ES2597227T3 - Dispositivo para la normalización del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibióticos a través del procedimiento de cruzado de tiras de gradiente - Google Patents

Dispositivo para la normalización del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibióticos a través del procedimiento de cruzado de tiras de gradiente Download PDF

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Abstract

Dispositivo para la normalización del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibióticos a través de la utilización de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado que comprende: * Una base circular (1) que sirve para el cruzado de dos tiras de papel graduado cada una impregnada con un gradiente de concentración predefinido de un agente antimicrobiano y que tiene sobre su superficie dos ranuras (2a, 2b) que se cruzan bajo un ángulo de 90º; * un colector de pinchado cruciforme desechable (5) que tiene dos bloques cruzados (7a, 7b) que ajustan apropiadamente en las ranuras (2a, 2b) cruzadas a 90 ° de la base circular (1) y que está equipado en el centro con una aguja/punto (6) y cuatro agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) situados a la misma distancia desde el centro de la aguja/punto (6).

Description

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DESCRIPCION
Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves del procedimiento de cruzado de tiras de gradiente.
Antecedentes de la invencion
[0001] En medicina, a fin de combatir un germen resistente, a menudo es necesario administrar a un paciente uno o dos antibioticos al mismo tiempo, por lo que en primer lugar es esencial para llevar a cabo una prueba de sinergia con el fin de verificar su compatibilidad y su efecto asociado.
[0002] La prueba de la sinergia de dos antibioticos realizada en un medio de cultivo bacteriano es, de hecho, esencial para el proposito de verificar:
- Un efecto antagonista de los dos antibioticos a administrar al paciente, en el sentido de que las dos moleculas antibioticas combinadas conjuntamente producen un efecto menor del que producirian si se consideran individualmente;
- Un efecto sinergico de los dos antibioticos a administrar al paciente, en el sentido de que las dos moleculas de antibioticos combinadas conjuntamente producen un efecto mayor que la suma de los efectos individuales de las dos moleculas;
- Un efecto aditivo de los dos antibioticos a administrar al paciente, en el sentido de que las dos moleculas de antibioticos combinadas conjuntamente producen un efecto que es igual a la suma de los efectos individuales de las dos moleculas;
- Un efecto indiferente de los dos antibioticos a administrar al paciente que se produce cuando las dos moleculas antibioticas, aun cuando se combinen conjuntamente, no producen un efecto mejorado en comparacion con el que se habria producido si se consideran individualmente.
[0003] En el estado actual de la tecnica, hay diferentes procedimientos para las pruebas de sinergia entre las moleculas antibioticas: letalidad para macrodilucion en caldo1, placa reticulada para microdilucion en caldo2, sustitucion de tiras de gradiente antimicrobiano sobre cultivo microbiano a traves de difusion en agar3, cruzado de tiras de gradiente antimicrobiano en cultivo microbiano a traves de difusion en agar4. 1 2 4 Comparacion de tres diferentes metodos in vitro de deteccion de sinergia: letalidad, placa reticulada, y E-test.
[0004] R L White, D S Burgess, M Manduru and J A Bosso Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40(8):1914.
R L White, D S Burgess, H y J Manduru Un Bosso Antimicrob. Agents Chemother. 1996, 40 (8): 1914.
[0005] 12 3 Comparacion de estudios de E-test, dilucion en placas de reticula y letalidad para la deteccion de sinergia o antagonismo entre agentes antifungicos ensayados contra especies de candida.
[0006] Lewis, R., Diekema, D., Messer, S., Pfaller, M. y Klepser, M. (2002). JAC. 49: 345- 351.
[0007] La determinacion de la concentracion minima inhibitoria (MIC) de un agente antimicrobiano frente a un microorganismo mediante la utilizacion de tiras graduadas impregnadas con gradiente antimicrobiano, consiste en depositar una tira, hecha de un material poroso o no poroso sobre una poblacion microbiana en un medio de cultivo de agar. La tira de antibiotico libera el antibiotico de acuerdo con el gradiente predefinido, y despues de un periodo de incubacion de 18 o mas horas, puede observarse una zona de inhibicion eliptica, simetrica y centrada a lo largo de la tira.
[0008] El valor de la CIM, expresada en pg/ml, es leida en el punto de interseccion entre el borde inferior de la elipse de inhibicion y la tira.
[0009] La prueba de sinergia de dos agentes antimicrobianos a traves de la utilizacion de la tira de gradiente con el procedimiento de cruzado de tiras en un medio de cultivo microbiano implica, en primer lugar la determinacion de la MIC para cada antibiotico; entonces, las tiras de los dos antibioticos se colocan perpendicularmente sobre el cultivo bacteriano. Las dos tiras deben cruzar en el punto correspondiente a los valores de CMI de los dos agentes antimicrobianos individuales previamente determinados. Despues de la incubacion, el nuevo CIM de cada antibiotico se evalua y se calcula el efecto combinado de los mismos utilizando el siguiente algoritmo 5’ 6:
Definiciones:
CIMA
CIMB
CIMab
CIMba
CIM del antibiotico A CIM del antibiotico B
CIM del antibiotico A en presencia del antibiotico B; CIM del antibiotico B en presencia del antibiotico A.
[0010] El indice CIF (indice de concentracion inhibitoria fraccionada) se calcula como:
Indice CIF = CIMab/CIMa + CIMba/ CIMb
Sinergia Efecto aditivo Indiferencia Antagonismo
CIF < 0.5 CIF > 0,5 y <1.0 CIF > 1 y < 4 CIF > 4
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5 Comparacion de las tecnicas de medicion de sinergismo antibiotico in vitro. Norden, C. W., Wentzel, H., Keleti, E. J. Infect. Dis. 140: 629-633, 1979.
6 Correlaciones entre metodos para medicion de sinergia. Berenbaum, M. C. 1980. J. Infect. Dis. 142: 476-480.
[0011] La precision de este procedimiento de ensayo de sinergia depende del cruzado correcto de las dos tiras de gradiente antimicrobiano que deben estar perfectamente perpendiculares. El comportamiento de este ensayo es propenso a errores por parte del operario, que accidentalmente podria fallar en colocar las tiras en un angulo de 90° o dejar de senalar el punto de cruzado correcto al depositar manualmente la segunda tira en la parte superior de la primera, lo que daria como resultado una ensayo a repetir o a obtencion de resultados poco fiables.
[0012] La interseccion de las tiras a 90°, es la condicion requerida para la evaluacion correcta de los anillos de inhibicion y la lectura del valor de la CIM en la tira graduada y el consiguiente calculo del algoritmo descrito anteriormente.
[0013] El depositar la segunda tira en el punto de cruzado deseado es dificil y propenso a errores porque es practica comun en los laboratorios realizar esta operacion de forma manual mediante pinzas de laboratorio, en un intento de lograr una colocacion milimetrica en el punto exacto de la tira graduada que corresponde al punto de CIM, expone al operario a imprecision natural. Una vez que la tira antimicrobiana ha entrado en contacto con el cultivo bacteriano ya no puede quitarse ni tampoco reposicionarse en la medida que el proceso de difusion del antibiotico es inmediato cuando entra en contacto con el agar.
Reveiacion de la invention
[0014] El objeto de la presente invencion es remediar los problemas antes mencionados, ofreciendo un dispositivo para los microbiologos o tecnicos de laboratorio, permitiendo el cruzado de dos tiras de papel graduadas impregnadas con dos antibioticos diferentes exactamente a 90°, lo que facilita la ejecucion de las pruebas de sinergia de los antibioticos en un medio de cultivo bacteriano.
[0015] Otro objeto de la presente invencion es hacer preciso el ensayo de sinergia, asegurando el cruzado exacto a 90° de dos tiras de papel graduado, impregnadas con dos antibioticos diferentes.
[0016] Otro objeto de la presente invencion es la normalizacion de los procedimientos de ensayo de sinergia con el fin de garantizar la condicion de repetible entre laboratorios para dichos ensayos de sinergia y reproducibilidad entre laboratorios.
[0017] Estos y otros objetos se consiguen por la invencion que es el objeto de la presente solicitud que se refiere a un dispositivo que hace que sea posible cruzar exactamente bajo un angulo de 90°, dos tiras de papel graduado cada una de las cuales se impregna con un gradiente de concentracion predefinido de un agente antimicrobiano para la determinacion del resultado exacto de su efecto sinergico.
Breve description de ios dibujos
[0018] Otras caracteristicas y ventajas de la invencion se comprenderan mejor a partir de la descripcion de una realizacion preferida pero no exclusiva de la misma, ilustrada por medio de un ejemplo indicativo pero no limitativo en los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1, muestra una vista en planta superior de una base circular (1) con un diametro de 124 mm que comprende dos ranuras (2a, 2b) que se cruzan exactamente a 90°, escalonadas en altura y teniendo cada una de las cuales una anchura de 6 mm, que corresponde a la anchura de la tira de papel graduado (no mostrada), en las que se hacen deslizar cada una de las antedichas tiras graduadas independientemente entre si. En el centro de la base circular (1) existe:
• un hueco circular (3) con un diametro de 20 mm;
• un hueco circular (4) con un diametro de 4 mm, concentrico al hueco circular (3);
• cuatro huecos circulares (4a, 4b, 4c, 4d) con un diametro de 2 mm y una profundidad de 1,5 mm, dispuestos a una distancia de 7,5 mm a partir del centro del hueco circular (4).
La figura 2, es una vista en alzado lateral de la base circular (1) con una anchura de 20 mm, del hueco circular (3) con una profundidad de 0,7 mm y del hueco circular (4) con una profundidad de 5,4 mm.
La figura 3, es una vista axonometrica de la base circular (1), presentando claramente las dos ranuras (2a, 2b) escalonadas en altura, creadas con el fin de permitir que los dos tiras de papel graduado deslicen de forma independiente.
La figura 4 es una vista en planta superior de un colector de pinchado cruciforme desechable (5) en el que se destacan las siguientes caracteristicas: una aguja/punto central (6) con un diametro de 8 mm y una altura de 1,4 mm y cuatro agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) con un diametro de 6 mm y una altura de 0,4 mm, situados a una distancia de 7,5 mm desde el centro de la aguja/punto (6).
La figura 5 es una vista en alzado lateral del colector de pinchado cruciforme desechable (5) con un diametro de 20 mm, equipado con una aguja/punto (6) en el centro, que sirve, una vez insertado en el hueco circular apropiado (3), para pinchar y recoger las tiras de papel graduadas perfectamente cruzadas en un angulo de 90°, y equipado con
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cuatro agujas /puntos adicionales (6a, 6b, 6c, 6d) que sirven para evitar que las tiras giren durante la transferencia desde la base circular (1) hasta el cultivo bacteriano en la placa de Petri.
La figura 6 es una vista axonometrica del colector de pinchado cruciforme desechable (5) mostrando claramente dos bloques cruzados (7a, 7b) capaz de encajar de forma apropiada en las ranuras (2a, 2b) escalonadas en altura en la base circular (1), en el centro del cual hay una aguja/punto (6) y, existiendo cuatro agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) a una distancia de 7,5 mm desde el centro de la aguja/punto (6), y un pomo (7) con un diametro de 12 mm.
Description detallada de la invention
[0019] La invencion que es el objeto de la presente solicitud se refiere a un dispositivo que consta de una base circular (1) que sirve para el cruzado de dos tiras de papel graduadas y un colector de pinchado cruciforme desechable (5) que sirve para recoger y transferir las dos tiras de papel graduado, cada una de las cuales ha sido impregnada previamente con un gradiente de concentracion predefinido de un agente antimicrobiano, desde la base circular (1) 20 mm de altura con el fin de cruzar exactamente bajo un angulo de 90° en los puntos obtenidos como resultado de las respectivas CIM obtenidas anteriormente, con el fin de determinar una evaluacion de sinergia exacta, una vez que se han colocado en un medio de cultivo bacteriano.
[0020] La superficie de esta base circular (1) con un diametro de 124 mm, presenta dos ranuras (2a, 2b) que se cruzan bajo un angulo de 90° que tienen una seccion rectangular de 6 mm de ancho y estan escalonadas en altura.
[0021] La primera ranura (2a) a lo largo de la cual puede hacerse deslizar la primera tira de papel graduada (no mostrada), tiene una profundidad de 3,9 mm, mientras que la segunda ranura (2b) a lo largo de la que puede deslizarse la segunda tira de papel graduada (no mostrada) de forma independiente de la primera, tiene 3,6 mm de profundidad.
[0022] Este efecto de escalonado entre las dos ranuras cruzadas (2a, 2b) se corresponde exactamente con el espesor de una de las dos tiras de papel graduado y es por esta razon que las tiras, una vez colocadas en sus respectivas ranuras cruzadas ( 2a, 2b), puede deslizarse independientemente entre si ya que una desliza sobre la parte superior de la otra, de manera que las dos tiras se cruzan mutuamente de manera exacta en los puntos graduados que corresponden a los valores de concentracion inhibitoria minima (CIM), obtenidos anteriormente.
[0023] En la superficie superior de esta base circular (1) existe un hueco circular (3) de 0,7 mm de profundidad que sirve para facilitar el centrado del colector de pinchado cruciforme desechable (5) gracias a que sus dos bloques cruzados (7a, 7b) se ajustan de manera apropiada en las ranuras (2a, 2b) de la base circular (1); este colector de pinchado cruciforme desechable (5) tiene una aguja/punto (6) en el centro con un diametro de 8 mm y una altura de 1,4 mm, que sirve para pinchar y recoger las dos tiras de papel graduado de la base circular (1) y colocarlas en el medio de cultivo de bacterias en la placa de Petri.
[0024] Con el fin de facilitar la recogida de los dos tiras de papel graduado, se proporciona el montaje de otras cuatro agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) con un diametro de 6 mm y una altura de 0,4 mm para, dichos puntos estan posicionados a la misma distancia de 7,5 mm a partir del centro de la aguja/punto (6), con el fin de evitar la posible rotacion de las tiras alrededor de la aguja durante la transferencia.
[0025] Concentrica con el hueco circular (3) de la base circular (1) esta el hueco circular (4), que tiene un diametro de 4 mm y una profundidad de 5,4 mm, el proposito del es el de facilitar la penetracion de la aguja del colector de pinchado cruciforme desechable (5) en las dos tiras de papel graduado, para asi recogerlas de la base circular (1) y colocarlas en el agar de cultivo bacteriano, exactamente cruzadas en un angulo de 90 °. A la misma distancia de 7,5 mm desde el centro del hueco circular (4) de la base circular (1), existen cuatro huecos circulares (4a, 4b, 4c, 4d), que tienen un diametro de 2 mm y una profundidad de 1,5 mm, con el fin de, como anterior, facilitar la penetracion de las agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) del colector de pinchado cruciforme desechable (5) en los dos tiras de papel graduado. La humedad del agar cultivo bacteriano facilitara el desprendimiento de las dos tiras del colector de pinchado cruciforme desechable (5) sin el riesgo de su posicion a 90° experimente variaciones.
[0026] Una vez que las tiras mencionadas anteriormente liberan el antibiotico en el agar de cultivo bacteriano, se forma una elipse; despues de esto, basandose en los resultados de las CIM obtenidos a partir de la combinacion de las dos tiras graduadas, sera evaluado el efecto de los dos antibioticos combinados: efecto sinergico, antagonismo, indiferencia o, efecto aditivo.
[0027] Los materiales y las dimensiones de la invencion descrita anteriormente, que se ilustra en los dibujos adjuntos y mas tarde afirmo, pueden variarse segun las necesidades. Ademas, todos los detalles pueden ser sustituidos por otros tecnicamente equivalentes sin, por esta razon apartarse del alcance de proteccion de la solicitud de patente de invencion presente.

Claims (5)

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    REIVINDICACIONES
    1. Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves de la utilizacion de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado que comprende:
    • Una base circular (1) que sirve para el cruzado de dos tiras de papel graduado cada una impregnada con un gradiente de concentracion predefinido de un agente antimicrobiano y que tiene sobre su superficie dos ranuras (2a, 2b) que se cruzan bajo un angulo de 90°;
    • un colector de pinchado cruciforme desechable (5) que tiene dos bloques cruzados (7a, 7b) que ajustan apropiadamente en las ranuras (2a, 2b) cruzadas a 90 ° de la base circular (1) y que esta equipado en el centro con una aguja/punto (6) y cuatro agujas/puntos (6a, 6b, 6c, 6d) situados a la misma distancia desde el centro de la aguja/punto (6).
  2. 2. Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves de la utilizacion de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado como se reivindica en la reivindicacion 1, caracterizado porque el hecho que las dos ranuras (2a, 2b) cruzadas a 90° de la base circular (1), tienen una seccion rectangular de 6mm y estan escalonadas en altura, teniendo la primera ranura (2 a) una profundidad de 3,9 mm, mientras que la segunda ranura (2b) tiene una profundidad de 3,6 mm.
  3. 3. Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves de la utilizacion de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado como se reivindica en la reivindicacion 1, caracterizado porque el hecho que sobre la superficie superior de la base circular (1) existe un hueco circular (3) con un diametro de 20 mm y una profundidad de 0,7 mm para facilitar el centrado del colector de perforacion cruciforme desechable (5).
  4. 4. Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves de la utilizacion de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado como se reivindica en la reivindicacion 3, caracterizado porque el hecho que sobre la superficie superior de la base circular (1) existe un hueco circular (4) con un diametro de 4 mm y una profundidad de 5, 4 mm que es concentrico al hueco circular (3).
  5. 5. Dispositivo para la normalizacion del ensayo de sinergia in-vitro de dos antibioticos a traves de la utilizacion de tiras de gradiente mediante el procedimiento de cruzado como se reivindica en la reivindicacion 4, caracterizado porque el hecho que sobre la superficie superior de la base circular (1) equidistantes a 7,75 mm del centro del hueco circular (4), existen cuatro hueco circulares (4 a, 4b, 4c y 4d) con un diametro de 2 mm y una profundidad de 1,5 mm para facilitar el centrado del colector de perforacion cruciforme desechable (5).
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