ES2609028T3

ES2609028T3 - Métodos de mediación de la respuesta fibrótica

Info

Publication number: ES2609028T3
Application number: ES09824091.4T
Authority: ES
Inventors: Patrick Branigan; Jason Ekert
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-28
Publication date: 2017-04-18
Anticipated expiration: 2029-10-28
Also published as: JP2012507543A; EP2349330A4; US20100111968A1; EP2349330B1; US8574582B2; WO2010051307A1; CA2741863A1; EP2349330A1

Abstract

Método in vitro de supresión de la proliferación de los fibrocitos, la diferenciación de los fibrocitos, o la secreción de proteínas por el fibrocito mediante un inhibidor que actúa sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe específicamente la interacción de IL-25 con el receptor de IL-25, que comprende inhibir la señalización de IL-25 en el fibrocito.

Description

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Metodos de mediacion de la respuesta fibrotica

Descripcion

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para mediar la respuesta fibrotica modulando la senalizacion de IL-25 en los fibrocitos, y sus usos.

Antecedentes de la invencion

La inflamacion es la respuesta coordinada a la lesion tisular o a la infeccion. La inflamacion comienza con la liberacion local de factores quimiotacticos, la activacion plaquetaria, y la iniciacion de las vlas de la coagulacion y del complemento. Estos eventos estimulan el endotelio local, promoviendo la extravasacion de neutrofilos y monocitos. La segunda fase de la inflamacion se caracteriza por la afluencia al tejido de celulas del sistema inmunitario adaptativo, incluidos los linfocitos. La fase de resolution posterior, cuando tiene lugar la apoptosis y la fagocitosis de los leucocitos excedentes por los macrofagos tisulares, tambien se caracteriza por la reparation del dano tisular por las celulas estromales, tales como los fibroblastos.

En tales mecanismos de reparacion los fibroblastos migran a la zona afectada y pueden presentar un fenotipo modificado que es hiperproliferativo o que produce colageno en exceso. Suele pensarse que los fibroblastos son predominantemente celulas residentes, sin embargo, nuevos datos han indicado que las celulas precursoras de los fibroblastos circulantes, los fibrocitos, migran a los sitios de reparacion o lesion, donde se diferencian e intervienen en la cicatrization de heridas, la reparacion tisular y otras respuestas fibroticas, tal como la fibrosis patologica.

Los fibrocitos se originan en la medula osea, se diferencian a partir de una poblacion precursora de monocitos de sangre periferica CD14+ y expresan marcadores de las celulas hematopoyeticas (CD45, MHC de clase II, CD34), las celulas estromales (colageno de tipo I y III, y fibronectina), as! como receptores de quimiocinas (CCR3, CCR5, CCR7 y CXCR4) (Abe et al., J. Immunol. 166:7556-62, 2001; Moore et al., Am. J. Pathol. 166:675-84, 2005; Bucala et al., Mol. Medicine 1:71-81, 1994). Los fibrocitos no expresan diversos marcadores endoteliales, epiteliales o de musculo liso, y son negativos para los marcadores especlficos de monocitos/macrofagos y celulas dendrlticas CD4, CD16 y Cd25 (Bucala et al., Mol. Med. 1:71-81, 1994; Freudenthal y Steinman PNAS 87:76987702, 1990). Por lo tanto, un fibrocito aislado es un tipo de celula unico con un fenotipo definido facilmente distinguible de las celulas circulantes o mesenquimales residentes.

Una vez liberados de la medula osea, la migration y la diferenciacion de los fibrocitos a fibroblastos y miofibroblastos es inducida por diversos mediadores. Se han relacionado los pares de receptor/ligando CCL2/CCR2, CXCR4/CXCL12, CCR7/CCL21 con el reclutamiento y la acumulacion de fibrocitos en los tejidos durante los procesos fibroticos (Phillips et al., J. Clin. Invest. 114:438-46, 2004; Sakai et al., PNAS 103:14098-103, 2006; Tacke y Randolph, Immunobiology 211:609-18, 2006). Se ha demostrado que TGF-p1, ET-1, PDGF, IL-4 e IL-13 promueven la diferenciacion de los fibrocitos a fibroblastos y miofibroblastos maduros con la adquisicion de un aumento de la production de colageno y otras protelnas de la ECM, la regulation por disminucion de CD34 y CD45, y la expresion del marcador de miofibroblastos alfa actina de musculo liso (a-SMA). La diferenciacion in vivo de los fibrocitos a partir de precursores circulantes puede producirse principalmente en el sitio del tejido y no en la sangre periferica (Haudek et al., PNAS 103:18284-289, 2006; Frid et al., Am. J. Pathol. 168:659-69, 2006). Ademas de la produccion de protelnas de la ECM, los fibrocitos secretan citocinas inflamatorias (TNF-a y TGF-p), factores de crecimiento hematopoyeticos (IL-6, IL-10, M-CSF), factores de crecimiento (TGF-a, VEGF, pDgF-A, HgF, CNTGF, bFGF) y quimiocinas (CCL2, CCL3, CCL4, CXCL1, CXCL8) (Abe et al., J. Immunol. 166:7556-62, 2001; Chesney et al., J. Immunol. 160:419-25, 2006; Chesney et al., Curr. Rheumatol. Rep. 2:501-5, 2000).

Los fibrocitos maduros entran rapidamente en los sitios de la lesion tisular donde secretan citocinas inflamatorias, protelnas de la matriz extracelular, otras citocinas y moleculas proangiogenicas, desempenando un papel en varias enfermedades humanas. Los estudios en seres humanos y en ratones han demostrado que los fibrocitos de sangre periferica migran a camaras de heridas cutaneas (Bucala et al., Mol. Med. 1:71-81, 1994; Chesney et al. J. Immunol. 160:419-25, 1998; Abe et al., J. Immunol. 166:7556-62, 2001) y a la mucosa bronquial despues de la exposition a antlgenos. Se han registrado fibrocitos en enfermedades con patologlas fibroticas incluidas el asma y la fibrosis pulmonar idiopatica (Schmidt et al., J. Immunol. 171:380-89, 2003; Abe et al., AM J. Prespir. Crit. Care Med. 170:1158-63, 2004; Moore et al. Am. J. Pathol. 166:675-84, 2005), y la excesiva proliferation de miofibroblastos esta relacionada con la enfermedad de Crohn (Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 295:G581-90, 2008). En modelos murinos, los fibrocitos han demostrado contribuir a la patogenia de la fibrosis pulmonar y la fibrosis hepatica, contribuyendo los fibrocitos en el hlgado a la deposition de colageno (Kisselva et al., J. hepatology 45:429-38, 2006; Gomperts y Stierter, J. leukocyte Biol. 82:449-56, 2007). Existen pruebas de que los fibrocitos tienen una funcion en la cicatrizacion hipertrofica o queloides, las quemaduras, la esclerodermia y trastornos relacionados. Los fibrocitos pueden contribuir a la fibrogenesis de varias maneras, ya que estas celulas producen colageno y han demostrado diferenciarse a un fenotipo de miofibroblasto mas residente, que puede

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empeorar aun mas el ambiente fibrotico (Moore et al., Am. J. Pathol. 166:675-84, 2005; Mehrad et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 353:104-8, 2007; Phillips et al., J. Clin. Invest. 114:438-46, 2004; Epperly et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 29:213-24, 2003; Hashimoto et al., J. Clin. Invest. 113:243-52, 2004; Moore et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 35:175-81, 2006). Los fibrocitos tambien constituyen parte de la respuesta del estroma a la invasion por tumores, y estas celulas pueden ser un pronosticador del potencial del tumor (Barth et al., J. Exp. Med. 11:11, 2002; Chauhan et al., J. Clin. Pathol. 56:271-76, 2003). La diferenciacion de los fibrocitos a miofibroblastos tambien esta relacionada con la remodelacion del estroma en carcinomas invasivos de la vejiga urinaria (Nimphius et al., Virchows Arch. 450:179-85, 2007).

Las senales que modulan la proliferacion y diferenciacion, la secrecion de citocinas y quimiocinas, y la migracion de los fibrocitos estan definidas solo parcialmente. Una mejor comprension de estas senales puede posibilitar nuevos tratamientos para prevenir enfermedades o afecciones humanas con una funcion de los fibrocitos modificada, por ejemplo, la fibrosis patologica. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar y modular las interacciones receptor/ligando que intervienen en las funciones de los fibrocitos.

Resumen de la invention

Un aspecto de la invencion es un metodo in vitro de supresion de la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito utilizando un inhibidor que actua sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe especlficamente la interaccion de IL-25 con el receptor de IL-25, que comprende inhibir la senalizacion de IL-25 en el fibrocito.

Otro aspecto de la invencion es un inhibidor de la senalizacion de IL-25 que actua sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe especlficamente la interaccion de IL-25 con el receptor de IL-25 para utilizarse en un metodo de tratamiento, tratamiento que se consigue suprimiendo la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito en un sujeto con una afeccion relacionada con la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito.

Otro aspecto de la invencion es un metodo in vitro de identificacion de moduladores de la senalizacion de IL-25 que suprimen la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito, que comprende:

a) proporcionar los fibrocitos;

b) proporcionar un modulador de ensayo;

c) poner en contacto los fibrocitos con el modulador de ensayo;

d) determinar un efecto del modulador de ensayo sobre la senalizacion de IL-25;

e) determinar el efecto del modulador de ensayo sobre la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los

fibrocitos, y la secrecion de protelnas por el fibrocito; y

f) seleccionar el modulador que

i) modula la senalizacion de IL-25; y

II) modula la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1. Respuesta de citocinas frente a IL-25 e IL-25 con TNF-a en fibrocitos.

Figura 2. Aumento de la proliferacion de fibrocitos en respuesta a IL-25 e inhibicion por un antagonista de IL-25.

Figura 3. Aumento de la diferenciacion de fibrocitos en respuesta a IL-25 e inhibicion por un antagonista de IL-25.

Descripcion detallada de la invencion

Tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", “una”, "la" y “el” incluyen la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “un polipeptido” es una referencia a uno o mas polipeptidos e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia.

A menos que defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la materia a la que pertenece una invencion. Aunque en la practica o en los ensayos de la invencion puede utilizarse cualquier composicion y metodo similar o equivalente a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen metodos y composiciones ejemplares.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "suprimir" o la expresion "que suprime" se refieren a bloquear la estimulacion, disminuir, prevenir, retrasar la activacion, inactivar, desensibilizar, inhibir, o regular por disminucion, parcial o totalmente, un cambio mensurable en la funcion celular, por ejemplo un cambio en la

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senalizacion de IL-25 o un cambio en una actividad no deseada en un fibrocito. Suprimir un cambio mensurable en la funcion celular se consigue cuando el valor de la actividad asignado a la funcion celular con respecto al control es del 50%-80%, opcionalmente del 25%-50% o del 0%-25%, en el que se asigna a las muestras de control un valor de la actividad relativo del 100%. Suprimir un cambio mensurable en la funcion celular puede conseguirse mediante diversas estrategias. Por ejemplo, la supresion de la senalizacion de IL-25 puede conseguirse bloqueando la interaccion de IL-25 y el receptor de IL-25, o suprimiendo la expresion del receptor de IL-25.

"Actividad no deseada en un fibrocito" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una funcion mensurable no deseada por parte de un fibrocito, por ejemplo la secrecion de colageno por el fibrocito, la secrecion de protelnas por el fibrocito, la diferenciacion de los fibrocitos, la proliferacion de los fibrocitos, o la migracion de los fibrocitos. Los fibrocitos son celulas progenitoras mesenquimales que presentan caracterlsticas morfologicas y moleculares de los monocitos, los fibroblastos y las celulas hematopoyeticas. Los fibrocitos pueden ser fibrocitos circulantes o residentes en tejido, por ejemplo fibrocitos residentes pulmonares, hepaticos o renales. La expresion superficial de CD45 y la produccion de colageno se considera un criterio suficiente para distinguir los fibrocitos tanto in vivo como in vitro de otras celulas mesenquimales circulantes o residentes en tejido (Bellini y Mattoli, Lab. Investig. 87:858-870, 2007).

"Proliferacion de los fibrocitos" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la capacidad del fibrocito para dividirse, por ejemplo tras el estlmulo con PDGF.

"Diferenciacion de los fibrocitos" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a la capacidad del fibrocito para diferenciarse a un miofibroblasto o fibroblasto. La diferenciacion de los fibrocitos a miofibroblastos puede ser inducida por ejemplo por TGF-p1 y endotelina-1 (ET-1), y la diferenciacion puede valorarse evaluando la expresion de marcadores de diferenciacion de los miofibroblastos, por ejemplo alfa actina de musculo liso (a-SMA).

"Secrecion de protelnas por el fibrocito" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una secrecion inducida o en el estado de equilibrio de protelnas y peptidos por los fibrocitos, por ejemplo citocinas tales como IL-4, IL-5, IL-13, TNF-a y TGF-p, factores de crecimiento hematopoyeticos tales como IL-6, IL-10 y M-CSF, factores de crecimiento tales como TGF-a VEGF, PDGF-A, HGF, CNTGF, bFGF, y quimiocinas tales como CCL2, CCL3, CCL4, CXCL1, CXCL8, MIP-1a, MIP-1 p, MCP-1, IL-8 y GROa (Chesney et al. 1998; Chesney y Bucala, 2000; Abe et al. 2001).

La expresion "receptor de IL-25" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un receptor o a un complejo receptor que interviene en la senalizacion de IL-25. La senalizacion de IL-25 requiere dos receptores, IL17RB e IL17RA, que pueden formar un complejo heteromerico. IL-25 se une a IL17RB con alta afinidad, mientras que IL17RA no se une a IL-25 pero es necesario para activar las vlas de senalizacion tras la union del ligando (Rickel et al., J. Immunology 181:4299-310, 2008). Por lo tanto, "receptor de IL-25" contempla tanto IL17RB como IL17RA. El termino "IL17RB" (IL-17BR, CRL4, EVI27, IL17RH1 o MGC5245) tal como se utiliza en el presente documento se refiere al "receptor B de la interleucina 17", un polipeptido con una secuencia de aminoacidos segun el numero de registro del GenBank NP_061195, el producto del gen humano del receptor IL17RB, e incluye todas las variantes, isoformas y homologos de especie de IL17RB. Tanto IL-25 como IL-17B son ligandos para IL17RB, pero el receptor se une a IL-25 con mayor afinidad (Lee, et al., J. Biol. Chem. 276, 1660-64, 2001). El termino "IL17RA" (CD217, IL17R, CDw217, IL-17RA, hIL-17R o MGC10262) tal como se utiliza en el presente documento se refiere al "receptor A de la interleucina 17", un polipeptido con una secuencia de aminoacidos segun el numero de registro del GenBank NP_055154, el producto del gen humano del receptor IL17RA, e incluye todas las variantes, isoformas y homologos de especie de IL17RA. Las variantes de IL17RB e IL17RA tambien incluyen los receptores maduros solubles.

El termino "IL-25" o la expresion "polipeptido IL-25" (IL17E, o IL-17E) tal como se utilizan en el presente documento se refieren a "interleucina-25", un polipeptido con una secuencia segun el numero de registro del GenBank NP_073626 o NP_758525, el producto del gen humano de la IL-25, e incluye todas las variantes, isoformas u homologos de especie de IL-25.

"Senalizacion de IL-25" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a los procesos iniciados por IL-25 o un segundo ligando para el receptor de IL-25 que interactua con el receptor de IL-25 en la superficie celular, lo que da como resultado cambios mensurables en la funcion celular. El complejo receptor de IL-25 incluye IL17RB e IL17RA, y la union del ligando activa las vlas de transduccion de senales aguas abajo, por ejemplo la molecula adaptadora TRAF6, ERK, JNK/p38 y NF-kB, lo que conduce a la produccion de citocinas y quimiocinas (Maezawa et al., J. Immunol. 176:1013-18, 2006). La senalizacion de IL-25 puede medirse por ejemplo evaluando la cantidad de citocinas y quimiocinas producidas tras la induccion con un ligando para el receptor de IL-25, por ejemplo midiendo la produccion de CXCL-8, IL-6, G-CSF, MCP-1, MIP-1a, RANTES o CCL2 (Cai et al., Cytokine 16:10-21, 2001; Lee et al., J. Biol. Chem. 276:1660-64, 2001; Pan et al., J. Immunol. 167:6559-67, 2001; Wong et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 33:186-194, 2005). La senalizacion de IL-25 tambien puede evaluarse mediante ensayos funcionales que miden por ejemplo el efecto del ligando para el receptor de IL-25 sobre la proliferacion o la diferenciacion celular, o utilizando genes indicadores y constructos genicos indicadores unidos operativamente a un promotor sensible a NF-kB. Los ejemplos de tales promotores incluyen aquellos para IL-6, IL-8 e IL-12 p40 (Murphy et al., Mol. Cell. Biol.

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15:5258-67, 1995; Libermann y Baltimore, Mol. Cell. Biol. 10:2327-34, 1990; Mauviel et al., J. Immunol. 149:2969-76, 1992). La activacion de quinasas intracelulares, por ejemplo JNK/p38, puede medirse mediante fosfoanticuerpos, y la evaluacion de las moleculas secretadas o la medicion de la proliferacion o la diferenciacion celular pueden realizarse mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELlSA) o una gama de bioensayos. Los metodos y sistemas de lectura adecuados son conocidos en la tecnica y estan disponibles en el mercado. Por ejemplo, la senalizacion de IL-25 en los fibrocitos puede medirse estimulando los fibrocitos con IL-25 solo o junto con un segundo estlmulo, por ejemplo TNF-a, y midiendo la cantidad de IL-6 y de RANTES secretados en los medios de cultivo en comparacion con un cultivo de fibrocitos de control no estimulado con IL-25.

El termino "ligando" se refiere a un peptido o polipeptido, una molecula pequena, o un oligonucleotido que se une a, o forma complejos con, el receptor de IL-25 o una variante del mismo. El ligando puede ser un antagonista, inhibidor, supresor, agonista, estimulador o activador, o similar, del receptor de IL-25. Los ligandos ejemplares son IL-25 e IL-17F.

El termino "agente" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a polipeptidos, peptidos o protelnas, protelnas de fusion, peptidomimeticos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, acidos nucleicos, oligonucleotidos, oligonucleotidos sinteticos, moleculas pequenas, y similares, que inhiben la senalizacion de IL-25. El agente puede identificarse utilizando ensayos de medicion de la senalizacion de IL-25, que se han descrito anteriormente. Los ejemplos de agentes incluyen un IL17RB maduro soluble, un polipeptido de IL-25, un anticuerpo contra IL-25, un anticuerpo antagonista contra el receptor de IL-25 o un anticuerpo antagonista contra IL17RB.

El termino "modulador" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una molecula o preparacion que se cree proporciona un beneficio terapeutico en seres humanos u otros animales, y se cree proporciona ese beneficio terapeutico, en parte, a traves de la activacion o supresion de la senalizacion de IL-25 en los fibrocitos. El termino "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los "inhibidores" son agentes que bloquean la estimulacion, disminuyen, previenen, retrasan la activacion, inactivan, desensibilizan o regulan por disminucion, parcial o totalmente, un proceso mensurable en una celula, por ejemplo la senalizacion de IL-25, por ejemplo, los antagonistas o antagonicos. Los activadores son agentes que estimulan, aumentan, abren, activan, facilitan, potencian la activacion, sensibilizan, o regulan por aumento un proceso mensurable en una celula, por ejemplo la senalizacion de IL-25, por ejemplo, los agonistas. Por ejemplo, el modulador de la senalizacion de IL-25 puede interactuar directamente con IL-25 o componentes del receptor de IL-25, uniendose por lo general al receptor de IL-25, cualquier componente del receptor de IL-25 o ligando para el receptor de IL-25, con una constante de afinidad de aproximadamente 10-6 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M o aproximadamente 10'10 M. El modulador tambien puede modular la senalizacion de IL-25 indirectamente, por ejemplo modulando la expresion del receptor de IL-25. Los moduladores incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, peptidos, polipeptidos, oligonucleotidos, moleculas qulmicas pequenas, y similares.

"Modulador de ensayo" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un modulador que se esta evaluando para la capacidad de activar o suprimir el proceso mensurable en una celula, por ejemplo la actividad no deseada en el fibrocito mediante la modulacion de la senalizacion de IL-25.

El termino "anticuerpo” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a una molecula que se une especlficamente a un antlgeno, e incluye anticuerpos dimericos, trimericos y multimericos, y anticuerpos hlbridos, humanizados y totalmente humanos. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento funcional de una molecula de anticuerpo, tal como un fragmento que conserva al menos su funcion de union al antlgeno, e incluyen Fab, F(ab'), F(ab')2, scFv, dsFv y diacuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse utilizando enzimas proteollticas (p. ej., un anticuerpo entero se digiere con papalna para producir fragmentos Fab, y el tratamiento con pepsina da como resultado la produccion de fragmentos F(ab')2). Las tecnicas para la preparacion y utilizacion de los diversos anticuerpos son conocidas en la tecnica (Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, 1987-2001; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Colligan, et al., ed., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, 1994-2001; Colligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, NY, 1997-2001; Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975; U.S. 4.816.567, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-10033, 1989). Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos monoclonales totalmente humanos que carezcan de cualquier secuencia no humana a partir de ratones transgenicos para inmunoglobulinas humanas o a partir de genotecas de presentacion en fagos (Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotech. 14:845-851, 1996; Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997; Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; Krebs et al., J. Immunol. Meth. 265:67-84, 2001).

Un agente, un modulador, una molecula de anticuerpo, o similar, "se une especlficamente" a un determinado antlgeno o protelna cuando se une a este antlgeno o protelna con mayor afinidad y de manera especlfica, en contraposicion a de manera no especlfica, en comparacion con un segundo antlgeno o protelna no identico. Dicho de otra manera, la "union especlfica" de un agente, un modulador, una molecula de anticuerpo, o similar, puede utilizarse para distinguir dos polipeptidos diferentes.

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Un "fragmento" es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que comprende una porcion, pero no la totalidad, de cualquier secuencia de aminoacidos de cualquier polipeptido de la invencion. Los fragmentos pueden incluir, por ejemplo, un polipeptido truncado que tiene una porcion de una secuencia de aminoacidos correspondiente a un peptido senal, dominio extracelular, dominio transmembrana o dominio citoplasmico, o variantes de los mismos, tal como una serie continua de residuos que incluye una secuencia de aminoacidos amino terminal y/o carboxilo terminal heterologa. Tambien se incluyen las formas de degradacion de los polipeptidos de la invencion producidos por, o en, una celula hospedadora. Otros fragmentos ejemplares se caracterizan por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden la helice alfa o las regiones que forman la helice alfa, la lamina beta o las regiones que forman la lamina beta, la vuelta o las regiones que forman la vuelta, el enrollamiento o las regiones que forman el enrollamiento, las regiones hidrofilas, las regiones hidrofobas, las regiones alfa-anfipaticas, las regiones beta-anfipaticas, las regiones flexibles, las regiones que forman la superficie, las regiones de union al sustrato, las regiones extracelulares y las regiones con alto Indice antigenico. Los polipeptidos de la invencion pueden utilizarse o proporcionarse como fragmentos.

El termino "polipeptido" se refiere a una molecula que comprende al menos dos residuos de aminoacidos unidos por un enlace peptldico para formar un polipeptido. Las protelnas pequenas de menos de 30 aminoacidos pueden denominarse "peptidos". Los polipeptidos tambien pueden denominarse "protelnas".

La presente invencion se refiere a metodos de supresion de la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito mediante la inhibicion de la senalizacion de IL-25. La invencion se basa en el descubrimiento de que el receptor de IL-25 esta presente en los fibrocitos, y la inhibicion o activacion de la senalizacion de IL-25 modula diversas actividades en los fibrocitos, por ejemplo la proliferacion, la diferenciacion, y la secrecion de protelnas de los fibrocitos; actuando as! IL-25 como un factor proinflamatorio, proproliferativo y de diferenciacion para este tipo de celula. Los fibrocitos migran al sitio de la lesion tisular en el que secretan protelnas de la matriz extracelular, citocinas inflamatorias, otras citocinas y moleculas proangiogenicas, que desempenan un papel en diversas enfermedades humanas, incluidas las afecciones fibroticas. Por lo tanto, la inhibicion de la senalizacion de IL-25 en el fibrocito puede ser util para tratar afecciones relacionadas con la actividad no deseada en los fibrocitos, por ejemplo las afecciones fibroticas.

En una forma de realizacion, la invencion proporciona un metodo in vitro de supresion de la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito que comprende inhibir la senalizacion de IL-25 en el fibrocito como se detalla en la reivindicacion 1. IL-25 (tambien conocido como IL-17E), un miembro de la familia de IL-17, esta implicado en la inmunidad mediada por celulas Th2 (Fort et al., Immunity 15:985-995 2001; Hurst et al., J. Immunol. 169:443-453. 2002). Los modelos animales de IL-25 o la administracion de IL-25 a animales demuestran que IL-25 induce respuestas tipo Th2 relacionadas con la inflamacion multiorganica, la infiltracion de celulas inflamatorias y la hiperplasia de las celulas epiteliales, activada por la expresion inducida por IL-25 de IL-4, IL-5 e IL-13 (Shi et al., J. Biol. Chem. 275:19167-76, 2000; Lee et al., J. Biol. Chem. 276:1660-64, 2001; Hurst et al., 2002; J. Immunol. 169:443-53, 2002; Kim et al., Blood 100:2330-42, 2002). Aun no estan claros los mecanismos moleculares mediante los que IL-25 regula la inmunidad de tipo 2. Se descubrio que una poblacion de linfocitos no B/T estaba regulada por IL-25 y producla citocinas Th2 en respuesta a la infeccion por Nippostrongylus brasiliensis (Fallon et al., J. Exp. Med. 203:1105-1116, 2006). Sin embargo, dada la amplia expresion de IL17RB, pueden existir dianas adicionales de IL-25 para regular las respuestas de IL-25. In vitro, se ha descubierto que IL-25 se expresa en los mastocitos derivados de la medula osea y las celulas Th2 activadas (Fort et al., Immunity 15:985-995 2001; Ikeda et al., Blood 101:3594-96, 2003). Se ha descubierto que los eosinofilos y basofilos activados de sujetos normales y atopicos secretan la protelna IL-25 bioactiva (Wang et al., J. Exp. Med. 204:1837-47, 2007). IL-25 esta tambien regulada por aumento en los macrofagos alveolares en un modelo de inflamacion de las vlas respiratorias inducida por partlculas en ratas y en raton (estirpe celular MLE12) y en las celulas epiteliales pulmonares humanas (A549) despues de la estimulacion con alergenos (Fort et al., Immunity 15:985-995 2001; Ikeda et al., Blood 101:3594-96, 2003). Las celulas diana para IL-25 que se han identificado tambien incluyen celulas dendrlticas, fibroblastos pulmonares, celulas de musculo liso de las vlas respiratorias, linfocitos T vlrgenes, celulas TH2 y macrofagos activados alternativamente, que expresan IL17RB in vitro (Gratchev et al., J. Immunol. 60:233-37, 2004; Lajoie-Kadoch et al., Am. J. Physiol. Lung cell Mol. Physiol. 290:L1238-46, 2006; Letuve et al., J. Allergy Clin. Immunol. 117:590-96, 2006; Angkasekwinai et al., J. Exp. Med. 11:11,2007).

La senalizacion de IL-25 en un fibrocito puede inhibirse mediante diversos agentes e inhibidores de la senalizacion de IL-25. Los agentes y los inhibidores pueden actuar sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibir especlficamente la interaccion de iL-25 con el receptor de IL-25. Tales agentes e inhibidores son, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra IL-25 o contra el receptor de IL-25, que reconocen porciones extracelulares de los polipeptidos receptores, moleculas de ARNip o antisentido disenadas contra los genes de IL-25 o del receptor de IL-25, o receptores de IL-25 solubles que comprenden los polipeptidos receptores IL17RB soluble o IL17RA soluble. Pueden utilizarse peptidos, oligonucleotidos o moleculas pequenas que bloquean la interaccion entre la IL-25 y el receptor de IL-25. Tales agentes e inhibidores tambien pueden ser peptidos, protelnas, protelnas de fusion o moleculas pequenas que impiden la interaccion de IL-25 con el receptor de IL-25. Se han descrito agentes que inhiben IL-25 (patente de EE.UU. n° 6.562.578 concedida a Gorman; n° 6.635.443 concedida a Shi). La senalizacion de IL-25 en un fibrocito y la actividad no deseada en un fibrocito pueden medirse utilizando diversos metodos como se ha descrito anteriormente.

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Es posible modificar la estructura de los polipeptidos o fragmentos que se utilizan como agentes para inhibir la senalizacion de IL-25 en un fibrocito para fines tales como potenciar la estabilidad, solubilidad, especificidad de sustrato, y similares. Por ejemplo, puede producirse un polipeptido modificado en el que se ha modificado la secuencia de aminoacidos, tal como mediante sustitucion, delecion o adicion de aminoacidos. Se contempla que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoacido con un aminoacido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservadoras) no tenga, en algunos casos aunque no en todos, un efecto importante sobre la actividad biologica de la molecula resultante. Las sustituciones conservadoras son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoacidos que son afines en sus cadenas laterales. Los aminoacidos codificados geneticamente pueden dividirse en cuatro familias: (1) acidos (aspartato, glutamato); (2) basicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano); y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cistelna, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptofano y la tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoacidos aromaticos. De manera similar, el repertorio de aminoacidos puede agruparse como (1) acidos (aspartato, glutamato); (2) basicos (lisina, arginina, histidina), (3) alifaticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), agrupandose opcionalmente la serina y la treonina por separado como alifaticos-hidroxilo; (4) aromaticos (fenilalanina, tirosina, triptofano); (5) amida (asparagina, glutamina); y (6) azufrados (cistelna y metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a ed., WH Freeman and Co., 1981). Puede determinarse facilmente si un cambio en la secuencia de aminoacidos de un polipeptido o fragmento del mismo da como resultado un homologo funcional evaluando la capacidad del polipeptido o fragmento modificado para producir una respuesta de una manera similar al polipeptido o fragmento sin modificar mediante los ensayos descritos en el presente documento. Pueden ensayarse facilmente de la misma manera los peptidos, polipeptidos o protelnas en los que se haya producido mas de una sustitucion.

El agente que inhibe la senalizacion de IL-25 en un fibrocito puede conjugarse con un segundo polipeptido para formar una protelna de fusion que puede conferir propiedades deseables, por ejemplo, un aumento de la estabilidad. Pueden formarse protelnas de fusion ejemplares conjugando a la vez un IL17RB maduro soluble y un armazon alternativo tal como la protelna con repeticiones de anquirina disenada (DARPins) (Stumpp y Amstutz, Curr. Opin. Durg Discov. Devel. 10:153-159, 2007), un constructo MIMETIBODY™ (Picha et al., Diabetes 57:19261934, 2008), u otros dominios proteicos. Las protelnas, peptidos o protelnas de fusion pueden generarse en general mediante cualquier metodo de acidos nucleicos recombinantes o mediante metodos de slntesis qulmica conocidos en la tecnica. Un constructo MIMETIBODY™ tiene la formula generica (I):

(Bp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3) ffl, (I)

en la que Bp es un peptido o polipeptido capaz de unirse a una molecula de interes, Lk es un polipeptido o enlace qulmico, V2 es una porcion de un extremo C-terminal de una region variable de inmunoglobulina, Hg es al menos una porcion de una region bisagra variable de inmunoglobulina, Ch2 es una region constante Ch2 de la cadena pesada de inmunoglobulina y CH3 es una region constante CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina, y t es independientemente un numero entero del 1 al 10. Sin desear restringirse a teorla alguna, se cree que el metodo de inhibition de la senalizacion de IL-25 en un fibrocito inhibe la diferenciacion, la proliferation o la secretion de citocinas y quimiocinas del fibrocito en un tejido, reduciendo la cantidad de colageno, protelnas de la matriz extracelular y citocinas proinflamatorias que los fibrocitos producen en un sitio de la lesion, inflamacion o zona fibrotica.

Otra forma de realization de la invention es un inhibidor de la senalizacion de IL-25 que actua sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe especlficamente la interaction de IL-25 con el receptor de IL-25 para utilizarse en un metodo de tratamiento, tratamiento que se consigue suprimiendo la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito en un sujeto con una afeccion relacionada con la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un inhibidor de la senalizacion de IL-25.

"Sujeto" se refiere a cualquier animal, preferentemente un paciente humano, ganado o mascota domestica. Sin desear restringirse a ninguna teorla concreta, se cree que el beneficio terapeutico de la invencion se debe a la inhibicion de la senalizacion de IL-25 que da como resultado la reduction de la secrecion de colageno y citocinas proinflamatorias en un sitio de lesion, reparation, o en estados patologicos tales como la fibrosis.

"Una afeccion relacionada con la actividad no deseada en el fibrocito” tal como se utiliza en el presente documento incluye las afecciones que estan relacionadas con una actividad anomala en los fibrocitos tisulares o en los circulantes, por ejemplo, afecciones relacionadas con un aumento de la secrecion de colageno o un aumento de la diferenciacion de los fibrocitos a miofibroblasto. Los ejemplos de tales afecciones son las afecciones fibroticas, el cancer y la cicatrizacion de heridas.

La afeccion fibrotica puede ser una fibrosis especlfica de organo o una fibrosis sistemica. La fibrosis especlfica de organo puede ser la fibrosis pulmonar, la fibrosis hepatica, la fibrosis renal, la fibrosis cardlaca, la fibrosis pancreatica, la fibrosis vascular, la fibrosis cutanea, la fibrosis ocular o la fibrosis de medula osea. La fibrosis pulmonar puede estar relacionada con la fibrosis pulmonar idiopatica, la fibrosis pulmonar de origen medicamentoso,

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el asma, la sarcoidosis, la neumonla intersticial idiopatica o la enfermedad pulmonar obstructiva cronica. La fibrosis hepatica puede estar relacionada con la cirrosis, la esquistosomiasis o la colangitis. La cirrosis puede seleccionarse de entre la cirrosis post-hepatitis C, la cirrosis post-hepatitis B, la cirrosis inducida por alcohol, farmacos o sustancias qulmicas, o la cirrosis biliar primaria. La colangitis puede ser la colangitis esclerosante. La fibrosis renal puede estar relacionada con la nefropatla diabetica, la glomeruloesclerosis lupica, la glomerulonefritis proliferativa, la glomerulonefritis esclerosante o la dermopatla fibrosante nefrogenica. La fibrosis cardlaca puede estar relacionada con el infarto de miocardio, la reestenosis coronaria, la miocardiopatla congestiva, o la insuficiencia cardlaca. La fibrosis pancreatica puede estar relacionada con la remodelacion del estroma, la pancreatitis o la fibrosis estromal. La fibrosis vascular puede estar relacionada con la reestenosis arterial tras la angioplastia, o la aterosclerosis. La fibrosis cutanea puede estar relacionada con la cicatrizacion de quemaduras, la cicatrizacion hipertrofica, los queloides, la esclerodermia, la psoriasis, o la dermopatla fibrosante nefrogenica. La fibrosis ocular puede estar relacionada con la fibrosis retroorbital, la post-cirugla de cataratas, la vitreorretinopatla proliferativa, la fibrosis corneal, la cicatrizacion corneal por cirugla, o la catarata de la capsula anterior. La fibrosis de medula osea puede estar relacionada con la mielofibrosis idiopatica o la mielofibrosis de origen medicamentoso. Otras afecciones fibroticas pueden estar relacionadas con la enfermedad de Peyronie, la contractura de Dupuytren, la enfermedad de Crohn, la dermatomiositis, la artritis reumatoide, lesiones fibroticas tales como las que se forman tras la infeccion por Schistosoma japonicum, enfermedades autoinmunitarias, la fibrosis patogena, la enfermedad de Lyme, la cistitis cronica, los fibromas uterinos, la fibrosis ovarica, otras formaciones fibroqulsticas, la trabeculotomla de glaucoma de angulo abierto, o las adherencias fibroticas resultado de procedimientos quirurgicos. La fibrosis sistemica puede estar relacionada con la esclerosis sistemica, la fibrosis sistemica nefrogenica, o la enfermedad de injerto contra hospedador.

Por ejemplo, en el asma, los fibrocitos se diferencian aun mas a miofibroblastos, que persisten en las paredes engrosadas de las vlas respiratorias. Sin desear limitarse a teorla alguna, se cree que la inhibicion de la serialization de IL-25 en el fibrocito puede suprimir la diferenciacion de los fibrocitos a miofibroblasto, mejorando as! los slntomas del asma.

Por ejemplo, en la cirrosis hepatica los fibrocitos pueden migrar al hlgado y contribuir a la secretion de colageno y a la fibrosis (Kisselva et al., J. Hepatology, 45:429-438, 2000). Sin desear limitarse a teorla alguna, se cree que la inhibicion de la senalizacion de IL-25 en el fibrocito puede suprimir la production de colageno del fibrocito en el hlgado, previniendo o retrasando as! la fibrosis debida a la cirrosis hepatica.

Los canceres ejemplares pueden ser la leucemia, la leucemia aguda, la leucemia linfoblastica aguda (ALL), ALL de linfocitos B, linfocitos T o FAB, la leucemia mieloide aguda (AML), la leucemia mieloide cronica (CML), la leucemia linfocltica cronica (CLL), la leucemia de celulas pilosas, el slndrome mielodisplasico (MDS), un linfoma, la enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, el linfoma no Hodgkin, el linfoma de Burkitt, el mieloma multiple, el sarcoma de Kaposi, el carcinoma colorrectal, el carcinoma pancreatico, el carcinoma de celulas renales, el cancer de mama, el cancer de piel, el cancer de cuello uterino, el cancer de pancreas, el carcinoma nasofarlngeo, la histiocitosis maligna, el slndrome paraneoplasico/hipercalcemia por malignidad, los tumores solidos, los adenocarcinomas, los carcinomas de celulas escamosas, los sarcomas, el melanoma maligno, particularmente el melanoma metastasico, el hemangioma, la enfermedad metastasica, el cancer relacionado con la resorcion osea, el cancer relacionado con el dolor oseo, y similares.

La cicatrizacion de heridas ejemplar puede estar relacionada con traumatismos o una lesion tisular o con afecciones cronicas resultado de o relacionadas con ello, en una celula, tejido, organo, animal o paciente, por ejemplo una lesion corporal o un traumatismo relacionados con una cirugla, incluidas una cirugla toracica, abdominal, craneana u oral; o en la que la herida puede seleccionarse del grupo que consiste en heridas asepticas, heridas contusas, heridas incisas, laceraciones, heridas no penetrantes, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas septicas, infartos y heridas subcutaneas; o en la que la herida puede seleccionarse del grupo que consiste en ulceras isquemicas, ulceras por decubito, fistulas, picaduras graves, quemaduras termicas y heridas del sitio donante; o en la que la herida es una ulcera aftosa, una herida traumatica o una lesion relacionada con el herpes. Las heridas del sitio donante son heridas que se producen, por ejemplo, en relation con llevar tejido duro de una parte del cuerpo a otra parte del cuerpo, por ejemplo, en relation con un trasplante. Las heridas resultado de tales operaciones son muy dolorosas y por lo tanto, una mejor curacion resulta muy valiosa. La fibrosis de las heridas es abordable por la supresion de la actividad no deseada por un fibrocito inhibiendo la senalizacion de IL-25, ya que los fibrocitos migran a la zona de la herida y comienzan a producir colageno, asi como factores proangiogenicos. Casi todos los procesos de reparation tisular incluyen la formation temprana de tejido conectivo, una estimulacion de este y los posteriores procesos mejora la cicatrizacion del tejido, sin embargo, la sobreproduccion de tejido conectivo y colageno puede conducir a un tejido fibrotico caracterizado por ser no elastico e hipoxico. La supresion de la produccion de colageno por los fibrocitos inhibiendo la senalizacion de IL-25 en un sujeto puede ser util para modular, tratar o prevenir tales secuelas de la cicatrizacion de heridas.

Con “metodos de supresion de la actividad no deseada en el fibrocito en un sujeto” debe entenderse que cualquier supresion de la actividad no deseada por el fibrocito es un efecto beneficioso y puede dar como resultado la mejora de los sintomas en un sujeto con una afeccion relacionada con la actividad no deseada en el fibrocito. Por

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lo tanto, los metodos pueden dar como resultado prevenir la aparicion de un slntoma cllnico, inhibir, detener o retrasar la afeccion, o aliviar o provocar la regresion de la afeccion.

Los inhibidores de la senalizacion de IL-25 se han descrito anteriormente, y pueden ser por ejemplo un anticuerpo contra IL-25, un anticuerpo contra el receptor de IL-25 o un polipeptido receptor de IL-25 maduro soluble. Las cantidades de un determinado inhibidor suficientes para suprimir la actividad no deseada en el fibrocito en un sujeto pueden determinarse facilmente. El inhibidor puede administrarse individualmente o en combinacion con un segundo inhibidor. Tal segundo inhibidor puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido, polipeptido, oligonucleotido, o molecula pequena que inhibe la senalizacion de IL-25. "En combinacion con” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a que el inhibidor descrito puede administrarse a un sujeto a la vez en una mezcla, al mismo tiempo como unico inhibidor o secuencialmente como inhibidores individuales en cualquier orden.

La "cantidad terapeuticamente eficaz" del inhibidor de la senalizacion de IL-25 para suprimir la actividad no deseada en el fibrocito en un sujeto con una afeccion relacionada con la actividad no deseada en el fibrocito puede determinarse mediante tecnicas de investigacion convencionales. Por ejemplo, la dosificacion del inhibidor que sera eficaz en la supresion de la actividad no deseada en el fibrocito en afecciones tales como la fibrosis pulmonar o la fibrosis hepatica puede determinarse administrando el inhibidor a un modelo animal de fibrosis pulmonar o de fibrosis hepatica.

Un modelo ejemplar para la fibrosis pulmonar se genera inyectando bleomicina en sus pulmones. La bleomicina es un antineoplasico que, cuando se inyecta en las vlas respiratorias, provoca fibrosis en los pulmones de un animal y es una forma convencional de estudiar la fibrosis pulmonar (Crouch, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 259:L159-L184). Un modelo ejemplar para la fibrosis hepatica se genera mediante la ligadura del coledoco, y es una forma convencional de estudiar la fibrosis hepatica (Hellebrand C et al., Hepatology 24:670-76, 1996).

Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los margenes posologicos optimos. Un experto puede determinar la selection de una dosis eficaz particular (por ejemplo, mediante ensayos cllnicos) basandose en la consideration de varios factores. Tales factores incluyen la enfermedad a tratar o prevenir, los slntomas involucrados, la masa corporal del paciente, el estado inmunitario del paciente y otros factores conocidos por el experto. La dosis exacta a emplearse en la formulation dependera tambien de la via de administration y la gravedad del debilitamiento relacionado con la enfermedad, y debe ser decidida segun el juicio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse de curvas de dosis- respuesta obtenidas de sistemas de ensayo en modelos animales o in vitro. La dosis del inhibidor a administrar a un paciente, tal como un ser humano, es muy variable y puede ser objeto de juicio independiente. Con frecuencia resulta practico administrar la dosis diaria del inhibidor a diferentes horas del dla. Sin embargo, en cada caso concreto, la cantidad del inhibidor administrada dependera de factores tales como la solubilidad del inhibidor, la formulacion utilizada, el estado del paciente (tal como el peso), y/o la via de administracion.

El modo de administracion para suprimir la actividad no deseada en un fibrocito de un inhibidor de la senalizacion de IL-25 puede ser cualquier via conveniente que lleve el agente al hospedador. Las protelnas, fragmentos de protelnas, protelnas de fusion, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos y las composiciones farmaceuticas de estos inhibidores son particularmente utiles para la administracion parenteral, por ejemplo, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea o intranasal.

Los inhibidores de la senalizacion de IL-25 pueden prepararse como composiciones farmaceuticas que contienen una cantidad eficaz del agente como principio activo en un transportador farmaceuticamente aceptable. El termino "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehlculo con el cual se administra el compuesto activo. Tales vehlculos farmaceuticos pueden ser llquidos, tal como agua y aceites, incluidos los de origen animal, vegetal, sintetico o procedentes del petroleo, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo, y similares. Por ejemplo, puede utilizarse solution salina al 0,4% y glicina al 0,3%. Estas soluciones son esteriles y estan generalmente libres de partlculas. Pueden esterilizarse mediante tecnicas de esterilizacion convencionales conocidas (por ejemplo, filtration). Las composiciones pueden contener las sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables que sean necesarias para aproximarse a las condiciones fisiologicas, tales como agentes amortiguadores y de ajuste del pH, agentes estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentration del agente de la invention en tales formulaciones farmaceuticas puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente un 0,5%, normalmente un o al menos aproximadamente un 1% a tanto como un 15% o 20% en peso y se seleccionara basandose principalmente en los volumenes de fluido, las viscosidades, etc., segun el modo de administracion concreto seleccionado. Los metodos reales de preparation de composiciones administrables por via parenteral son conocidos y se describen con mas detalle por ejemplo en "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack publishing Company, Easton, PA.

Otro aspecto de la invencion es un metodo in vitro de identification de moduladores de la senalizacion de IL-25 que suprimen la proliferation de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secretion de protelnas por el fibrocito, proporcionando fibrocitos; proporcionar un modulador de ensayo; poner en contacto los fibrocitos con el modulador de ensayo; determinar un efecto del modulador de ensayo sobre la senalizacion de IL-25; determinar el efecto del modulador de ensayo sobre la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, y la

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secrecion de protelnas por el fibrocito; y seleccionar el modulador que modula la senalizacion de IL-25; y que modula la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito. Estos moduladores pueden ser naturales o sinteticos, inhibidores o activadores de la senalizacion de IL-25, y pueden identificarse utilizando uno o mas ensayos que evaluan la senalizacion de IL-25 y la actividad en un fibrocito como se ha descrito anteriormente.

Los fibrocitos pueden aislarse a partir de sangre periferica o tejido, purificarse y cultivarse como cultivos adherentes mediante metodos convencionales (Bucala et al., Mol. Medicine 1:71-81, 1994). Por ejemplo, las PBMC se alslan mediante centrifugacion en Ficoll-Paque, y se cultivan en cultivo adherente. Se eliminan las celulas no adherentes, y los fibrocitos se purifican adicionalmente de linfocitos T, linfocitos B y monocitos contaminantes mediante inmunoseleccion negativa con anticuerpos anti-CD2, anti-CD19 y anti-CD14, respectivamente. La expresion de CD45, CD34 y colageno I en la poblacion purificada confirma el origen fibrocltico (Bellini y Mattoli, Lab. Investigation 87:858-70, 2007).

El modulador de ensayo se incuba con fibrocitos sensibles a IL-25, y se evalua el efecto del modulador sobre la senalizacion de IL-25 y sobre la actividad en un fibrocito. El modulador de ensayo puede unirse directamente a IL-25 o al receptor de IL-25, o modular indirectamente la senalizacion de IL-25 en el fibrocito. El modulador de ensayo puede cribarse en forma sustancialmente purificada o en una mezcla bruta. Los moduladores de ensayo pueden ser anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, protelnas, peptidos, moleculas pequenas u oligonucleotidos.

En un ensayo de cribado ejemplar, los fibrocitos en cultivo se ponen en contacto con IL-25 y un modulador de ensayo, y se mide el efecto del modulador de ensayo sobre la secrecion de citocinas inducida por IL-25 y la diferenciacion de los fibrocitos. Las citocinas medidas son por ejemplo IL-6 y RANTES, y la diferenciacion de los fibrocitos puede medirse evaluando la cantidad de a-SMA en el fibrocito. Los metodos de deteccion de la secrecion de citocinas y la evaluacion de la diferenciacion de los fibrocitos son conocidos y se han descrito anteriormente.

Una vez que la presente invencion se ha descrito en su totalidad, sera evidente para un experto en la materia que pueden realizarse en la misma muchos cambios y modificaciones sin alejarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las formas de realization especlficas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo solamente, y la invencion sera limitada por los terminos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance total de los equivalentes a los que tales reivindicaciones tienen derecho, y la invencion no debe quedar limitada por las formas de realizacion especlficas que se han presentado en el presente documento a modo de ejemplo.

Ejemplo 1

Expresion de IL17RB en fibrocitos humanos y de roedores

Se ha descrito que los fibrocitos son una de las fuentes de aumento de miofibroblastos junto con los fibroblastos derivados de la EMT y los fibroblastos residentes que son una caracterlstica distintiva de las patologlas fibroticas. Los fibrocitos derivados de la medula osea que tienen que migrar a los sitios de lesion tisular pueden potenciar la fibrosis debido a la production de factores profibroticos y proinflamatorios. Alterar la diferenciacion, proliferacion o migration de los fibrocitos podrla proporcionar una via terapeutica distinta para tratar diversas afecciones fibroticas.

Se aislaron y cultivaron fibrocitos pulmonares y sangulneos murinos, y fibrocitos sangulneos humanos, segun los materiales y metodos. Las celulas aisladas mostraron morfologla con forma de huso o estrella irregular con prolongaciones ramificadas, caracterlsticas del tipo de celula. La inmunocitoqulmica demostro que los fibrocitos pulmonares y sangulneos murinos mostraban tincion positiva conjunta para cD45 y colageno I, marcadores de fibrocitos (datos no mostrados). La expresion positiva de IL17RB se demostro utilizando microscopia confocal en todas las clases de fibrocito ensayadas, incluidos los fibrocitos pulmonares y sangulneos murinos (datos no mostrados).

Para cuantificar la expresion de IL17RB de los fibrocitos, las celulas se sometieron a tincion triple con CD45, colageno e IL17RB y se enumeraron mediante citometrla de flujo. El 80% de los fibrocitos pulmonares murinos y el 49% de los fibrocitos sangulneos murinos dieron positivo para CD45 y el colageno I. De esta poblacion de celulas, el 40% de los fibrocitos pulmonares y el 99% de los fibrocitos sangulneos dieron positivo para IL17RB. Las celulas pulmonares murinas colageno I+ CD45- (fibroblastos) tambien expresaron IL17RB. Los fibrocitos sangulneos humanos tambien se evaluaron para la expresion de IL17RB; el 88% de los fibrocitos seleccionados dieron positivo para CD45 y colageno I. De esa poblacion de celulas, el 93% dio positivo para IL17RB. Por lo tanto, los fibrocitos circulantes sangulneos murinos y humanos expresaban IL17RB a niveles comparables.

Ejemplo 2

Senalizacion de IL-25 intacta en los fibrocitos

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Se evaluo el efecto de IL-25 sobre la liberacion de citocinas en los fibrocitos para demostrar las vlas de senalizacion de IL-25 intacta y de IL17RB funcional en los fibrocitos. La estimulacion especlfica in vitro de IL17RB ha demostrado aumentar la secrecion de citocinas proinflamatorias en otros tipos de celulas. IL-25 potenciaba la secrecion de RANTES, IL-6, KC y CCL2 inducida por TNF-a en los fibrocitos, pero no estimulaba en solitario la liberacion de citocinas.

Los fibrocitos pulmonares murinos (Fig. 1) estimulados con IL-25 en solitario durante 24 horas no mostraron un aumento de la expresion de citocinas mediante Luminex. 10 ng/ml de TNF-a en solitario aumentaron significativamente RANTES (Fig. 1A) en comparacion con el control (p = 0,022) y con las tres concentraciones de IL-25 (p = 0,021, p = 0,025, p = 0,018 para 1 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml de IL-25, respectivamente), pero fue significativamente menor que IL-25 + 10 ng/ml de TNF-a (p < 0,001). La coestimulacion de los fibrocitos con IL-25 y TNF-a dio como resultado un aumento significativo de RANTES en comparacion con todos los demas grupos (p < 0,001 para cada grupo). KC (Fig. 1B) fue significativamente mayor para IL-25 + 10 ng/ml de TNF-a en comparacion con el control (p = 0,015), con las tres concentraciones de IL-25 (p = 0,004, p = 0,009, p = 0,001 para 1 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml de IL-25, respectivamente) y TNF-a en solitario (p = 0,05). CCL2 (Fig. 1) fue significativamente mayor para IL-25 + 10 ng/ml de TNF-a en comparacion con el control (p = 0,012), con las tres concentraciones de IL-25 (p = 0,002, p = 0,005, p < 0,001 para 1 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml de IL-25, respectivamente) y con TNF-a en solitario (p = 0,017). El cambio en IL-6 (Fig. 2D) no resulto ser significativo mediante un ensayo para una diferencia global entre todos los grupos (p = 0,153), aunque IL-6 fue significativamente mayor comparando individualmente 10 ng/ml de IL-25 combinada con TNF-a con las tres concentraciones de IL-25 (p = 0,020, p = 0,048, p = 0,025 para 1 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml de IL-25, respectivamente), pero no TNF-a en solitario.

RANTES esta implicado en los procesos inmunorreguladores e inflamatorios, y es transcrito y secretado por los linfocitos T, otras celulas inflamatorias y las celulas estromales. RANTES es un ligando para los receptores de quimiocinas CCR1, CCR3, CCR4 y CCR5, que se expresan en las celulas epiteliales, los macrofagos, los linfocitos, las celulas dendrlticas y las celulas estromales (Ruster et al., Front Biosci. 13:944-55, 2008; van Deventer et al., Cancer Res. 65:3374-9, 2005). CXCL8 es un factor proangiogenico secretado por los fibrocitos y se encuentra presente durante la respuesta de cicatrizacion de heridas (Kovacs et al., FASEB J. 8:854-61, 1994). Se sabe que CCL2 es fundamental para el desarrollo de la fibrosis pulmonar y esta implicado en el reclutamiento de fibrocitos al pulmon (Moore et al., Am. J. Pathol. 166:675-84, 2005) y es la via probable mediante la que promueve la fibrosis. El CCL2 secretado por los fibrocitos es un potente quimioatrayente de linfocitos T y puede actuar para reclutar especlficamente linfocitos T CD4+ al entorno de reparacion tisular. IL-6 es un factor de crecimiento hematopoyetico secretado por los fibrocitos sangulneos y esta activo en muchas celulas, incluidos los fibroblastos, y por lo tanto, puede hacer de mediador autocrino o paracrino (Moodley et al., Am. J. Pathol. 163:345-54, 2003; Fries et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 11:552-60, 1994). Se ha demostrado que regula la diferenciacion de macrofagos, la proliferacion de linfocitos, el desarrollo de Th17 (Weaver et al., Immunity 24:677-88, 2006), es un factor profibrogenico (Moodley et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 29:490-98, 2003), puede inhibir la apoptosis en algunas celulas (Liu et al., Am. J. respire. Cell Mol. Biol. 37:121-8, 2007) y se sabe que es liberado durante la fase temprana de la reparacion tisular (Kishimoto et al., Science 258:593-97, 1992). Se ha descubierto que RANTES, CxCl8 y CCL2 estan aumentados en los pacientes con FPI, y se ha descubierto que CCL2 esta elevado en el epitelio bronquiolar de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) (Chung, Curr. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 4:619-25, 2005; Kodama et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Boil. 18:526-31, 1998; Tsoutsou et al., Respir. Med. 100:938-45, Epub del 19 de octubre de 2005).

TNF-a tiene efectos pleiotropicos, la mayorla de los cuales estimula una respuesta inflamatoria al actuar sobre las celulas mononucleares, los neutrofilos y las celulas endoteliales. En este estudio, TNF-a demostro tener un papel coestimulador en los fibrocitos con IL-25 para aumentar la secrecion de citocinas proinflamatorias. TNF-a es producido por los macrofagos y linfocitos activados, las celulas epiteliales y las celulas endoteliales. Tiene un papel central en los eventos tempranos que conducen a la cascada de produccion de citocinas y quimiocinas. Estimula directa o indirectamente la produccion de varios factores, tales como TGF-13, IL-1, IL-6, CXCL8, CCL2, PDGF y el factor estimulador de colonias de macrofagos y granulocitos. Un gran numero de estudios sobre la FPI y la EPOC ha demostrado que esta citocina esta presente en las zonas de fibrosis pulmonar (Emad et al., J. Interferon Cytokine Res. 27:38-43, 2007; Chung, Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 4:619-25, 2005). TNF-a ha demostrado anteriormente en combinacion con IL-25 en las celulas de musculo liso y los fibroblastos pulmonares humanos aumentar el ARNm de IL17RB e inducir la expresion de citocinas proinflamatorias (Letuve et al., J. Allergy Clin. Immunol. 117:590-6, 2006; Lajoie-Kadoch et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290:L1238-46, Epub del 20 de enero de 2006). La senalizacion intracelular inducida por IL-25 puede implicar la activacion de la familia MAPK, as! como NF-kB (Lee et al., J. Biol. Chem. 276:1660-4, 2001). La via de senalizacion principal de TNF-a tambien es a traves de la via de NF-kB y, por los tanto, las vlas de senalizacion solapantes pueden desempenar un papel en el efecto sinergico de IL-25 y TNF-a que induce la liberacion de citocinas en los fibrocitos. Esto sugiere que IL-25 y TNF-a podrlan actuar juntos en eventos fibroticos tempranos para activar las citocinas proinflamatorias liberadas desde los fibrocitos estimulados. La demostracion en este estudio de que los fibrocitos tienen un IL17RB funcional puede sugerir que IL-25 actua como mediador fibrotico a traves de la estimulacion de los fibrocitos circulantes y residentes.

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Ejemplo 3

La modulacion de la senalizacion de IL-25 modifica la funcion del fibrocito

Se estudio el efecto de IL-25 sobre la capacidad proliferativa del fibrocito mediante la estimulacion con IL-25 en solitario o en combinacion con PDGF-AB durante 96 horas en medio sin suero. PDGF-AB ha demostrado potenciar la proliferacion in vitro de los fibroblastos pulmonares [27]. PDGF-AB en solitario genero un aumento del 27% (p < 0,001) en la proliferacion de fibrocitos pulmonares murinos (Fig. 2A). IL-25 en solitario aumento significativamente la proliferacion de fibrocitos pulmonares murinos a todas las concentraciones ensayadas (p < 0,001 para cada comparacion), produciendo 1 ng/ml y 10 ng/ml (p < 0,001) de IL-25 un aumento del 30% en la proliferacion de los fibrocitos (Fig. 2A). La adicion de PDGF-AB a los fibrocitos pulmones murinos estimulados con IL-25 incremento el aumento de la actividad proliferativa en comparacion con 10 ng/ml de IL-25 (p = 0,04) o con 10 ng/ml de PDGF-AB (p = 0,02) en solitario (Fig. 2A). El efecto proliferativo (p < 0,02) de PDGF-AB sobre los fibrocitos pulmonares murinos se confirmo mediante incorporacion de BrdU (datos no mostrados). Por lo tanto, IL-25 y/o PDGF-AB exogenos pueden aumentar la proliferacion de fibrocitos pulmonares murinos in vitro. La adicion exogena de IL-25 a 1 ng/ml (p = 0,006) y 10 ng/ml (p = 0,001) tambien podia aumentar la proliferacion de fibrocitos sangulneos humanos significativamente en comparacion con el control sin suero, al igual que 10 ng/ml de PDGF (p = 0,024) (Fig. 2B).

Se estudio el efecto del bloqueo de IL-25 sobre la proliferacion de fibrocitos pulmonares murinos mediante AcMo de rata anti-IL-25 murina (AcMo 1923). La proliferacion de fibrocitos pulmonares inducida por IL-25 se redujo significativamente con concentraciones de AcMo anti-IL-25 de 5,5 pg/ml (p = 0,011), 16,7 pg/ml (p = 0,026) y 50 pg/ml (p = 0,001) en comparacion con IL-25 en solitario (Fig. 2). Para verificar que la respuesta de IL-25 era un efecto proliferativo y no un efecto apoptotico sobre los fibrocitos pulmonares murinos, se realizaron en los fibrocitos estudios de incorporacion de BrdU, lo que dio como resultado una respuesta similar de AcMo anti-IL-25 de inhibicion de la proliferacion inducida por IL-25 en los fibrocitos pulmonares murinos (datos no mostrados). El AcMo de rata anti-IL-25 murina produjo un efecto dependiente de la dosis significativamente lineal (p < 0,001) sobre la proliferacion de los fibrocitos pulmonares murinos inducida por IL-25 (10 ng/ml) (Fig. 2A) al reducir la proliferacion en un 3,75% por cada aumento de 3 veces de la concentracion de AcMo anti-IL-25 (Fig. 2C). Tambien se observo una disminucion significativa en la proliferacion de fibrocitos pulmonares murinos inducida por IL-25 (1 ng/ml) utilizando un hlbrido de IL17RB-Fc a 11 pg/ml o mas (p < 0,001 para 11 pg/ml, 33 pg/ml y 100 pg/ml de IL-25r) (Fig. 2D).

La diferenciacion de los fibrocitos murino a celulas tipo miofibroblasto se potencio gracias a la estimulacion con IL-25 exogena durante 96 horas en medio sin suero. TGF-p, una importante citocina fibrogenica y de regulacion del crecimiento implicada en la remodelacion tisular, aumenta la diferenciacion y la actividad funcional de los fibrocitos en cultivo (Chesney et al., J. Immunol. 160:419-25, 1998; Schmidt et al., J. Immunol. 171:380-9, 2003). Los fibrocitos cultivados en medios sin suero expresaron constitutivamente a-SMA (Fig. 3) y el tratamiento con TGF-p aumento la expresion de a-SMA en los fibrocitos pulmonares murinos (p < 0,001) (Fig. 3C). La estimulacion de los fibrocitos pulmonares murinos con IL-25 a todas las concentraciones ensayadas (Fig. 3A) provoco aumentos significativos (p < 0,001) en la expresion de a-SMA en comparacion con el control. Dentro de las concentraciones de IL-25 evaluadas, 10 ng/ml de IL-25 provocaron significativamente mayor expresion de a-SMA que 0,5 ng/ml (p = 0,010), 1 ng/ml (p = 0,017) y 20 ng/ml (p = 0,007) de IL-25. IL-25 aumento la expresion de a-SMA tambien en los fibrocitos sangulneos humanos a concentraciones de 1 ng/ml, 20 ng/ml y 50 ng/ml de IL-25, aunque el aumento solo fue significativo para 50 ng/ml de IL-25 (p = 0,025) en comparacion con el control sin suero (Fig. 3B).

Se evaluo el efecto del bloqueo de la diferenciacion de los fibrocitos pulmonares murinos inducida por IL-25 mediante un AcMo de rata anti-IL-25 murina (AcMo 1923). El AcMo de rata anti-IL-25 murina (p < 0,005) a 50 pg/ml podia bloquear completamente la diferenciacion de los fibrocitos pulmonares murinos inducida por 10 ng/ml de IL-25 (p < 0,001 comparado con el control) (Fig. 3C). El grupo de 50 pg/ml de AcMo anti-IL-25 fue significativamente diferente a todas las demas combinaciones de AcMo anti-IL-25 (p < 0,001 para cada comparacion) y el grupo de IL-25 en solitario (p < 0,001). El AcMo de rata anti-IL-25 murina todavia mostro una reduccion significativa en la expresion de a-SMA en comparacion con el grupo de IL-25 en solitario a las concentraciones de 16,7 pg/ml de grupo AcMo anti-IL-25 (p = 0,001), 5,5 pg/ml de grupo AcMo anti-IL-25 (p = 0,002) y 1,9 pg/ml de grupo AcMo anti-IL-25 (p = 0,040). Existia una relacion dosis-respuesta significativa (Fig. 3C) entre la concentracion de AcMo anti-IL-25 y la expresion de a-SMA cuando se combinaba el AcMo anti-IL-25 con IL-25. Estos estudios de diferenciacion realizados en celulas de raton y humanas demostraron que IL-25 podia aumentar la diferenciacion de los fibrocitos a miofibroblastos y que la diferenciacion podia ser bloqueada por un inhibidor de la senalizacion de IL-25.

Metodologfas

Aislamiento de fibrocitos a partir de pulmones murinos, y de sangre periferica murina y humana.

Se extrajeron pulmones murinos en condiciones asepticas. Los pulmones combinados se picaron con tijeras en medio completo DMEM que contenia suero bovino fetal al 20%. Los pulmones se colocaron en 10 ml de medio en una placa de cultivo de tejidos de 100 cm2. Las celulas no adherentes se eliminaron despues de 3 dias y

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las celulas se dejaron crecer durante otros 4 dlas en cultivo cuando las celulas alcanzaron el 80%-90% de confluencia. Las celulas se recolectaron utilizando Accutase y se tineron con anticuerpos anti-CD45 acoplados a bolas magneticas (Miltenyi Biotec). A continuacion, las celulas marcadas se clasificaron como positivas una o dos veces utilizando un aparato autoMacs segun las instrucciones del fabricante. La tincion para citometrla de flujo sobre esta poblacion confirmo que estas celulas eran CD45+ colageno (col) 1+.

Para la recogida de sangre humana, se recogieron y mantuvieron todos los permisos, autorizaciones y licencias necesarias, incluida la autorizacion de un Comite Institucional de Revision (IRB) tercero pertinente de un Formulario y Protocolo de Consentimiento Informado y cualquier documentacion pertinente relacionada con el estudio exigida por el IRB, para obtener, manipular, almacenar, guardar en un banco, transportar o utilizar muestras biologicas de empleados voluntarios del Centocor, R&D, Inc. En primer lugar, se aislo el total de PBMC de sangre humana o murina mediante centrifugacion sobre Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia) seguido del protocolo del fabricante. Despues de 2 dlas en cultivo en placas de cultivo sin recubrimiento en DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementadas con FCS al 20% (HyClone Labs, Logan, UT), se eliminaron las celulas no adherentes mediante una unica aspiracion suave. Despues de 10 a 12 dlas de cultivo continuo, las celulas adherentes se recogieron mediante incubacion en Accutase y se empobrecieron mediante seleccion inmunomagnetica en linfocitos T (pan-T, anti-CD2, Miltenyi Biotech), monocitos (anti-CD14, Miltenyi Biotech) y linfocitos B (Pan-B, anti-CD19, Miltenyi Biotech) contaminantes. Se determino que la viabilidad celular era > 90% mediante analisis Guava.

Generacion de anticuerpos monoclonales murinos anti-IL-25

Una rata CD de 12-14 semana de edad (Charles River Laboratories) recibio dos inyecciones intraperitoneales (IP) de 50 pg de IL-25 murina (R&D Systems, Minneapolis, MN) emulsionada en adyuvante Titermax los dlas 0 y 14. El dla 68, la rata recibio un refuerzo final de 50 pg de IL-25 murina subcutanea tres dlas antes de la recoleccion esplenica para la fusion. Se aislo el bazo, se preparo una suspension de una sola celula y se llevo a cabo la fusion en una relacion 1:1 entre celulas de mieloma murino FO y celulas de bazo viables segun el metodo de De St. Groth [25]. La fusion celular se inicio con PEG 4000 y los clones se cultivaron en presencia de medio HAT [DMEM con Glutamax™ (modificado), complementado con FBS al 20%, Origen al 5%, 25 pg/ml de gentamicina (Sigma) y HAT (hipoxantina 100 pM, aminopterina 0,4 pM y timidina 16 pM (Sigma) y se sembraron en metilcelulosa semisolida (Medium D, StemCell Technologies) en placas de Petri grandes (Genetix, Hampshire, Reino Unido). Las placas se hicieron pasar por el instrumento ClonePixFL (Gentix) para la seleccion de una sola colonia basandose en imagenes de luz blanca. Se seleccionaron colonias individuales en medio Medium E (StemCell Technologies) para realizar ensayos adicionales. El cribado primario de todos los sobrenadantes de hibridomas sin diluir se realizo mediante un ensayo ELISA de captura para IL-25. Todas las estirpes celulares que se unieron a la IL-25 murina recombinante se subclonaron limitando la dilucion y se cribaron mediante ensayos ELISA en fase solida y de captura para IL-25. Se identifico un clon de hibridoma neutralizante de IL-25, se hizo proliferar y el anticuerpo monoclonal expresado AcMo 1923 se purifico mediante purificacion discontinua en matraz.

Inmunocitoqufmica

Para la inmunofluorescencia, las celulas se sembraron en portaobjetos de 8 pocillos a 1,5 x 104 celulas/pocillo y se fijaron cuando alcanzaron la semiconfluencia (dla 7) en formaldehldo al 3% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron varias veces en PBS. Las celulas se permeabilizaron con metanol durante 10 minutos a -20°C y se lavaron en tampon de tincion, se bloquearon y se detectaron utilizando los protocolos convencionales. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anticuerpo monoclonal de rata anti-CD45 de raton (dilucion 1:40; BD Biosciences, San Jose CA), anticuerpo policlonal de conejo anti-colageno I de raton (dilucion 1:200; Chemicon, Temecula, CA) o anticuerpo monoclonal de rata anti-IL-25R de raton (dilucion 1:50; R&D Systems). Los controles de isotipo fueron: control de isotipo IgG2b de rata (dilucion 1:320; BD Biosciences) y control de isotipo IgG de conejo (dilucion 1:300; Imgenex, San Diego, CA). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron cabra anti-IgG de rata Alexa Fluor® 594 (H+L) (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR) o cabra anti-IgG de conejo Alexa Fluor® 647 (H+L) (dilucion 1:200; Molecular Probes). Todos los portaobjetos se observaron en el microscopio confocal laser (disco giratorio UltraVIEW ERS; Perkin Elmer, Wellesley, MA).

Analisis de citometrla de flujo

Para el analisis de citometrla de flujo de los fibrocitos pulmonares y sangulneos murinos, se anadieron a los tubos de citometrla de flujo 2 x 105 celulas viables y se sometieron a centrifugacion. Las celulas se resuspendieron en 50 pl de tampon de tincion (BSA al 0,2% y azida sodica al 0,02% en PBS) y 1 pl de bloqueador de Fc (BD Biosciences) y se incubaron durante 10 minutos. Se anadio anticuerpo monoclonal anti-CD45 conjugado con PE (BD Biosciences) y se incubo durante 40 minutos, despues de lo cual las celulas se lavaron, fijaron y permeabilizaron en BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences) durante 20 minutos. Las celulas se resuspendieron en tampon BD, y las protelnas se detectaron con el anticuerpo primario de rata anti-IL-25R de raton (dilucion 1:50; R&D systems) y anti-colageno I conjugado con biotina (dilucion 1:150; Rockland, Gilbertsville, PA) seguido de cabra anti- IgG de rata Alexa Fluor® 488 (dilucion 1:200; Molecular Probes) y conjugado con estreptavidina-aloficocianina (1:150; BD Biosciences). Las celulas se lavaron y fijaron con paraformaldehido al 3%. Los controles de isotipo fueron

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control de isotipo IgG2b de rata conjugado con PE (BD Biosciences), control de isotipo IgG2b de rata (R&D Systems) y fraccion IgG del anti-biotina (1:1.500; Rockland).

Para la citometrla de flujo de los fibrocitos sangulneos humanos, se anadieron a los tubos de citometrla de flujo 2 x 105 celulas viables y se sometieron a centrifugacion. Las celulas se resuspendieron en 50 pl de tampon de tincion (BSA al 0,2% y azida sodica al 0,02% en PBS) y 1 pl de bloqueador de Fc y se incubaron durante 10 minutos. Se anadio anticuerpo monoclonal anti-CD45 conjugado con PE (clon HI30, eBiosciences, San Diego, CA) y se incubo durante 40 minutos, despues de lo cual las celulas se lavaron, fijaron y permeabilizaron en BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences) durante 20 minutos. Las celulas se resuspendieron en tampon BD, y las protelnas se detectaron utilizando anticuerpo de raton anti-IL-25R humano (dilucion 1:100; R&D systems) y anticuerpo anti-colageno I conjugado con biotina (dilucion 1:150; Rockland, Gilbertsville, PA), seguido de cabra anti- IgG de raton Alexa Fluor® 488 (dilucion 1:200; Molecular Probes) y conjugado con estreptavidina-aloficocianina (dilucion 1:150; BD Biosciences). Las celulas se lavaron y fijaron con paraformaldehido al 3%. Los controles de isotipo fueron control de isotipo IgG1 de raton (BD Biosciences), control de isotipo IgG2b de rata (dilucion 1:320; BD Biosciences) y fraccion IgG del anti-biotina (dilucion 1:1500; Rockland).

Estudios de secrecion de protefnas

Para el ensayo de secrecion de protelnas se sembraron fibrocitos pulmonares y sangulneos murinos y fibrocitos sangulneos humanos recien seleccionados a 1 x 104 celulas viables/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las celulas se incubaron en los medios de control (BSA al 10% en DMEM) durante 5 dlas, se privaron de suero durante 24 horas, y se incubaron durante 24 horas en DMEM sin suero en presencia de IL-25 o TNF-a en solitario o IL-25 y TNF-a en combinacion. Se midieron los niveles de citocinas/quimiocinas en el medio acondicionado mediante un panel de citocinas/quimiocinas de raton - 22 Plex (Millipore, Billerica, MA) para los fibrocitos murinos o un panel de citocinas/quimiocinas humanas - 25 Plex (Millipore) para los fibrocitos humanos, y se analizaron en el sistema Luminex. Los datos se expresan como la media ± dE (n = 2).

Ensayo de proliferacion celular

Para el ensayo de proliferacion celular se sembraron fibrocitos pulmonares murinos o fibrocitos sangulneos humanos recien seleccionados a 0,5 x 104 celulas viables/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Las celulas se incubaron en los medios de control (BSA al 10% en DMEM) durante la noche. Los medios se eliminaron y sustituyeron con IL-25 o PDGF-AB en solitario o IL-25 y PDGF-AB en combinacion en medios sin suero (BSA e ITS al 1% en DMEM). Se utilizo AcMo 1923 a concentraciones entre 0,62 pg/ml-50 pg/ml, y se utilizo el hlbrido IL-25RFc humano maduro recombinante (R&D systems) a concentraciones entre 1,1 pg/ml-100 pg/ml. El IL-25RFc o el AcMo 1923 se incubaron con IL-25 durante 40 minutos antes de anadirse a los fibrocitos. La proliferacion celular se midio utilizando CellTiter-Glo® (Promega, Madison WI) e incorporacion de BrdU. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 3).

Ensayo de diferenciacion

Para el ensayo de diferenciacion celular se sembraron fibrocitos pulmonares murinos o fibrocitos sangulneos humanos recien seleccionados a 1,5 x 104 celulas viables/pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos opaca. Las celulas se incubaron en los medios de control (BSA al 10% en DMEM) durante la noche. Los medios se eliminaron y sustituyeron con IL-25 o TGF-p en solitario en medios sin suero (BSA e ITS al 1% en DMEM). Se utilizo AcMo 1923 a concentraciones entre 0,62 pg/ml-50 pg/ml, y se incubo con IL-25 durante 40 minutos antes de anadirse a los fibrocitos. Las celulas se incubaron durante 96 horas a 37°C, se fijaron en metanol al 100%, se bloquearon y se tineron con anti-alfa actina de musculo liso (dilucion 1:400; Sigma) seguido de anti-IgG de raton conjugado con HRP (dilucion 1:2.000; Sigma) durante 60 minutos a temperatura ambiente. La densidad optica de los pocillos se analizo utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 405 nm. Los datos se expresan como la media ± DE (n = 3).

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Reivindicaciones

1. Metodo in vitro de supresion de la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito mediante un inhibidor que actua sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe especlficamente la interaccion de IL-25 con el receptor de IL-25, que comprende inhibir la senalizacion de IL-25 en el fibrocito.
2. Inhibidor de la senalizacion de IL-25 que actua sobre IL-25 y/o el receptor de IL-25, o inhibe especlficamente la interaccion de IL-25 con el receptor de IL-25 para utilizarse en un metodo de tratamiento de afecciones fibroticas en las cuales el tratamiento se consigue suprimiendo la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito en un sujeto con una afeccion relacionada con la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de protelnas por el fibrocito.
3. Metodo segun la reivindicacion 1, en la que la inhibicion de la senalizacion de IL-25 comprende poner en contacto los fibrocitos con un inhibidor que se une especlficamente a IL-25 o al receptor de IL-25.
4. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 2, en la que el inhibidor se une especlficamente a IL-25 o al receptor de IL-25.
5. Metodo segun la reivindicacion 3, o inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 4, en las que el inhibidor esta seleccionado de un grupo que consiste en

a) un anticuerpo;

b) un fragmento de anticuerpo;

c) un peptido;

d) un polipeptido;

e) un oligonucleotido;

f) una molecula pequena; y

g) una combinacion de los mismos.
6. Metodo segun la reivindicacion 5, en la que el inhibidor esta seleccionado de un grupo que consiste en

a) un receptor de IL-25 soluble;

b) un anticuerpo contra IL-25; y

c) un anticuerpo antagonista contra el receptor de IL-25.
7. Metodo segun la reivindicacion 3, o inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 4, en las que el receptor de IL-25 es IL17RB.
8. Metodo segun la reivindicacion 1, o inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 2, en las que los fibrocitos son fibrocitos pulmonares residentes o fibrocitos circulantes.
9. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 2, en la que el sujeto es un ser humano.
10. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 2, en la que la afeccion con proliferacion de los fibrocitos, diferenciacion de los fibrocitos o secrecion de protelnas por el fibrocito es:

a) una afeccion fibrotica;

b) un cancer; o

c) la enfermedad de Crohn, la cistitis cronica, una enfermedad autoinmunitaria, la artritis reumatoide, la enfermedad de Lyme, la cicatrizacion postquirurgica, la cicatrizacion de heridas, o las lesiones por radiacion.
11. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion, 10 en la que:

a) la afeccion fibrotica es una fibrosis especlfica de organo o una fibrosis sistemica; o

b) el cancer es el cancer de mama, el cancer de piel, el cancer de pancreas, o el cancer de cuello uterino.
12. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 11, en la que:

a) la fibrosis especlfica de organo es la fibrosis pulmonar, la fibrosis hepatica, la fibrosis de rinon o renal, la fibrosis cardlaca, la fibrosis pancreatica, la fibrosis vascular, la fibrosis cutanea, la fibrosis ocular o la fibrosis de medula osea; o

b) la fibrosis sistemica es la esclerosis sistemica, la fibrosis sistemica nefrogenica o la enfermedad de injerto contra hospedador.
13. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 12, en la que:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

a) la fibrosis pulmonar esta relacionada con la fibrosis pulmonar de origen medicamentoso, la fibrosis pulmonar idiopatica, el asma, la sarcoidosis, la neumonia intersticial idiopatica o la enfermedad pulmonar obstructiva cronica;

b) la fibrosis hepatica esta relacionada con la cirrosis, la esquistosomiasis o la colangitis;

c) la fibrosis renal esta relacionada con la glomeruloesclerosis lupica, la glomerulonefritis proliferativa, la glomerulonefritis esclerosante, la dermopatia fibrosante nefrogenica, o la nefropatia diabetica; o

d) la fibrosis cardiaca esta relacionada con el infarto de miocardio, la reestenosis coronaria, la miocardiopatia congestiva, o la insuficiencia cardiaca;

e) la fibrosis pancreatica esta relacionada con la remodelacion del estroma, la pancreatitis, o la fibrosis estromal;

f) la fibrosis vascular esta relacionada con la reestenosis arterial tras la angioplastia, o la aterosclerosis;

g) la fibrosis cutanea esta relacionada con la cicatrizacion de quemaduras, los queloides, la esclerodermia, la psoriasis, o la dermopatia fibrosante nefrogenica;

h) la fibrosis ocular esta relacionada con la fibrosis retroorbital, la post-cirugia de cataratas, la vitreorretinopatia proliferativa, la fibrosis corneal, la cicatrizacion corneal por cirugia, o la catarata de la capsula anterior; o

i) la fibrosis de medula osea esta relacionada con la mielofibrosis idiopatica o la mielofibrosis de origen medicamentoso.
14. Inhibidor para utilizarse segun la reivindicacion 13, en la que:

a) la cirrosis es la cirrosis post-hepatitis C, la cirrosis post-hepatitis B, la cirrosis inducida por alcohol, farmacos o sustancias quimicas, o la cirrosis biliar primaria; o

b) la colangitis es la colangitis esclerosante.
15. Metodo in vitro de identificacion de moduladores de la senalizacion de IL-25 que suprimen la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de proteinas por el fibrocito, que comprende:

a) proporcionar los fibrocitos;

b) proporcionar un modulador de ensayo;

c) poner en contacto los fibrocitos con el modulador de ensayo;

d) determinar un efecto del modulador de ensayo sobre la senalizacion de IL-25;

e) determinar el efecto del modulador de ensayo sobre la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, y la secrecion de proteinas por el fibrocito; y

f) seleccionar el modulador que

i) modula la senalizacion de IL-25; y

II) modula la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de proteinas por el fibrocito.
16. Metodo segun la reivindicacion 15, que selecciona adicionalmente el modulador que:

a) inhibe la senalizacion de IL-25; y

b) suprime la proliferacion de los fibrocitos, la diferenciacion de los fibrocitos, o la secrecion de proteinas por el fibrocito.