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido, que comprende: - someter dicha biomasa a hidrólisis ácida en presencia de una disolución acuosa de al menos un ácido orgánico seleccionado de ácidos alquil- o aril-sulfónicos que tienen de C7 a C20 átomos de carbono, a una temperatura que varía de 80 ºC a 160 ºC, obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa; - someter dicha primera mezcla a hidrólisis enzimática obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase sólida y una segunda fase acuosa; - someter dicha segunda fase acuosa a fermentación en presencia de al menos una levadura oleaginosa obteniendo una biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos.

Description

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descripcion
Procedimiento para la produccion de Kpidos a partir de biomasa
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de Ifpidos a partir de biomasa, que incluye al menos un polisacarido.
Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de Ifpidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacarido que comprende someter dicha biomasa a hidrolisis acida, someter la mezcla obtenida de dicha hidrolisis acida a hidrolisis enzimatica, y someter los azucares obtenidos de dicha hidrolisis a fermentacion en presencia de al menos una levadura oleaginosa.
Los Ifpidos as^ obtenidos pueden usarse ventajosamente en la produccion de biodiesel o diesel verde, que puede usarse como tal, o en una mezcla con otros combustibles para vehuculos de motor.
Hablando en terminos generales, una biomasa es cualquier sustancia con una matriz organica, vegetal o animal, que puede ser destinada a fines energeticos, por ejemplo como materia prima para la produccion de biocombustibles, o de componentes que pueden anadirse a combustibles. La biomasa puede formar por lo tanto una fuente de energfa renovable como alternativa a materias primas tradicionales de origen fosil usadas normalmente en la produccion de combustibles. Para este fin, es particularmente util la biomasa lignocelulosica.
La produccion de azucares a partir de biomasa, en particular biomasa lignocelulosica, se conoce en la tecnica.
La biomasa lignocelulosica es una estructura compleja que comprende tres componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Sus cantidades relativas vanan segun el tipo de biomasa lignocelulosica usada. En el caso de las plantas, por ejemplo, dichas cantidades vanan segun la especie y edad de la planta.
La celulosa es el mayor constituyente de la biomasa lignocelulosica, y esta presente generalmente en una cantidad que vana de 30 % en peso a 60 % en peso con respecto al peso total de la biomasa lignocelulosica. Las celulosa consiste en moleculas de glucosa (de aproximadamente 500 a 10.000 unidades) unidas unas a otras mediante un enlace p-1,4 glucosido. El establecimiento de enlaces de hidrogeno entre las cadenas causa la formacion de dominios cristalinos que dan resistencia y elasticidad a las fibras vegetales. En la naturaleza, puede encontrarse solamente en su estado puro en plantas anuales tales como algodon y lino, mientras que en las plantas lenosas esta acompanada siempre por hemicelulosa y lignina.
La hemicelulosa, que esta presente generalmente en una cantidad que vana de 10 % en peso a 40 % en peso con respecto al peso total de la biomasa lignocelulosica, aparece como un polfmero mixto, relativamente corto (de 10 a 200 moleculas) y ramificado, constituido tanto por azucares con seis atomos de carbono (glucosa, manosa, galactosa) como tambien azucares con cinco atomos de carbono (xilosa, arabinosa). Algunas propiedades importantes de las fibras vegetales son debidas a la presencia de hemicelulosa, de la que la principal propiedad es la de favorecer la imbibicion de dichas fibras vegetales, cuando esta presente agua, causando su hinchamiento. La hemicelulosa tambien tiene propiedades adhesivas, y por lo tanto tiende a cementar o desarrollar una consistencia una consistencia cornea, con la consecuencia de que dichas fibras vegetales se hacen ngidas y son embebidas mas lentamente.
La lignina esta presente generalmente en una cantidad que vana de 10 % en peso a 30 % en peso con respecto al peso total de la biomasa lignocelulosica. Su funcion principal consiste en unir y cementar las diversas fibras vegetales unas con otras dando a la planta compactacion y resistencia, y tambien proporciona proteccion contra insectos, agentes patogenos, lesiones y luz ultravioleta. Se usa principalmente como combustible, pero en la actualidad tambien se usa ampliamente en la industria como dispersante, endurecedor, agente emulsionante, para laminados plasticos, envases de carton y artfculos de caucho manufacturado. Tambien puede tratarse qmmicamente para producir compuestos aromaticos, del tipo de la vainillina, siringaldelddo, p-hidroxibenzaldehudo, que pueden usarse en qmmica farmaceutica, o en la industria cosmetica y alimentaria.
A fin de optimizar la transformacion de la biomasa lignocelulosica en productos para uso energetico, se conoce someter dicha biomasa a un tratamiento preliminar para separar la lignina e hidrolizar la celulosa y hemicelulosa a azucares simples, tales como, por ejemplo, glucosa y xilosa. Estos azucares pueden usarse como fuentes de carbono en procedimientos de fermentacion en presencia de microorganismos para la produccion de alcoholes y/o Ifpidos.
La solicitud de patente de EE.UU. 2008/0102176, por ejemplo, describe un metodo para la extraccion de grasas vegetales que comprende: pulverizar la materia prima que contiene celulosa para obtener partfculas con un diametro de 1-2 mm; sumergir las partfculas en acido sulfurico a una concentracion igual a 1-2% para acidificar dichas partfculas a fin de aumentar la hidrolisis de la celulosa y ajustar el pH a un valor de 4,5±0,5; retirar las partfculas acidificadas por el acido sulfurico y anadir, en secuencia, celulasa y una levadura oleaginosa a las partfculas acidificadas y someter a fermentacion durante 8-9 dfas a una temperatura de 25-30 0C y una humedad de 85-90 %; anadir un hidrocarburo alifatico, como disolvente, a los productos de fermentacion a fin de extraer las grasas, obteniendo una mezcla de extraccion; retirar las partfculas acidificadas que permanecen en la mezcla de extraccion
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y separar las grasas del dlsolvente por destllaclon, obtenlendo acelte bruto. La celulasa es preferlblemente Trichoderma viride y la levadura oleaglnosa es Rhodotorula glutinis. Las grasas obtenldas pueden ser convertldas en biodiesel despues de esterlflcaclon.
Dal et al. descrlben la producclon de blodlesel a partlr de levaduras oleaglnosas en el artfculo: “Blodlesel generatlon from oleaglnous yeast Rhodotorula glutinis wlth xylose asslmllatlng capaclty”, publlcado en “Afrlcan Journal of Blotechnology” (20o7), VoI. 6 (18), paglnas 2130-2134. En dlcho artfculo, la blomasa Ilgnoceluloslca se muele y se somete a hldrollsls aclda en presencla de acldo sulfurlco. Los azucares as^ obtenldos se usan como fuentes de carbono en un procedlmlento de fermentaclon en presencla de una cepa selecclonada prevlamente de Rhodotorula glutinis, capaz de usar tamblen pentosas, xllosa en partlcular, con el fln de obtener aceltes que se extraen posterlormente por extracclon Soxhlet y se someten a transesterlflcaclon a fln de obtener blodlesel.
Greenwalt et al. (2000), Llfe Support & Blosphere Sclence, voI. 7, paglnas 243-249, descrlbe ozonlzaclon y tratamlento alcallno-peroxldo como metodos de pretratamlento para la sacarlflcaclon enzlmatlca y fermentaclon posterlor de paja de trlgo con la levadura oleaglnosa Cryptococcus curvatus.
Los procedlmlentos anterlores, sln embargo, pueden tener dlversos lnconvenlentes.
A fln de hldrollzar ambos componentes pollsacarldos de la blomasa (p.ej., hemlcelulosa y celulosa), por ejemplo, en partlcular en presencla de acldo sulfurlco dlluldo (p.ej., a concentraclones que vanan de 0-5 % a 11 %) es necesarlo operar a altas temperaturas (p.ej., por enclma de 160oC). A dlchas temperaturas, se produce la formaclon de subproductos que derlvan de la deshldrataclon de Ios azucares y de la despollmerlzaclon parclal de la Ilgnlna. Estos subproductos, e partlcular furfural, hldroxllmetllfurfural, compuestos fenollcos, pueden actuar como lnhlbldores del creclmlento de Ios mlcroorganlsmos usados normalmente en Ios procedlmlentos de fermentaclon de azucares posterlores. Ademas, en presencla de acldo sulfurlco dlluldo, el rendlmlento de azucares, glucosa en partlcular, es normalmente bajo (p.ej., menor que 50 %).
Ademas, antes de someter Ios azucares a fermentaclon, puede ser necesarlo neutrallzar el acldo sulfurlco para ajustar el pH a valores aceptables para la fermentaclon posterlor. La neutrallzaclon se obtlene generalmente anadlendo oxldos y/o hldroxldos tales como, por ejemplo, oxldo de calclo, hldroxldo de calclo o hldroxldo de barlo, con la formaclon conslgulente de sales (p.ej., sulfato de calclo, sulfato de calclo dlhldrato (“yeso”), sulfato de barlo) que preclpltan y deben ser separadas por Io tanto de Ios azucares antes de que estos ultlmos sean sometldos a fermentaclon. Ademas, estas sales deben ser desechadas posterlormente por medlo de un tratamlento adecuado, con un conslgulente aumento en el coste de producclon. Ademas, es lmposlble recuperar y reutlllzar dlcho acldo lnorganlco.
El Sollcltante ha encontrado ahora que la producclon de Kpldos a partlr de blomasa, en partlcular a partlr de blomasa que lncluye al menos un pollsacarldo, puede ser reallzada ventajosamente por medlo de un procedlmlento que comprende someter dlcha blomasa a hldrollsls aclda en presencla de una dlsoluclon acuosa de al menos un acldo organlco, a una temperatura menor que o lgual a 160oc, someter la mezcla obtenlda de dlcha hldrollsls aclda a hldrollsls enzlmatlca, y someter Ios azucares obtenldos de estas hldrollsls a fermentaclon en presencla de al menos una levadura oleaglnosa.
Se obtlenen numerosas ventajas por medlo de este procedlmlento. Dlcho procedlmlento permlte, por ejemplo, obtener un alto rendlmlento de azucares de pentosa y hexosa, que derlvan de la hldrollsls aclda de dlcha blomasa, que pueden usarse posterlormente como fuentes de carbono en procedlmlentos de fermentaclon para la producclon de Upldos. Dlchos Kpldos pueden usarse ventajosamente en la producclon de blodlesel o dlesel verde, que puede usarse como tal, o mezclarse con otros combustlbles para vehfculos de motor.
Ademas, la poslbllldad de operar a temperaturas que no son altas, es declr, menores que o lguales a 160 oc, permlte reduclr la formaclon de subproductos, tales como, por ejemplo, furfural, hldroxllmetllfurfural, compuestos fenollcos, que pueden actuar como lnhlbldores del creclmlento de Ios mlcroorganlsmos usados normalmente en Ios procedlmlentos de fermentaclon de azucares posterlores.
Otra ventaja relevante radlca en el hecho de que dlcho procedlmlento permlte recuperar el acldo organlco, que puede ser reclclado despues al procedlmlento anterlor, en partlcular, a la hldrollsls aclda de la blomasa. Dlcha recuperaclon tamblen permlte evltar la etapa de neutrallzaclon y, por Io tanto, la producclon de sales y su desecho posterlor.
Una ventaja relevante adlclonal es que la fase sollda humeda que comprende reslduos celulares, en partlcular protemas y pollsacarldos contenldos en la membrana celular de las levaduras oleaglnosas usadas, que se obtlene al flnal de la fermentaclon, puede ser recuperada y usada en el procedlmlento menclonado anterlormente, en partlcular puede usarse en la hldrollsls aclda. La hldrollsls aclda de esta fase sollda humeda permlte obtener amlnoacldos a partlr de protemas y azucares a partlr de pollsacarldos, que se envfan posterlormente a la etapa de fermentaclon, permltlendo, de esta manera, reduclr la cantldad de nltrogeno que debe anadlrse normalmente al medlo de cultlvo en el que tlene lugar la fermentaclon, y proporclonar azucares adlclonales para la fermentaclon.
Un objeto de la presente lnvenclon se reflere por Io tanto a un procedlmlento para la producclon de Upldos a partlr de
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biomasa que incluye al menos un polisacarido, que comprende:
- someter dicha biomasa a hidrolisis acida en presencia de una disolucion acuosa de al menos un acido organico seleccionado de acidos alquil- o aril-sulfonicos que tienen de C7 a C20 atomos de carbono, preferiblemente de C9 a C15 atomos de carbono, a una temperatura que vana de 80 0C a 160 0C, preferiblemente de 100 oc a 150 oc, obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase solida y una primera fase acuosa;
- someter dicha primera mezcla a hidrolisis enzimatica obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase solida y una segunda fase acuosa;
- someter dicha segunda fase acuosa a fermentacion en presencia de al menos una levadura oleaginosa obteniendo una biomasa celular oleaginosa que comprende Ifpidos.
Para los fines de la presente descripcion y de las siguientes reivindicaciones, la definicion de los intervalos numericos siempre incluye los extremos, a menos que se especifique lo contrario.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho polisacarido puede seleccionarse de celulosa, hemicelulosa 0 mezclas de las mismas. La celulosa, 0 mezclas de hemicelulosa y celulosa, son particularmente preferidas.
De acuerdo con una realizacion preferida adicional de la presente invencion, dicha biomasa es una biomasa lignocelulosica. Como se menciono anteriormente, la biomasa lignocelulosica incluye tres componentes: hemicelulosa, celulosa y lignina.
Dicha biomasa lignocelulosica se selecciona preferiblemente de:
- productos de cultivos cultivados expresamente para uso energetico (por ejemplo, miscanthus, mijo, cana comun), incluyendo subproductos, residuos y desechos de dichos cultivos 0 de su procesamiento;
- productos de cultivos agncolas, forestacion y silvicultura, que comprenden madera, plantas, residuos y subproductos de procesamiento agncola, forestacion y silvicultura;
- subproductos de agri-alimentos destinados a alimentacion humana 0 zootecnica;
- residuos, no tratados qmmicamente, de la industria del papel;
- productos de desecho que provienen de la recogida diferenciada de desechos solidos urbanos (p.ej., desechos urbanos de origen vegetal, papel).
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha biomasa puede someterse a un procedimiento de molienda preliminar antes de ser sometida a hidrolisis acida. Dicha biomasa se muele preferiblemente hasta que se obtienen partfculas que tienen un diametro que vana de 0,1 mm a 10 mm, mas preferiblemente que vana de 0,5 mm a 4 mm. Las partfculas que tienen un diametro menor que 1 mm son particularmente preferidas.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha biomasa esta presente en la mezcla de reaccion en una cantidad que vana de 5 % en peso a 40 % en peso, preferiblemente de 20 % en peso a 35 % en peso, con respecto al peso total de la mezcla de reaccion.
Para los fines de la presente descripcion y de las siguientes reivindicaciones, la expresion “mezcla de reaccion” significa la mezcla que comprende la biomasa y la disolucion acuosa de dicho al menos un acido organico.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho al menos un acido organico es soluble en agua y extrafble con un disolvente organico insoluble en agua.
Para los fines de la presente invencion y de las siguientes reivindicaciones, la expresion “acido organico soluble en agua” significa un acido organico que tiene una solubilidad en agua destilada, a 25 oc, de al menos 0,5 g/100 ml de agua destilada, preferiblemente de al menos 2 g/100 ml de agua destilada.
Para los fines de la presente invencion y de las siguientes reivindicaciones, la expresion “acido organico extrafble con un disolvente organico insoluble en agua” significa un acido organico que puede ser extrafdo con un disolvente organico insoluble en agua con un rendimiento de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, calculandose dicho rendimiento con respecto a la cantidad total de acido organico presente en la disolucion acuosa.
Para los fines de la presente invencion y de las siguientes reivindicaciones, la expresion “acido organico insoluble en agua” significa un acido organico que tiene una solubilidad en agua destilada, a 25 oc, menor que 4 % en volumen, preferiblemente menor que 2 % en volumen.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dichos acidos alquil- 0 aril-sulfonicos pueden
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seleccionarse de: acido dodecil-sulfonico, acido para-tolueno-sulfonico, acido 1-naftaleno-sulfonico, acido 2- naftaleno-sulfonico, acido 1,5-naftaleno-disulfonico, o mezclas de los mismos. El acido para-tolueno-sulfonico, acido 2-naftaleno-sulfonico, acido 1,5-naftaleno-disulfonico, o mezclas de los mismos, son particularmente preferidos.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho al menos un acido organico esta presente en la disolucion acuosa en una concentracion que vana de 0,1 % en peso a 5 % en peso, preferiblemente de 0,5 % en peso a 2,5 % en peso, con respecto al peso total de la disolucion acuosa.
Dicho acido organico actua como catalizador para la hidrolisis acida de dicha biomasa. En particular, cuando la biomasa de partida es una biomasa lignocelulosica, dicho acido organico actua espedficamente como catalizador para la hidrolisis acida de la hemicelulosa. Debe senalarse que el procedimiento objeto de la presente invencion, cuando la biomasa de partida es una biomasa lignocelulosica, no solo permite obtener la hidrolisis acida de la hemicelulosa, sino tambien mejora la disposicion de la celulosa, permaneciendo dicha celulosa sustancialmente no hidrolizada, para la hidrolisis enzimatica posterior, gracias a una desestructuracion mejorada de la biomasa de partida.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha hidrolisis acida puede llevarse a cabo durante un tiempo que vana de 20 minutos a 6 horas, preferiblemente de 30 minutos a 3 horas.
Dicha hidrolisis acida puede llevarse a cabo en reactores conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, autoclaves, o extrusores.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha primera fase solida comprende lignina y celulosa y dicha primera fase acuosa comprende al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono y dicho al menos un acido organico. Dicho azucar es preferiblemente xilosa. Dicha xilosa deriva preferiblemente de la hidrolisis acida de la hemicelulosa.
Dicha hidrolisis acida permite obtener al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono, en particular xilosa que deriva de la hidrolisis acida de la hemicelulosa, con un alto rendimiento. Mas espedficamente, dicha hidrolisis acida permite obtener un rendimiento de xilosa mas alto que 0 igual a 80 %, calculandose dicho rendimiento con respecto a la cantidad total de xilosa presente en la biomasa de partida.
Dicha hidrolisis acida permite tambien obtener altos rendimientos de celulosa y lignina.
Para recuperar dicho al menos un acido organico, dicha primera mezcla puede someterse a extraccion con un disolvente organico soluble en agua.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento tambien comprende someter dicha primera mezcla a extraccion con al menos un disolvente organico insoluble en agua. Preferiblemente, dicho disolvente organico insoluble en agua puede seleccionarse de: hidrocarburos halogenados tales como, por ejemplo, cloruro de metileno, monoclorobenceno, diclorobenceno, 0 mezclas de los mismos; hidrocarburos aromaticos tales como, por ejemplo, tolueno, xileno, 0 mezclas de los mismos; alcoholes alifaticos que tienen de C4 a C6 atomos de carbono tales como, por ejemplo, n-butanol, n-pentanol, 0 mezclas de los mismos; 0 mezclas de los mismos. Las mezclas de tolueno y n-butanol son particularmente preferidas.
Dicho disolvente organico insoluble en agua se evapora posteriormente obteniendo una fase solida adicional que comprende dicho al menos un acido organico.
Como se especifico anteriormente, el procedimiento objeto de la presente invencion permite recuperar dicho al menos un acido organico con un alto rendimiento, en particular, con un rendimiento de al menos 80 %, preferiblemente de al menos 90 %, calculandose dicho rendimiento con respecto a la cantidad total de acido organico presente en dicha disolucion acuosa. Dicho al menos un acido organico, por lo tanto, puede reutilizarse posteriormente segun el procedimiento objeto de la presente invencion. Debe senalarse que, cuando la recuperacion de dicho al menos un acido organico es igual a 100 %, dicha primera fase acuosa estara exenta de dicho al menos un acido organico.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento tambien comprende reutilizar dicho al menos un acido organico en dicha hidrolisis acida.
Para los fines del procedimiento objeto de la presente invencion, dicha hidrolisis enzimatica puede llevarse a cabo segun tecnicas conocidas en la tecnica, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 5.628.830, 5.916.780 y 6.090.595, usando enzimas comerciales tales como, por ejemplo, Celluclast 1.5L (Novozymes), Econase CE (Rohm Enzymes), Spezyme (Genecor), Novozym 188 (Novozymes), usadas individualmente 0 mezcladas unas con otras.
Para ajustar el pH a valores que vanan de 4 a 6, preferiblemente de 4,5 a 5,5, puede anadirse acido acetico glacial a dicha primera mezcla, antes de la hidrolisis enzimatica, en una cantidad tal como para obtener el pH deseado.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha segunda fase solida comprende lignina y
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dicha segunda fase acuosa comprende al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono, preferiblemente xilosa, glucosa, celobiosa 0 mezclas de las mismas. En particular, dicha segunda fase acuosa comprende xilosa que deriva de la hidrolisis acida de la hemicelulosa, glucosa y celobiosa que derivan de la hidrolisis enzimatica de la celulosa.
En particular, esta hidrolisis enzimatica permite obtener un alto rendimiento de glucosa, mas espedficamente un rendimiento de glucosa mas alto que 0 igual a 90 %, calculandose dicho rendimiento con respecto a la cantidad total de glucosa presente en la biomasa de partida.
Las cantidades de azucares contenidos en la biomasa de partida, asf como tambien las cantidades de azucares obtenidos despues de la hidrolisis (hidrolisis acida y/o enzimatica), pueden ser determinadas por medio de tecnicas conocidas en la tecnica, tales como, por ejemplo, Cromatograffa L^quida de Alta Resolucion - HPLC.
Dicha segunda fase solida y dicha segunda fase acuosa pueden ser separadas por tecnicas conocidas en la tecnica, tales como, por ejemplo, filtracion, centrifugacion. Dichas fases se separan preferiblemente por filtracion.
Dicha segunda fase solida, que comprende lignina, puede ser ascendida en calidad como combustible, por ejemplo como combustible para producir la energfa necesaria para sostener los procedimientos de tratamiento de la biomasa.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha fermentacion puede llevarse a cabo a una temperatura que vana de 20 0C a 40 0C, preferiblemente de 25 0C a 35 0C.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha fermentacion puede llevarse a cabo durante un tiempo que vana de 3 dfas a 10 dfas, preferiblemente de 4 dfas a 8 d^as.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha fermentacion puede llevarse a cabo a un pH que vana de 4,5 a 6,5, preferiblemente de 5 a 6. Para mantener el pH dentro de los intervalos deseados, puede anadirse una disolucion acuosa de al menos una base inorganica tal como, por ejemplo, hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de calcio, hidroxido de magnesio 0 mezclas de los mismos, al medio de cultivo usado para la fermentacion, en una cantidad que sea tal como para obtener el pH deseado.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha levadura oleaginosa puede seleccionarse de: Rhodotornla glutinis, Rhodotornla gracilis, Rhodotornla graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis, Torulopsis sp..
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha fermentacion es una fermentacion de lote alimentado.
Antes de usarse en dicha fermentacion, dicha levadura oleaginosa se cultiva preferiblemente en un medio de cultivo que contiene xilosa, celobiosa, glucosa 0 mezclas de las mismas, en una concentracion que vana preferiblemente de 1 % en peso a 2 % en peso con respecto al peso total de dicho medio de cultivo.
Dicha fermentacion puede llevarse a cabo ventajosamente en fermentadores conocidos en la tecnica, en presencia de medios de cultivo usados normalmente para este fin que comprenden nutrientes tales como, por ejemplo, nitrogeno, fosfato de potasio, magnesio, sales, vitaminas.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento comprende tambien someter dicha biomasa celular oleaginosa a tratamiento mecanico.
Dicho tratamiento mecanico puede realizarse usando equipos y tecnicas que son conocidos en la tecnica.
Dicho tratamiento mecanico puede realizarse ventajosamente, por ejemplo, usando homogeneizadores de alta presion, preferiblemente a una presion que vana de 30 MPa (3o0 bar) a 50 MPa (500 bar) (p.ej., homogeneizador Polytron), 0 usando una prensa de celulas French.
Un tratamiento mecanico se realiza preferiblemente usando una prensa de celulas French, que opera a una presion que vana de 137,9 MPa (20 Kpsi) a 344,7 MPa (50 Kpsi), preferiblemente de 241,3 MPa (35 Kpsi) a 310,3 MPa (45 Kpsi).
A fin de concentrar la biomasa celular oleaginosa, antes de ser sometida a tratamiento mecanico, dicha biomasa puede ser sometida a centrifugacion. Dicha centrifugacion puede realizarse durante un tiempo que vana de 5 minutos a 30 minutos, preferiblemente de 15 minutos a 25 minutos, a una velocidad de rotacion que vana de 3.000 rpm a 9.000 rpm, preferiblemente de 4.000 a 8.000 rpm.
A fin de desactivar las enzimas lipoltticas (p.ej., lipasa), dicha biomasa celular oleaginosa, antes de ser sometida a tratamiento mecanico, puede ser sometida a tratamiento termico. Dicho tratamiento termico puede llevarse a cabo a una temperatura que vana de 70 oc a 90 oc, preferiblemente de 75 oc a 85 oc, durante un tiempo que vana de 30 minutos a 3 horas, preferiblemente de 1 a 2 horas.
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De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento comprende tambien someter dicha biomasa celular oleaginosa a centrifugacion, despues del tratamiento mecanico.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicha centrifugacion puede llevarse a cabo durante un tiempo que vana de 5 minutos a 30 minutos, preferiblemente de 10 minutos a 25 minutos, a una velocidad de rotacion que vana de 3.000 rpm a 9.000 rpm, preferiblemente de 4.000 rpm a 8.000 rpm.
Al final de la centrifugacion, se obtienen las siguientes fases:
(i) una fase oleosa que comprende Ifpidos;
(ii) una fase acuosa que comprende trazas de Ifpidos no separados y azucares no fermentados;
(iii) una fase solida humeda que comprende residuos celulares y trazas de Ifpidos no separados.
El procedimiento objeto de la presente invencion permite recuperar los Kpidos con un rendimiento que vana de 50 % a 90 %, preferiblemente de 55 % a 80 %, calculandose dicho rendimiento con respecto a la cantidad total de Ifpidos presentes en la biomasa celular oleaginosa obtenida despues de la fermentacion.
Los Ifpidos incluidos en dicha fase oleosa (i) son preferiblemente trigliceridos, mas preferiblemente esteres de glicerol con acidos grasos que tienen de C-m a C20 atomos de carbono tales como, por ejemplo, acido palmttico, acido estearico, acido oleico, acido a-linoleico, en una cantidad mas alta que 0 igual a 80 % en peso, preferiblemente mas alta que 0 igual a 90 % en peso, con respecto al peso total de los Ifpidos. Otros Ifpidos que pueden estar presentes en dicha fase oleosa son: fosfolfpidos, monogliceridos, digliceridos, 0 mezclas de los mismos.
La cantidad de Ifpidos contenidos en la biomasa celular oleaginosa obtenida despues de la fermentacion, como tambien la cantidad de Ifpidos contenidos en dicha fase oleosa, puede determinarse por medio de tecnicas conocidas en la tecnica, tales como, por ejemplo, el metodo colorimetrico que esta basado en la reaccion de Ifpidos con acido fosforico y fosfo-vainillina: pueden encontrarse detalles adicionales para este metodo, por ejemplo, en el siguiente artmulo: “Chemical Basis of the Sulpho-phospho-vanillin reaction for Estimating Total Serum Lipids”, J. a. Knight et al., publicado en “Clinical Chemistry” (1972), VoI. 18, No. 3, paginas 199-202.
Como ya se especifico anteriormente, la fase solida humeda (iii) que comprende residuos celulares, en particular protemas y polisacaridos contenidos en la membrana celular de la levadura oleaginosa usada, puede ser recuperada y usada en el procedimiento objeto de la presente invencion, en particular puede ser enviada a la hidrolisis acida. Las protemas y polisacaridos de la membrana son hidrolizados despues a aminoacidos y azucares simples (por ejemplo, glucosa, manosa) que pueden usarse despues como fuente de nitrogeno y carbono en la fermentacion posterior. Debe subrayarse el hecho de que la recuperacion y uso de dicha fase solida humeda (iii) permite suministrar nitrogeno al medio de cultivo usado para la fermentacion, reduciendo por consiguiente la cantidad de nitrogeno anadida normalmente al medio de cultivo en el que tiene lugar la fermentacion y proporcionando azucares adicionales para la fermentacion.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento comprende tambien enviar dicha fase solida humeda (iii) a hidrolisis acida. En este caso, dicha primera fase acuosa, ademas de dicho al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono y dicho al menos un acido organico, comprendera aminoacidos y azucares simples (por ejemplo, glucosa y manosa) que derivan de la hidrolisis acida de las protemas y de los polisacaridos de la membrana; mientras que dicha primera fase solida comprendera, ademas de celulosa y lignina, residuos celulares no hidrolizados.
Para obtener un rendimiento de Ifpidos mas alto, es decir, un rendimiento mas alto que 90 %, dicha fase acuosa (ii) y/o dicha fase solida humeda (iii) pueden someterse a extraccion con un disolvente, 0 con una mezcla de alcohol/disolvente.
De acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion, dicho procedimiento comprende tambien someter dicha fase acuosa (ii) y/o dicha fase solida humeda (iii) a extraccion con al menos un disolvente que puede seleccionarse de hidrocarburos alifaticos que tienen de C3 a C10 atomos de carbono tales como, por ejemplo, pentano, n-hexano, octano 0 mezclas de los mismos; 0 con una mezcla que comprende al menos un alcohol alifatico que tiene de C3 a C5 atomos de carbono que puede seleccionarse de, por ejemplo, isopropanol, n-butanol, 0 mezclas de los mismos, y al menos un hidrocarburo alifatico que tiene de C3 a C10 atomos de carbono seleccionado de los descritos anteriormente. Dicho disolvente organico y/o dicha mezcla son evaporados posteriormente obteniendo una fase oleosa adicional que comprende Ifpidos, una fase acuosa adicional que comprende azucares no fermentados y una fase solida humeda adicional que comprende residuos celulares.
Como se describio anteriormente para la fase solida humeda (iii), dicha fase solida humeda adicional obtenida despues de dicha extraccion tambien puede ser recuperada y enviada a la hidrolisis acida.
Los Ifpidos obtenidos segun el procedimiento de la presente invencion pueden ser sometidos a esterificacion en presencia de un alcohol que tiene de 1 a 4 atomos de carbono, preferiblemente metanol, etanol, y de un catalizador
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acido o basico, a fin de producir glicerol y esteres de alquilo, en particular esteres de metilo o esteres de etilo (biodiesel).
Alternativamente, dichos Ifpidos pueden ser sometidos a hidrogenacion/desoxigenacion en presencia de hidrogeno y un catalizador a fin de producir diesel verde. Los procedimientos de hidrogenacion/desoxigenacion son conocidos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 1.728.844.
La presente invencion se describira ahora mediante una forma ilustrativa con referenda a la Figura 1 proporcionada al final de la presente memoria.
Segun una realizacion tipica del procedimiento objeto de la presente invencion, la biomasa (p.ej., biomasa lignocelulosica molida previamente) se somete a hidrolisis acida en presencia de un acido organico (p.ej., acido 2- naftaleno-sulfonico), obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase acuosa que incluye xilosa que deriva de la hidrolisis de la hemicelulosa y dicho acido organico, y una primera fase solida que comprende lignina y celulosa.
Como se representa en la Figura 1, dicha primera mezcla se somete a extraccion con un disolvente organico insoluble en agua (p.ej., una mezcla de tolueno y n-butanol) para recuperar dicho acido organico y reciclarlo, despues de la evaporacion del disolvente, a dicha hidrolisis acida.
Despues de la extraccion con el disolvente, dicha primera mezcla se somete a hidrolisis enzimatica, en presencia de una enzima (p.ej., una disolucion acuosa de Celluclast 1,5L y Novozym 188) obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase acuosa que incluye xilosa que deriva de la hidrolisis acida de la hemicelulosa, glucosa y celobiosa que derivan de la hidrolisis enzimatica de la celulosa, y una segunda fase solida que incluye lignina.
Antes de ser sometida a hidrolisis enzimatica, puede anadirse acido acetico glacial a dicha primera mezcla a fin de ajustar el pH a valores que vanan de 4 a 6 (no representado en la Figura 1).
Dicha segunda fase acuosa y dicha segunda fase solida se separan por filtracion (no representado en la Figura 1).
Dicha segunda fase acuosa se somete a fermentacion en presencia de una levadura oleaginosa (p.ej., Lypomices starkey NRRL 1389).
Al final de la fermentacion, se obtiene una biomasa celular oleaginosa, que se somete a tratamiento mecanico (p.ej., por medio de una prensa de celulas French), y a centrifugacion posterior obteniendo las siguientes tres fases:
(i) una fase oleosa que comprende Ifpidos;
(ii) una fase acuosa que comprende trazas de Ifpidos no separados y azucares no fermentados;
(iii) una fase solida humeda que comprende residuos celulares y trazas de Ifpidos no separados.
A fin de concentrar la biomasa celular oleaginosa, antes de ser sometida a tratamiento mecanico, dicha biomasa puede ser sometida a centrifugacion (no representado en la Figura 1).
A fin de desactivar las enzimas lipolfticas (p.ej., lipasa), antes de ser sometida a tratamiento mecanico, dicha biomasa celular oleaginosa puede ser sometida a tratamiento termico (no representado en la Figura 1).
Como se representa en la Figura 1, dicha fase solida humeda (iii) se envfa a hidrolisis acida.
A fin de obtener un alto rendimiento de Ifpidos, dicha fase acuosa (ii) y dicha fase solida humeda (iii) pueden ser sometidas a extraccion en presencia de una mezcla que comprende al menos un alcohol alifatico y al menos un hidrocarburo alifatico (p.ej., una mezcla de isopropanol y n-hexano) (no representado en la Figura 1).
Se proporcionan algunos ejemplos ilustrativos y no limitantes para una mejor comprension de la presente invencion y para su realizacion.
Ejemplos
Ejemplo 1
Hidrolisis acida de la biomasa
Se anadieron 300 g de madera de comfera molida previamente (diametro de partfculas < 1 mm) a una disolucion de 20 g de acido 2-naftaIenosuIfonico en 1 I de agua.
La composicion de la biomasa de partida fue la siguiente: 50 % en peso de celulosa, 25 % en peso de hemicelulosa, 25 % en peso de lignina, con respecto al peso total de la biomasa de partida.
La mezcla de reaccion asf obtenida se mantuvo, bajo agitacion, en un autoclave, a 140oC, durante 1 hora,
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obteniendo una primera mezcla que comprend^a 225 g (peso seco) de una primera fase solida (que comprend^a celulosa y lignina) y 1.095 g de una primera fase acuosa (que comprendfa xilosa que derivaba de la hidrolisis de la hemicelulosa y acido 2-naftalenosulfonico).
Despues de enfriar hasta 25 0C, dicha primera mezcla se sometio a extraccion con 1 l de una mezcla de tolueno y n- butanol (3/1 en volumen).
La mezcla de tolueno y n-butanol se separo y evaporo posteriormente, a presion reducida, obteniendo una fase solida adicional que comprendfa 19,6 g (peso seco) de acido 2-naftalenosulfonico (rendimiento de recuperacion 98 % calculado con respecto a la cantidad total del acido presente en la disolucion acuosa).
Despues de la separacion del acido, se anadio acido acetico glacial a dicha primera mezcla hasta que se obtuvo un pH de dicha primera fase acuosa igual a 5.
Se anadio posteriormente una disolucion acuosa de la enzima Celluclast 1,5L (Novozymes) correspondiente a 1485 FPU (Unidades de Papel de Filtro) y la enzima Novozym 188 (de Novozymes) correspondiente a 18.000 BGU (Unidades de Beta Glucanasa). La suspension asf obtenida se mantuvo bajo agitacion, durante 72 horas, a 45 oc.
Al final de la hidrolisis enzimatica, se separaron por filtracion 90 g (peso seco) de una segunda fase solida que comprendfa lignina (75 g - peso seco) y celulosa no hidrolizada (15 g - peso seco) y 1.200 g de una segunda fase acuosa que comprendfa glucosa (152 g - peso seco) y xilosa (72 g - peso seco).
Fermentacion
Se diluyeron adecuadamente con agua destilada 250 ml de dicha segunda fase acuosa obtenida como se describio anteriormente, que contema 200 g/l de azucares, hasta que se obtuvo una disolucion que tema una concentracion final de azucares igual a 50 g/l.
Se anadieron los siguientes nutrientes a esta disolucion: sulfato de amonio 0,1 %, KH2PO4 0,1 %, MgS04 7H2O 0,005 %, NaCI 0,001 %, CaCl2 0,001 %, extracto de levadura 0,1 %. El caldo de fermentacion (medio de cultivo) as^ obtenido se inoculo en un fermentador con celulas de levadura (Lypomices starkey NRRL 1389) (inoculo igual a 2,5 g/l - peso seco) para un volumen de fermentacion igual a 1 litro, y se mantuvo el pH en 5,5 mediante la adicion de una disolucion acuosa de NaOH 0,1 M.
Se cultivaron las celulas de levadura, bajo agitacion a 500 rpm, a 30 oc, aireacion 0,5 l/min de aire esteril.
Se anadieron al fermentador 250 ml adicionales de dicha segunda fase acuosa obtenida de la hidrolisis de la biomasa, que contema 200 g/l de azucares, diluida adecuadamente con agua destilada para obtener una disolucion que tema una concentracion final de azucares igual a 50 g/l.
Despues de 150 horas, se recogieron las celulas de levadura y se centrifugaron a 7.000 rpm, durante 20 minutos, obteniendo 52 g (peso seco) de biomasa celular oleaginosa.
Recuperacion de los Ifpidos
La biomasa celular oleaginosa asf obtenida se mantuvo a 80 oc, durante dos horas, a fin de inhibir las enzimas lipoltticas, y despues se resuspendio en 200 ml de agua.
La suspension asf obtenida se sometio a tratamiento mecanico por medio de una prensa de celulas French, que operaba a una presion de 269 MPa (39 Kpsi) obteniendo un lisado celular.
Dicho lisado celular se centrifugo a 7.000 rpm durante 20 minutos obteniendo tres fases: una fase oleosa insoluble en agua, una fase acuosa y una fase solida humeda.
La fase oleosa insoluble en agua se separo y se seco en una estufa a 60 oc, obteniendo 19 g (peso seco) de un residuo oleoso que comprendfa Ifpidos.
La fase acuosa que comprendfa trazas de Upidos no separados y azucares no fermentados y la fase solida humeda que comprendfa residuos celulares y trazas de Ifpidos no separados, se extrajeron con 50 ml de una mezcla que comprendfa n-hexano e isopropanol en una proporcion de 3:1. La mezcla de disolventes se separo y evaporo, a presion reducida, obteniendo 12,2 g (peso seco) de un residuo oleoso adicional que comprendfa Ifpidos, una fase solida humeda adicional y una fase acuosa adicional.
La cantidad total de Ifpidos obtenida es por lo tanto igual a 31,2 g (peso seco) (rendimiento de recuperacion de 60 % calculado con respecto a la cantidad total de la biomasa celular oleaginosa obtenida despues de la fermentacion).
Los Ifpidos se determinaron por medio del metodo colorimetrico, que esta basado en la reaccion de los Ifpidos con acido fosforico y fosfo-vainillina.
La fase solida humeda adicional, obtenida despues de la extraccion de los Ifpidos, que comprendfa agua y residuos
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celulares, que inclma 42 % en peso (peso seco) de polisacaridos y 45 % en peso de protemas (peso seco), se separo por centrifugacion de la fase acuosa adicional que comprend^a azucares no fermentados.
Ejemplo 2
La fase solida humeda adicional, obtenida despues de la extraccion de los Kpidos como se describe en el Ejemplo 1, se envio a hidrolisis acida, operando bajo las condiciones indicadas a continuacion.
Se anadieron 42 g (peso seco) de dicha fase solida humeda adicional y 260 g de madera de comfera molida previamente (diametro de partmulas < 1 mm) a una disolucion de 20 g de acido 2-naftalenosulfonico en 1 l de agua.
La composicion de la biomasa de partida fue la siguiente: 50 % en peso de celulosa, 25 % en peso de hemicelulosa, 25 % en peso de lignina, con respecto al peso total de la biomasa de partida.
La mezcla de reaccion as^ obtenida se mantuvo, bajo agitacion, en un autoclave, a 140oC, durante 1 hora, obteniendo una primera mezcla que comprend^a 198 g (peso seco) de una primera fase solida humeda (que comprendfa celulosa, lignina y residuos celulares) y 1.100 g de una primera fase acuosa (que comprendfa xilosa que derivaba de la hidrolisis de la hemicelulosa, glucosa, manosa y aminoacidos que derivaban de la hidrolisis de los polisacaridos y de las protemas de la membrana incluidas en los residuos celulares y acido 2-naftalenosulfonico).
Despues de enfriar hasta 25 oc, dicha primera mezcla se sometio a extraccion con 1 l de una mezcla de tolueno y n- butanol (3/1 en volumen).
La mezcla de tolueno y n-butanol se separo y evaporo posteriormente, a presion reducida, obteniendo una fase solida adicional que comprendfa 19,5 g (peso seco) de acido 2-naftalenosulfonico (rendimiento de recuperacion 98 % calculado con respecto a la cantidad total del acido presente en la disolucion acuosa).
Despues de la separacion del acido, se anadio acido acetico glacial a dicha primera mezcla hasta que se obtuvo un pH de dicha primera fase acuosa igual a 5,0.
Se anadio posteriormente una disolucion acuosa de la enzima Celluclast 1,5L (Novozymes) correspondiente a 1400 FPU (Unidades de Papel de Filtro) y la enzima Novozym 188 (de Novozymes) correspondiente a 18.000 BGU (Unidades de beta Glucanasa). La suspension as^ obtenida se mantuvo bajo agitacion, durante 72 horas, a 45 oc.
Al final de la hidrolisis enzimatica, se separaron por filtracion 80 g (peso seco) de una segunda fase solida que comprendfa lignina (65 g - peso seco), celulosa no hidrolizada (13 g - peso seco) y residuos celulares (2 g - peso seco) y 1.220 g de una segunda fase acuosa que comprendfa glucosa (139 g - peso seco), manosa (9 g - peso seco), xilosa (67 g - peso seco) y aminoacidos (20 g - peso seco).
Dicha segunda fase acuosa puede ser sometida a fermentacion operando como se describe en el Ejemplo 1.

Claims (38)

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    20
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    35
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    reivindicaciones
    1. Un procedimiento para la produccion de Kpidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacarido, que comprende:
    - someter dicha biomasa a hidrolisis acida en presencia de una disolucion acuosa de al menos un acido organico seleccionado de acidos alquil- o aril-sulfonicos que tienen de C7 a C20 atomos de carbono, a una temperatura que vana de 80 0C a 160 0C, obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase solida y una primera fase acuosa;
    - someter dicha primera mezcla a hidrolisis enzimatica obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase solida y una segunda fase acuosa;
    - someter dicha segunda fase acuosa a fermentacion en presencia de al menos una levadura oleaginosa obteniendo una biomasa celular oleaginosa que comprende Ifpidos.
  2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en donde dichos acidos alquil- 0 aril-sulfonicos tienen de Cg a C15 atomos de carbono.
  3. 3. El procedimiento segun la reivindicacion 1 0 2, en donde dicha temperatura vana de 100 oc a 150 oc.
  4. 4. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho polisacarido se selecciona de celulosa, hemicelulosa 0 sus mezclas.
  5. 5. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha biomasa es una biomasa lignocelulosica.
  6. 6. El procedimiento segun la reivindicacion 5, en donde dicha biomasa lignocelulosica se selecciona de:
    - productos de cultivos cultivados expresamente para uso energetico incluyendo subproductos, residuos y desechos de dichos cultivos 0 de su procesamiento;
    - productos de cultivos agncolas, forestacion y silvicultura, que comprenden madera, plantas, residuos y subproductos de procesamiento agncola, forestacion y silvicultura;
    - subproductos de agri-alimentos destinados a alimentacion humana 0 zootecnica;
    - residuos, no tratados qmmicamente, de la industria del papel;
    - productos de desecho que provienen de la recogida diferenciada de desechos solidos urbanos.
  7. 7. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha biomasa se somete a un procedimiento de molienda preliminar antes de ser sometida a hidrolisis acida.
  8. 8. El procedimiento segun la reivindicacion 7, en donde dicha biomasa se muele hasta que se obtienen partfculas que tienen un diametro que vana de 0,1 mm a 10 mm.
  9. 9. El procedimiento segun la reivindicacion 8, en donde dicha biomasa se muele hasta que se obtienen partfculas que tienen un diametro menor que 1 mm.
  10. 10. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha biomasa esta presente en la mezcla de reaccion en una cantidad que vana de 5 % en peso a 40 % en peso con respecto al peso total de la mezcla de reaccion.
  11. 11. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho al menos un acido organico es soluble en agua y extrafble por medio de un disolvente organico insoluble en agua.
  12. 12. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos acidos alquil- 0 aril- sulfonicos se seleccionan de: acido dodecil-sulfonico, acido para-tolueno-sulfonico, acido 1-naftaIeno-suIfonico, acido 2-naftaIeno-suIfonico, acido 1,5-naftaIeno-disuIfonico 0 sus mezclas.
  13. 13. El procedimiento segun la reivindicacion 12, en donde dicho al menos un acido organico se selecciona de acido para-tolueno-sulfonico, acido 2-naftaIeno-suIfonico, acido 1,5-naftaIeno-disuIfonico, 0 sus mezclas.
  14. 14. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho al menos un acido organico esta presente en la disolucion acuosa en una concentracion que vana de 0,1 % en peso a 5 % en peso con respecto al peso total de la disolucion acuosa.
  15. 15. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha hidrolisis acida se lleva a cabo durante un tiempo que vana de 20 minutos a 6 horas.
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    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  16. 16. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha primera fase solida comprende lignina y celulosa.
  17. 17. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha primera fase acuosa comprende al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono y dicho al menos un acido organico.
  18. 18. El procedimiento segun la reivindicacion 17, en donde dicho al menos un azucar es xilosa.
  19. 19. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha primera mezcla se somete a extraccion con un disolvente organico insoluble en agua.
  20. 20. El procedimiento segun la reivindicacion 19, en donde dicho disolvente organico insoluble en agua se selecciona de: hidrocarburos halogenados; hidrocarburos aromaticos; alcoholes alifaticos que tienen de C4 a C6 atomos de carbono; 0 mezclas de los mismos.
  21. 21. El procedimiento segun la reivindicacion 20, en donde dicho disolvente organico insoluble en agua se selecciona de mezclas de tolueno y n-butanol.
  22. 22. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en donde dicho disolvente organico insoluble en agua se evapora obteniendo una fase solida adicional que comprende dicho al menos un acido organico.
  23. 23. El procedimiento segun la reivindicacion 22, en donde dicho procedimiento comprende reutilizar dicho al menos un acido organico en dicha hidrolisis acida.
  24. 24. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha segunda fase solida comprende lignina.
  25. 25. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha segunda fase acuosa comprende al menos un azucar que tiene de C5 a C6 atomos de carbono.
  26. 26. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha segunda fase acuosa comprende xilosa, glucosa y celobiosa.
  27. 27. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fermentacion se lleva a cabo a una temperatura que vana de 20 0C a 40 0C.
  28. 28. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fermentacion se lleva a cabo durante un tiempo que vana de 3 dfas a 10 dfas.
  29. 29. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fermentacion se lleva a cabo a un pH que vana de 4,5 a 6,5.
  30. 30. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha levadura oleaginosa se selecciona de: Rhodotornla glutinis, Rhodotornla gracilis, Rhodotornla graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis, Torulopsis sp..
  31. 31. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fermentacion es una fermentacion de lote alimentado.
  32. 32. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha biomasa celular oleaginosa se somete a tratamiento mecanico.
  33. 33. El procedimiento segun la reivindicacion 32, en donde dicho tratamiento mecanico se lleva a cabo usando una “prensa de celulas French”, que opera a una presion que vana de 137,9 MPa (20 Kpsi) a 344,7 MPa (50 Kpsi).
  34. 34. El procedimiento segun la reivindicacion 32 0 33, en donde dicha biomasa celular oleaginosa se somete a centrifugacion despues del tratamiento mecanico.
  35. 35. El procedimiento segun la reivindicacion 34, en donde dicha centrifugacion se lleva a cabo durante un periodo de tiempo que vana de 5 minutos a 30 minutos.
  36. 36. El procedimiento segun la reivindicacion 34 0 35, en donde dicha centrifugacion se lleva a cabo a una velocidad rotacional que vana de 3.000 rpm a 9.000 rpm.
  37. 37. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en donde al final de la centrifugacion se obtienen las siguientes tres fases:
    (i) una fase oleosa que comprende Ifpidos;
    (ii) una fase acuosa que comprende trazas de Ifpidos no separados y azucares no fermentados;
    (iii) una fase solida humeda que comprende residuos celuIares y trazas de Upidos no separados.
  38. 38. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fase solida humeda (iii) se transporta hacia la hidrolisis acida.
    5 39. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fase acuosa (ii) y/o
    dicha fase solida humeda (iii) se someten a extraccion con al menos un disolvente que se selecciona de hidrocarburos alifaticos que tienen de C3 a Cio atomos de carbono; 0 con una mezcla que comprende al menos un alcohol alifatico que tiene de C3 a C5 atomos de carbono y al menos un hidrocarburo alifatico que tiene de C3 a Cio atomos de carbono.
    10
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