ES2819723T3 - Proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa empleando microorganismos oleaginosos - Google Patents

Abstract

Proceso para la produccion de lipidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacarido que comprende: - someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacarido a hidrolisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase solida y una primera fase acuosa; - preparar un inoculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentacion para obtener un primer caldo de fermentacion; - alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentacion a un segundo dispositivo de fermentacion para obtener un segundo caldo de fermentacion; - someter al menos una porcion de dicho segundo caldo de fermentacion a microfiltracion para obtener un primer retenido y un primer permeado; - alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentacion; - someter dicho primer permeado a un tratamiento de purificacion para obtener un segundo permeado y un segundo retenido o una fase evaporada y un concentrado - alimentar dicho segundo retenido o concentrado a dicho segundo dispositivo de fermentacion; - al final de dicha fermentacion, someter dicho segundo caldo de fermentacion a separacion para obtener una suspension acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lipidos y una segunda fase acuosa; en donde dicha microfiltracion y dicho tratamiento de purificacion se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentacion.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa empleando microorganismos oleaginosos

La presente invención se refiere a un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido.

De manera más particular, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa; preparar un inóculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentación para obtener un primer caldo de fermentación; alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación; someter al menos una porción de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración para obtener un primer retenido y un primer permeado; alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentación; someter dicho primer permeado a un tratamiento de purificación para obtener un segundo permeado y un segundo retenido o una fase evaporada y un concentrado; alimentar dicho segundo retenido o concentrado a dicho segundo dispositivo de fermentación; al final de dicha fermentación, someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa; en donde dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentación.

Los lípidos obtenidos de este modo pueden usarse ventajosamente en la producción de biocarburantes, tal como, por ejemplo, biodiésel o diésel verde, que pueden usarse tal como están o en una mezcla con otros carburantes para vehículos de motor.

En general, la biomasa se define como cualquier sustancia de origen orgánico, vegetal o animal que puede utilizarse con fines energéticos, por ejemplo, como materia prima para la producción de biocarburantes y/o biocombustibles, o de componentes que se pueden añadir a carburantes y/o biocombustibles. Por lo tanto, la biomasa puede actuar como fuente de energía renovable, como alternativa a las materias primas tradicionales de origen fósil que se usan convencionalmente en la producción de carburantes y/o combustibles. La biomasa lignocelulósica es particularmente útil para este propósito.

La producción de azúcares a partir de biomasa, en particular de biomasa lignocelulósica, se conoce en la técnica.

La biomasa lignocelulósica es una estructura compleja que comprende tres componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Las cantidades relativas de las mismas varían según el tipo de biomasa utilizada. Por ejemplo, en las plantas, dichas cantidades varían según la especie y la edad de la planta.

La celulosa es el componente principal de la biomasa lignocelulósica, y generalmente está presente en cantidades que varían del 30 % en peso al 60 % en peso en función del peso total de la biomasa lignocelulósica. La celulosa consiste en moléculas de glucosa (aproximadamente de 500 a 10000 unidades) unidas por un enlace p-1,4-glucosídico. La formación de enlaces de hidrógeno entre las cadenas conduce a la formación de dominios cristalinos que dan a las fibras vegetales fuerza y resistencia. En la naturaleza, solo se encuentra en la forma pura en plantas anuales tales como el algodón y el lino, mientras que en las plantas leñosas siempre está acompañada de hemicelulosa y lignina.

La hemicelulosa, que generalmente está presente en cantidades que van del 10 % en peso al 40 % en peso en función del peso total de la biomasa lignocelulósica, tiene forma de un polímero mixto relativamente corto (de 10 a 200 moléculas) y ramificado formado a partir de azúcares que tienen seis átomos de carbono (glucosa, manosa, galactosa) y de azúcares que tienen cinco átomos de carbono (xilosa, arabinosa). Algunas propiedades importantes de dichas fibras vegetales se deben a la presencia de hemicelulosa, entre las que destaca la propiedad de promover la imbibición de dichas fibras vegetales cuando hay agua, haciendo que se hinchen. La hemicelulosa muestra además propiedades adhesivas y, por lo tanto, tiende a cementarse o adquirir una consistencia similar a la de un cuerno, con el resultado de que dichas fibras vegetales se vuelven rígidas y absorben más lentamente.

la lignina generalmente está presente en cantidades que van del 10 % en peso al 30 % en peso en función del peso total de la biomasa lignocelulósica. La función principal de la misma es unir y cementar las diversas fibras de la planta para darle a la planta compactación y fuerza, y además forma una protección contra los insectos, patógenos, daños y luz ultravioleta. Se utiliza principalmente como combustible, pero actualmente también se usa ampliamente en la industria como dispersante, agente de endurecimiento, emulsionante, para laminados de material plástico, cajas y productos de caucho. Además, también se puede tratar químicamente para producir compuestos aromáticos, tal como la vainillina, siringaldehído, p-hidroxibenzaldehído, que se puede usar en química farmacéutica o en las industrias cosmética y alimentaria.

Para mejorar la transformación de la biomasa lignocelulósica en productos para uso energético, se sabe que se somete dicha biomasa lignocelulósica a un tratamiento preliminar para separar la lignina e hidrolizar la celulosa y la hemicelulosa a azúcares simples tales como glucosa y xilosa. Dichos azúcares se pueden usar después como fuente de carbono en los procesos de fermentación en presencia de microorganismos para la producción de alcoholes y/o lípidos.

Por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 2009/108773 describe un método para tratar previamente una biomasa lignocelulósica que comprende: tratar previamente la biomasa lignocelulósica en un primer reactor presurizado, en donde la biomasa lignocelulósica se somete a hidrólisis; descargar la biomasa lignocelulósica de dicho primer reactor presurizado y enviarla a un dispositivo de sellado presurizado que tiene un primer acoplamiento presurizado conectado al puerto de descarga de dicho primer reactor presurizado; mantener una fase de vapor en dicho primer reactor presurizado inyectando vapor en él, en donde el vapor inyectado proporciona energía térmica a la biomasa lignocelulósica; lavar la biomasa lignocelulósica en una región aguas abajo de dicho primer reactor presurizado o de dicho dispositivo de sellado presurizado; drenar un líquido que incluye hemicelulosa disuelta extraída de la biomasa lignocelulósica de dicho primer reactor presurizado o de dicho dispositivo de sellado presurizado; descargar la biomasa lignocelulósica del dispositivo de sellado presurizado a través de un segundo acoplamiento presurizado a un segundo reactor presurizado, en donde la biomasa lignocelulósica se mantiene a una presión más alta que la del primer reactor presurizado; en dicho segundo reactor presurizado, infundir células de la biomasa lignocelulósica con vapor o vapor de agua inyectando vapor o vapor de agua en dicho segundo reactor presurizado; liberando rápidamente la presión aplicada a la biomasa lignocelulósica infundida con agua para causar una explosión de vapor en las células de la biomasa lignocelulósica y purificar la biomasa lignocelulósica. Dicho método permite obtener azúcares que pueden usarse para la producción de alcoholes (por ejemplo, etanol).

La solicitud de patente internacional WO 2012/042544 describe una composición de biomasa que comprende un sólido, un líquido, una cantidad de azúcares C5 basada en la cantidad de arabinanos y xilanos y los monómeros, dímeros, oligómeros y polímeros de arabinosa y xilosa incluidos en el líquido y sólido de la composición, una cantidad de azúcares C6 basada en la cantidad de glucano, que incluye los monómeros, dímeros, oligómeros y polímeros de glucano, incluidos en el líquido y sólido de la composición, y furfural, en donde la composición se caracteriza además por tener una accesibilidad a las enzimas hidrolíticas de 24 horas de al menos un 30 %. Dicha composición se obtiene por explosión de vapor. Los azúcares obtenidos después de la hidrólisis enzimática pueden usarse para la producción de etanol.

La solicitud de patente internacional WO 2009/063138 describe un método para producir lípidos o mezclas de lípidos a partir de material orgánico que comprende un polisacárido, que se selecciona del grupo que comprende celulosa, hemicelulosa, almidón, todos estos, mezclas de los mismos o productos de degradación de los mismos o un polisacárido sin almidón, caracterizado por comprender: (a) tratar el material orgánico con una sustancia, que se selecciona entre el grupo que comprende: (i) agua, (ii) ácido y (iii) álcali, y posteriormente separar el precipitado y el filtrado obtenidos, y someter el precipitado obtenido de dicho tratamiento a molienda mecánica o termomecánica como tal o en presencia de agua, ácido o alcalino, y separar el precipitado y el filtrado y, como alternativa, someter el precipitado una o más veces nuevamente al (a los) tratamiento(s) de cualquiera de las secciones (i), (ii) o (iii) y/o molienda, y (b) poner en contacto un microorganismo productor de lípidos con el filtrado obtenido de este modo o con los diversos filtrados obtenidos o con el precipitado, o con cualquier combinación de los mismos y, opcionalmente, con el material orgánico, en un medio de cultivo, mediante el cual las células de microorganismos comienzan a producir lípidos y (c) recuperar los lípidos. Los lípidos obtenidos por dicho método pueden usarse en la producción de biocarburantes.

La solicitud de patente internacional WO 2010/149859 describe un método para la producción de grasa, caracterizado porque el método comprende las etapas de: poner en contacto, en un medio de cultivo, una fase líquida o una masa celular residual o una mezcla de las mismas o cualquier fracción o fracciones de las mismas, obtenidas por separación, antes o después de la recuperación de grasa o en relación con la recuperación de grasa, a partir de una masa unicelular obtenida de un proceso de producción de aceite con células sueltas, con un microorganismo capaz de producir grasa y permitir que el microorganismo produzca grasa y/o poner en contacto, en un medio de cultivo, una suspensión de células sueltas o una masa celular obtenida de un proceso de producción de aceite con células sueltas, o una fase líquida obtenida de dicho proceso, o una suspensión celular de microorganismos obtenida de otras maneras, una masa celular o una fase líquida obtenida de otras maneras, o mezclas de las mismas o una fracción o fracciones obtenidas de esta manera, con un microorganismo capaz de producir grasa, y permitir que el organismo produzca grasa, y recuperar la grasa resultante o pasar la masa del microorganismo a un proceso de producción de aceite con células sueltas. La grasa obtenida por dicho método puede usarse en la producción de biocarburantes.

La solicitud de patente americana US 2008/0102176 describe un método para extraer grasas vegetales que comprende: pulverizar la materia prima que contiene celulosa en una pluralidad de partículas de 1-2 mm de diámetro; sumergir las partículas en ácido sulfúrico de una concentración de 1 % -2 % para acidificar dichas partículas para potenciar la hidrólisis y ajustar el valor de pH a 4,5 ± 0,5; eliminar las partículas acidificadas a partir de ácido sulfúrico y añadir celulasa y levadura oleaginosa en secuencia a las partículas acidificadas y fermentar durante 8-9 días a una temperatura de 25 °C-30 °C y una humedad del 85 % -90 %; añadir hidrocarburos alifáticos como solvente en los productos de fermentación para extraer grasas, obteniendo así la mezcla de extracción; y eliminar las partículas acidificadas que quedan en la mezcla de extracción y separar las grasas del disolvente por destilación para obtener así aceite crudo. Preferentemente, la celulasa se obtiene de Trichoderma viride y la levadura oleaginosa es Rhodotorula glutinis. Las grasas obtenidas se pueden convertir en biodiésel después de la esterificación.

Dai et al. describen la producción de biodiésel a partir de levadura oleaginosa en el artículo, "Biodiesel generation from oleaginous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity", publicado en el "African Journal of Biotechnology" (2007), Vol. 6 (18), págs. 2130-2134. En este artículo, la biomasa lignocelulósica se tritura y se somete a hidrólisis ácida en presencia de ácido sulfúrico. Los azúcares obtenidos de este modo se utilizan como fuentes de carbono en un proceso de fermentación en presencia de una cepa de Rhodotorula glutinis, seleccionado de antemano, que también es capaz de usar pentosas, en particular xilosa, para obtener aceites que posteriormente se extraen mediante extracción Soxhlet y se someten a transesterificación para obtener biodiésel.

La solicitud de patente internacional WO 2010/046051 describe un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa a hidrólisis ácida en presencia de una solución acuosa de al menos un ácido orgánico que tiene de C⁷ a C²⁰ átomos de carbono, preferentemente de C⁹ a C¹⁵ átomos de carbono, a una temperatura que varía entre 80 °C y 160 °C, obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa,

- someter dicha primera mezcla a hidrólisis enzimática obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase sólida y una segunda fase acuosa,

- someter dicha segunda fase acuosa a fermentación en presencia de al menos una levadura oleaginosa obteniendo una biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos.

Los lípidos obtenidos de este modo pueden usarse ventajosamente en la producción de biodiésel o diésel verde, que pueden usarse tal como están o en una mezcla con otros carburantes para vehículos de motor.

La solicitud de patente internacional WO 2012/052368 describe un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis ácida obteniendo una primera mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa;

- alimentar dicha primera fase acuosa a un dispositivo de fermentación en presencia de al menos una levadura oleaginosa obteniendo un primer caldo de fermentación que comprende una primera biomasa celular oleaginosa; - someter dicha primera fase sólida a hidrólisis ácida o a hidrólisis enzimática obteniendo una segunda mezcla que comprende una segunda fase sólida y una segunda fase acuosa;

- alimentar dicha segunda fase acuosa a dicho dispositivo de fermentación en presencia de dicho primer caldo de fermentación obteniendo un segundo caldo de fermentación que comprende una segunda biomasa celular oleaginosa que incluye lípidos;

- someter al menos una parte de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración obteniendo un retenido y un permeado;

- alimentar dicho retenido a dicho dispositivo de fermentación.

Los lípidos obtenidos de este modo pueden usarse ventajosamente en la producción de biodiésel o diésel verde, que pueden usarse tal como están o en una mezcla con otros carburantes para vehículos de motor.

La solicitud de patente italiana MI2012A002249 describe un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa;

- preparar un inóculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentación para obtener un primer caldo de fermentación;

- alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación;

- someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa;

- someter dicha segunda fase acuosa a ósmosis inversa para obtener un permeado y un retenido;

- alimentar dicho retenido a dicho primer dispositivo de fermentación o a dicho segundo dispositivo de fermentación, preferentemente a dicho primer dispositivo de fermentación.

La solicitud de patente internacional WO 2012/052368 divulga un proceso para producir lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis obteniendo una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa,

- preparar un inóculo que comprende al menos una fermentación de microorganismos oleaginosos en un primer dispositivo obteniendo un primer caldo de fermentación,

- alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación,

- someter al menos una porción de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración, obteniendo un primer retenido y un primer permeado,

- alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentación,

- al final de dicha fermentación, someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa.

Singh, R en el Capítulo 3.1.15 de "Hybrid Membrane Synthesis for Water Purification, 2006, páginas 151-153, divulgan un proceso para producir productos de fermentación en un biorreactor de reciclaje de membrana que comprende:

- someter al menos una porción del caldo de fermentación a microfiltración, obteniendo un retenido que comprende las células y un permeado,

- alimentar dicho retenido que comprende las células al biorreactor,

en donde dicha microfiltración se realiza de forma continua durante la fermentación.

Los lípidos obtenidos de este modo pueden usarse ventajosamente en la producción de biodiésel o diésel verde, que pueden usarse tal como están o en una mezcla con otros carburantes para vehículos de motor.

Debido a que la reducción de los costes del proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa es importante, en particular si dichos lípidos se utilizan posteriormente en la producción de biocarburantes, tal como biodiésel o diésel verde, debido a que dichos biocarburantes compiten con los combustibles fósiles, que tienen un coste menor, el estudio de nuevos procesos capaces de reducir dichos costes y mejorar el rendimiento de los lípidos sigue siendo de gran interés.

Por lo tanto, el solicitante se ha enfrentado al problema de encontrar un proceso para producir lípidos que sean utilizables en la producción de biocarburantes, tal como biodiésel o diésel verde, que sea capaz de reducir los costes del proceso y mejorar el rendimiento de los lípidos.

El solicitante ahora ha descubierto que la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido puede implementarse ventajosamente mediante un proceso que comprende someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa; preparar un inóculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentación para obtener un primer caldo de fermentación; alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación; someter al menos una porción de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración para obtener un primer retenido y un primer permeado; alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentación; someter dicho primer permeado a un tratamiento de purificación para obtener un segundo permeado y un segundo retenido o una fase evaporada y un concentrado; alimentar dicho segundo retenido o concentrado a dicho segundo dispositivo de fermentación; al final de dicha fermentación, someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa; en donde dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentación.

Este proceso conlleva a numerosas ventajas. Por ejemplo, porque dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentación, dicho proceso hace posible:

- mantener constante el volumen de dicho segundo caldo de fermentación en dicho segundo dispositivo de fermentación y aumentar la concentración de la biomasa celular oleaginosa en dicho segundo caldo de fermentación;

- tomar una parte del agua (es decir, el primer permeado) de dicho segundo caldo de fermentación para eliminar el calor (es decir, se elimina una corriente a la temperatura de fermentación y se proporciona una corriente de temperatura más baja al fermentador);

- usar para dichas soluciones de azúcares de fermentación que son más diluidas de lo normal y están disponibles a costes más bajos;

- recuperar los azúcares así como otras sustancias orgánicas e inorgánicas utilizadas en la fermentación (p. ej., nitratos, fosfatos) que están incluidos en dicho primer permeado y para reciclarlos a la fermentación (es decir, segundo retenido o concentrado), dando como resultado costes de proceso más bajos;

- usar un hidrolizado lignocelulósico (es decir, una primera fase acuosa) que tiene un mayor contenido de compuestos tóxicos, tales como furfural (F), 5-hidroximetilfurfural (HMF), que pueden actuar como inhibidores del crecimiento de los microorganismos utilizados convencionalmente en la fermentación y, por lo tanto, no hay que prestar especial atención a los métodos de hidrólisis de biomasa;

- trabajar con volúmenes más bajos al final de dicha fermentación;

- obtener lípidos con un mayor rendimiento [por ejemplo, un rendimiento de lípidos mayor o igual al 25 % basándose en la cantidad total de azúcares utilizados para la fermentación, calculándose dicho rendimiento de lípidos como gramos de lípidos obtenidos por gramo de azúcar utilizado para la fermentación].

Dichos lípidos pueden usarse ventajosamente en la producción de biocarburantes, tal como biodiésel o diésel verde, que pueden usarse tal como están o en una mezcla con otros carburantes para vehículos de motor.

La presente invención se refiere, por lo tanto, a un proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa;

- preparar un inóculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentación para obtener un primer caldo de fermentación;

- alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación;

- someter al menos una porción de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración para obtener un primer retenido y un primer permeado;

- alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentación;

- someter dicho primer permeado a un tratamiento de purificación para obtener un segundo permeado y un segundo retenido o una fase evaporada y un concentrado;

- alimentar dicho segundo retenido o concentrado a dicho segundo dispositivo de fermentación;

- al final de dicha fermentación, someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa;

en donde dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentación.

Para el fin de la presente descripción y de las siguientes reivindicaciones, las definiciones de intervalos numéricos siempre incluyen los extremos a menos que se indique lo contrario.

Para el fin de la presente descripción y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "que comprende" también incluye las expresiones "que consiste esencialmente en" o "que consiste en". En una realización preferida de la presente invención, dicho polisacárido puede seleccionarse de celulosa, hemicelulosa o mezclas de las mismas. La celulosa, o mezclas de celulosa y hemicelulosa, son particularmente preferidas.

En una realización preferida adicional de la presente invención, dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido es una biomasa lignocelulósica. Tal como se indica anteriormente, la biomasa lignocelulósica consta de tres componentes: hemicelulosa, celulosa y lignina.

Preferentemente, dicha biomasa lignocelulósica puede seleccionarse, por ejemplo, de:

- productos derivados de cultivos cultivados específicamente para uso energético como el miscanto, pasto varilla, caña común, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dichos productos o de su procesamiento; - productos derivados de productos agrícolas como el cardo mariano, guayule, maíz, soja, algodón, semilla de lino, colza, caña de azúcar, aceite de palma, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho derivados de dichos productos o de su procesamiento;

- productos derivados de la forestación o la silvicultura, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dichos productos o de su procesamiento;

- restos de alimentos y productos agrícolas destinados a la nutrición humana o zootecnia;

- residuos no tratados químicamente de la industria del papel;

- materiales de desecho de la recogida por separado de desechos sólidos municipales (tales como desechos de plantas municipales, papel);

- algas tal como macroalgas o microalgas, macroalgas en particular.

Preferentemente, dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido puede seleccionarse de cardo, guayule, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dicho cardo o guayule o de su procesamiento.

En una realización preferida de la presente invención, dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido puede someterse a un procedimiento preliminar de molienda antes de someterse a dicha hidrólisis. Preferentemente, dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido puede triturarse para obtener partículas que tienen un diámetro que varía entre 0,1 mm y 10 mm, más preferentemente que varía entre 0,5 mm y 4 mm. Se prefieren particularmente las partículas que tienen un diámetro inferior a 1 mm.

Para el fin de la presente invención, la hidrólisis de la biomasa que incluye al menos un polisacárido se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Ejemplos no limitantes de dichos métodos son:

- tratamiento térmico conocido como "explosión de vapor", seguido de hidrólisis enzimática, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2012/042544 mencionada anteriormente;

- tratamiento en presencia de ácidos diluidos, por ejemplo ácido sulfúrico diluido, seguido de hidrólisis enzimática, como se describe, por ejemplo, por Humbrid D. et al. en "Technical Report Nrel/Tp-5100-47764" (Mayo de 2011); - tratamiento en presencia de ácidos orgánicos, por ejemplo ácido 2-naftalenosulfónico, seguido de hidrólisis enzimática, como se describe, por ejemplo, en la patente internacional WO 2010/046051 mencionada anteriormente.

Dicha hidrólisis enzimática se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en las patentes americanas US 5.628.830, US 5.916.780, US 6.090.595, utilizando enzimas disponibles comercialmente tal como, por ejemplo, Celluclast 1.5L (Novozymes), Econase CE (enzimas Rohm), Spezyme (Genecor), Novozym 188 (Novozymes), usadas de forma individual o mezcladas juntas.

Dicha hidrólisis da como resultado una mezcla que comprende una fase sólida y una fase acuosa.

Dicha mezcla se somete a filtración o centrifugación para obtener una primera fase sólida y una primera fase acuosa.

Dicha primera fase sólida comprende lignina y dicha primera fase acuosa comprende al menos un azúcar que tiene de 5 a 6 átomos de carbono, más preferentemente xilosa y glucosa.

Las cantidades de azúcar obtenidas después de la hidrólisis pueden determinarse mediante técnicas conocidas en la técnica tales como, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) o cromatografía de intercambio iónico.

En una realización preferida de la presente invención, dicha fase acuosa puede comprender:

- una cantidad de glucosa mayor que o igual a 50 g/l, preferentemente mayor que o igual a 100 g/l, hasta el límite de solubilidad de glucosa en dicha primera fase acuosa;

- una cantidad de xilosa de 0 g/l a 200 g/l, preferentemente de 10 g/l a 100 g/l;

- una cantidad de arabinosa de 0 g/l a 20 g/l, preferentemente de 5 g/l a 10 g/l;

- una cantidad de manosa de 0 g/l a 20 g/l, preferentemente de 2 g/l a 10 g/l;

- una cantidad de galactosa de 0 g/l a 10 g/l, preferentemente de 2 g/l a 8 g/l;

- una cantidad de ácido acético de 0 g/l a 8 g/l, preferentemente de 0 g/l a 5 g/l;

- una cantidad de furfural (F) de 0 g/l a 2,5 g/l, preferentemente de 0,1 g/l a 1,5 g/l;

- una cantidad de 5-hidroximetilfurfural (HMF) de 0 g/l a 4,5 g/l, preferentemente de 0,2 g/l a 3,5 g/l.

Sin embargo, cabe señalar que el proceso de acuerdo con la presente invención hace posible utilizar cantidades de compuestos tóxicos, es decir, furfural (F) y 5-hidroximetilfurfural (HMF), mucho mayores que las que se usan normalmente, es decir, hace posible utilizar una cantidad de furfural (F) que varía entre 0,1 g/l y 1,5 g/l y una cantidad de 5-hidroximetilfurfural (HMF) que varía entre 0,2 g/l y 3,5 g/l.

Para obtener dicho inoculado, al lado de al menos un microorganismo oleaginoso, tiene que añadirse al menos una solución acuosa que comprende una cantidad de azúcares mayor que o igual a 40 g/l, que varía preferentemente entre 45 g/l y 60 g/l, a dicho primer dispositivo de fermentación. En una realización preferida de la presente invención, en dicho primer dispositivo de fermentación, la fermentación se puede llevar a cabo a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C, que varía preferentemente entre 25 °C y 35 °C.

En una realización preferida de la presente invención, en dicho primer dispositivo de fermentación, la fermentación puede llevarse a cabo durante un tiempo que varía entre 10 horas y 36 horas, que varía preferentemente entre 12 horas y 26 horas.

En una realización preferida de la presente invención, en dicho primer dispositivo de fermentación, la fermentación puede llevarse a cabo a un pH que varía entre 4,5 y 7, que varía preferentemente entre 5 y 6,7. Para mantener el pH en los intervalos deseados, puede añadirse una solución acuosa de al menos una base inorgánica, tal como, por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio o mezclas de los mismos, preferentemente hidróxido de potasio, o al menos un ácido inorgánico, tal como, por ejemplo, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o mezclas de los mismos, en una cantidad tal como para obtener el pH deseado, al medio de cultivo utilizado para la fermentación.

Cabe destacar que, en el proceso de acuerdo con la presente invención, dicha solución acuosa comprende una cantidad de azúcar mayor que o igual a 40 g/l, que varía preferentemente entre 45 g/l y 60 g/l, puede ser una alícuota de la primera fase acuosa obtenida de la hidrólisis de la biomasa que incluye al menos un polisacárido, opcionalmente diluido para tener las cantidades deseadas de azúcar.

Cuando el microorganismo oleaginoso ha alcanzado una concentración mayor que o igual a 8 g/l, que varía preferentemente entre 10 g/l y 25 g/l, dicho primer caldo de fermentación, de acuerdo con el proceso de acuerdo con la presente invención, se proporciona a un segundo dispositivo de fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, en dicho segundo dispositivo de fermentación, la fermentación se puede llevar a cabo a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C, que varía preferentemente entre 25 °C y 35 °C.

En una realización preferida de la presente invención, en dicho segundo dispositivo de fermentación, la fermentación puede llevarse a cabo durante un tiempo que varía entre 2 días y 10 días, que varía preferentemente, de 3 días a 8 días.

En una realización preferida de la presente invención, en dicho segundo dispositivo de fermentación, la fermentación puede llevarse a cabo a un pH que varía entre 4,5 y 7, que varía preferentemente entre 5 y 6,7. Para mantener el pH en los intervalos deseados, puede añadirse una solución acuosa de al menos una base inorgánica, tal como, por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de calcio, hidróxido de magnesio o mezclas de los mismos, preferentemente hidróxido de potasio, o al menos un ácido inorgánico, tal como, por ejemplo, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico o mezclas de los mismos, en una cantidad tal como para obtener el pH deseado, al medio de cultivo utilizado para la fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, dicho microorganismo puede seleccionarse de levaduras oleaginosas tales como Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Torulopsis sp., Pichia stipitis, Trichosporon cacaoliposimilis, Trichosporon oleaginosus, Trichosporon pullulans, Rhodosporidium azoricum, Cryptococcus curvatus.

En una realización preferida de la presente invención, la fermentación en dicho segundo dispositivo de fermentación puede llevarse a cabo en una o más etapas, en modo discontinuo ("discontinua"), en modo semi-continuo ("discontinua alimentada"), en modo continuo, en modo de perfusión. Preferentemente, la fermentación en dicho segundo dispositivo de fermentación se lleva a cabo en un modo discontinuo ("discontinua") durante las primeras 3 horas - 10 horas y posteriormente en un modo de perfusión.

Para el fin de la presente descripción y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "modo de perfusión" significa que durante la fermentación, dentro de dicho segundo dispositivo de fermentación, el volumen de dicho segundo caldo de cultivo se mantiene constante, mientras que al menos parte del medio de cultivo utilizado para la fermentación se reemplaza, de manera continua, con el segundo retenido o el concentrado que derivan del tratamiento de purificación, haciendo posible, de este modo, que la biomasa celular se concentre en el mismo. Dicho "modo de perfusión" se implementa mediante la microfiltración mencionada anteriormente, que en realidad se lleva a cabo de manera continua durante la fermentación.

En dicho primer dispositivo de fermentación y en dicho segundo dispositivo de fermentación, que son dispositivos bien conocidos en la técnica, la fermentación se lleva a cabo en presencia de medios de cultivo utilizados convencionalmente para este fin, que comprenden, junto con los azúcares, diversos nutrientes, tal como, por ejemplo, nitrógeno, fosfato potásico, magnesio, sales, vitaminas, microelementos

Para aumentar el rendimiento de los lípidos, se puede añadir licor de maíz fuerte a dicho segundo dispositivo de fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, dicho proceso comprende además añadir a dicho segundo dispositivo de fermentación licor de maíz fuerte en una cantidad que varía entre 2 g/l y 20 g/l, que varía preferentemente entre 4 g/l y 18 g/l. Dicho licor de maíz fuerte puede añadirse tanto al alimentar dicha primera fase acuosa como después de alimentar de dicha primera fase acuosa.

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede llevarse a cabo durante la fase de crecimiento exponencial (o logarítmica) de la biomasa celular oleaginosa.

Para el fin de la presente descripción y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "fase de crecimiento exponencial (o logarítmica)", significa la fase en la cual el microorganismo oleaginoso utilizado en la fermentación se reproduce a una velocidad constante (correspondiente a la velocidad máxima de reproducción) determinada tanto por las características genéticas de dicho microorganismo oleaginoso como por factores ambientales (p. ej., temperatura, composición del medio de cultivo). A modo de ejemplo, para el microorganismo oleaginoso utilizado en los ejemplos a continuación, es decir Rhodosporidium azoricum RGRDP3, la fase de crecimiento exponencial varía entre 3 horas y 10 horas.

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede llevarse a cabo a través de membranas que tienen un diámetro medio de poro que varía entre 0,02 |jm y 2,0 |jm, que varía preferentemente entre 0,1 jm y 0,8 jm .

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede llevarse a cabo aplicando una presión transmembrana (TMP, por sus siglas en inglés) que varía entre 5X103 Pa (0,05 bar) y 2,5X105 Pa (2,5 bar), que varía preferentemente entre I ^{0 4} Pa (0,1 bar) y 2,2X105 Pa (2,2 bar).

Dicha presión transmembrana (TMP) se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

TMP = 0,5*(Pi P²) - P³

en donde:

Pi = presión de la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa en el lado de entrada de la membrana; P² = presión de la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa en el lado de salida de la membrana;

P3 = presión del permeado.

Cabe destacar que, para el fin de la presente invención, dicha presión transmembrana (TMP) se puede obtener usando una bomba, por ejemplo una bomba peristáltica, que, cuando se aplica al aparato de microfiltración aguas abajo de la salida de permeado, disminuye la presión en el lado de salida de la membrana, produciendo una presión transmembrana positiva (TMP) que genera un flujo de permeado.

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede llevarse a cabo realizando un flujo específico (kg de permeado por metro cuadrado de superficie de la membrana de microfiltración por hora) que varía entre 0,2 kg/(m2 x h) y 70 kg/(m2 x h), variando más preferentemente de 0,4 kg/(m2 x h) a 50 kg/(m2 x h).

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede llevarse a cabo a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C, que varía preferentemente entre 25 °C y 35 °C, más preferentemente a la temperatura de fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, dicha microfiltración puede implementarse a través de láminas planas o membranas poliméricas de fibra hueca sumergidas o en configuración tangencial ("flujo cruzado"), o a través de membranas cerámicas sumergidas o en configuración tangencial ("flujo cruzado") o en configuración giratoria ("flujo cruzado dinámico"). Ejemplos de membranas que pueden usarse para el fin de la presente invención y que están disponibles comercialmente son "Casetes de microfiltración Hydrosart®" de Sartorius, productos Ceram inside® de Tami, productos Schumasiv ™ o Membralox® de Pall, o productos Microza de Asahi Kasei Corporation.

Para el fin de la presente invención y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "primer retenido" significa la suspensión acuosa que contiene biomasa celular oleaginosa concentrada derivada de la microfiltración de al menos parte de dicho segundo caldo de fermentación.

Para el fin de la presente invención y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "primer permeado" significa la corriente acuosa que contiene azúcares y otras sustancias orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, nitratos, fosfatos) de la microfiltración de al menos parte de dicho segundo caldo de fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, dicho tratamiento de purificación puede implementarse por medio de ósmosis inversa o por evaporación.

En una realización preferida de la presente invención, dicha ósmosis inversa se lleva a cabo en presencia de al menos una membrana polimérica que se selecciona de las membranas poliméricas generalmente utilizadas para la desalinización (generalmente conocidas como "membranas de agua de mar" o "membranas de agua salobre") tales como, por ejemplo: membranas que comprenden poliamidas, poliimidas, polisulfonas, polietersulfonas. Preferentemente, dicha membrana polimérica se selecciona de las membranas poliméricas que comprenden poliamidas.

En una realización preferida de la presente invención, dicha membrana polimérica puede tener una temperatura máxima de funcionamiento que varía entre 15 °C y 90 °C, que varía preferentemente entre 20 °C y 80 °C, variando aún más preferentemente de 20 °C a la temperatura de fermentación.

En una realización preferida de la presente invención, dicha membrana polimérica puede tener una presión operativa máxima que varía entre 5 X105 Pa (5 bar) y 8 X106 Pa (80 bar), que varía preferentemente entre 106 Pa (10 bar) y 7X106 Pa (70 bar).

En una realización preferida de la presente invención, dicha membrana polimérica puede tener un límite de peso molecular (MWCO por sus siglas en inglés) que varía entre 30 daltons y 200 daltons, que varía preferentemente entre 40 daltons y 100 daltons.

En una realización preferida de la presente invención, dicha membrana polimérica puede seleccionarse de aquellas que tienen un pH operativo compatible con el pH del primer permeado, que varía preferentemente de 1 a 13, variando más preferentemente de 2 a 11, incluso variando más preferentemente de 3,5 a 7,5.

Ejemplos de membranas poliméricas que pueden usarse para los fines de la presente invención y que están disponibles comercialmente son los productos Dow™ Filmtec™ de la serie SW30, serie BW30 o serie BW30LE, de Dow Chemical, o los productos Desal™ de la serie AG de General Electric, o los productos TFC®-HR de Koch Membrane Systems.

La membrana polimérica mencionada anteriormente puede estar en forma de discos planos, membranas tubulares, membranas modulares en espiral, membranas compuestas de película delgada (TFC, por sus siglas en inglés), o en otras formas útiles.

En una realización preferida de la presente invención, dicha ósmosis inversa puede llevarse a cabo aplicando una presión en el lado de alimentación (lado retenido) que varía entre 5X105 Pa (5 bar) y 8X106 Pa (80 bar), que varía preferentemente entre 106 Pa (10 bar) y 4X106 Pa (40 bar).

En una realización preferida de la presente invención, dicha ósmosis inversa puede llevarse a cabo trabajando a un flujo específico (kg de permeado por metro cuadrado de la superficie de la membrana de ósmosis inversa por hora) que varía entre 5 kg/(m2 x h) y 80 kg/(m2 x h), variando más preferentemente de 10 kg/(m2 x h) a 40 kg/(m2 x h).

Para el fin de la presente invención y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "segundo retenido" significa la corriente acuosa concentrada en azúcares y otras sustancias orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, nitratos, fosfatos) que deriva de dicho primer permeado. Dicha corriente acuosa concentrada en azúcares contiene preferentemente una cantidad de azúcares que varía entre 20 g/l y 110 g/l, variando más preferentemente de 30 g/l a 100 g/l.

Para el fin de la presente invención y de las siguientes reivindicaciones, la expresión "segundo permeado" significa la corriente acuosa que deriva de dicho primer permeado.

En una realización preferida de la presente invención, dicha evaporación puede llevarse a cabo a una temperatura que varía entre 30 °C y 100 °C y a una presión que varía según la temperatura y que es igual a la presión (presión de vapor) a la que el agua se evapora a esa temperatura, preferentemente a una presión que varía entre 4X103 Pa (0,04 bar) y 105 Pa (1 bar).

Cabe señalar que si el tratamiento de purificación se implementa por evaporación, se obtienen una fase purificada (fase evaporada) equivalente a dicho segundo permeado y un concentrado equivalente a dicho segundo retenido.

Al final de la fermentación, para desactivar las enzimas lipolíticas (p. ej., lipasa), dicho segundo caldo de fermentación puede someterse a un tratamiento térmico. Dicho tratamiento térmico puede llevarse a cabo a una temperatura que varía entre 70 °C y 120 °C, que varía preferentemente entre 75 °C y 110 °C, durante un tiempo que varía entre 5 minutos y 3 horas, que varía preferentemente entre 30 minutos y 2 horas.

Al final de la fermentación, la separación a la que se somete el segundo caldo de fermentación para recuperar dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos (dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa tiene una concentración de biomasa celular oleaginosa mayor que la concentración de biomasa celular oleaginosa en dicho segundo caldo de fermentación) y dicha segunda fase acuosa (dicha segunda fase acuosa que contiene opcionalmente sólidos suspendidos, por ejemplo, las células del microorganismo oleaginoso utilizado en la fermentación, o las partículas derivadas del deterioro del equipo utilizado en el proceso, o de la precipitación de sales) puede implementarse mediante métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, filtración, filtro de prensa, microfiltración o ultrafiltración, centrifugación.

Dicho segundo permeado puede someterse a tratamientos adicionales con el fin de eliminarse, o puede recuperarse y usarse como agua de proceso dentro del proceso de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, como agua de lavado o agua de dilución).

Con el fin de concentrar adicionalmente la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lí pidos obtenida después de la separación, dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa puede, antes de someterse a la recuperación de los lípidos (es decir, a la lisis celular, extracción por disolvente y evaporación del disolvente), someterse a centrifugación. Dicha centrifugación puede llevarse a cabo durante un tiempo que varía entre 5 minutos y 30 minutos, que varía preferentemente entre 15 minutos y 25 minutos, a una velocidad de rotación que varía entre 3000 rpm y 9000 rpm, que varía preferentemente entre 4000 rpm y 8000 rpm.

Con el fin de recuperar los lípidos, dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos puede someterse a lisis celular, que puede implementarse por varios métodos. Ejemplos no limitantes de dichos métodos son:

- tratamiento térmico, que puede llevarse a cabo utilizando autoclaves bajo presión (por ejemplo, autoclave Brignole modelo AU-2, o reactor agitado Parr modelo PA 4575), a una presión que varía entre 2X105 Pa (2 bar) y 6,5X105 Pa (6,5 bar), que varía preferentemente entre 3X105 Pa (3 bar) y 5,5X105 Pa (5,5 bar), a una temperatura que varía entre 100 °C y 160 °C, que varía preferentemente entre 110 °C y 150 °C, durante un tiempo que varía entre 1 hora y 8 horas, preferentemente entre 1,5 horas y 4 horas, en agitación que varía entre 100 rpm y 800 rpm, que varía preferentemente entre 400 rpm y 600 rpm, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional mencionada anteriormente;

- tratamiento mecánico, que puede llevarse a cabo utilizando homogeneizadores de alta presión (por ejemplo, homogeneizador Gea NiroSoavi modelo NS3006L), a una presión que varía entre 8X107 Pa (800 bar) y 2X108 Pa (2000 bar), que varía preferentemente entre 108 Pa (1000 bar) y 1,6X108 Pa (1600 bar), a una temperatura que varía entre 10 °C y 100 °C, que varía preferentemente entre 20 °C y 80 °C, a un caudal de la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que varía entre 5 l/h y 50 l/h, que varía preferentemente de entre 7 l/h y 40 l/h; - tratamiento con microondas, que puede llevarse a cabo utilizando dispositivos de microondas (por ejemplo, dispositivo de microondas Milestone modelo MicroSYNTH), a una temperatura que varía entre 45 °C y 150 °C, que varía preferentemente entre 50 °C y 100 °C, durante un tiempo que varía entre 10 minutos y 2 horas, que varía preferentemente entre 15 minutos y 1 hora.

Al final de dicha lisis celular, los lípidos pueden recuperarse de la suspensión acuosa obtenida de biomasa celular agotada que comprende lípidos, por extracción usando, por ejemplo, un extractor de reflujo.

Dicha extracción puede llevarse a cabo en presencia de al menos un disolvente orgánico, que puede seleccionarse de: solventes orgánicos no polares tales como, por ejemplo, isooctano, n-octano, o mezclas de los mismos; mezclas de hidrocarburos, tal como, por ejemplo, cortes de nafta o diésel que opcionalmente también pueden derivar de la producción de diésel verde; disolventes orgánicos polares tales como, por ejemplo, metanol, etanol, /so-propanol, acetona, acetato de etilo, hexano, metilferc-butilcetona, etil-ferc-butil éter, o mezclas de los mismos; o mezclas de los mismos.

Dicha extracción puede llevarse a cabo a una temperatura que varía entre 20 °C y 200 °C, preferentemente en el punto de ebullición del disolvente usado.

Dicha extracción puede llevarse a cabo en presencia de una cantidad de disolvente que varía entre 1 vez y 6 veces, que varía preferentemente entre 1,5 y 5 veces, el volumen de la fase acuosa de la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa agotada que comprende lípidos que se obtiene de la lisis celular.

La suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa agotada que comprende lípidos que se obtiene después de dicha lisis celular puede someterse a extracción una o más veces. Preferentemente, dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa agotada que comprende lípidos puede someterse a extracción entre 1 y 5 veces, más preferentemente entre 1 vez y 3 veces.

Al final de la extracción mencionada anteriormente, se obtienen las siguientes dos fases:

(i) una fase orgánica que comprende lípidos disueltos en disolvente;

(ii) una fase acuosa que comprende restos celulares y trazas de lípidos no separados.

Con el fin de recuperar los lípidos, dicha fase orgánica (i) se somete a evaporación para obtener como residuo un aceite de alto punto de ebullición (ia) que comprende lípidos y una fase líquida que contiene el disolvente que puede reciclarse a la extracción mencionada anteriormente.

El proceso de acuerdo con la presente invención hace posible recuperar los lípidos con un rendimiento de extracción que varía entre el 40 % y el 99,9 %, preferentemente entre el 45 % y el 99 %, calculándose dicho rendimiento de extracción en función de la cantidad total de lípidos presentes en la biomasa celular oleaginosa (seca) obtenida después de la fermentación.

Preferentemente, los lípidos comprendidos en dicha fase orgánica (i) son triglicéridos, más preferentemente ésteres de glicerol con ácidos grasos que tienen de 14 a 24 átomos de carbono, tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido a-linoleico, en cantidades mayores que o iguales al 80 % en peso, preferentemente mayores que o iguales al 90 % en peso, en función del peso total de la formulación. Otros lípidos que pueden estar presentes en dicha fase orgánica (i) son: fosfolípidos, monoglicéridos, diglicéridos, ácidos grasos libres, o mezclas de los mismos.

La cantidad total de lípidos presentes en la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa obtenida después de la fermentación en dicho segundo dispositivo de fermentación, así como la cantidad total de lípidos incluidos en dicho aceite de alto punto de ebullición (ia) pueden determinarse por métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, el método colorimétrico basado en la reacción de los lípidos con ácido fosfórico y fosfovainillina utilizando, por ejemplo, el kit "total lipid sulpho-phospho-vanillin" comercializado por Spinreact S.A./SAU., Ctra Santa Coloma, 7 -E-17176 Sant Esteve de Bas (Gl), España. Se pueden encontrar más detalles respecto a dicho método, por ejemplo, en el siguiente artículo, "Chemical Basis of the Sulpho-phosphovanillin Reaction for Estimating Total Serum Lipids", J. A. Knight et al., publicado en "Clinical Chemistry" (1972), Vol. 18, n.° 3, págs. 199-202.

Dicha fase acuosa (ii) que comprende los restos celulares, en particular proteínas y polisacáridos incluidos en la membrana celular del microorganismo oleaginoso utilizado, puede deshumidificarse y utilizarse como carburante, opcionalmente en conexión con la lignina derivada de la hidrólisis de la biomasa.

Como alternativa, dicha fase acuosa (ii) puede someterse a digestión anaerobia para producir biogás, que puede usarse para la producción de energía eléctrica, que también puede usarse para cumplir con los requisitos de energía del proceso de acuerdo con la presente invención. Como alternativa, dicha fase acuosa (ii) puede someterse a licuefacción para producir bio-aceite, como se describe, por ejemplo, en las solicitudes de patentes internacionales WO 2010/069583 o WO 2010/069516.

Los lípidos obtenidos por el proceso de acuerdo con la presente invención pueden someterse a esterificación en presencia de al menos un alcohol que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente metanol, etanol, y de al menos un catalizador ácido o básico, para producir glicerol y ésteres de alquilo, en particular ésteres metílicos o ésteres etílicos (biodiésel). Como alternativa, dichos lípidos pueden someterse a hidrogenación/desoxigenación en presencia de al menos un catalizador para producir diésel verde. Los procesos de hidrogenación/oxigenación son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 1.728.844.

La presente invención se ilustrará ahora con mayor detalle por medio de una realización, refiriéndose a la Fig. 1 mencionada anteriormente.

La Fig. 1 describe una realización del proceso de acuerdo con la presente invención. Para este fin, la biomasa que incluye al menos un polisacárido (por ejemplo, biomasa lignocelulósica molida por adelantado) se somete a hidrólisis (trabajando de acuerdo con uno de los métodos mencionados anteriormente conocidos en la técnica) para obtener una mezcla que comprende una primera fase acuosa y una primera fase sólida que incluyen lignina.

Dicha mezcla se somete a filtración o centrifugación (no mostrada en la Fig. 1) para obtener una primera fase sólida y una primera fase acuosa.

Mientras tanto, se prepara un inóculo en un primer dispositivo de fermentación utilizando un microorganismo oleaginoso (p. ej., Rhodosporidium azoricum) para obtener un primer caldo de fermentación: cabe destacar que, como se ha dicho anteriormente, la solución acuosa que comprende una cantidad de azúcares mayor que o igual a 40 g/l, que varía preferentemente entre 45 g/l y 60 g/l, puede ser una alícuota de la primera fase acuosa obtenida de la hidrólisis de la biomasa que incluye al menos un polisacárido, opcionalmente diluida para tener la cantidad deseada de azúcares (indicada por una línea discontinua en la Fig. 1).

Dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación se proporcionan a un segundo dispositivo de fermentación en presencia de un microorganismo oleaginoso (por ejemplo, Rhodosporidium azoricum) para obtener un segundo caldo de fermentación.

Al menos parte de dicho segundo caldo de fermentación se somete, continuamente durante la fermentación, a microfiltración para obtener una corriente acuosa que contiene azúcares y otras sustancias orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, nitratos, fosfatos) (primer permeado - P1), que se somete a un tratamiento de purificación (por ejemplo, por ósmosis inversa o evaporación), y una suspensión acuosa que contiene biomasa celular oleaginosa concentrada (primer retenido

- R1), que se envía a dicho segundo dispositivo de fermentación.

Del tratamiento de purificación se obtiene una corriente acuosa adicional (segundo permeado

- P2), que se envía para su eliminación (aguas residuales), y otra corriente acuosa concentrada en azúcares y otras sustancias orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, nitratos, fosfatos) (segundo retenido - R2), que se envía a dicho segundo dispositivo de fermentación.

Dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante la fermentación. Al final de la fermentación, dicho segundo caldo de fermentación se somete a separación (por ejemplo, por centrifugación) para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa y una segunda fase acuosa. Dicha suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa se somete a lisis celular (trabajando de acuerdo con uno de los métodos descritos anteriormente), extracción en presencia de un disolvente y posterior evaporación del disolvente para obtener lípidos, mientras que dicha segunda fase acuosa se envía para su eliminación (aguas residuales). Para una mejor comprensión de la presente invención y para ponerla en práctica, se dan a continuación algunos ejemplos ilustrativos de la misma.

EJEMPLO 1

Composición del hidrolizado lignocelulósico

El hidrolizado lignocelulósico (es decir, "primera fase acuosa") utilizado en los siguientes ejemplos era de la siguiente composición: glucosa (126 g/l), xilosa (87,1 g/l), arabinosa (7,5 g/l), manosa (2,9 g/l), galactosa (6,5 g/l), ácido acético (4,9 g/l), furfural (F) (1 g/l), 5-hidroximetilfurfural (HMF) (3 g/l), para un contenido total de azúcares de 230 g/l.

El contenido de furfural (F) y de 5-hidroximetilfu rfu ral (HMF) se determinó por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) usando un LichroCART Purospher RP-18 con tapa final (240 mm x 4 mm; 5 |jm) de Merck, provisto de un sensor UV de fotodiodo, con flujo de 0,8 ml/min, temperatura 40 °C, y fase móvil de ácido fosfórico al 0,05 % en agua (eluyente A) y acetonitrilo ácido fosfórico al 0,05 % en agua, a una relación 90/10 vol./vol. (eluyente B), utilizando el gradiente de elución mostrado en la Tabla 1.

TABLA 1

El contenido de azúcares se determinó por cromatografía de intercambio iónico (HPAE-PAD), usando un cromatógrafo Dionex, equipado con una columna Carbopac PA100, con un gradiente de hidróxido de sodio y acetato de sodio como contraión.

La determinación cuantitativa de los ácidos orgánicos, es decir, ácido acético, se implementó utilizando un cromatógrafo de iones DIONEX BIOLC 4000 conectado a un sensor de conductividad (PED - "Detector electroquímico pulsado"), columna de cromatografía Ice-AS1 (diámetro: 9 mm; longitud: 250 mm), supresor AMMS-ICE (supresor de micromembrana Anion), volumen de inyección 50 jl, elución isocrática usando ácido heptafluorobutírico 0,4 mM. EJEMPLO 2

Preparación de inoculo utilizando hidrolizado (Rhodosporidium azoricum)

El inóculo (es decir, el primer caldo de fermentación) se preparó usando parte del hidrolizado lignocelulósico (es decir, la primera fase acuosa) descrito en el Ejemplo 1.

Para este fin, se colocaron 22 ml de dicho hidrolizado lignocelulósico (es decir, primera fase acuosa), diluido adecuadamente con agua (78 ml) para tener una concentración final de azúcares de 50 g/l, en un matraz de 500 ml, provisto de un agitador magnético, al que se añadieron sucesivamente los siguientes: extracto de levadura 2 g/l, 1 g/l de KH²PO, 0,05 g/l de MgSO4- ⁷ H²O, 0,01 g/l de NaCl y 0,01 g/l de NaCl: el pH de la mezcla obtenida se llevó a 6 añadiendo algunas gotas de hidróxido de potasio (KOH) 2,5 M. La mezcla obtenida se esterilizó en un autoclave a 80 °C, durante 45 minutos.

Al final de la esterilización, la mezcla obtenida se llevó a temperatura ambiente (25 °C) y se inoculó con células de Rhodosporidium azoricum RGRDP3, que se dejaron crecer durante 24 horas a 30 °C, en agitación (200 rpm) para obtener un primer caldo de fermentación que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa de 23 g/l (peso seco).

EJEMPLO 3

Fermentación de Rhodosporidium azoricum (microfiltración y osmosis inversa llevadas a cabo de forma continua)

La prueba de fermentación usando células de Rhodosporidium azoricum RGRDP3 se llevó a cabo en un fermentador de 20 litros, trabajando en las siguientes condiciones:

- 0,78 litros de hidrolizado lignocelulósico (es decir, primera fase acuosa) como se describe en el Ejemplo 1, diluido adecuadamente con agua para tener una concentración inicial de azúcares de 30 g/l;

- 2,0 g/l de extracto de levadura;

- 5 g/l de maíz fuerte sólido

- 5 g/l de (NH4)2SO4;

- 6 g/l de KH²PO;

- 0,03 g/l de MgSO4- ⁷ H²O;

- 0,06 g/l de NaCl;

- 0,06 g/l de CaCfc- ² H²O;

- aire suministrado: flujo igual a 1 l/min

- temperatura: 30 °C

- pH de trabajo igual a 6, mantenido añadiendo, según fuera necesario, algunas gotas de una solución de hidróxido de potasio (KOH) 5 M y ácido sulfúrico (H²SO⁴) 10 % (v/v);

- agitación a 600 rpm - 900 rpm, modulada con el flujo de aire para mantener la concentración de oxígeno disuelto (DO²) por encima del 30 % del valor de saturación;

- volumen inicial: 6 litros;

- inóculo de Rhodosporidium azoricum RGRDP3 (es decir, primer caldo de fermentación) obtenido como se describe en el Ejemplo 2, diluido al 10 % (v/v) con el medio de cultivo utilizado para la fermentación para comenzar la fermentación con una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 2,3 g/l (peso seco).

La fermentación se llevó a cabo en modo discontinuo ("discontinua") durante las primeras 6 horas y posteriormente en modo de perfusión. A este respecto, se conectó un dispositivo de microfiltración tangencial, provisto de una membrana de microfiltración "Casetes de microfiltración Hydrosart®" de Sartorius, al fermentador a través de una bomba de pistón, teniendo dicha membrana un área de membrana igual a 0,1 m2 y un diámetro medio de poro igual a 0,45 |jm, con el fin de eliminar parte del medio de cultivo (permeado - P1) y concentrar la segunda biomasa celular oleaginosa (retenido - R1) producida en dicho segundo caldo de cultivo. Para este fin, dicha bomba de pistón se accionó de manera continua, durante la fermentación, para recircular la biomasa celular oleaginosa y el medio de cultivo en dicho aparato de microfiltración a un caudal igual a 144 l/h, trabajando en las mismas condiciones de pH y temperatura dadas anteriormente para la fermentación. Dicha segunda biomasa celular oleaginosa se concentró de este modo para obtener un retenido (R1) que se proporcionó de manera continua al fermentador (recirculación) y un permeado (P1) que se proporcionó de manera continua para la ósmosis inversa. El caudal de permeado (P1) se controló dentro de un intervalo de entre 61 ml/h y 75 ml/h utilizando una bomba peristáltica colocada aguas abajo de la salida del permeado (P1) del aparato de microfiltración.

A este respecto, la prueba de ósmosis inversa se llevó a cabo con un aparato de prueba de membranas planas, que consiste en un recipiente cilindrico de acero en cuya base se montó la membrana polimérica sobre el tabique filtrante poroso que forma el soporte para la membrana. El recipiente, provisto de agitación, puede presurizarse a la presión de 3,5X106 Pa (35 bar). El permeado (P2) se filtra a través de la membrana y se recoge en un recipiente colocado debajo, mientras se enviaba el retenido (R2) que quedaba por encima de la membrana, a través de una válvula de control de flujo situada aguas abajo de dicho aparato, al dispositivo de fermentación, a un caudal que varía entre 20 ml/h y 25 ml/h.

Para la ósmosis inversa, se usó la membrana BW30 de Dow Chemical, siendo esta una membrana compuesta de película delgada (TFC) basada en poliamida que tiene las siguientes características:

- límite de peso molecular nominal (MWCO) = 50 daltons;

- pH de funcionamiento = 2 - 11;

- temperatura máxima de funcionamiento = 70 °C;

- presión máxima de funcionamiento = 6,8X106 Pa (68 bar).

El permeado (P1) se envió de este modo al dispositivo de ósmosis inversa descrito anteriormente, en agitación a 500 rpm, a una presión igual a 3,5X106 Pa (35 bar).

De la ósmosis inversa se obtuvo un segundo retenido (R2) que contenía azúcares concentrados por un factor de concentración igual a 3: pasando de un contenido inicial de azúcares igual a 28 g/l (primer permeado - P1) a un contenido de azúcares igual a 84 g/l (segundo retenido - R2).

El contenido de azúcares se determinó trabajando como se describe en el Ejemplo 1.

Dicho segundo retenido (R2) contenía además sales concentradas. De hecho, el primer permeado (P1) tenía un contenido de sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), cloro (CI) y fósforo (P) igual a 825 ppm, 3186 ppm, 273 ppm, 184 ppm, 320 ppm y 1880 ppm respectivamente; Al mismo tiempo, el segundo permeado (P2) tenía un contenido de sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), cloro (CI) y fósforo (P) de 8 ppm, 50 ppm, menos de 2 ppm, menos de 2 ppm, 25, 4 ppm, y el segundo retenido (R2) tenía un contenido de sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg), calcio (Ca), cloro (CI) y fósforo (P) igual a 2440 ppm, 9550 ppm, 820 ppm, 552 ppm, 960 ppm y 5640 ppm respectivamente.

El contenido de sales se determinó por espectroscopía de masas por plasma acoplado inductivamente (ICP-MS, por sus siglas en inglés). Para este fin, se utilizó el espectrómetro de ICP-MS ELAN DRCe de Perkin Elmer. La dilución utilizada para el análisis por medio de la ICP-MS mencionada anteriormente varió dependiendo del analito relevante; la muestra para análisis se acidificó con ácido nítrico (HNO³) al 2 % en volumen. Las soluciones patrón utilizadas para la calibración se prepararon diluyendo y acidificando soluciones patrón acuosas certificadas de 1000 ppm.

El caudal del suministro al fermentador, en otras palabras, del segundo retenido (R2) más hidrolizado nuevo, se controló automáticamente durante la duración de la fermentación utilizando un sensor de nivel, de tal manera que se compensó el volumen del permeado a la salida de la microfiltración (P1) y el volumen del caldo de fermentación permaneció constante en el fermentador: dicho suministro era de una concentración de azúcares de 295 g/l y estaba compuesto, tal como se indica anteriormente, del retenido (R2) y del hidrolizado nuevo, que se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1 y se diluyó como se describe anteriormente, en una relación de 1:2.

Dicho caudal se controló dentro de un intervalo entre 61 ml/h y 75 ml/h para tener una cantidad de azúcares de entrada que variaba entre 22 g/h y 18 g/h para cumplir los requisitos de la levadura oleaginosa y mantener una concentración de 30 g/l en el fermentador.

Al final de la fermentación, después de 100 horas, se obtuvo un segundo caldo de fermentación con una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 68 g/l (peso seco) y un contenido total de lípidos igual al 55 % en peso (37,4 g/l) basándose en el peso seco de dicha biomasa celular oleaginosa, manteniendo el volumen dentro del fermentador (6 I) constante durante toda la prueba.

El contenido total de lípidos se determinó usando el kit "sulfo-fosfo-vainillina de lípidos totales" trabajando como se describe anteriormente. El contenido de azúcares se determinó trabajando como se describe en el Ejemplo 1.

Dicho segundo caldo de fermentación se sometió a separación por centrifugación a 7000 rpm durante 20 minutos para obtener 1,2 kg de biomasa celular oleaginosa [408 g (peso seco) - concentración igual al 35% en peso basándose en la cantidad total de biomasa celular oleaginosa obtenida].

Se lograron un rendimiento de biomasa celular oleaginosa igual a 0,36 g/g en función del sustrato consumido (Y^x/^s = g de biomasa obtenida por g de sustrato consumido) y un rendimiento de lípidos igual a 0,17 g/g basado en el sustrato consumido (Y^l/^s = g de lípidos obtenidos por g de sustrato consumido).

EJEMPLO 4

Fermentación de Rhodosporidium azoricum (microfiltración y evaporación llevadas a cabo de forma continua)

La prueba de fermentación usando células de Rhodosporidium azoricum RGRDP3 se llevó a cabo en un fermentador de 20 litros, trabajando en las siguientes condiciones:

- 0,78 l de hidrolizado lignocelulósico (es decir, primera fase acuosa) como se describe en el Ejemplo 1, diluido adecuadamente con agua para tener una concentración inicial de azúcares igual a 30 g/l;

- 2,0 g/l de extracto de levadura;

- 5 g/l de maíz fuerte sólido

- 5 g/l de (NH4)2SO4;

- 6 g/l de KH²PO;

- 0,03 g/l de MgSO4- ⁷ H²O;

- 0,06 g/l de NaCl;

- 0,06 g/l de CaCfc- ² H²O;

- aire suministrado: flujo igual a 1 l/min

- pH de trabajo igual a 6, mantenido añadiendo, según fuera necesario, algunas gotas de una solución de hidróxido de potasio (KOH) 5 M y ácido sulfúrico (H²SO⁴) 10 % (v/v);

- temperatura: 30 °C;

- agitación a 600 rpm - 900 rpm, modulada con el flujo de aire para mantener la concentración de oxígeno disuelto (DO²) por encima del 30 % del valor de saturación;

- volumen inicial: 6 litros;

- inóculo de Rhodosporidium azoricum RGRDP3 (es decir, primer caldo de fermentación) obtenido como se describe en el Ejemplo 2, diluido al 10 % (v/v) con el medio de cultivo utilizado para la fermentación para comenzar la fermentación con una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 2,3 g/l (peso seco).

La fermentación se llevó a cabo en modo discontinuo ("discontinua") durante las primeras 6 horas y posteriormente en modo de perfusión. A este respecto, un dispositivo de microfiltración tangencial, provisto de una membrana de microfiltración "Casetes de microfiltración Hydrosart®" de Sartorius, estaba conectado al fermentador a través de una bomba de pistón, teniendo dicha membrana un área de membrana igual a 0,1 m2 y un diámetro medio de poro igual a 0,45 |jm, con el fin de eliminar parte del medio de cultivo (permeado - P1) y concentrar la segunda biomasa celular oleaginosa (retenido - R1) producida en dicho segundo caldo de cultivo. Para este fin, dicha bomba de pistón se accionó de manera continua, durante la fermentación, para recircular la biomasa celular oleaginosa y el medio de cultivo en dicho aparato de microfiltración a un caudal de 144 l/h, trabajando en las mismas condiciones de pH y temperatura dadas anteriormente para la fermentación. Dicha segunda biomasa celular oleaginosa se concentró de este modo para obtener un retenido (R1) que se proporcionó de manera continua al fermentador (recirculación) y un permeado (P1) que se proporcionó de manera continua para la evaporación. El caudal de permeado (P1) se controló dentro de un intervalo de entre 58 ml/h y 70 ml/h utilizando una bomba peristáltica colocada aguas abajo de la salida del permeado (P1) del aparato de microfiltración.

A este respecto, la prueba de evaporación se llevó a cabo utilizando un rotavapor. Por lo tanto, el permeado (P1) se envió al rotavapor y se llevó a cabo la evaporación a 38 °C y a una presión igual a 1,47X104 Pa (147 mbar).

La fase purificada (P2) (fase evaporada - equivalente al segundo permeado) se condensó usando un circuito que contenía agua de enfriamiento a 15 °C, mientras que el concentrado (R2) (equivalente al segundo retenido) se envió al dispositivo de fermentación por medio de una bomba de pistón a un caudal entre 16 ml/h y 20 ml/h.

De la evaporación se obtuvo un concentrado (R2) que contenía azúcares concentrados por un factor de concentración de 3,5: pasando de un contenido inicial de azúcares igual a 28 g/l (primer permeado - P1) a un contenido de azúcares igual a 98 g/l (concentrado - R2).

El contenido de azúcares se determinó trabajando como se describe en el Ejemplo 1.

Dicho segundo concentrado (R2) contenía además todas las sales: para la confirmación, la conductividad de dicha fase purificada (P2) se midió después de la condensación, usando un medidor de conductividad MM40+ de Crison, y se encontró que era inferior a 0,2 mS/cm.

El caudal del suministro al fermentador, en otras palabras, del segundo concentrado (R2) más hidrolizado nuevo, se controló automáticamente durante la duración de la fermentación utilizando un sensor de nivel, de tal manera que se compensó el volumen del permeado a la salida de la microfiltración (P1) y el volumen del caldo de fermentación permaneció constante en el fermentador: dicho suministro era de una concentración de azúcares de 313 g/l y estaba compuesto, tal como se indica anteriormente, del retenido (R2) y del hidrolizado nuevo, que se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1 y se diluyó como se describe anteriormente, en una relación de 2:5.

Dicho caudal se controló dentro de un intervalo entre 58 ml/h y 70 ml/h para tener una cantidad de azúcares de entrada que variaba entre 22 g/h y 18 g/h para cumplir los requisitos de la levadura oleaginosa y mantener una concentración de 30 g/l en el fermentador.

Al final de la fermentación, después de 100 horas, se obtuvo un segundo caldo de fermentación que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 67 g/l (peso seco) y un contenido total de lípidos igual al 56 % en peso (37,5 g/l) basándose en el peso seco de dicha biomasa celular oleaginosa, manteniendo el volumen dentro del fermentador (6 I) constante durante toda la prueba.

El contenido total de lípidos se determinó usando el kit "sulfo-fosfo-vainillina de lípidos totales" trabajando como se describe anteriormente. El contenido de azúcares se determinó trabajando como se describe en el Ejemplo 1.

Dicho segundo caldo de fermentación se sometió a separación por centrifugación a 7000 rpm durante 20 minutos para obtener 1,1 kg de biomasa celular oleaginosa [402 g (peso seco) - concentración igual al 36 % en peso basándose en la cantidad total de biomasa celular oleaginosa obtenida].

Se lograron un rendimiento de biomasa celular oleaginosa igual a 0,35 g/g en función del sustrato consumido (Y^x/^s = g de biomasa obtenida por g de sustrato consumido) y un rendimiento de lípidos igual a 0,17 g/g basado en el sustrato consumido (Y^l/^s = g de lípidos obtenidos por g de sustrato consumido).

EJEMPLO 5

Recuperación de lípidos por lisis celular (tratamiento térmico)

Para este fin, al final de la fermentación, se sometieron 1180 ml del segundo caldo de fermentación obtenido como se describe en el Ejemplo 3, que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 68 g/l (peso seco), a centrifugación a 7000 rpm, durante 20 minutos, para obtener 200 ml de una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 350 g/l (peso seco) y 980 ml de agua de fermentación agotada (es decir, segunda fase acuosa).

Los 200 ml de dicha suspensión acuosa se colocaron en un autoclave de 0,5 l (reactor agitado Parr modelo PA 4575 A) y se llevaron a una temperatura de 140 °C, a la presión autógena de 4,9X105 Pa (4,9 bar), con agitación a 450 rpm, y se mantuvieron en estas condiciones durante 2 horas. Después de este tiempo, se descargó la biomasa celular oleaginosa agotada y se inició el proceso de extracción (Ejemplo 8).

EJEMPLO 6

Recuperación de lípidos por lisis celular (tratamiento mecánico)

Para este fin, al final de la fermentación, se sometieron 6 I del segundo caldo de fermentación obtenido como se describe en el Ejemplo 3, que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 68 g/l (peso seco), a centrifugación a 7000 rpm, durante 20 minutos, para obtener 200 ml de una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 352 g/l (peso seco) y 5,8 l de agua de fermentación agotada (es decir, segunda fase acuosa).

Los 5,8 l de dicha suspensión acuosa se bombearon en un homogeneizador (Gea NiroSoavi modelo NS3006L) a una presión de homogeneización de 1,5X108 Pa (1500 bar), a temperatura ambiente y a un caudal de aproximadamente 15 l/h.

Al final del tratamiento, se descargó la biomasa celular oleaginosa agotada y se inició el proceso de extracción (Ejemplo 8).

EJEMPLO 7

Recuperación de lípidos por lisis celular (tratamiento con microondas)

Para este fin, al final de la fermentación, se sometieron 1180 ml del segundo caldo de fermentación obtenido como se describe en el Ejemplo 3, que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 68 g/l (peso seco), a centrifugación a 7000 rpm, durante 20 minutos, para obtener 200 ml de una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que tenía una concentración de biomasa celular oleaginosa igual a 350 g/l (peso seco) y 980 ml de agua de fermentación agotada (es decir, segunda fase acuosa).

Los 200 ml de dicha suspensión acuosa se colocaron en un matraz de vidrio de 300 ml provisto de refrigerante, barra de agitación magnética, y se llevaron a una temperatura de 100 °C utilizando un dispositivo de microondas (Milestone modelo "MicroSYNTH"). La temperatura se mantuvo constante durante 20 minutos, a presión atmosférica.

Al final del tratamiento, se descargó la biomasa celular oleaginosa agotada y se inició el proceso de extracción (Ejemplo 8).

EJEMPLO 8

Extracción por disolvente

Con el fin de recuperar los lípidos incluidos en la biomasa celular oleaginosa obtenida después de los tratamientos descritos en los Ejemplos 5, 6 y 7, se realizaron varias pruebas de extracción utilizando diversos tipos de disolventes o mezclas de los mismos.

Para este fin, se usaron 200 ml de la suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa agotada, obtenida como se describe en el Ejemplo 5, en el Ejemplo 6 o en el Ejemplo 7, en las distintas pruebas.

Dicha suspensión acuosa se sometió a dos ciclos de extracción, cada una de 2 horas, en el punto de ebullición del disolvente o de la mezcla de disolventes utilizados, en un extractor de reflujo, en presencia de un volumen de disolvente o de una mezcla de disolventes 2 veces el volumen de dicha suspensión acuosa.

Los lípidos se obtuvieron después de separar la fase orgánica que contenía el disolvente y los lípidos de dicha suspensión acuosa que contenía la biomasa celular oleaginosa agotada, y después de someter dicha fase orgánica a la destilación del disolvente, que se recicla a la extracción.

Los disolventes y las mezclas de disolventes utilizados, los tratamientos a los que se sometió la biomasa celular oleaginosa (Ejemplos 6-8 - lisis celular), las temperaturas de extracción y los rendimientos de extracción, se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la producción de lípidos a partir de biomasa que incluye al menos un polisacárido que comprende:

- someter dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido a hidrólisis para obtener una mezcla que comprende una primera fase sólida y una primera fase acuosa;

- preparar un inóculo que comprende al menos un microorganismo oleaginoso en un primer dispositivo de fermentación para obtener un primer caldo de fermentación;

- alimentar dicha primera fase acuosa y dicho primer caldo de fermentación a un segundo dispositivo de fermentación para obtener un segundo caldo de fermentación;

- someter al menos una porción de dicho segundo caldo de fermentación a microfiltración para obtener un primer retenido y un primer permeado;

- alimentar dicho primer retenido a dicho segundo dispositivo de fermentación;

- someter dicho primer permeado a un tratamiento de purificación para obtener un segundo permeado y un segundo retenido o una fase evaporada y un concentrado

- alimentar dicho segundo retenido o concentrado a dicho segundo dispositivo de fermentación;

- al final de dicha fermentación, someter dicho segundo caldo de fermentación a separación para obtener una suspensión acuosa de biomasa celular oleaginosa que comprende lípidos y una segunda fase acuosa;

en donde dicha microfiltración y dicho tratamiento de purificación se llevan a cabo de manera continua durante dicha fermentación.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polisacárido se selecciona de celulosa, hemicelulosa o mezclas de las mismas.

3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido es una biomasa lignocelulósica, seleccionada entre:

- productos derivados de cultivos cultivados específicamente para uso energético, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dichos productos o de su procesamiento;

- productos derivados de productos agrícolas, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho derivados de dichos productos o de su procesamiento;

- productos derivados de la forestación o la silvicultura, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dichos productos o de su procesamiento;

- restos de alimentos y productos agrícolas destinados a la nutrición humana o zootecnia;

- residuos no tratados químicamente de la industria del papel;

- materiales de desecho de la recogida selectiva de sólidos urbanos;

- algas tal como macroalgas o microalgas, macroalgas en particular;

cardo, guayule, incluidos los restos, residuos y materiales de desecho de dicho cardo o guayule o de su procesamiento.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha biomasa que incluye al menos un polisacárido se somete a un procedimiento preliminar de molienda antes de someterse a dicha hidrólisis para obtener partículas que tienen un diámetro que varía entre 0,1 mm y 10 mm.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha primera fase acuosa comprende:

- una cantidad de glucosa mayor que o igual a 50 g/l hasta el límite de solubilidad de glucosa en dicha primera fase acuosa;

-una cantidad de xilosa de 0 g/l a 200 g/l;

-una cantidad de arabinosa de 0 g/l a 20 g/l;

-una cantidad de manosa de 0 g/l a 20 g/l;

-una cantidad de galactosa de 0 g/l a 10 g/l;

-una cantidad de ácido acético de 0 g/l a 8 g/l;

-una cantidad de furfural (F) de 0 g/l a 2,5 g/l;

-una cantidad de 5-hidroximetilfurfural (HMF) de 0 g/l a 4,5 g/l.

6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en dicho primer dispositivo de fermentación, la fermentación se lleva a cabo:

- a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C; y/o

- durante un tiempo que varía entre 10 horas y 36 horas; y/o

- a un pH que varía entre 4,5 y 7.

7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en dicho segundo dispositivo de fermentación, la fermentación se lleva a cabo:

- a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C; y/o

- durante un tiempo que varía entre 2 días y 10 días; y/o

- a un pH que varía entre 4,5 y 7.

8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho microorganismo se selecciona de levaduras oleaginosas seleccionadas de Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Torulopsis sp., Pichia stipitis, Trichosporon cacaoliposimilis, Trichosporon oleaginosus, Trichosporon pullulans, Rhodosporidium azoricum, Cryptococcus curvatus.

9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fermentación en dicho segundo dispositivo de fermentación se lleva a cabo en una o más etapas, en modo discontinuo, en modo semicontinuo, en modo continuo, en modo de perfusión, en modo discontinuo durante las primeras 3 horas - 10 horas y posteriormente en modo de perfusión.

10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho proceso comprende añadir a dicho segundo dispositivo de fermentación licor de maíz fuerte en una cantidad que varía entre 2 g/l y 20 g/l.

11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha microfiltración se lleva a cabo durante la fase de crecimiento exponencial de la biomasa celular oleaginosa.

12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha microfiltración se lleva a cabo a través de membranas que tienen un diámetro medio de poro que varía entre 0,02 |jm y 2,0 |jm.

13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha microfiltración se lleva a cabo:

- aplicando una presión transmembrana (TMP) que varía entre 5X103 Pa (0,05 bar) y 2,5X105 Pa (2,5 bar); y/o - realizando un flujo específico (kg de permeado por metro cuadrado de superficie de la membrana de microfiltración por hora) que varía entre 0,2 kg/(m2 x h) y 70 kg/(m2 x h); y/o

- a una temperatura que varía entre 20 °C y 40 °C.

14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha microfiltración se implementa a través de membranas poliméricas de láminas planas o de fibra hueca sumergidas o en configuración tangencial o a través de membranas cerámicas sumergidas o en configuración tangencial o en configuración giratoria.

15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho tratamiento de purificación se implementa por medio de ósmosis inversa, o por evaporación.

16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha ósmosis inversa se lleva a cabo en presencia de al menos una membrana polimérica que se selecciona de las membranas poliméricas generalmente utilizadas para la desalinización seleccionada de: membranas que comprenden poliamidas, poliimidas, polisulfonas, polietersulfonas, preferentemente de las membranas poliméricas que comprenden poliamidas.

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha membrana polimérica tiene:

- un intervalo de temperatura máxima de funcionamiento que varía entre 15 °C y 90 °C; y/o

- una presión máxima de funcionamiento que varía entre 5X105 Pa (5 bar) y 8X106 Pa (80 bar); y/o

- un límite de peso molecular nominal (MWCO) que varía entre 30 daltons y 200 daltons; y/o

- un pH de funcionamiento que varía entre 1 y 13.

18. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde dicha ósmosis inversa se lleva a cabo:

- aplicando una presión en el lado de alimentación que varía entre 5X105 Pa (5 bar) y 8X106 Pa (80 bar); y/o - operando a un flujo específico (kg de permeado por metro cuadrado de la superficie de la membrana de ósmosis inversa por hora) que varía entre 5 kg/(m2 x h) y 80 kg/(m2 x h).

19. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde dicha evaporación se lleva a cabo a una temperatura que varía entre 30 °C y 100 °C y a una presión que varía dependiendo de la temperatura que varía entre 4X103 Pa (0,04 bar) y 105 Pa (1 bar).

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