ES2598006T3 - Anticuerpos anti-TGF-beta para la inducción del crecimiento óseo - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que se une inmunológicamente a TGF-( para su uso en un método para aumentar la masa ósea y/o el volumen óseo y/o aumentar el crecimiento del hueso y/o la resistencia del hueso en un sujeto, en donde dicho sujeto padece osteoporosis, fractura ósea, pérdida de hueso debida a traumatismo o enfermedad de Paget, en donde el sujeto no tiene cáncer y en donde el anticuerpo se une a las tres isoformas de TGF-β.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Anticuerpos anti-TGF-beta para la induccion del crecimiento oseo Antecedentes de la invencion

I. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a los campos de la biologia molecular y la medicina. Mas en particular, se refiere a los campos de enfermedades y lesiones de huesos, reparacion de huesos, implantes oseos, injertos oseos, enfermedades periodontales y cancer. Especificamente, trata de anticuerpos dirigidos contra TGF-p en el uso para estimular la formacion y el crecimiento del hueso, para aumentar la masa y la resistencia oseas y, por tanto, para tratar enfermedades oseas tales como la osteoporosis, asi como el traumatismo oseo.

II. Tecnica relacionada

Aproximadamente 200 millones de personas en todo el mundo padecen trastornos oseos tales como osteoporosis, fracturas oseas y enfermedades periodontales (encias) (en donde el diente se desprende del hueso circundante). La osteoporosis representa un problema de atencion sanitaria importante y en rapido crecimiento con una necesidad medica no satisfecha de los tratamientos que estimulen la formacion del hueso. La mayoria de farmacos actuales para la osteoporosis retrasan la degradation del hueso, pero no estimulan la formacion osea para sustituir el hueso ya perdido. Los compuestos que estimulan la formacion osea representan de esta manera una necesidad no satisfecha en el area de las enfermedades de huesos. Se sabe que la osteoporosis afecta aproximadamente a 100 millones de personas en todo el mundo -35 millones de las cuales viven en Estados Unidos, Europa occidental y Japon. Ademas, aproximadamente 25 millones de individuos sufren fracturas de huesos anualmente, 60 millones tienen enfermedades periodontales (en las que los dientes se desprenden de la mandibula), y otros 18 millones tienen otras enfermedades tales como cancer de hueso.

Los tratamientos mas usuales para los pacientes con osteoporosis se centran en la prevention de la perdida del hueso, no en la formacion de hueso. Esto sigue siendo una importante consideration ya que una morbilidad y mortalidad significativas se asocian con el reposo prolongado en cama de personas mayores que se produce tras una fractura de hueso, particularmente, en aquellas personas que han sufrido fracturas de cadera. Las complicaciones debidas al reposo en cama incluyen coagulos y neumonia. Estas complicaciones son reconocidas y se toman usualmente medidas para evitarlas, pero estas son apenas el mejor enfoque al tratamiento.

Otro problema de salud adicional relacionado con los huesos es la reconstruction osea y, especificamente, la capacidad de reconstruir defectos en el tejido oseo que son resultado de una lesion traumatica, como consecuencia del cancer o de la cirugia contra el cancer, o como resultado de un defecto congenito, o como resultado del envejecimiento. Existe una necesidad significativa de implantes ortopedicos mas frecuentes, y los huesos craneales y faciales son dianas concretas para este tipo de necesidades reconstructivas. La disponibilidad de nuevos materiales de implante, por ejemplo, titanio, ha permitido la reparacion de defectos relativamente grandes. Los implantes de titanio proporcionan excelente estabilidad temporal en los defectos oseos. Sin embargo, la experiencia ha mostrado que la carencia de hueso viable para salvar el defecto puede dar como resultado la exposition del aparato, infection, inestabilidad estructural y, finalmente, al fracaso en la reparacion del defecto.

Los injertos de hueso autologos son otra posibilidad para hacer frente a la lesion osea, pero tienen algunas desventajas demostradas porque deben extraerse de algun sitio del donante tal como la cresta iliaca o una costilla, normalmente esto proporciona una cantidad de hueso insuficiente para rellenar completamente el defecto y el hueso que se forma es algunas veces propenso a la infeccion y a la resorcion. Las preparaciones xenogenicas parcialmente purificadas no son practicas para el uso clinico debido a que a partir de kilogramos de hueso de bovino solo se purifican cantidades en microgramos, haciendo que la production comercial a gran escala sea costosa e impracticable. Se emplean a menudo por tanto aloinjertos y preparaciones de huesos desmineralizados. Las transferencias microquirurgicas de injertos de huesos libres con tejido blando y vasos sanguineos unidos pueden cerrar defectos oseos y permiten una fuente inmediata de suministro de sangre al injerto. Sin embargo, estas tecnicas que requieren mucho tiempo, han mostrado producir una gran cantidad de morbilidad, y pueden utilizarse solo por individuos especialmente preparados.

Otra forma de enfermedad osea es la resultante del cancer. Numerosos canceres metastatizan al hueso y pueden dar como resultado el debilitamiento del hueso, y algunos se asocian incluso a su destruction del hueso y perdida, tal como cancer de mama, pulmon, tiroides, rinon y prostata. Ademas, el mieloma multiple y su enfermedad osea asociada a mieloma (MBD) no es un cancer metastasico. En su lugar, las celulas de mieloma se derivan de linfocitos B del sistema inmunitario que residen normalmente en la medula osea y estan por tanto intimamente asociados con el hueso. De hecho, el microentorno de la medula osea juega un importante papel en el crecimiento, la supervivencia y la resistencia a la quimioterapia de las celulas de mieloma, que, a su vez, regula la perdida de hueso aumentada asociada con este trastorno (pagina web en multiplemyeloma.org). Aproximadamente el 90 % de los pacientes con mieloma tienen implicaciones oseas, comparado con el 40-60 % de los pacientes con cancer que tienen metastasis

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

osea, y aproximadamente el 80 % de estos pacientes con MBD tienen un dolor de huesos intratable. Adicionalmente, aproximadamente un 30 % de los pacientes de mieloma tienen hipercalcemia, que es un resultado de la actividad osteolftica aumentada asociada con esta enfermedad (Cavo et al., 2006).

A diferencia de la osteolisis asociada con otros tumores oseos, las lesiones de MBD son unicas ya que no sanan ni se reparan, a pesar de que los pacientes lleven muchos anos de remision completa (pagina web en multiplemyeloma.org; Terpos et al., 2005). Mecanicistamente, esto parece estar relacionado con la inhibicion y/o la perdida de los osteoblastos formadores de huesos durante la progresion de la enfermedad. De hecho, los estudios de marcadores oseos y de histomorfometria indican que los osteoclastos resorbedores de hueso y la actividad osteoblastica estan aumentadas, pero equilibradas al principio de la enfermedad, mientras que la MBD abierta muestra actividad osteoclastica alta y baja actividad osteoblastica (pagina web en multiplemyeloma.org). Por lo tanto, la MBD es un trastorno en el que la formacion de hueso y la perdida de hueso estan desacopladas y se beneficiarian de tratamientos que estimulen la formacion de hueso y el retraso de su perdida. Hasta la fecha, no existen dichos tratamientos. Por lo tanto, sigue existiendo necesidad de metodos mejorados de estimulacion de la formacion de hueso y de aumento de la resistencia del hueso in vivo para tratar las enfermedades y las lesiones de huesos, incluyendo cancer.

Los documentos US 2006/0015952 divulgan el uso de anticuerpos dirigidos contra TGF-beta neutralizantes para preservar la destruccion del hueso y la perdida del hueso, y detener o retrasar los procesos patologicos de destruccion o perdida de hueso. El documento US 2006/0015952 esta limitado al campo del cancer y al tratamiento del cancer.

Mooney et al. (Journal of craniofacial surgery, vol. 18, n° 2, pag. 336-346) divulga que el tratamiento con anticuerpos dirigidos a TGFbeta2 aumenta el volumen y el crecimiento del craneo.

Sumario de la invencion

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, se proporciona un anticuerpo que se une inmunologicamente a TGF-p para su uso en un metodo para aumentar la masa osea y el volumen oseo y/o aumentar el crecimiento del hueso y/o la resistencia del hueso en un sujeto, en donde dicho sujeto padece osteoporosis, fractura osea, perdida de hueso debida a traumatismo, o enfermedad de Paget, en donde el sujeto no tiene cancer y en donde el anticuerpo se une a las tres isoformas de TGF-p. El anticuerpo puede designarse como 1D11, y puede ser una version humanizada de 1D11, o cualquier version genomanipulada que contenga las CDR de 1D11 en un marco heterologo.

En realizaciones, el anticuerpo dirigido contra TGF-p se une especialmente a al menos: (a) TGF-p1, TGF-p2, y TGF- p3 (denominado tambien "anticuerpo pan-neutralizante"). En varias realizaciones, la constante de afinidad Ka del anticuerpo dirigido contra TGF-p para al menos una isoforma de TGF-p, que se une especificamente, es preferentemente mayor de 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, o 1012 M-1. En otras realizaciones adicionales, el anticuerpo de la invencion se une especificamente a una proteina sustancialmente identica a la TGF- p1, TGF-p2, y/o TGF-p3 humanas. Contempladas tambien para su uso en seres humanos estan las formas quimericas y humanizadas y los derivados de anticuerpos no humanos. La production de dichas variantes esta tambien comprendida entre los conocimientos normales de una persona experta en la materia (vease, por ejemplo, Antibody Engineering, ed., Borrebaeck, 2a ed., Oxford University Press, 1995).

En una realization, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es un anticuerpo monoclonal de murino 1D11 producido mediante el hibridoma 1D11.16 (n.° de deposito ATCC HB 9849, tambien descrito en las patentes de Estados Unidos. 5.571.714, 5.772.998 y 5.783.185). El anticuerpo 1D11 se une especificamente a las tres isoformas de TGF- p de mamiferos. La secuencia de la region variable de la cadena pesada de 1D11 esta disponible con el n.° de registro AAB46787. En realizaciones relacionadas, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es un derivado de 1D11, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las secuencias CDR identicas a las de 1D11 (por ejemplo, un anticuerpo quimerico, humanizado o con la CDR injertada). En otra realizacion adicional, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es un anticuerpo recombinante completamente humano.

El anticuerpo puede administrarse a dicho sujeto sistemicamente, por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea o topica. El anticuerpo se puede administrar en un sitio diana del hueso, incluyendo la inyeccion en el sitio. El anticuerpo puede tambien estar comprendido en un dispositivo de liberation temporal implantado en el sitio.

El sujeto puede ser un ser humano o un animal no humano, tal como un raton, una rata, un conejo, un perro, un gato, un caballo, un mono o una vaca. El metodo puede comprender ademas al menos una segunda administration de dicho anticuerpo, incluyendo regimenes de tres administraciones por semana. El sujeto puede recibir al menos 9 administraciones. El metodo puede comprender ademas evaluar la masa osea tras la administracion de dicho anticuerpo, tal como mediante obtencion de imagenes oseas.

Se divulga tambien en el presente documento:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

• un metodo para aumentar el numero de osteoblastos en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une inmunologicamente al TGF-p;

• un metodo que comprende disminuir el numero de osteoclastos en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une inmunologicamente al TGF-p;

• un metodo para aumentar la resistencia del hueso en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une inmunologicamente al TGF-p; y

• un metodo para disminuir la senalizacion del TGF-p en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une inmunologicamente al TGF-p.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invencion. La invencion puede comprenderse mejor por referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de las realizaciones especificas presentadas en el presente documento.

FIG. 1 - Regimen de tratamiento. Se trataron por via intraperitoneal ratones C57B1/6 (n = 5) con 1D11 o anticuerpo control (13C4) 3 veces/semana durante 28 dias. Se determinaron los parametros esqueleticos mediante digitalizacion con |jCT, analisis histomorfometrico y ensayo bioquimico. Se determinaron tambien los efectos del tratamiento con anticuerpos dirigidos contra TGF-p sobre la distribucion y la expresion del gen/proteina.

FIGS. 2A-F - el tratamiento con 1D11 aumenta el volumen oseo. Imagenes de renderizado tridimensional procedentes de regiones digitalizadas con jCT de metafisis de la tibia (200 jm) mostraron un volumen oseo aumentado en ratones tratados con 1D11 (FIGS. 2A-B), acompanado por un aumento de BV/TV (FIG. 2C) y BMD (FIG. 2D). Tambien se observo un engrosamiento de las trabeculas (FIG. 2E), y una disminucion en la separacion trabecular en esta region en los animales tratados con 1D11 (FIG. 2F; * = p < 0,05).

FIGS. 3A-B - Analisis histomorfometrico. Las secciones tisulares de vertebras lumbares descalcificadas de animales tratados con 1D11 mostraron un significativo aumento en BV/TV y cambios positivos en los parametros trabeculares, en comparacion con los animales del control (FIG. 3A, Von Kossa/Van Gieson, * = p < 0,05). El volumen oseo largo aumento de forma importante (FIG. 3B, H y E).

FIGS. 4A-D - Distribucion celular de osteocitos despues del tratamiento con 1D11. Secciones tibiales descalcificadas tenidas para TRAP mostraron una considerable disminucion en los osteoclastos tenidos positivamente que revisten la superficie del hueso trabecular en comparacion con los controles (FIG. 4A, aumento inicial x4; FIG. 4B, aumento inicial x20; flechas negras = osteoclastos). Se cuantifico la distribucion celular mediante el analisis morfometrico de las secciones tenidas con H y E y TRAP, y demostro una disminucion significativa en el numero de osteoclastos y la superficie sobre el hueso de los ratones tratados con 1D11 (FIG. 4C, ** p < 0,01). El numero de osteoclastos se elevo significativamente en ratones tratados con el anticuerpo 1D11 (FIG. 4D, * p < 0,05).

FIG. 5 ■ Ensayo biomecanico. Se examinaron biomecanicamente femures recientemente disecados procedentes de ratones tratados con 1D11 o ratones del control mediante flexion de 3 puntos. Los femures se situaron horizontalmente y se cargaron monotonicamente a una velocidad de 3 mm/min en la diafisis media. El tratamiento con 1D11 aumento significativamente la resistencia a la flexion, el limite elastico y el modulo del tejido (** = p < 0,01; *** = p < 0,001).

Descripcion detallada de la invencion

TGF-p es una proteina de la matriz osea abundante que afecta la formacion, la funcion y las interacciones celula- celula de osteoblastos y osteoclastos, para controlar la remodelacion del hueso y mantener una masa osea adecuada. De este modo, la ruta de senalizacion de TGF-p representa una unica diana farmacologica, con el potencial para regular el volumen y la calidad del hueso mediante el control de osteoblastos y osteoclastos. Los estudios previos utilizando modelos murinos que contienen modificaciones geneticas en la ruta de senalizacion de TGF-p han mostrado que la senalizacion reducida de TGF-p potencia las propiedades mecanicas y la concentracion de minerales de la matriz osea, asi como la masa osea. Aunque los inhibidores de moleculas pequenas de la senalizacion de TGF-p han mostrado disminuir el crecimiento y la invasividad del cancer, no se ha resuelto completamente el efecto directo del bloqueo de TGF-p sobre el entorno de la medula osea normal en ratones que no soportan tumores.

Por lo tanto, los inventores examinaron la capacidad de un anticuerpo generado contra TGF-p de bloquear las rutas de senalizacion de TGF-p. Este anticuerpo regulo positivamente el numero de osteoblastos, aunque disminuyo simultaneamente la cantidad de osteoclastos activos en la medula. Esto dio como resultado un importante aumento en el volumen y la calidad del hueso. Estos hallazgos ilustran claramente el potencial de los compuestos que pueden dirigir especificamente la ruta de senalizacion de TGF-p in vivo, y sugiere una solucion terapeutica para aumentar la masa y la resistencia oseas. Estos y otros aspectos de la invencion se muestran en detalle a continuacion.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

I. Anticuerpo dirigido contra-TGF-p

A. TGF-p

El factor p de crecimiento transformante (TGB-p) controla la proliferation, la diferenciacion celular y otras funciones en la mayoria de las celulas. Actua sobre la inmunidad, el cancer, la cardiopatia, la diabetes, y el sindrome de Marfan. El TGF-p actua como un factor antiproliferativo en celulas epiteliales normales y en los estadios iniciales de la oncogenesis. Algunas celulas secretan TGF-p, y tienen tambien receptores del TGF-p. Esto se conoce como una senalizacion autocrina. Las celulas cancerosas aumentan su production de TGF-p, que actua tambien sobre las celulas circundantes.

TGF-p es una proteina secretada que existe en tres isoformas, denominadas TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. Este era tambien el nombre original de TGF-p1, que fue el miembro fundador de esta familia. La familia de TGF-p forma parte de una superfamilia de proteinas conocida como la superfamilia del factor beta de crecimiento transformante, que incluye inhibinas, activina, la hormona antimullerania, la proteina morfogenetica osea, decapentaplegica y Vg-1.

Las estructuras peptidicas de los tres miembros de la familia TGF-p son muy similares. Todas estan codificadas como precursores de proteinas grandes; TGF-p1 contiene 390 aminoacidos y TGF-p2 y TGF-p3 contienen, cada una, 412 aminoacidos. Tienen cada una un peptido de senalizacion en el extremo N de 20-30 aminoacidos que es necesario para la secretion desde una celula, una prorregion (denominada peptido asociado a latencia o LAP), y una region en el extremo C de 112-114 aminoacidos que se convierte en la molecula TGF-p madura tras su liberation de la prorregion mediante escision proteolitica. La proteina TGF-p madura dimeriza para producir una molecula activa de 25 KDa con muchos motivos estructurales conservados. TGF-p tiene nueve restos de cisteina que estan conservados entre su familia; ocho forman enlaces disulfuro en la molecula para crear una estructura de nudo de cisteina caracteristica de la superfamilia de TGF-p mientras que las nueve cisteinas forman un enlace con las nueve cisteinas de otra molecula de TGF-p para producir el dimero. Se cree que muchos otros restos conservados en TGF-p forman una estructura secundaria mediante interacciones hidrofobas. La region entre la quinta y la sexta cisteinas conservadas aloja el area mas divergente de las moleculas de TGF-p que se expone a la superficie de la molecula y esta implicada en la union y especificidad del receptor de TGF-p.

TGF-p induce la apoptosis en numerosos tipos de celulas. TGF-p puede inducir la apoptosis de dos maneras: mediante la ruta SMAD o la ruta DAXX. La ruta SMAD es la ruta de senalizacion consensuada que los miembros de la familia TGF-p utilizan para la senalizacion. En esta ruta, los dimeros de TGF-p se unen a un receptor de tipo II que identifica y fosforila un receptor de tipo I. El receptor de tipo I identifica y fosforila a continuation un receptor regulado por SMAD (R-SMAD). SMAD3, y RSMAD, que se ha implicado en la induction de la apoptosis. El R-SMAD se une a continuacion al SMAD comun (coSMAD) SMAD4 y forma un complejo heterodimerico. Este complejo entra a continuacion en el nucleo de la celula donde actua como factor de transcription de diversos genes, incluyendo los que activan la ruta de la proteina quinasa 8 activada por mitogeno, que estimula la apoptosis. TGF-p puede estimular tambien la apoptosis mediante la proteina 6 asociada a muerte (proteina adaptadora DAXX). Se ha mostrado que DAXX se asocia y se une a la quinasa receptora de TGF-p de tipo II. Se cree que TGF-p es importante en la regulation del sistema inmunitario por los linfocitos CD25+ reguladores. TGF-p parece bloquear la activation de los linfocitos y los monocitos derivados de fagocitos.

B. Anticuerpos Metodos de produccion.

La presente invention se refiere a un anticuerpo que es inmunorreactivo con las tres isoformas de TGF-p.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, pero podria tambien emplearse el uso de una preparation de anticuerpos policlonales con la misma especificidad por TGFp1-3. Son bien conocidos en la tecnica los medios para preparar y caracterizar anticuerpos (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).

En resumen, se preparan anticuerpos policlonales inmunizando un animal con un inmunogeno (es decir, TGF-p o uno de sus fragmentos) y recogiendo el antisuero de los animales inmunizados. Se puede usar un amplio intervalo de especies animales para la produccion del antisuero. Normalmente, un animal utilizado para la produccion de antisuero es un animal no humano incluyendo conejos, ratones, ratas, hamsteres, cerdos o caballos. Debido al volumen relativamente grande de sangre de conejos, se prefiere seleccionar un conejo para la produccion de anticuerpos policlonales.

Como es bien sabido en la tecnica, una composition dada puede variar en su inmunogenicidad. Resulta a menudo necesario por tanto reforzar el sistema inmunitario del hospedador, lo que se puede conseguir acoplando un peptido o un polipeptido inmunogeno a un transportador. Los trasportadores ilustrativos y preferidos son la hemocianina de lapa californiana (KLH) y albumina de suero bovino (BSA). Otras albuminas tales como ovoalbumina, albumina de suero de raton o albumina de suero de conejo se pueden usar tambien como trasportadores. Son bien conocidos en la tecnica los medios para conjugar un polipeptido con una proteina trasportadora e incluyen glutaraldehido, ester de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida, carbodiimida y bencidina bis-biazotizada.

Como tambien es bien sabido en la tecnica, la inmunogenicidad de una composicion inmunogena concreta puede potenciarse mediante el uso de estimuladores no especificos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes ilustrativos y preferidos incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador no especifico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis muerto), adyuvantes incompletos de Freund y un adyuvante de hidroxido de aluminio.

La cantidad de composicion inmunogena utilizada en la produccion de anticuerpos policlonales varia dependiendo de la naturaleza del inmunogeno, asi como del animal utilizado para la inmunizacion. Se puede usar varias rutas para administrar el inmunogeno (subcutanea, intramuscular, intradermica, intravenosa e intraperitoneal). Puede vigilarse la produccion de anticuerpos policlonales realizando un muestreo de la sangre de los animales inmunizados en diversos momentos despues de la inmunizacion. Se puede proporcionar tambien una segunda inyeccion de refuerzo. El proceso de refuerzo y titulacion se repite hasta que se consigue un titulo adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, se puede extraer sangre del animal inmunizado y aislarse y almacenarse el suero, y/o el animal se puede usar para generar los mAb.

Los mAb pueden prepararse facilmente mediante el uso de tecnicas bien conocidas, tales como las ilustradas en la patente de Estados Unidos 4.196.265. Normalmente, esta tecnica implica inmunizar un animal adecuado con una composicion inmunogena seleccionada, es decir, una proteina TGF-p purificada o parcialmente purificada, o un polipeptido o peptido o celula que expresa altos niveles de TGF-p. La composicion inmunizante se administra de una manera eficaz para estimular las celulas que producen anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son animales preferidos, sin embargo, es tambien posible el uso de celulas de conejo, oveja y rana. El uso de ratas puede proporcionar determinadas ventajas (Goding, 1986), pero se prefieren ratones, siendo el mas preferido el raton BALB/c, que se usa de forma mas rutinaria y proporciona generalmente un mayor porcentaje de fusiones estables.

Tras la inmunizacion, las celulas somaticas con potencial para producir anticuerpos, especificamente linfocitos B (celulas B), se seleccionan para su uso en el protocolo de generacion de mAb. Estas celulas pueden obtenerse de bazos que se han sometido a biopsia, amigdalas o ganglios linfaticos, o de una muestra de sangre periferica. Se prefieren esplenocitos y celulas de sangre periferica, los primeros porque son una fuente rica de celulas productoras de anticuerpos que estan en un estadio de plasmablasto en division, y los segundos porque la sangre periferica es facilmente accesible. A menudo, habra de inmunizarse un panel de animales y se retirara el bazo del animal con el titulo de anticuerpo mas alto y se obtendran los linfocitos del bazo homogeneizando el bazo con una jeringuilla. Normalmente, un bazo de un raton inmunizado contiene aproximadamente de 5 x 107 a 2 x 108 linfocitos.

A continuation, los linfocitos B productores de anticuerpos procedentes del animal inmunizado se fusionan con celulas de mieloma inmortales, generalmente de la misma especie que el animal que se inmunizo. Las lineas de celulas de mieloma adecuadas para su uso en los procedimientos de fusion de produccion de hibridomas preferentemente no producen anticuerpos, tienen una elevada eficacia de fusion, y deficiencias enzimaticas que las convierten, entonces, en incapaces de crecer en determinados medios selectivos que soportan el crecimiento solo de las celulas fusionadas deseadas (hibridomas).

Se puede usar una cualquiera de numerosas celulas de mieloma, como se conocen por los expertos en la materia (Goding, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un raton, se puede usar P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se puede usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son tambien utiles para las fusiones celulares.

Los metodos para generar hibridos de esplenocitos o celulas de ganglios linfaticos y celulas de mieloma productoras de anticuerpo comprenden usualmente mezclar celulas somaticas con celulas de mieloma en una relation 2:1, aunque la relacion puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (quimico o electrico) que promueve la fusion de las membranas celulares. Se han descrito metodos de fusion que utilizan virus Sendai (Kohler y Milstein, 1975; 1976), y los que utilizan polietilenglicol (PEG), tales como PEG al 37 % (v/v), de Gefter et al. (1977). Es tambien adecuado el uso de metodos de fusion inducidos electricamente (Goding, 1986).

Los procedimientos de fusion producen usualmente hibridos a frecuencias bajas, alrededor de 1 x 10-6 a 1 x 10-8. Sin embargo, esto no plantea un problema, ya que los hibridos fusionados viables se diferencian de las celulas sin fusionar progenitoras, (particularmente de las celulas de mieloma sin fusionar que continuarian normalmente dividiendose indefinidamente) cultivandolas en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente aquel que contiene un agente que bloquea la sintesis de novo de los nucleotidos en el medio de cultivo de tejido. Los agentes ilustrativos y preferidos son aminopterina, metotrexato, y azaserina. Aminopterina y metotrexato bloquean la sintesis de novo de purinas y pirimidinas, mientras que azaserina bloquea solamente la sintesis de purina. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio esta suplementado con hipoxantina y timidina como fuente de nucleotidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio esta suplementado con hipoxantina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El medio de seleccion preferido es HAT. Solo las celulas que pueden hacer funcionar rutas no modificadas de nucleotidos son capaces de sobrevivir en medio HAT. Las celulas de mieloma son defectivas en las enzimas clave de la ruta no modificada, por ejemplo, hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Los linfocitos B pueden hacer funcionar esta ruta, pero tienen una duracion de la vida limitada en el cultivo y mueren generalmente en aproximadamente dos semanas. Por lo tanto, las unicas celulas que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos hibridos formados a partir de celulas de mieloma y linfocitos B.

Este cultivo proporciona una proporcion de hibridomas a partir de la cual se seleccionan hibridomas especificos. Normalmente, la seleccion de hibridomas se lleva a cabo cultivando las celulas mediante dilucion de clones individuales en placas de microtitulacion, seguido por el ensayo de los sobrenadantes clonicos individuales (despues de aproximadamente dos a tres semanas) para la reactividad deseada. El ensayo debe ser sensible, sencillo y rapido, tal como radioinmunoensayos, enzimoinmunoensayos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placas, ensayos de inmunotransferencia, y similares.

Los hibridomas seleccionados podrian a continuacion diluirse y clonarse en serie en lineas de celulas individuales productoras de anticuerpos, cuyos clones pueden a continuacion propagarse indefinidamente para proporcionar los mAb. Las lineas celulares pueden aprovecharse para la produccion de mAb de dos maneras basicas. Una muestra del hibridoma puede inyectarse (a menudo en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo utilizado para proporcionar las celulas somaticas y de mieloma para la fusion original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal especifico producido por la celula hibrida fusionada. Los fluidos corporales del animal, tales como suero y fluido ascitico, se pueden aprovechar a continuacion para proporcionar los mAb a alta concentracion. Las lineas celulares individuales podrian tambien cultivarse in vitro, donde los mAb se secretan naturalmente en el medio de cultivo a partir del cual se obtienen facilmente en altas concentraciones. Los mAb producidos por cualquier medio pueden purificarse adicionalmente, si se desea, utilizando metodos de filtracion, centrifugacion y diversos metodos cromatograficos tales como HPLC o cromatografia de afinidad.

Anticuerpos modificados. En una realizacion, las moleculas de anticuerpos comprenderan fragmentos (tales como (F(ab'), F(ab')2) que se producen, por ejemplo, por la escision proteolitica de los mAb, o las inmunoglobulinas monocatenarias que se pueden producir, por ejemplo, mediante medios recombinantes. Dichos derivados de anticuerpos son monovalentes. En una realizacion, dichos fragmentos pueden combinarse entre si, o con otros fragmentos de anticuerpos o ligandos de receptores para formar moleculas de union "quimericas". De forma significativa, dichas moleculas quimericas pueden contener sustituyentes capaces de unirse a diferentes epitopos de la misma molecula.

Puede ser deseable "humanizar" los anticuerpos producidos en hospedadores no humanos para atenuar cualquier reaccion inmunitaria cuando se usa en tratamiento humano. Dichos anticuerpos humanizados pueden estudiarse en un contexto in vitro o en un contexto in vivo. Pueden producirse anticuerpos humanizados sustituyendo, por ejemplo, una parte inmunogena de un anticuerpo con una parte correspondiente, pero no inmunogena (es decir, anticuerpos quimericos). Solicitud PCT PCT/US86/02269; solicitud EP 184.187; solicitud EP 171.496; solicitud EP 173.494; solicitud PCT N° WO 86/01533; solicitud EP 125.023; Sun et al. (1987); Wood et al. (1985); y Shaw et al. (1988). Se proporcionan revisiones de anticuerpos quimericos "humanizados" por Morrison (1985. "Humanized" antibodies can alternatively be produced by CDR or CEA substitution. Jones et al. (1986); Verhoeyan et al. (1988); Beidler et al. (1988).

En realizaciones mas especificas, se pueden usar las regiones CDR del anticuerpo 1D11 y colocar estas en las regiones marco de cualquier otro anticuerpo adecuado, humano o no humano. El anticuerpo 1D11 dirigido contra TGF-p es un anticuerpo monoclonal de murino producido por el hibridoma 1D11.16 (ATCC N.° de registro HB 9849, se describen tambien en las Patentes de Estados Unidos. 5.571.714, 5.772.998 y 5.783.185). El anticuerpo 1D11 se une especificamente a las tres isoformas de TGF-p de mamiferos. La secuencia de la region variable de la cadena pesada de 1D11 esta disponible con el n.° de registro AAB46787.

En realizaciones relacionadas, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es un derivado de 1D11, por ejemplo, un anticuerpo que comprende las secuencias CDR identicas a las de 1D11 (por ejemplo, un anticuerpo quimerico, humanizado o injertado a la CDR). En otra realizacion adicional, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es un anticuerpo recombinante completamente humano.

II. Estructura y fisiologia osea

El hueso es un tejido vivo, en crecimiento. Es poroso y esta mineralizado, y constituido por celulas, vasos, matriz organica y cristales de hidroxiapatito inorganicos. El esqueleto humano esta realmente constituido por 2 tipos de huesos: el hueso cortical y el hueso trabecular. El hueso cortical representa cerca casi el 80 % de la masa del esqueleto. El hueso cortical tiene una tasa de renovacion lenta y una resistencia alta a la flexion y a la torsion. Proporciona resistencia cuando la flexion puede ser indeseable, como en la parte intermedia de los huesos largos. El hueso trabecular representa solamente el 20 % de la masa del esqueleto, pero comprende el 80 % de la superficie osea. Es menos denso, mas elastico y tiene mayor tasa de renovacion que el hueso cortical.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

A. Celulas formadoras de hueso

Precursores oseos. Las celulas precursoras de hueso humanas se caracterizan como celulas de pequenas dimensiones que expresan cantidades bajas de protemas oseas (osteocalcina, osteonectina, y fosfatasa alcalina) y tienen un grado bajo de complejidad interna (Long et al., 1995). Cuando se estimulan para diferenciarse, estas celulas proteoblasticas se convierten en osteoblastos por su aspecto, tamano, expresion antigenica, y estructura interna. Aunque estas celulas estan normalmente presentes en frecuencias muy bajas en la medula osea, se ha descrito un proceso para aislar estas celulas (Long et al., 1995). La patente de EE.uU. 5.972.703 describe metodos para aislar y utilizar las celulas precursoras de huesos.

Numerosos estudios indican que las celulas derivadas de medula osea tienen potencial osteogenico. La mayoria de estas investigaciones apuntan que los citoblastos del mesenquima (MSC) experimentan diferenciacion a osteoblastos cuando se cultivan en presencia de citoquinas activas en hueso (Jaiswal et al., 2000; Phinney et al., 1999; Aubin, 1998; Zohar et al., 1997). Los citoblastos del mesenquima son una poblacion pluripotente capaz de generar multiples linajes de celulas estromales. Las MSC, como se utilizan actualmente, son una poblacion heterogenea de celulas aisladas mediante adherencia a plastico, y se propagan mediante pases de baja densidad. No obstante, una reciente publication indica la naturaleza clonica de los resultados del destino celular en MSC indicando que una unica celula MSC puede proporcionar un dos o tres linajes mesenquimales, uno de los cuales es usualmente de celulas de hueso (Pittenger et al., 1999). Estos estudios son consistentes con informes anteriores que demostraban el potencial osteogenico de las celulas estromales de medula osea, en particular las denominadas UFC-f procedentes de ratones y seres humanos (Friedenstein et al., 1968; Reddi y Huggins, 1972; Friedenstein et al., 1982; Ashton et al., 1985; Bleiberg, 1985; Gronthos et al., 1994; Gronthos et al., 1999).

El aislamiento de celulas individuales de MSC humanas genero clones que expresan el mismo fenotipo superficial que las MSC sin fraccionar (Pittenger et al., 1999). De manera interesante, de los 6 clones de MSC evaluados, 2 retuvieron el potencial osteogenico, condriogenico, y adipogenico; otros eran bipotentes (tanto con potencial osteogenico mas condriogenico, o potencial osteoadipocitico) o eran monolinaje (condrocitos). Esto sugiere que las propias MSC son de naturaleza heterogenea en la naturaleza (aunque las condiciones de cultivo pueden tambien haber conducido a la perdida del linaje potencial). Hasta la fecha, la capacidad de autorrenovacion de las MSC sigue sin estar clara. No obstante, estos estudios in vitro y otros estudios in vivo (Kadiyala et al., 1997; Petite et al., 2000; Krebsbach et al., 1999) muestran que las MSC puede asignar al hueso un linaje celular y desarrollarlo hasta el estado de mineralization de la matriz in vitro, o la formation del hueso in vivo.

Preosteoblastos. Los preosteoblastos son intermedios entre celulas osteoprogenitoras y osteoblastos. Muestran una creciente expresion de marcadores fenotipicos oseos tales como la fosfatasa alcalina (Kale et al., 2000). Tienen una capacidad proliferativa mas limitada, pero sin embargo continuan dividiendose y produciendo mas preosteoblastos u osteoblastos.

Osteoblastos. Un osteoblasto es una celula mononucleada que es responsable de la formacion del hueso. Los osteoblastos producen osteoide, que esta compuesto principalmente de colageno de tipo I. Los osteoblastos son tambien responsables de la mineralizacion de la matriz osteoide. El hueso es un tejido dinamico que constantemente esta siendo reconfigurado por los osteoblastos, que construyen el hueso, y los osteoclastos, que resorben el hueso. Los osteoblastos tienden a disminuir en numero y actividad a medida que los individuos envejecen, disminuyendo de esta manera la renovation natural del tejido oseo.

Los osteoblastos surgen de celulas osteoprogenitoras localizadas en el periostio y la medula osea. Los osteoprogenitores son celulas progenitoras inmaduras que expresan el factor de transcription regulador maestro Cbfal/Runx2. Los osteoprogenitores se inducen para diferenciarse bajo la influencia de factores de crecimiento, en particular, las proteinas morfogeneticas oseas (BMP). Ademas de las BMP, otros factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor p de crecimiento transformante (TGF-p), pueden promover la division de los osteoprogenitores y aumentar potencialmente la osteogenesis. Una vez que los osteoprogenitores comienzan a diferenciarse en osteoblastos, comienzan a expresar varios marcadores geneticos que incluyen Osterix, Col1, ALP, osteocalcina, osteopontina, y osteonectina. Aunque el termino osteoblasto implica un tipo de celula inmadura, los osteoblastos son, de hecho, las celulas oseas maduras enteramente responsables de generar tejido oseo en animales y seres humanos.

Osteoclastos. Un osteoclasto es un tipo de celula osea que elimina el tejido oseo retirando su matriz mineralizada. Se conoce este proceso como resorcion del hueso. Los osteoclastos y los osteoblastos son instrumentos para controlar la cantidad de tejido oseo: los osteoblastos forman hueso, los osteoclastos resorben el hueso. Los osteoclastos se forman mediante la fusion de celulas del linaje celular de monocitos-macrofagos. Los osteoclastos se caracterizan por una elevada expresion de la fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) y la catepsina K.

La formacion de osteoclastos requiere la presencia del ligando RANK (activador del receptor del factor nuclear Kp) y MCSF (factor estimulador de colonias de macrofagos). Estas proteinas unidas a membrana se producen por celulas estromales y osteoblastos adyacentes; requiriendo de esta manera un contacto directo entre estas celulas y los precursores de osteoclastos. M-CSF actua a traves de su receptor en el osteoclasto, c-fms (receptor del factor 1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

estimulador de colonias), un receptor de la tirosina quinasa transmembrana, que conduce a la activacion del mensajero secundario de la tirosina quinasa Src. Ambas moleculas son necesarias para la osteoclastogenesis y estan ampliamente implicadas en la diferenciacion de las celulas derivadas de monocitos/macrofagos. RANKL es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), y es esencial en la osteoclastogenesis. Los ratones RANKL inactivados genicamente presentan un fenotipo de osteoporosis y defectos en la salida de los dientes, junto con una ausencia o deficiencia de osteoclastos. RANKL activa NFKp (factor nuclear-Kp) y NFATcl (factor nuclear de los linfocitos t activados, citoplasmico, dependiente de calcineurina 1) mediante RANK. La activacion de NF-Kp se estimula casi inmediatamente despues de producirse la interaccion RANKL-RANK, y no esta regulada en exceso. La estimulacion de NFATcl, sin embargo, comienza 24-48 horas despues que se produce la union y se ha mostrado que su expresion es dependiente de RANKL. La diferenciacion de los osteoclastos esta inhibida por la osteoprotegerina (OPG), que se une a RANKL evitando la interaccion con RANK.

B. Formacion del hueso

La formacion del hueso durante la etapa fetal del desarrollo se produce mediante dos procesos: osificacion intramembranosa y osificacion endocondrial. La osificacion intramembranosa se produce principalmente durante la formacion de los huesos planos del craneo; el hueso se forma a partir del tejido del mesenquima. Las etapas de la osificacion intramembranosa se desarrollan a partir del centro de osificacion, calcificacion, formacion de trabeculas y desarrollo del periostio. La osificacion endocondrial, por otra parte, se produce en los huesos largos, tales como en las extremidades; el hueso se forma alrededor de un molde de cartNago. Las etapas en la osificacion endocondrial son el desarrollo de un modelo de cartilago, el crecimiento del modelo de cartilago, el desarrollo del centro de osificacion primaria y el desarrollo del centro de osificacion secundaria.

La osificacion endocondrial comienza con puntos en el cartilago denominados "centros de osificacion primaria". Aparecen principalmente durante el desarrollo del feto, aunque unos pocos huesos cortos comienzan su osificacion primaria despues del nacimiento. Son responsables de la formacion de la diafisis de los huesos largos, huesos cortos y determinadas partes de huesos irregulares. La osificacion secundaria se produce despues del nacimiento, y forma las epifisis de los huesos largos y las extremidades de los huesos irregulares y planos. La diafisis y ambas epifisis de un hueso largo estan separadas por una zona de cartNago en crecimiento (la placa epifisial). Cuando el nino alcanza la madurez del esqueleto (18 a 25 anos de edad), todo el cartilago se sustituye por hueso, fusionando la diafisis y ambas epifisis entre si (cierre epifisial).

La remodelacion o renovacion osea es el proceso de resorcion seguido por la sustitucion del hueso con poco cambio en la forma y se produce a lo largo de la vida de una persona. Los osteoblastos y osteoclastos, acoplados entre si mediante la senalizacion de las celulas paracrinas, se denominan unidades de remodelacion osea. El objetivo de la remodelacion es regular la homeostasia del calcio, reparar los huesos microdanados (debidos al estres diario) pero tambien formar y esculpir el esqueleto durante el crecimiento.

El proceso de resorcion osea por los osteoclastos libera el calcio almacenado a la circulation sistemica y es un proceso importante en la regulation del equilibrio del calcio. A medida que la formacion del hueso fija activamente el calcio en circulacion en su forma mineral, eliminandolo del torrente sanguineo, la resorcion lo desaloja activamente este aumentando de esta forma los niveles de calcio en circulacion. Estos procesos se producen en tandem en localizaciones especificas de sitio.

El esfuerzo repetido, tal como el ejercicio que soporta peso o la cicatrization del hueso, da como resultado el engrosamiento del hueso en los puntos de esfuerzo maximo (ley de Wolff). Se ha teorizado que esto es el resultado de las propiedades piezoelectricas del hueso, que hacen que el hueso genere pequenos potenciales electricos bajo tension.

III. Tratamientos

A. Enfermedades y dolencias oseas

Las enfermedades y dolencias que se van a tratar de acuerdo con la invention estan especificadas en las reivindicaciones. Otras enfermedades y dolencias referidas a continuation, pero no en las reivindicaciones, se proporcionan como divulgation.

Existe una pletora de dolencias que se caracterizan por la necesidad de potenciar la formacion del hueso o de inhibir la resorcion del hueso y que de esta manera se beneficiarian del uso de anticuerpos dirigidos contra TGF-p o combinaciones de anticuerpos dirigidos contra TGF-p y agentes secundarios, como se ha descrito anteriormente o celulas tratadas con los anteriores en la promotion de la formacion del hueso y/o la reparation osea. Quiza lo mas evidente sea el caso de las fracturas de huesos, donde seria deseable estimular el crecimiento oseo y acelerar y completar la reparacion del hueso. Los agentes que potencian la formacion del hueso serian tambien utiles en los procedimientos de reconstruction facial. Otras dolencias con deficit de hueso incluyen defectos segmentales oseos, enfermedad periodontal, enfermedad osea metastasica, enfermedad osea osteolitica y dolencias donde la reparacion del tejido conectivo seria beneficiosa, tal como la cicatrizacion o regeneration de los defectos o lesiones

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

del cartilago. Tambien de gran significancia es la dolencia cronica de la osteoporosis, incluyendo la osteoporosis relacionada con la edad y la osteoporosis asociada con estados hormonales posteriores a la menopausia. Otras dolencias caracterizadas por la necesidad de crecimiento del hueso incluyen hiperparatiroidismo primario y secundario, osteoporosis por desuso, osteoporosis relacionada con diabetes, y osteoporosis relacionada con glucocorticoides. Existen algunas otras dolencias, tales como, por ejemplo, deficiencia de vitamina D.

Fracturas. El primer ejemplo es el individuo por otra parte sano que padece una fractura. A menudo, la fractura osea clinica se trata mediante escayolado para aliviar el dolor y permitir que los mecanismos de reparacion naturales reparen la herida. Se han hecho progresos en el tratamiento de las fracturas en los ultimos tiempos, sin embargo, incluso sin considerar las diversas complicaciones que puedan surgir en el tratamiento de los huesos fracturados, cualquier nuevo procedimiento para aumentar la cicatrization del hueso en circunstancias normales representaria un gran avance.

Enfermedad periodontal. La enfermedad periodontal progresiva conduce a la perdida del diente debida a la destruction de la fijacion dental al hueso que la rodea. Aproximadamente 5 - 20 % de la poblacion de EE.UU. (15-60 millones de individuos) padece enfermedad periodontal generalizada grave, y existen 2 millones de procedimientos quirurgicos relacionados. Ademas, si la enfermedad se define como la identification de al menos un sitio de perdida de la fijacion clinica, entonces aproximadamente un 80 % de todos los adultos estan afectados, y un 90 % de aquellos que tienen de 55 a 64 anos de edad. Si no se trata, aproximadamente un 88 % de los individuos afectados muestran progresion de la enfermedad moderada a rapida que muestra una fuerte correlation con la edad. El tratamiento actual principal de la enfermedad periodontal es la terapia regenerativa consistente en la sustitucion de los tejidos periodontales perdidos. La perdida del hueso se trata usualmente con el propio hueso y la medula osea del individuo, debido a su alto potencial osteogenico. Se pueden llevar a cabo aloinjertos de hueso (entre individuos) utilizando hueso humano almacenado. Aunque los analisis de costes periodontales actuales son dificiles de obtener, el tamano de la poblacion afectada y el uso actual de los injertos de hueso como terapia de primer orden sugieren fuertemente que esta area representa una diana atractiva para las terapias de desarrollo de hueso.

Osteopenia/osteoporosis. Los terminos osteopenia y osteoporosis se refieren a un grupo homogeneo de trastornos caracterizados por una masa osea disminuida y fracturas. La osteopenia es una masa osea que tiene una o mas desviaciones estandar por debajo de la masa osea promedio de una poblacion; la osteoporosis se define como 2,5 SD o inferior. Una poblacion estimada en 20-25 millones de personas esta en riesgo creciente de fracturas debido a la perdida de hueso especifica de sitio. Los factores de riesgo para la osteoporosis incluyen el aumento de la edad, el sexo (principalmente mujeres), masa osea baja, menopausia temprana, raza (caucasianos en general; mujeres asiaticas e hispanas), baja captation de calcio, reducida actividad fisica, factores geneticos, factores ambientales (incluyendo tabaquismo, alcoholismo o abuso de cafeina), y deficiencias en el control neuromuscular que crean una propension a las caidas.

Mas de un millon de fracturas en los EE.UU. cada ano pueden atribuirse a la osteoporosis. En terminos economicos, los costes (exclusivamente los salarios perdidos) por los tratamientos contra la osteoporosis son 35.000 millones de dolares en todo el mundo. Las tendencias demograficas (es decir, el aumento gradual de la edad de la poblacion de los EE.UU.) sugiere que estos costes pueden aumentar a 62.000 millones de dolares en el ano 2020. Claramente, la osteoporosis es un problema de atencion sanitaria significativo.

La osteoporosis, pensada una vez como una parte natural del envejecimiento de la mujer, ya no se considera dependiente de la edad o dependiente del sexo. La osteoporosis se define como un trastorno esqueletico caracterizado por una predisposition a un riesgo creciente de fractura debido a una resistencia del hueso alterada. La resistencia osea refleja la integration de dos caracteristicas principales: la densidad osea y la calidad del hueso. La densidad osea se expresa en gramos de mineral por area o volumen y en cualquier individuo dado se determina por el maximo de masa osea y la cantidad de perdida de hueso. La calidad del hueso se refiere a la arquitectura, renovation, la acumulacion de danos (por ejemplo, microfracturas) y la mineralization. Una fractura se produce cuando se aplica una fuerza que induce un fallo (por ejemplo, un traumatismo) a un hueso osteoporotico.

Los tratamientos actuales para pacientes con osteoporosis se centran en la prevention de la fractura, no en promover la formation de hueso o la reparacion de fracturas. Esto sigue siendo una consideration importante segun la bibliografia, que indica claramente que una morbilidad y mortalidad significativas estan asociadas al reposo prolongado en cama de las personas mayores, particularmente, en aquellas personas que han sufrido fracturas de cadera. Las complicaciones debidas al reposo en cama incluyen coagulos y neumonia. Estas complicaciones son reconocidas y se toman usualmente medidas para evitarlas, pero estas son apenas el mejor enfoque al tratamiento. Por lo tanto, la poblacion de pacientes osteoporoticos se beneficiaria de nuevos tratamientos disenados para fortalecer los huesos y acelerar el proceso de reparacion de las fracturas, consiguiendo que estas personas se pusieran de pie antes de que surjan complicaciones.

Reconstmccion/injerto de huesos. Un cuarto ejemplo esta relacionado con la reconstruction osea y, especificamente, la capacidad de reconstruir defectos en el tejido oseo que son resultado de una lesion traumatica; como consecuencia del cancer o de la cirugia contra el cancer; o como resultado de un defecto congenito; o como resultado del envejecimiento. Existe una necesidad significativa de implantes ortopedicos mas frecuentes, y los

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

huesos craneales y faciales son dianas concretas para este tipo de necesidades reconstructivas. La disponibilidad de nuevos materiales de implante, por ejemplo, titanio, ha permitido la reparacion de defectos relativamente grandes. Los implantes de titanio proporcionan excelente estabilidad temporal a traves de los defectos oseos y son un excelente material para implantes oseos o articulaciones artificiales tales como cadera, rodilla y sustitucion de articulaciones. Sin embargo, la experiencia ha mostrado que la carencia de hueso viable que se una a los implantes del defecto puede dar como resultado la exposicion del aparato a la infeccion, inestabilidad estructural y, finalmente, al fracaso en la reparacion del defecto. Por lo tanto, un agente terapeutico que estimule la formacion del hueso o alrededor del implante facilitara una recuperacion mas rapida.

Los injertos de huesos autologos son otra posibilidad, pero tienen algunas desventajas demostradas porque deben extraerse de sitio del donante tal como la cresta iliaca o una costilla, normalmente ello proporciona una cantidad de hueso insuficiente para rellenar completamente el defecto, y el hueso que se forma es algunas veces propenso a la infeccion y a la resorcion. Las preparaciones xenogenicas parcialmente purificadas no son practicas para el uso clinico debido a que cantidades en microgramos se purifican a partir de kilogramos de hueso de bovino, haciendo que la produccion comercial a gran escala sea costosa e impracticable. Se emplean a menudo por tanto aloinjertos y preparaciones de huesos desmineralizados, pero adolecen de su naturaleza desvitalizada en que solo funcionan como estructuras para el crecimiento endogeno de celulas oseas.

Las transferencias microquirurgicas de injertos de hueso libre con tejido blando y vasos sanguineos unidos pueden cerrar defectos oseos con una fuente inmediata de suministro de sangre al injerto. Sin embargo, estas tecnicas que requieren mucho tiempo, han mostrado producir una gran cantidad de morbilidad, y pueden utilizarse solo por individuos especialmente preparados. Ademas, el implante oseo esta a menudo limitado en su cantidad y no se contornea facilmente. En la mandibula, por ejemplo, la mayoria de pacientes no puede usar los aparatos dentales utilizando tecnicas aceptadas actualmente (incluso despues que se ha establecido la continuidad), y de esta manera consiguen poca mejora en su capacidad de masticacion.

Junto con la reconstruccion del hueso, las areas de mejora con problemas especificos son las que se refieren al tratamiento de grandes defectos, tales como los creados por traumatismos, defectos congenitos, o de forma concreta, tras la reseccion de un tumor; y tambien el area de las articulaciones artificiales. El exito de los implantes ortopedicos, interfases y articulaciones artificiales podria mejorarse de forma razonable si la superficie del implante, o una parte funcional de un implante, estuviera revestida con un agente estimulador del hueso. La superficie de los implantes podria revestirse con uno o mas materiales adecuados a fin de promover una interaccion mas eficaz con el sitio biologico que rodea el implante y, de manera ideal, promover la reparacion del tejido.

Cancer de hueso primario y enfermedad osea metastasica. El cancer de hueso se produce manera infrecuente mientras que la metastasis osea esta presente en una amplia variedad de canceres, incluyendo cancer de tiroides, rinon, y pulmon. El cancer de hueso metastasico es una dolencia cronica; la supervivencia desde el momento del diagnostico es variable dependiendo del tipo de tumor. En el cancer de prostata y de mama y en el mieloma multiple, el tiempo de supervivencia se puede medir en anos. Para el cancer de pulmon avanzado, se mide en meses. Los sintomas de cancer incluyen dolor, hipercalcemia, fractura patologica, y compresion de la medula o el nervio espinal. El pronostico del cancer de hueso metastasico esta afectado por el sitio del tumor primario, presencia de una enfermedad extraosea, y la extension y temporalizacion de la enfermedad osea. La progresion del cancer/metastasis osea esta determinada por los ensayos de diagnostico por imagenes y la medida de los marcadores especificos oseos. Recientes investigaciones muestran una fuerte correlacion entre la tasa de resorcion del hueso y el resultado clinico, en terminos de progresion de la enfermedad o muerte.

Mieloma multiple. El mieloma multiple (MM) es una neoplasia maligna de los linfocitos B caracterizada por la acumulacion de celulas plasmaticas clonales malignas en la medula osea. Las manifestaciones clinicas de la enfermedad se deben a la sustitucion de los componentes de la medula osea normal por celulas plasmaticas anomalas, con la consiguiente sobreproduccion de una inmunoglobulina monoclonal (proteina M o componente M), destruccion del hueso, dolor de huesos, anemia, hipercalcemia y disfuncion renal.

A diferencia de otros tipos de canceres que se extienden al hueso (por ejemplo, mama, pulmon, tiroides, rinon, prostata), la enfermedad del mieloma oseo (MBD) no es una enfermedad metastasica. En su lugar, las celulas de mieloma se derivan de linfocitos B del sistema inmunitario que residen normalmente en la medula osea y estan por tanto intimamente asociados con el hueso. De hecho, el microentorno de la medula osea juega un importante papel en el crecimiento, la supervivencia y la resistencia a la quimioterapia de las celulas de mieloma, que, a su vez, regula la perdida de hueso aumentada asociada con este trastorno (pagina web en multiplemyeloma.org). Aproximadamente el 90 % de los pacientes con mieloma tienen implicaciones oseas, comparado con el 40-60 % de los pacientes con cancer que tienen metastasis osea, y aproximadamente un 80 % tiene un dolor de huesos intratable. Adicionalmente, aproximadamente un 30 % de los pacientes de mieloma tienen hipercalcemia, que es un resultado de la actividad osteolitica aumentada asociada con esta enfermedad (Cavo et al., 2006).

Los problemas comunes en el mieloma son la debilidad, la confusion y la fatiga debida a la hipercalcemia. Dolores de cabeza, cambios en la vision y la retinopatia pueden ser el resultado de la hiperviscosidad de la sangre dependiendo de las propiedades de la paraproteina. Finalmente, puede existir dolor radicular, perdida del control del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

intestino o la vejiga (debida a la implicacion de la medula espinal que conduce a la compresion de la medula) o smdrome de tunel carpiano y otras neuropatias (debido a la infiltracion de los nervios perifericos por el amiloide). Puede proporcionar un aumento de paraplejias en casos que se presentan posteriormente.

Enfermedad osea metastasica. Tal como se ha descrito anteriormente, a diferencia de la osteolisis asociada con otros tumores oseos, las lesiones de MBD son unicas ya que no sanan ni se reparan, a pesar de que los pacientes tengan muchos anos de remision completa. Mecanicistamente, esto parece estar relacionado con la inhibicion y/o la perdida de los osteoblastos formadores de huesos durante la progresion de la enfermedad. De hecho, los estudios de marcadores oseos y de histomorfometria indican que los osteoclastos resorbedores de hueso y la actividad osteoblastica estan aumentadas, pero equilibradas al principio de la enfermedad, mientras que la MBD abierta muestra actividad osteoclastica alta y baja actividad osteoblastica. Por lo tanto, la MBD es un trastorno en el que la formacion de hueso y la perdida de hueso estan desacopladas y se beneficiarian de tratamientos que estimulen la formacion de hueso y el retraso de su perdida.

Se han utilizado numerosos enfoques terapeuticos en la MBD, con los criterios de valoracion de tratamiento del dolor, hipercalcemia, o la reduccion de acontecimientos relacionados con el esqueleto (SRE). Muchos de estos pueden presentar complicaciones graves. La cirugia, tal como la vertebroplastia o la cifoplastia, que se lleva a cabo para el alivio de la estabilidad y el dolor tiene los riesgos quirurgicos concomitantes (por ejemplo, infeccion) empeorados por un sistema inmunocomprometido y no invierten los defectos esqueleticos existentes. La radioterapia y el tratamiento con isotopos radioactivos se utilizan para prevenir/controlar la progresion de la enfermedad y tienen los riesgos normales de las terapias con irradiacion. Mas recientemente, farmacos tales como los bisfosfonatos, que inhiben la actividad osteoclastica han llegado a ser un tratamiento estandar para la MBD, a pesar del hecho de trabajan mal en este trastorno. En 9 ensayos doble ciegos, controlados por placebo sobre bisfosfonatos, solo un 66 % de pacientes mostraron una reduccion eficaz del dolor; 56 % mostraron una reduccion en los ser y solo 1 de 9 demostro un beneficio de supervivencia.

B. Tratamientos combinados

Tal como se describe, la presente invencion proporciona el tratamiento de enfermedades oseas y traumatismos oseos mediante la estimulacion de la produccion de nuevo tejido oseo. Otros agentes se pueden usar junto con los anticuerpos dirigidos contra TGF-p de la presente invencion. De forma mas general, estos agentes se proporcionarian en una cantidad combinada (junto con los anticuerpos dirigidos contra TGF-p) para producir cualquiera de los efectos anteriormente descritos. Este proceso puede implicar la puesta en contacto de la celula o sujeto con ambos agentes al mismo tiempo. Esto se puede conseguir poniendo en contacto la celula con una unica composition o formulation farmacologica que incluye ambos agentes, o poniendo en contacto la celula o el sujeto con dos composiciones o formulaciones diferentes, al mismo tiempo, en el que una composicion incluye el inhibidor intracelular y el resto incluye el segundo agente.

Como alternativa, un agente puede preceder o seguir al otro en intervalos comprendidos entre minutos y semanas. En realizaciones donde los agentes se aplican independientemente a la celula o sujeto, se deberia garantizar de manera general que no transcurra un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada administration, de tal forma que siguiera siendo posible que los agentes ejercieran un efecto combinado ventajoso sobre la celula o el sujeto. En tales casos, se contempla que se puede poner en contacto la celula o el sujeto con ambas modalidades en un plazo de aproximadamente 12-24 h de separation y, mas preferentemente, en un plazo de aproximadamente 6-12 h de separacion. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo del tratamiento de forma significativa, sin embargo, donde varios dias (2, 3, 4, 5, 6 o 7) o varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8) pueden transcurrir entre las respectivas administraciones.

Se pueden emplear varias concentraciones, el anticuerpo dirigido contra TGF-p es "A" y el otro agente es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

Los protocolos de administracion y formulacion de dichos agentes seguiran de forma general los habituales para farmacos farmaceuticos, como se analiza mas delante de forma detallada. Los agentes de combination incluyen bisfosfonatos (Didronel™, Fosamax™ y Actonel™), SERM (Evista) u otros derivados hormonales, y analogos de la hormona paratiroidea (PTH).

IV. Formulaciones farmaceuticas y administracion A. Composiciones y vias

Las composiciones farmaceuticas comprenden una cantidad eficaz de uno o mas anticuerpos dirigidos contra TGF-p para su uso en la presente invencion, disueltos o dispersos en un transportador farmaceuticamente aceptable. La expresion "farmaceuticamente o farmacologicamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

que no producen reacciones adversas, alergica o negativa distinta cuando se administran a un animal, tales como, por ejemplo, un ser humano, segun sea adecuado. La preparacion de una composicion farmaceutica que contiene al menos un anticuerpo dirigido contra TGF-p, y opcional un principio activo adicional, sera conocida de los expertos en la materia a la luz de la presente divulgacion, tal como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990. Ademas, para la administracion a un animal (por ejemplo, un ser humano), se entendera que las preparaciones deben cumplir los estandares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biologics Standards.

Como se usa en el presente documento, "transportador farmaceuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifungicos), agentes isotonicos, agentes de retraso de la absorcion, sales, conservantes, farmacos, estabilizantes de farmacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregacion, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes, materiales de este tipo y combinaciones de los mismos, como sabra una persona normalmente experta en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, 1289-1329). Excepto en el caso de que cualquier vehiculo convencional sea incompatible con el principio activo, esta contemplado su uso en las composiciones farmaceuticas.

El anticuerpo dirigido contra TGF-p se puede premezclar con diferentes tipos de transportadores dependiendo de si se va administrar por via oral o mediante inyeccion. La presente invencion se puede administrar por via bucal, por via intravenosa, intradermica, transdermica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, topica, intramuscular, por via intratumoral, en la vasculatura tumoral, por via subcutanea, mucosal, por via oral, topica, local, mediante inhalacion (por ejemplo, inhalacion de aerosol), inyeccion, infusion, infusion continua, perfusion localizada que bana las celulas diana directamente, mediante un cateter, mediante un lavado, en cremas, en composiciones lipidas (por ejemplo, nanoparticulas, liposomas), o por otros metodos o cualquier combinacion de los anteriores, tal como conoceria una persona experta en la materia (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990). En particular, el anticuerpo dirigido contra TGF-p se formula en una composicion que se puede administrar mediante una jeringuilla para usar en una administracion intravenosa.

El anticuerpo dirigido contra TGF-p se puede formular en una composicion como base libre, neutra o forma salina o ester. Tambien se puede sintetizar/formular como profarmaco. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido, por ejemplo, aquellas formadas con los grupos amino libres de una composicion proteinica, o que se forman con acidos inorganicos, tales como, por ejemplo, acido clorhidrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, fumarico, o acido mandelico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien puede derivarse a partir de bases inorganicas, tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos; o bases organicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaina. Tras la formulacion, se administraran soluciones de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en tal cantidad que sea terapeuticamente eficaz.

Ademas, de acuerdo con la presente invencion, la composicion que comprende el anticuerpo para su uso en la presente invencion adecuado para administracion se proporciona en un transportador farmaceuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El transportador debera ser asimilable e incluir transportadores liquidos, semisolidos, es decir, pastas, o transportadores solidos. Salvo en la medida que cualquier medio, agente, diluyente o transportador convencional sea perjudicial para el receptor o para la eficacia terapeutica de la composicion incluida en la anterior, su uso en una composicion administrable que comprende el anticuerpo para su uso en la presente invencion es adecuado. Los ejemplos de transportadores o diluyentes adecuados incluyen grasas, aceites, agua, sueros salinos, lipidos, liposomas, resinas, aglutinantes, cargas y similares, o sus combinaciones. La composicion puede incluir tambien diferentes antioxidantes que retrasan la oxidacion de uno o mas componentes. Adicionalmente, la prevention de la action de microorganismos puede lograrse por medio de conservantes tales como varios agentes antibacterianos y antifungicos, incluyendo, pero sin limitarse a parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutano, fenol, acido sorbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

En una realization especifica de la presente invencion, la composicion que comprende el anticuerpo para su uso en la presente invencion se combina o se mezcla completamente con un transportador semisolido o solido. La mezcla se puede llevar a cabo de cualquier manera conveniente tal como molienda. Los agentes estabilizantes tambien se pueden anadir durante el proceso de mezclado para proteger la composicion de la perdida de actividad terapeutica, es decir, desnaturalizacion en el estomago. Los ejemplos de estabilizantes para su uso en la composicion incluyen tampones, aminoacidos tales como glicina y lisina, hidratos de carbono tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.

En realizaciones adicionales, la presente invencion se puede referir al uso de composiciones farmaceuticas con vehiculo lipido que incluyen los anticuerpos dirigidos contra TGF-p de la presente invencion, uno o mas lipidos, y un disolvente acuoso. Como se usa en el presente documento, el termino "lipido" se definira para incluir cualquiera de una amplia gama de sustancias que sean caracteristicamente insolubles en agua, y se puedan extraer con un disolvente organico. Esta amplia clase de compuestos es bien conocida de los expertos en la materia, y el termino

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

"lipido", tal como se usa en el presente documento, no esta limitado a ninguna estructura particular. Los ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifaticos de cadena larga y sus derivados. Un lipido puede ser de origen natural o sintetico (es decir, disenado o producido por el hombre). Los Kpidos son bien conocidos en la materia, e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolipidos, fosfogliceridos, esteroides, terpenos, lisoKpidos, glicoesfingolipidos, glucoKpidos, sulfatidos, Kpidos con acidos grasos con enlaces eter o ester y lipidos polimerizables, y combinaciones de los mismos.

Una persona experta en la materia estara familiarizada con la gama de tecnicas que se pueden utilizar para dispersar una composition en un vehiculo Kpido. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra TGF-p se pueden dispersar en una solution que contiene un lipido, disolverse en un lipido, emulsionarse con un lipido, mezclarse con un lipido, combinarse con un lipido, unirse covalentemente a un lipido, incluirse como suspension en un lipido, incluirse o complejarse con una micela o liposoma, o asociarse de cualquier otra forma con un lipido o estructura lipida por cualquier medio conocido por los expertos en la materia. La dispersion puede dar como resultado, o no, la formacion de liposomas.

La cantidad de dosis real de una composicion que comprende el anticuerpo a usar de la presente invention administrada a un paciente animal se puede determinar mediante factores fisicos y fisiologicos tales como el peso corporal, gravedad de la dolencia, el tipo de enfermedad a tratar, intervenciones terapeuticas anteriores o concurrentes, idiopatia del paciente y via de administration. Dependiendo de la dosis y de la via de administration, el numero de administraciones de una dosis preferida y/o una cantidad eficaz pueden variar dependiendo de la respuesta del sujeto. El medico responsable de la administracion, en cualquier caso, determinara la concentration de ingrediente activo (o ingredientes activos) en una composicion y la dosis adecuada para el sujeto individual.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo dirigido contra TGF-p para usar en la presente invencion puede estar incluido en composiciones farmaceuticas que comprenden, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % del antagonista, aproximadamente un 0,5 % del antagonista, o aproximadamente un 1,0 % del antagonista. En otras realizaciones, el antagonista puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable de los anteriores. Naturalmente, la cantidad de antagonista en cada composicion terapeuticamente util se puede preparar de tal forma que se obtenga una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Los factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biologica, la ruta de administracion, duration del producto, asi como otras consideraciones farmaceuticas se tendran en cuenta por el experto en la tecnica para preparar dichas formulaciones farmaceuticas y, de esta forma, pueden ser deseables varias dosis y regimenes de tratamiento.

En otros ejemplos no limitativos, una dosis de anticuerpo dirigido contra TGF-p tambien puede comprender de aproximadamente 0,1 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 0,2 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 0,5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal,

aproximadamente 50 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg de peso corporal,

aproximadamente 200 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg de peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg de peso corporal, aproximadamente 5 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 10 miligramos/kg de peso corporal,

aproximadamente 50 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 100 miligramos/kg de peso corporal,

aproximadamente 200 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 350 miligramos/kg de peso corporal, aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o mas por administracion, y cualquier intervalo derivable de los anteriores. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los numeros listados en el presente documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg de peso corporal a aproximadamente 500 miligramos/kg de peso corporal, basandose en los numeros descritos anteriormente.

En realizaciones particulares de la presente invencion, los anticuerpos dirigidos contra TGF-p para usar en la presente invencion se formulan para su administracion mediante una via alimentaria. Las vias alimentarias incluyen todas las posibles vias de administracion en las que la composicion se pone en contacto directo con el tracto alimentario. Especificamente, las composiciones farmaceuticas divulgadas en el presente documento se pueden administrar por via oral, por via bucal, rectal, o sublingual. De este modo, dichas composiciones se pueden formular en un diluyente inerte o con un transportador comestible asimilable, o se puede incluir en una capsula de gelatina dura o blanda, o se puede comprimir en comprimidos, o se puede incorporar directamente con los alimentos de la dieta.

En determinadas realizaciones, los principios activos para utilizar en la presente invencion pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares (Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; patentes de los Estados Unidos con numeros 5.641.515, 5.580.579 y 5.792.451). Los comprimidos, trociscos, pildoras, capsulas y similares tambien pueden incluir lo siguiente: un aglutinante, tal como, por ejemplo, goma tragacanto, acacia, almidon de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ma^z, gelatina o combinaciones de los mismos; un excipiente, tal como, por ejemplo, fosfato dicalcico, manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio o combinaciones de los mismos; un agente disgregante, tal como, por ejemplo, almidon de maiz, almidon de patata, acido alginico o combinaciones de los mismos; un lubricante, tal como, por ejemplo, estearato de magnesio; un agente edulcorante, tal como, por ejemplo, sacarosa, lactosa, sacarina o combinaciones de los mismos; un aromatizante, tal como, por ejemplo, piperita, aceite de gaulteria, aroma a cereza, aroma a naranja, etc. Cuando la forma farmaceutica unitaria es una capsula, puede incluir, ademas de los materiales del tipo citado anteriormente, un transportador liquido. Pueden estar presentes otros materiales como recubrimientos o para modificar de otra manera la forma fisica de la dosis unitaria. Por ejemplo, comprimidos, pildoras, o capsulas pueden estar recubiertos con shellac, azucar, o ambos. Cuando la forma farmaceutica es una capsula, puede incluir, ademas de los materiales del tipo citado anteriormente, transportadores tales como un transportador liquido. Las capsulas de gelatina, comprimidos, o pastillas pueden tener un revestimiento enterico. Los revestimientos entericos evitan la desnaturalizacion de la composition en el estomago o parte superior del intestino donde el pH es acido. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.629.001. Tras alcanzar el intestino delgado, su pH basico disuelve el revestimiento y permite que la composicion se libera y se absorba por las celulas especializadas, por ejemplo, enterocitos epiteliales y celulas M de las placas de Peyer. Un jarabe o elixir puede contener el principio activo, sacarosa como agente edulcorante y metilparabeno y propilparabeno como conservantes, un colorante y un aromatizante, tal como aroma a cereza o a naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparation de cualquier forma farmaceutica unitaria debera ser farmaceuticamente puro y sustancialmente no toxico en las cantidades utilizadas. Ademas, los principios activos se pueden incorporar a las preparaciones y formulaciones de liberacion sostenida.

Para administration oral, tal como en el tratamiento de la enfermedad periodontal, las composiciones que comprenden el anticuerpo para usar en la presente invention puede incorporarse alternativamente con uno o mas excipientes en la forma de un colutorio, dentifrico, comprimido bucal, pulverization oral, gel, o formulation administrada por via sublingual. Por ejemplo, puede prepararse un enjuague bucal incorporando el principio activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado, tal como una solution de borato de sodio (Solution Dobell). Como alternativa, el principio activo puede incorporarse a una solucion oral tal como una que contenga borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersarse en un dentifrico, o anadirse en una cantidad terapeuticamente eficaz a una composicion que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes, y humectantes. Alternativamente, las composiciones se pueden conformar en un comprimido, gel o forma de solucion que puede ponerse bajo la lengua, a lo largo de la encia, cepillarse sobre las superficies dentales, o disolverse en la boca de cualquier otra forma. Las patentes de Estados Unidos 6.074.674 y 6.270.750 describen composiciones topicas de liberation sostenida para procedimiento periodontales.

En realizaciones adicionales, los anticuerpos dirigidos contra TGF-p pueden administrarse mediante una ruta parenteral. Como se usa en el presente documento, el termino "parenteral" incluye rutas que evitan el tracto alimentario. Especificamente, las composiciones farmaceuticas divulgadas en el presente documento se pueden administrar, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, por via intravenosa, intradermica, intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutanea, o intraperitoneal. Patentes de Estados Unidos 6.537.514, 6.613.308, 5.466.468, 5.543.158; 5.641.515; y 5.399.363. Las soluciones de los principios activos en forma de base libre o como sales farmaceuticamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles liquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones incluyen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion en otro momento de soluciones o dispersiones inyectables esteriles (patente de Estados Unidos 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida que debe poder inyectarse con facilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe preservarse frente a la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehiculo puede ser un disolvente o un medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (es decir, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol liquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez correcta se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamano de particula necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevention de la accion de microorganismos puede lograrse por medio de varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutano, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares y cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir mediante el uso composiciones de agentes que retrasen la absorcion, por ejemplo, monostearato de aluminio y gelatina.

Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe tamponarse adecuadamente si es necesario y el diluyente liquido se vuelve en primer lugar isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas concretas son especialmente adecuadas para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, e intraperitoneal. En esta linea, se pueden emplear medios acuosos esteriles conocidos de los expertos en la materia a la luz de la presente divulgation. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solucion de NaCl isotonica y se anade a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o se inyecta en el sitio de infusion propuesto, (vease, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edition, paginas

5

10

15

20

25

30

35

1035-1038 y 1570-1580). Se producira necesariamente alguna variacion en la dosificacion dependiendo de la dolencia del sujeto que se esta tratando. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual. Ademas, para la administracion humana, las preparaciones deben cumplir la esterilidad, la pirogenicidad, la seguridad y los estandares de pureza generales que se requieren por la FDA Office of Biologics Standards.

Las formulaciones de liberacion sostenida para tratar las enfermedades oseas incluyen las patentes de Estados Unidos 4.722.948, 4.843.112, 4.975.526, 5.085.861, 5.162.114, 5.741.796 y 6.936.270. Los metodos y las composiciones inyectables para la reparation de huesos se describen en las patentes de Estados Unidos 4.863.732, 5.531.791, 5.840.290, 6.281.195, 6.288.043, 6.485.754, 6.662.805 y 7.008.433.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los principios activos en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con otros diversos ingredientes indicados anteriormente, segun sea necesario, seguido de esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes principios activos esterilizados en un vehiculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los demas ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparation preferidos son el secado a vacio y las tecnicas de criodesecacion que dan como resultado un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una de sus soluciones anteriormente filtrada en esteril. Una composition en polvo se combina con un portador liquido tal como, por ejemplo, agua o una solution salina, con o sin un agente estabilizante.

B. Dispositivos (no reivindicado)

Ademas de proporcionar anticuerpos dirigidos contra TGF-p para su administracion mediante las rutas anteriormente citadas, dichos agentes, solos o en combination, se pueden utilizar en el contexto de dispositivos, tales como implantes. Se contempla varios implantes relacionados con el hueso, incluidos los implantes dentales, implantes en articulaciones tales como caderas, rodillas, y codos, implantes vertebrales/dorsales, y otros. Los anticuerpos dirigidos contra TGF-p se pueden impregnar sobre una superficie del implante, incluidos una matriz o recubrimiento bioactivo. El inhibidor se puede formular adicionalmente para una liberacion sostenida, retrasada, prolongada o temporalizada. El recubrimiento puede comprender polimeros, por ejemplo, tales como los relacionados a continuacion. Se indica a continuacion una lista de patentes de Estados Unidos relacionadas con implantes y dispositivos oseos que se pueden utilizar de acuerdo con esta realization de la invention:

TABLA 1 • PATENTES DE IMPLANTES OSEOS

Patente de Estados Unidos

7.044.972

7.022.137

7.001.551

6.994.726

6.989.031

6.988.015

6.981.975

6.981.872

6.929.662

6.923.830

6.921.264

6.918.766

6.913.621

6.899.734

6.860.884

6.852.129 6.802.845 6.786.908 6.767.367 6.761.738 6.755.832

6.730.129

6.689.167

Tftulo de la patente

Bone implant, in particular, an inter-vertebral implant

Bone hemi-lumbar interbody spinal fusion implant having an asymmetrical leading end and method of installation thereof

Method of forming a composite bone material implant

Dual function prosthetic bone implant and method for preparing the same

Hemi-interbody spinal implant manufactured from a major long bone ring or a bone

composite

Bone implant

Method for inserting a spinal fusion implant having deployable bone engaging projections Bone implant method of implanting, and kit for use in making implants, particularly useful with respect to dental implants End member for a bone fusion implant

Spinal fusion implant having deployable bone engaging projections

Implant to be implanted in bone tissue or in bone tissue supplemented with bone substitute material

Method, arrangement and use of an implant for ensuring delivery of bioactive substance to

the bone and/or tissue surrounding the implant

Flexible implant using partially demineralized bone

Modular implant for fusing adjacent bone structure

Implant for bone connector

Adjustable bone fusion implant and method

Implant for bone connector

Bone fracture support implant with non-metal spacers Spinal fusion implant having deployable bone engaging projections Reinforced molded implant formed of cortical bone Bone plate implant

Implant for application in bone, method for producing such an implant, and use of such an implant

Method of using spinal fusion device, bone joining implant, and vertebral fusion implant

6.689.136 6.666.890

6.652.592

6.648.917

6.607.557

6.599.322

6.562.074

6.562.073

D473,944

6.540.770

6.537.277

6.506.051

6.478.825

6.458.136

6.447.545

6.436.146 6.371.986 6.370.418 6.364.880 6.350.283

6.350.126

6.287.343

6.270.346

6.248.109

6.217.617

6.214.050

6.213.775

6.206.923

6.203.545 6.149.689 6.149.688 6.149.686 6.126.662 6.083.264

6.058.590

6.018.094

5.976.147

5.906.488

5.899.939

5.895.425

5.890.902

5.885.287

5.819.748

5.810.589

5.759.035

5.720.750

5.709.683

5.709.547

5.674.725

5.658.338 D381,080 5.639.402 5.624.462 D378,314 5.607.430 5.571.185 5.456.723

Implant for fixing two bone fragments to each other

Bone hemi-lumbar interbody spinal implant having an asymmetrical leading end and

method of installation thereof

Segmentally demineralized bone implant

Adjustable bone fusion implant and method

Artificial bone graft implant

Method for producing undercut micro recesses in a surface, a surgical implant made

thereby, and method for fixing an implant to bone

Adjustable bone fusion implant and method

Spinal bone implant

Bone implant

Reversible fixation device for securing an implant in bone Implant for fixing a bone plate

Bone implant with intermediate member and expanding assembly

Implant, method of making same and use of the implant for the treatment of bone defects

Orthopaedic instrument for sizing implant sites and for pressurizing bone cement and a

method for using the same

Self-aligning bone implant

Implant for treating ailments of a joint or a bone

Spinal fusion device, bone joining implant, and vertebral fusion implant

Device and method for measuring the position of a bone implant

Spinal implant with bone screws

Bone hemi-lumbar interbody spinal implant having an asymmetrical leading end and method of installation thereof Bone implant

Threaded spinal implant with bone ingrowth openings Dental implant for bone regrowth Implant for interconnecting two bone fragments Bone implant and method of securing

Expandable implant for inter-bone stabilization and adapted to extrude osteogenic material,

and a method of stabilizing bones while extruding osteogenic material

Method of fastening an implant to a bone and an implant therefor

Flexible implant using partially demineralized bone

Implant for fixing bone fragments after an osteotomy

Implant as bone replacement

Artificial bone graft implant

Threaded spinal implant with bone ingrowth openings Bone implant

Implant material for replacing or augmenting living bone tissue involving thermoplastic syntactic foam

Apparatus and methods for embedding a biocompatible material in a polymer bone implant Implant and insert assembly for bone and uses thereof

Modular instrumentation for bone preparation and implant trial reduction of orthopedic implants

Releasable holding device preventing undesirable rotation during tightening of a screw connection in a bone anchored implant Bone-derived implant for load-supporting applications Bone implant

Implant bone locking mechanism and artificial periodontal ligament system Self-tapping interbody bone implant Implant for use in bone surgery

Dental implant abutment combination that reduces crestal bone stress Bone fusion dental implant with hybrid anchor

Device for the preparation of a tubular bone for the insertion of an implant shaft Interbody bone implant having conjoining stabilization features for bony fusion Dental implant for anchorage in cortical bone

Implant materials having a phosphatase and an organophosphorus compound for in vivo mineralization of bone

Prosthetic modular bone fixation mantle and implant system Combined metallic skull base surgical implant and bone flap fixation plate Method for fabricating artificial bone implant green parts Bone implant and method of securing Bone spinal implant

Bone stabilization implant having a bone plate portion with integral cable clamping means Process for the production of a bone implant and a bone implant produced thereby Metallic implant anchorable to bone tissue for replacing a broken or diseased bone

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

5.441.538

5.405.388

5.397.358

5.383.935

5.364.268

5.312.256

Bone implant and method of securing Bone biopsy implant Bone implant

Prosthetic implant with self-generated current for early fixation in skeletal bone Method for installing a dental implant fixture in cortical bone

Dental implant for vertical penetration, adapted to different degrees of hardness of the bone

V. Ensayos de cribado (no reivindicado)

Tambien se divulgan en el presente documento metodos para identificar anticuerpos nuevos y utiles contra el TGF-p para su uso en la estimulacion del a produccion de hueso. Por ejemplo, un metodo comprende por lo general:

(a) proporcionar un anticuerpo candidato;

(b) premezclar el modulador candidato con una celula o animal experimental adecuado;

(c) medir la actividad de osteoblastos u osteoclastos, o el crecimiento, resistencia, masa o formation del hueso; y

(d) comparar la caracteristica medida en la etapa (c) con la observada en ausencia del candidato,

en el que una diferencia entre la caracteristica medida indica que dicho candidato es, de hecho, un estimulante de la produccion de hueso.

Los ensayos se pueden realizar en celulas aisladas o en organismos incluyendo animales transgenicos. La formacion de hueso se puede identificar mediante la tincion de von Kossa o con rojo alizarina, analisis espectrometrico mediante FTIR o Raman, o mediante fluorocromos unidos a compuestos que se unen al hueso.

Se entendera, por supuesto, que todos los metodos de cribado de la divulgation son utiles por si mismos entendiendo el hecho que es posible que no se descubran candidatos eficaces. La divulgacion proporciona metodos para cribar dichos candidatos, no solamente metodos para encontrarlos.

Los siguientes ejemplos se han incluido para demostrar realizaciones preferidas de la presente invention.

Ejemplo 1 -Materiales y metodos

Anticuerpos. El anticuerpo 1D11 lo genero Genzyme Corporation (Framingham). El anticuerpo del control (13C4) consistente en un complejo IgG identico carece de cualquiera de las capacidades de union a TGF-p.

Regimen de tratamiento. Ratones C57B1/6 machos normales de 13 semanas de edad (Harlan) (n = 5) se trataron con 10 mg/kg/x3 semanas de 1D11 o anticuerpo del control. Cada reactivo se administro mediante inyeccion intraperitoneal esteril durante un periodo de tiempo de 4 semanas (FIG. 1). Se llevaron a cabo todos los procedimientos con animales de acuerdo con los protocolos de la IACUC homologados por el Vanderbilt University Medical Center.

Obtencion de imagenes. Se analizaron la tibia y el femur mediante digitalization con |jCT (|jCT40, Scanco) a un tamano de voxel isotropico de 12 jm (55 Kv). Despues de identificar cada placa de crecimiento en cada conjunto de digitalizaciones, se digitalizo la region metafiseal de 200 jm por debajo de esta area y se analizo para determinar las alteraciones en los parametros del hueso trabecular (Umbral 280).

Histologia e histomorfometria. Se recogieron cuerpos vertebrales lumbares (L3-5) y huesos largos tras el sacrificio y se fijaron durante hasta 48 h en formol al 10 %. Se procesaron las regiones descalcificadas de las vertebras y se incluyeron en resina de tipo metilmetacrilato y se seccionaron a 5 jm. Las secciones se desplastificaron y se tineron para determinar los iones de calcio unidos utilizando el procedimiento de Von Kossa con una contratincion de van Gieson, o utilizando una tecnica de tincion posterior al acoplamiento para la fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP). Se descalcificaron los huesos largos durante 2 semanas en EDTA al 10 % y se procesaron en cera de parafina. Las muestras se seccionaron a 5 jm y se tineron con H&E/Orange G, o para la actividad de TRAP. El volumen oseo y la distribution celular se cuantificaron histomorfometricamente utilizando el programa informatico de cuantificacion Osteomeasure (Osteometrics).

Expresion genica Se evaluo la relation de expresion del gen RANKL/OPG en osteoblastos T23 tratados con 1D11 o con el control, con ARN aislado utilizando los kits de extraction RNEasy (Qiagen). Se adquirieron cebadores Taqman validados y se analizaron las muestras utilizando un sistema PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se evaluo la expresion osteogenica utilizando las tecnicas de la RT-PCR normalizadas.

Expresion de protemas. Se aislo suero normal de ratones tratados y no tratados mediante exsanguinacion antes

VI. Ejemplos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

del sacrificio. Se evaluo el suero mediante enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA) para determinar los niveles de RANKL o de la proteina OPG utilizando el sistema Quantikine Immunoassay (R&D Systems) con el concentrado y una dilucion en suero x 5 utilizado para RANKL y OPG, respectivamente.

Ensayo de resorcion en orina. Se recogieron muestras de orina de todos los animales antes del sacrificio. Se cuantifico la desoxipiridinolina del producto de degradacion del colageno (DPD) mediante ELISA utilizando el ensayo MicroVue-DPD (Quidel Corp.) segun las directrices del fabricante y se normalizo para los niveles de creatinina urinaria (MicroVue-Creatinine, Quidel Corp.).

Ensayo bioqmmico. La resistencia y el modulo de la region diafiseal del femur se analizaron bioquimicamente. Femures frescos se situaron horizontalmente sobre rodillos de soporte y se cargaron monotonicamente en una flexion de tres puntos a una velocidad de 3 mm/min, utilizando un sistema de ensayo de materiales (Dynamight 8841; Instron). Se registro la curva de fuerza-desplazamiento para proporcionar la fuerza maxima soportada por el hueso y la rigidez inicial. Utilizando el momento de inercia derivado de uCT y las ecuaciones flexurales de la teoria de haces (Schriefer et al., 2005), los inventores convirtieron estas propiedades estructurales en la resistencia a flexion y el modulo del hueso completo.

Microespectroscopia Raman. La composicion quimica del tejido oseo se caracterizo mediante microespectroscopia Raman confocal (Renishaw). Se incluyeron las tibias en PMMA y se cortaron en la metafisis por debajo del lugar de crecimiento para exponer una seccion transversal de la corteza. Esta superficie se molio sucesivamente sobre esmeriles en papel de carburo de silicio y se pulio con 1 |jm de suspension de alumina. Un objetivo de 50x enfoca el laser (una fuente de un diodo laser de 785 nm) en una region de 3 jm por debajo de la superficie del tejido, se recogio una luz inelastica mediante un espectrografo Renishaw (1 cm-1 de resolucion espectral). El espectro medido consistio en tres acumulaciones con un tiempo de integracion de 10 s cada una. Utilizando comandos Matlab personalizados, se sustrajo la fluorescencia de fondo en el espectro mediante un algoritmo de ajuste polinomico modificado (Lieber et al., 2003). Se recogieron los espectros de 10 localizaciones trabeculares con la metafisis tibial (molida por debajo de la placa de crecimiento). Se calculo la relacion entre el mineral y el colageno como la intensidad del pico de fosfato v1 (962 cm-1) por la intensidad del pico de prolina (856 cm-1) y se promedio por hueso.

Nanoindentacion. Se cuantifico el modulo a nivel tisular mediante nanoindentacion. Se sondaron las regiones incluidas en resina de la diafisis tibial utilizando un Nanoidenter XP (MTS XP). Una punta de diamante Berkovitch (angulo de inclination: 142,30; radio: 100 nm) se presiono contra la superficie utilizando un esquema de carga trapezoidal de la siguiente forma: 1) carga a una velocidad de deformation de 0,5/s a una profundidad de 1 jm, 2) mantener a Pmax durante 10 segundos, 3) descargar a 350 jN s-1 a 90 % de Pmax, y 4) dejar el indentador sobre la superficie durante 60 segundos a fin de establecer la deriva termica. A partir de la curva fuerza-desplazamiento resultante, se calculo el modulo elastico (E) del tejido en el punto de indentation (0,25 jm de resolucion) siguiendo los metodos de Oliver y Pharr (2004). Esto implica un procedimiento de calibration inicial utilizando silice fundida para establecer la relacion entre la profundidad de la indentacion y el area de contacto de la punta, y para determinar la pendiente de la parte sin cargar de la curva fuerza-desplazamiento. Se recogieron diez indentaciones por hueso, donde los datos se representan en forma de promedio ± SE.

Analisis estadistico. Se determinaron los valores estadisticamente significativos mediante el test de la t de Students y Mann-Whitney y los valores p menores de 0,05 se consideraron significativos.

EJEMPLO 2 • RESULTADOS

La inhibition de TGF-p mediante el tratamiento con anticuerpo 1D11, resenado en la FIG. 1, aumento significativamente el volumen oseo largo en comparacion con los controles (FIGS. 2A-B). El hueso trabecular en la metafisis de la tibia analizada mediante digitalization con jCT mostro un drastico aumento en BV/TV global (FIG. 2C), densidad mineral osea (BMD) (FIG. 2D), espesor trabecular (FIG. 2F) y separation trabecular disminuida (FIG. 2F) en animales tratados con 1D11 en comparacion con ratones tratados con el control. El analisis histomorfometrico de secciones descalcificadas de las vertebras lumbares respaldo el analisis jCT de los huesos largos. La inhibicion de TGF-p mediada por ID11 conduce a un aumento del 54 % en el BV/TV trabecular. Este aumento en el hueso estuvo acompanado por un mayor numero de trabeculas, disminucion de la separacion trabecular y aumento del engrosamiento trabecular (FIGS. 3A-B).

Un analisis de la distribution de celulas oseas en las secciones vertebrales tenidas con TRAP mostro numeros de osteoclastos y un area superficial significativamente reducidos tras el tratamiento con 1D11 (FIGS. 4A-C). Por el contrario, se observo un numero de osteoblastos y un area de osteoblastos revistiendo la superficie osea elevados en ratones tratados con 1D11, en comparacion con los controles (FIG. 4D). Ademas de alteraciones en el numero de celulas oseas, la masa osea global y la integridad esqueletica pueden verse tambien afectadas por los cambios en la tasa de remodelacion del hueso. Para determinar las tasas de renovation tras el tratamiento con 1D11, los inventores evaluaron la desoxipiridinolina en el producto de degradacion del colageno (DPD) en muestras de orina recogidas en el sacrificio. En respaldo de los datos histomorfometricos, la relacion DPD/creatinina indico una disminucion en la actividad resortiva tras el tratamiento con 1D11 (control = 39,3 ± 5,6; 1D11 = 12,0 ± 6,2 jg de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

protema).

En los anos recientes ha quedado claro que, ademas de la cantidad global de hueso presente en el esqueleto, la calidad del hueso es tambien un elemento esencial a considerar cuando se analizan nuevas terapias y sus efectos sobre el esqueleto. Para resolver esto, los inventores llevaron a cabo una flexion de 3 puntos sobre los femures extirpados para determinar el efecto del tratamiento con 1D11 sobre las propiedades biomecanicas del hueso. El bloqueo de la senalizacion de TGF-p dio como resultado huesos considerablemente mas fuertes con una resistencia a la flexion y un modulo del hueso completo aumentados (FIG. 5). Se determino tambien el efecto de 1D11 sobre el modulo esqueletico a un nivel tisular utilizando nanoindentacion. Estos hallazgos respaldan los datos biomecanicos que muestran un modulo de nivel tisular potenciado tras el tratamiento con 1D11 (Tabla 2). Ademas, La microespectroscopia Raman permitio a los inventores analizar y cuantificar el efecto del bloqueo de TGF-p sobre los componentes composicionales del hueso. Estos estudios demostraron un aumento del 11 % en la relacion entre mineral y colageno del hueso trabecular en la metafisis tibial tras el tratamiento con 1D11. Sin embargo, la calidad de la hidroxiapatito y la cristalinidad global del componente inorganico permanecio inalterada (Tabla 2).

La integridad esqueletica se mantuvo cuando las actividades de formacion de osteoblastos y osteoclastos estaban equilibradas. Un mecanismo primario que media la resorcion del hueso osteoclastico se produce mediante la expresion de RANKL/OPG en los osteoclastos. Como TGF-p habia mostrado previamente alterar la relacion RANKL/OPG) (Mohammad et al., 2009; Karst et al., 2004; Quinn et al., 2001; Thirunavukkarasu et al., 2001), los inventores examinaron el efecto del tratamiento con 1D11 sobre la expresion genica de RANKL/OPG en lineas de osteoblastos in vitro y evaluaron los niveles de proteina RANKL y OPG in vivo, en muestras de suero procedentes de animales tratados con 1D11 o con el control. En cultivo, el tratamiento con TGF-p disminuyo la expresion del ARNm de RANKL (rankl/gapdh; 1,6 ± 0,2 versus 0,7 ± 0,1) y aumento la expresion del gen OPG (opg/gapdh: 1,7 ± 0,1 versus 2,4 ± 0,2). Este efecto se bloqueo mediante la adicion de 1D11 a cultivos de osteoblastos. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en individuos con niveles de proteinas RANKL (control = 31,9 ± 7,6; 1D11 = 17,0 ± 1,8 pg/ml) u OPG (control = 487,7 ± 22,6; 1D11 = 451,5 ± 20,4 pg/ml) que fueron detectables en muestras de suero procedentes de ratones tratados o no tratados, aunque los niveles de RANKL reducidos conducen a una disminucion del 50 % en la relacion de RANKL/OPG global. Ademas, el efecto directo de TGF-p sobre la expresion del gen osteogeno se analizo in vitro. El tratamiento de los osteoblastos 2T3 con TGF-p indujo una disminucion del 49,3 % en la expresion del gen de la fosfatasa alcalina y un aumento del 331,8 % en la expresion de PTHrP, como se determino mediante la PCR. Este aumento se evito completamente mediante el tratamiento con 1D11 ademas de TGF-p. No se observaron alteraciones en los niveles de expresion del analisis x2, p-catenina, colageno de tipo 1 u osteocalcina, con identicos resultados observados en la linea de celulas osteoblasticas MC3T3. Juntos, estas investigaciones confirman un efecto beneficioso global en el esqueleto tras la neutralizacion de TGF-p en el entorno de la medula osea.

Tabla 2 • Parametros de composicion del hueso tratado

Control 1011

Nanoindentacion

Modulo nivel tejido (GPa)

22,7 ± 0,5 24,3 ±1,3*

Microespectroscop^a Raman

Relacion de colageno mineral (%)

5,5 ± 0,1 6,1 ±0,1*

Sustituciones de carbonato

0,185 ± 0,012 0,169 ± 0,009

Cristalinidad

0,078 ± 0,005 0,081 ± 0,002

EJEMPLO 3. DISCUSION

Este estudio investiga el uso de un anticuerpo neutralizante de TGF-p como un agente oseo anabolico y resalta el potencial de inhibicion de TGF-p como mecanismo para aumentar la masa osea. Los inventores emplearon tecnicas normalizadas aceptadas junto con tecnologias emergentes para analizar en profundidad el volumen, la densidad, la resistencia y la composicion del hueso. Juntos, estos estudios demuestran que los farmacos destinados a bloquear la ruta de senalizacion de TGF-p tienen la capacidad de regular positivamente el numero de osteoblastos a la vez que disminuyen simultaneamente la cantidad de osteoclastos activos en la medula osea. Esto dio como resultado un importante aumento en el volumen y la calidad del hueso, similar al observado en los estudios de roedores tratados con PTH (Dempster et al., 1993).

Existe una considerable necesidad de agentes anabolicos oseos mas eficaces. Actualmente, el enfoque terapeutico principal para la excesiva perdida de hueso es el uso de antirresortivos tales como bisfosfonatos. Aunque estos agentes son ciertamente capaces de reprimir la resorcion del hueso adicional, son incapaces de estimular nuevos ciclos de formacion para sustituir el hueso que se ha perdido. Los inventores han mostrado que el direccionamiento de TGF-p con un anticuerpo neutralizante tiene la capacidad de evitar la destruccion de hueso mediante la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

disminucion de los osteoclastos, a la vez que incrementa simultaneamente los osteoblastos. El resultado directo es una mejora neta en la masa osea en las regiones esqueleticas apendicular y axial. Tambien se ha demostrado que los huesos largos son considerablemente mas fuertes con las propiedades composicionales de la matriz potenciadas de forma favorable para un funcionamiento normal del esqueleto.

Una perdida de hueso elevada, tal como la observada en la osteoporosis, conduce con frecuencia a un aumento en el riesgo de fracturas. Esta caracteristica es el resultado en ultima instancia de una perdida global de resistencia y una calidad del hueso disminuida en el esqueleto. Se ha sugerido que este deficit en la calidad del hueso no se puede tener en cuenta solo por la disminucion en el volumen oseo, sugiriendo un defecto intrinseco en la produccion de nueva matriz osea en estos individuos. El hueso normal comprende usualmente una relacion equilibrada de matriz de colageno organico y componente mineral inorganico. Aunque una desregulacion excesiva de cada elemento da como resultado profundos defectos esqueleticos, la relacion puede modificarse a lo largo de la vida para aumentar la resistencia global del hueso y la resistencia a la fractura. El tratamiento con 1D11 aumento la relacion entre mineral y colageno del hueso trabecular sin deteriorar la pureza del hidroxiapatito, como se evalua por el nivel de sustituciones del carbonato dentro del cristal, sugiriendo que la inhibicion de TGF-p en este entorno favorece la produccion de hueso de calidad mejorada. Asimismo, las caracteristicas composicionales potenciadas del hueso tratado con 1D11 se traducen bien en un aumento global en la resistencia del hueso en estos animales. Estos datos se vieron apoyados por modelos de ratones modificados geneticamente cuando la senalizacion de TGF- p perturbada aumenta la resistencia del hueso (Balooch et al., 2005), aunque no se sabe si este sistema representaria un enfoque terapeutico viable y eficaz para aumentar la masa osea. Los drasticos efectos beneficiosos notificados en el estudio de los inventores proporcionan una fuerte evidencia para el desarrollo de agentes farmaceuticos especificamente dirigidos a la inhibicion de TGF-p para aumentar la masa y la resistencia osea.

Dosis intermitentes de hormona paratiroidea (PTH) representan actualmente el unico enfoque clinicamente disponible para aumentar el volumen oseo. Sin embargo, el mecanismo a traves del cual PTH induce este efecto no esta todavia claro. Ademas, el tratamiento continuo con PTH ha demostrado estimular la resorcion del hueso osteoclastico y disminuir la masa osea global (Raisz, 2005). Al igual que PTH, la neutralizacion del TGF-p mediante el tratamiento con anticuerpo 1D11 mejoro ampliamente los parametros esqueleticos, y al igual que PTH, el mecanismo verdadero a traves del cual se puede producir sigue siendo desconocido. Pero a diferencia de los efectos de PTH, 1D11 regula negativamente los osteoclastos, inhibiendo la degradacion del hueso y ofreciendo un doble enfoque para potenciar la masa osea mediante un aumento en el numero de osteoblastos y una disminucion en la resorcion osteoclastica.

A pesar de una amplia bibliografia que describe los efectos de TGF-p sobre los osteocitos, sigue estando poco claro como la inhibicion de TGF-p media en los acontecimientos esqueleticos in vivo. Recientes estudios sugieren una desregulacion de las moleculas osteoclastogenicas primarias (RANKL/OPG) o en la remodelacion del hueso mediada por efrina (Mohammad et al., 2009).

Los inventores examinaron los niveles de proteinas RANKL y OPG solubles en sueros de ratones tras el tratamiento con 1D11 o control y senalaron una tendencia hacia una disminucion en la relacion RANKL/OPG conseguida por los niveles de RANKL disminuidos. Este hallazgo puede estar asociado con la expresion disminuida de PTHrP observada en osteoblastos tratados con 1D11, ya que se sabe que PTHrP estimula RANKL en este tipo de celulas (Lee y Lorenzo, 1999; Itoh et al., 2000). Aunque estas observaciones in vivo son consistentes con los estudios actuales (Mohammad et al., 2009) y sugieren que el tratamiento con 1D11 podria aumentar el volumen oseo suprimiendo la regulacion de TGF-p de RANKL u OPG en los osteoblastos, el contraste con estudios moleculares in vitro indica que el tratamiento con TGF-p conduce a una reduccion significativa en RANKL y aumenta la expresion del ARNm de OPG, que se podria bloquear por 1D11. Estos hallazgos son consistentes con los estudios publicados que documentan la regulacion de TGF-p de RANKL/OPG in vitro (Quinn et al., 2001; Thirunavukkarasu et al., 2001) y sugieren con fuerza un papel diverso de TGF- p en la fisiologia normal, que no esta bien recapitulada en los sistemas de cultivo, y es probablemente dependiente de las interacciones con otras moleculas reguladoras. Es por tanto necesaria una interpretacion cuidadosa de los resultados cuando se analizan las diferencias entre la funcion de TGF-p in vitro e in vivo.

Los osteoblastos se derivan de una poblacion de citoblastos del mesenquima en la medula osea. Se estimularon las celulas precursoras para alcanzar el linaje osteoblastico mediante factores estimuladores tales como BMP-2 (Katagiri et al., 1990; Takuwa et al., 1991). El analisis molecular de la expresion osteogenica del gen, que sugiere que la actividad osteoblastica puede estar alterada por el tratamiento con 1D11 in vitro, evidencio niveles aumentados de fosfatasa alcalina. Este hallazgo esta correlacionado con los datos publicados (Filvaroff et al., 1999; Alliston et al., 2001; Kang et al., 2005), aunque fracasan en ilustrar cualquier efecto principal sobre la maduracion de precursores para aumentar el numero de osteoblastos, como se demostro por los hallazgos de los inventores in vivo. Esto sugiere que la inhibicion local de TGF-p en la medula osea puede afectar la formacion del hueso durante este periodo de tratamiento, pero el mecanismo verdadero que gobierna cualquier cambio en la osteoblastogenesis sigue siendo desconocido.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ademas de los efectos directos sobre las celulas oseas, los inventores son incapaces de excluir un efecto sistemico de TGF-p en este sistema. Es plausible que el control de TGF-p de los procesos fisiologicos normales afecte negativamente la masa osea, y el bloqueo de estos efectos es beneficioso en ultimo extremo para la salud del esqueleto. Es tambien posible que el control de TGF-p de la formation o la actividad de los osteocitos varie temporalmente a medida que cambia la poblacion celular de la medula. Esto seria consistente con los estudios in vitro que describen efectos diferenciales sobre celulas precursoras en comparacion a la matriz madura que forma los osteoblastos (Mundy and Bonewald, 1990). Los inventores utilizaron ratones macho C57BI/6 maduros para resaltar los efectos beneficiosos del bloqueo de TGF-p sobre el esqueleto. Seran necesarios estudios adicionales utilizando modelos de perdida de hueso para evaluar si el tratamiento con 1D11 aumenta el hueso en estas condiciones. A pesar de esto, el uso por parte de los inventores de ratones C57BI/6, (de los que se notifico que tienen la menor BMD de todas las razas de raton disponibles Beamer et al., 1996), sugiere que es probable que la inhibicion de TGF- p mejore las propiedades esqueleticas en el caso de masa osea baja, tambien en modelos de envejecimiento u osteopenicos.

En apoyo de estos datos, las moleculas pequenas destinadas al bloqueo de la senalizacion de TGF-p inhibiendo la actividad quinasa del receptor de TGF-p que se ha demostrado recientemente que aumenta la masa osea (Mohammad et al., 2009). Aunque estas moleculas demuestran una potenciacion significativa en el hueso trabecular, el bloqueo de TGF-p mediado por 1D11 aumenta el volumen de hueso trabecular y mejora la resistencia osea cortical. Estos efectos esqueleticos superiores pueden ser un resultado de la completa elimination de la senalizacion de TGF-p a traves de la avidez de la union y la neutralization de todas las isoformas de TGF-p extracelulares, en comparacion con la inhibicion de las enzimas asociadas al receptor intracelular dirigidas actualmente por moleculas pequenas. Estos hallazgos ilustran claramente el potencial de los compuestos que se pueden dirigirse especificamente TGF-p in vivo, y sugieren un enfoque terapeutico para aumentar la masa osea en condiciones donde es prevalente la destruccion excesiva de hueso, tal como la osteoporosis.

VII. Referencias

Patente de Estados Unidos 4.196.265.

Patente de Estados Unidos 4.722.948.

Patente de Estados Unidos 4.843.112.

Patente de Estados Unidos 4.863.732.

Patente de Estados Unidos 4.975.526.

Patente de Estados Unidos 5.571.714.

Patente de Estados Unidos 5.772.998.

Patente de Estados Unidos 5.783.185.

Patente de Estados Unidos 5.085.861.

Patente de Estados Unidos 5.162.114.

Patente de Estados Unidos 5.399.363.

Patente de Estados Unidos 5.466.468.

Patente de Estados Unidos 5.531.791.

Patente de Estados Unidos 5.543.158.

Patente de Estados Unidos 5.580.579.

Patente de Estados Unidos 5.629.001.

Patente de Estados Unidos 5.641.515.

Patente de Estados Unidos 5.741.796.

Patente de Estados Unidos 5.792.451 Patente de Estados Unidos 5.840.290.

Patente de Estados Unidos 5.972.703.

Patente de Estados Unidos 6.074.674.

Patente de Estados Unidos 6.270.750.

Patente de Estados Unidos 6.281.195.

Patente de Estados Unidos 6.288.043.

Patente de Estados Unidos 6.485.754.

Patente de Estados Unidos 6.537.514.

Patente de Estados Unidos 6.613.308.

Patente de Estados Unidos 6.662.805.

Patente de Estados Unidos 6.936.270.

Patente de Estados Unidos 7.008.433.

Alliston et al., EMJO. J., 20(9):2254-2272, 2001.

Ashton et al., Bone, 6:313-319,1985.

Aubin, Biochem. Cell Biology, 76:899-910,1998.

Balooch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(52):18813-18818, 2005. Beamer et al., Bone, 18(5):397-403, 1996.

Beidler et al., J. Immunol., 141(11):4053-4060, 1988.

Bleiberg, Connect Tissue Res., 14:121-127,1985.

Campbell et al., Am. Rev. Respir. Dis., 130(3):417-423, 1984.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Cavo et al., New England Journal of Medicine 354:1076-1078, 2006.

Dempster et al., Endocr. Rev., 14(6):690-709, 1993.

EP Application 125,023 EP Application 171,496 EP Application 173,494

EP Application 184,187 Filvaroff et al., Development, 126(19):4267-4279, 1999.

Friedenstein et al., Exp. Hematol., 10:217-227,1982.

Friedenstein et al., Transplantation, 6:230-247,1968.

Gefter et al., Somatic Cell Genet., 3:231-236, 1977.

Goding, In: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed., Academic Press, Orlando, Fl, pp 60-61, 7174, 1986.

Gronthos et al., Blood, 84:4164-4173,1994.

Gronthos et al., J. Bone Min. Res., 14:47-56,1999.

Harlow and Lane, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Hwang et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 15(3):243-284, 1998.

Itoh et al., J. Bone Miner res., 15(9): 1766-1775, 2000.

Jaiswal et al., J. Biol. Chem., 275:9645-9652, 2000.

Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986.

Kadiyala et al., Cell Transplantation, 6:125-134,1997.

Kale et al., Nat. Biotech., 18:954-958, 2000.

Kang et al., EMBO. J., 24(14):2543-2555, 2005.

Karst et al., J. Cell Physiol., 200:99-106, 2004.

Katagirl et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 172(1):295-299, 1990.

Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976.

Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975.

Lee and Lorenzo, Endocrinology, 140(8):3552-3561, 1999.

Lieber et al., Appl. Spectrosc. 57:1363-67, 2003.

Long, J. Clin. Invest., 95:881-887, 1995.

Mathiowitz et al., Nature, 386(6623):410-414, 1997.

Mohammad et al., PLoS ONE, 4:e5275, 2009.

Morrison, Science, 229(4719):1202-1207, 1985.

Mundy and Bonewald, Ann. Ny Acad. Sci., 593:91-97, 1990.

Oliver & Pharr, J. Mater. Res., 19:3-20, 2004.

PCT Appln. PCT/uS86/02269 PCT Appln. WO 86/01533 Petite et al., Nat. Biotech., 18:959-963,2000.

Phinney et al., J. Cellular Biochem., 75:424-436,1999.

Pittenger et al., Science, 284:143-147,1999.

Quinn et al., J. Bone Miner. Res., 16:1787-94, 2001.

Raisz, J. Clin. Invest., 115(12):3318-3325, 2005.

Reddi and Huggins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:1601-1605,1972.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., pages 1035-1038 and 1570-1580, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980.

Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, pp. 1289-1329, 1990.

Schriefer et al., J. Biomech., 38:467-75, 2006.

Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 80(19):1553-1559, 1988.

Sun et al., J. Steroid Biochem., 26(1):83-92, 1987.

Takuwa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 174(1):96-101, 1991.

Terpos et al., Annals of Oncology 16:1223-1231,2005.

Thirunavukkaraus et al., J. Biol Chem., 276:36241-50, 2001.

Verhoeyen et al., Science, 239(4847):1534-1536, 1988.

Wood et al., J. Clin. Lab. Immunol., 17(4):167-171, 1985.

Zohar et al., Blood, 90:3471-3481,1997.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo que se une inmunologicamente a TGF-p para su uso en un metodo para aumentar la masa osea y/o el volumen oseo y/o aumentar el crecimiento del hueso y/o la resistencia del hueso en un sujeto,

   en donde dicho sujeto padece osteoporosis, fractura osea, perdida de hueso debida a traumatismo o enfermedad de Paget, en donde el sujeto no tiene cancer y en donde el anticuerpo se une a las tres isoformas de TGF-p.
2. 2. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 1, en donde el metodo para aumentar la masa osea comprende al menos administrar dicho anticuerpo dos veces.
3. 3. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 2, en donde el metodo comprende administrar dicho anticuerpo tres veces a la semana.
4. 4. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 2, en donde el metodo comprende administrar dicho anticuerpo al menos 9 veces.
5. 5. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 1, en donde los metodos para aumentar la masa osea y el crecimiento oseo comprenden administrar sistemicamente dicho anticuerpo a dicho sujeto.
6. 6. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 5, en donde los metodos comprenden administrar dicho anticuerpo por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea o topica.
7. 7. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 1, en donde los metodos para aumentar la masa osea y el crecimiento oseo comprenden administrar dicho anticuerpo a un sitio oseo diana.
8. 8. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 7, en donde el metodo para aumentar la masa osea comprende inyectar dicho anticuerpo en dicho sitio o mediante un dispositivo de liberacion temporalizada en dicho sitio.
9. 9. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 1, en donde dicho sujeto es un ser humano o un animal no humano.
10. 10. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 9, en donde el metodo es un metodo para aumentar la masa osea y dicho animal no humano es un raton, una rata, un conejo, un perro, un gato, un caballo, un mono o una vaca.
11. 11. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 1, en donde el metodo comprende ademas evaluar la masa osea despues de la administracion de dicho anticuerpo.
12. 12. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 11, en donde la evaluacion de la masa osea comprende obtener imagenes del hueso.

13. 13. El anticuerpo para el uso

    de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es para usar en un metodo para

    aumentar la resistencia del hueso.

14. 14. El anticuerpo para el uso

    de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es para usar en un metodo para

    aumentar el volumen oseo.

15. 15. El anticuerpo para el uso

    de la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo es para usar en un metodo para

    aumentar la masa osea.