ES2592452T3 - Moduladores de TGR5 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un compuesto, que tiene la fórmula C:**Fórmula** o una sal, solvato, hidrato, conjugado de glicina o conjugado de taurina del mismo, en la que: R2 es hidrógeno o hidroxilo; R4 es alquilo sin sustituir; y R16 es hidroxilo, alcoxi o halógeno.

Description

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La Figura 4 es una serie de 3 gráficos (A-C) que muestra los resultados del compuesto 10 de ensayo de citotoxicidad in vitro que mide la liberación de ATP después de 4 horas de estimulación usando intestino humano (NCI-H716). LCA es un control positivo. La Figura 5 es una serie de 3 gráficos (A-C) que muestra los resultados para el compuesto 10 de un ensayo de citotoxicidad in vitro que mide la liberación de ATP después de 4 horas de estimulación usando líneas celulares hepáticas (HepG2). LCA es un control positivo. La Figura 6 es un gráfico que representa la tensión superficial representada contra el logaritmo de la concentración de compuesto10 (mM) en NaCl 0,15 M. La Figura 7 es un diagrama de flujo biliar para un experimento de infusión en el duodeno realizado usando el compuesto 10. La Figura 8 es un diagrama del flujo biliar para un experimento de infusión femoral realizado usando el compuesto 10. La Figura 9 es un gráfico que representa las tasas de secreción frente al tiempo en experimentos de infusión femoral y duodenal realizados usando el compuesto 10. La Figura 10 es una serie de gráficos que muestra el compuesto 10 y su metabolito principal identificado en bilis usando espectrometría de masas en un experimento iv. Los datos se presentan como valores absolutos de área.

Descripción de la invención

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en la descripción adjunta a continuación. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción. En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen las plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. A menos que se define otra, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva.

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o una sal, solvato, hidrato, conjugado de glicina o conjugado de taurina del mismo, en la que R2 es hidrógeno o hidroxilo; R4 es alquilo sin sustituir; y R16 es hidroxilo, alcoxi o halógeno.

o una sal, solvato, hidrato, conjugado de glicina o conjugado de taurina del mismo, en la que R2, R4, y R16 son como se ha descrito anteriormente.

En un aspecto, la invención incluye un compuesto que tiene la fórmula E:

o una sal, solvato, hidrato, conjugado de glicina o conjugado de taurina del mismo, en la que R2 y R16 son como se ha descrito anteriormente.

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o una sal, solvato, hidrato, conjugado de glicina o conjugado de taurina del mismo.

En un aspecto, la invención incluye un compuesto, en el que el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención incluye una composición que comprende un compuesto o una sal, solvato, hidrato conjugado con glicina o conjugado con taurina del mismo y al menos un excipiente. En un aspecto, la invención incluye una composición que comprende un compuesto o una sal, solvato, hidrato conjugado con glicina o conjugado con taurina del mismo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto, la invención incluye el compuesto o una composición de la invención, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad en un sujeto. En otro aspecto, la invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en un sujeto administrando un compuesto o una composición de la invención. En un aspecto, la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención que se administra al sujeto. En un aspecto, la invención incluye una cantidad profilácticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención que se administra.

En un aspecto, la invención incluye el uso del compuesto o composición de la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto que implica la modulación del receptor TGR5. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad que implica la inducción del receptor TGR5 en un sujeto mediante la administración de un compuesto o composición de la invención.

En un aspecto, la invención incluye el uso, donde la enfermedad se selecciona de enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad hepática, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardíaca, enfermedad renal, cáncer y enfermedad gastrointestinal. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada de enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad hepática, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad cardíaca, enfermedad renal, cáncer y enfermedad gastrointestinal.

En un aspecto, la invención incluye el uso, donde la enfermedad es una enfermedad metabólica seleccionada de obesidad, diabetes, síndrome metabólico, resistencia a insulina, hipertensión y dislipidemia. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica seleccionada de obesidad, diabetes, diabesidad, síndrome metabólico, resistencia a insulina, resistencia prediabética a insulina, hipertensión y dislipidemia.

En un aspecto, la intención incluye el uso, donde la enfermedad es una inflamatoria seleccionada de alergia, osteoartritis, apendicitis, asma bronquial, pancreatitis, erupción alérgica y psoriasis. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad inflamatoria seleccionada de alergia, osteoartritis, apendicitis, asma bronquial, pancreatitis, erupción alérgica y psoriasis.

En un aspecto, la invención incluye el uso, donde la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria seleccionada de artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes tipo I. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmunitaria seleccionada de artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes tipo I.

En un aspecto, la invención incluye el uso, donde la enfermedad es una enfermedad gastrointestinal seleccionada de enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, o colitis ulcerante), síndrome del intestino corto (colitis posradiación), colitis microscópica, síndrome del intestino irritable (absorción deficiente) y crecimiento bacteriano excesivo. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de una enfermedad gastrointestinal seleccionada de enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn, colitis ulcerante), síndrome del intestino corto (colitis posradiación), colitis microscópica, síndrome del intestino irritable (absorción deficiente) y crecimiento bacteriano excesivo.

En un aspecto, la invención incluye el uso, donde la enfermedad es enfermedad renal seleccionada de nefropatía diabética, insuficiencia renal crónica, nefroesclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, glomerulopatía crónica por trasplante, nefritis intersticial crónica y enfermedad renal poliquística. La invención incluye un método de tratamiento o prevención de enfermedad renal seleccionada de nefropatía diabética, insuficiencia renal crónica, nefroesclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, glomerulopatía crónica por trasplante, nefritis intersticial crónica y enfermedad renal poliquística.

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monodosis de composición es una cantidad eficaz y se varía de acuerdo con el tratamiento particular implicado. Un experto en la materia apreciará que a veces es necesario hacer variaciones rutinarias a la dosificación dependiendo de la edad y estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contempla una diversidad de vías, incluyendo oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica de un compuesto de la invención incluye polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En otra realización, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, tampón o propulsor que sea necesario.

La expresión "dosis rápida" se refiere a formulaciones de compuestos que son formas de dosificación de rápida dispersión.

La expresión "liberación inmediata" se define como una liberación de compuesto a partir de una forma de dosificación en un período de tiempo relativamente breve, generalmente hasta aproximadamente 60 minutos. La expresión "liberación modificada" se define para incluir liberación retardada, liberación prolongada y liberación pulsada. La expresión "liberación pulsada" se define como una serie de liberaciones de fármaco desde una forma de dosificación. La expresión "liberación sostenida" o "liberación prolongada" se define como liberación continua de un compuesto desde una forma de dosificación durante un período prolongado.

Un "sujeto" incluye mamíferos, por ejemplo, seres humanos, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, aves y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, aves de corral y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, aves y similares). Típicamente, el sujeto es un ser humano.

La expresión "modulador de TGR5" significa cualquier compuesto que interacciona con el receptor TGR5. La interacción no está limitada a un compuesto que actúa como antagonista, agonista, agonista parcial o agonista inverso del receptor TGR5. En un aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un antagonista del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un agonista del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un agonista parcial del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un agonista inverso del receptor TGR5. El perfil de un ligando, tradicionalmente, endógeno sintético, se caracteriza por su eficacia intrínseca "e" descrita originalmente por Furchgott en 1966. Se usa para expresar el grado al cual los diferentes ligandos producen respuestas biológicas variables ocupando al mismo tiempo la misma cantidad de receptores. En líneas generales, el término "agonista" significa un compuesto que potencia la actividad de otra molécula o sitio receptor. Un agonista, por definición clásica, sea ortostérico, alostérico, inverso o coagonista tiene una propiedad de unirse al receptor, alterar su estado del receptor y provocar una acción biológica. Por consiguiente, el agonismo se define como una propiedad de un agonista o un ligando de producir una acción biológica. En contraste con esto, un "antagonista" es esencialmente un agonista con alta afinidad para la misma macromolécula de receptor, pero con eficacia intrínseca muy baja o insignificante, y por tanto evita estéricamente las acciones biológicas de un agonista. Como una propiedad, el antagonismo puede ser funcional o fisiológico, donde un agonista tiene una competición directa por el sitio del receptor en el primero y efectos opuestos mediante un sistema diferente de receptor-mensajero en el segundo. Más específicamente, una agonista de TGR5 es un ligando de receptor o compuesto que se une a TGR5 y aumenta la concentración de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) en al menos un 20 % en células que expresan el receptor. A la inversa, un antagonista de TGR5 sería un compuesto que antagoniza o bloquea la actividad de un agonista, logrando de ese modo una reducción en la concentración de AMPc.

La presente invención se refiere a compuestos que tienen actividad moduladora del receptor TGR5 y su uso para tratar y prevenir enfermedades metabólicas tales como obesidad y sensibilidad a insulina.

A continuación se muestra un compuesto de la invención.

Compuesto n.º

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La mención de publicaciones y documentos de patente no significa el reconocimiento de que todo pertenece a la técnica anterior, ni supone reconocimiento alguno en cuanto al contenido o fecha del mismo. Habiendo descrito ahora la invención por medio de una descripción escrita, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se

5 puede llevar a la práctica en una diversidad de realizaciones, y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes sirven de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLO 1: Síntesis de moduladores TGRS

10 Los compuestos de la invención, y derivados relacionados, pueden sintetizarse mediante métodos conocidos por un experto en la técnica.

Síntesis de sal sódica del ácido 3α,7α,16β-trihidroxi-6a-etil-5β-colan-24-oico (10)

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5,41 (1H, s a, 7-CH), 7,23 (1H, dd, J1 = 6,5 Hz, J2 = 6,7 Hz, 5'-H), 7,94 (1H, d, J = 6,7 Hz, 4'-H), 8,04 (1H, d, J = 6,5 Hz, 6'-H); 8,37 (1H, s, 2'-H). 13C RMN (CDCl3) δ: 11,6, 11,7, 18,2, 20,7, 21,7, 22,2, 23,1, 23,9, 26,8, 27,9, 29,6, 30,8 (x 2), 34,4, 35,1 (2 x), 35,5, 39,2, 39,3, 41,3, 42,9, 44,6, 50,6, 51,4, 55,3, 74,2, 74,5, 93,9, 128,9, 130,1, 132,4, 138,6, 141,6, 164,5, 170,3, 174,6.

3a-Acetoxi-6a-etil-7α-(3'-yodobenzoil)oxi-17a-cloro-5β-colan-24-oato de metilo (5)

A una solución de 4 (3,5 g, 4,95 mmol) en CH2Cl2 (280 ml) que contenía tBuOH 0,3 M (8,2 ml) se le añadió dicloroyodobenceno (3,38 g, 12,4 mmol). La mezcla se desoxigenó durante 3 min burbujeando N2 seco. Después, la mezcla se sometió a fotólisis a 0 ºC usando una lámpara de tungsteno (200 W) durante 1 h. Después, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó rápidamente por cromatografía ultrarrápida eluyendo con éter de petróleo/EtOAc (8:2, v/v) para producir 3,35 g (4,52 mmol, 92 %) del derivado de 17-cloro 5 en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CDCl3) δ: 0,81 (3H, s, 18-CH3), 0,91 (3H, d, J = 7,3 Hz, 21-CH3), 1,0 (6H, m, 19-CH3 + 26-CH3), 1,12-1,93 (24H, m), 2,03 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,18-2,25 (2H, m), 3,65 (3H, s, COOCH3), 4,57-4,62 (1H, m, 3-CH), 5,40 (1H, s a, 7-CH), 7,22 (1H, t, J = 7,79 Hz, 5'- H), 7,91 (1H, d, J = 7,76 Hz, 4'-H), 8,02 (1H, d, J = 7,7 Hz, 6'-H), 8,38 (1H, s, 2'-H). 13C RMN (CDCl3) δ: 11,6, 14,4, 14,5, 20,7, 21,6, 22,2, 23,1 (x 2), 26,7, 28,6, 29,4, 31,7, 34,2 (x 2), 35,1, 35,4, 39,6, 40,4, 41,1, 41,3, 44,6, 45,2, 49,9, 51,5, 74,1, 74,4, 92,9, 93,9, 128,8, 130,1, 132,3, 138,6, 141,7, 164,9, 170,7, 174,1.

A16 3α-Acetoxi-6α-etil-7α-(3'-yodobenzoil)oxi-5β-colan-24-oato de metilo (6)

El derivado de 17-cloro 5 (3,3 g, 4,46 mmol) se disolvió en piridina seca (130 ml) y se calentó a reflujo durante una noche. Después, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con 8:2 de éter de petróleo/EtOAc para producir 2,24 g (3,18 mmol, 72 %) de la olefina deseada en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CDCl3) δ: 0,75 (3H, s, 18-CH3), 0,89 (3H, t, J = 7,4 Hz, 21-CH3), 0,98 (3H, t, J = 6,5 Hz, 26-CH3), 1,03 (H, s, 19-CH3), 1,11-2,02 (22H, m), 2,05 (3H, s, 3-CHOC(O)CH3), 2,22- 2,30 (2H, m), 3,65 (3H, s, COOCH3), 4,58-4,62 (1H, m, 3-CH), 5,20 (1H, s a, 7-CH), 5,51 (1H, s, 16-CH), 7,21 (1H, t, J = 7,9 Hz, 5'-H), 7,90 (1H, dt, J1 = 7,9 Hz, J2 = 1,1 Hz, 4'-H), 8,02 (1H, dt, J1 = 7,9 Hz, J2 = 1,1 Hz, 6'-H), 8,37 (1H, t, J = 1,3 Hz, 2'-H). 13C RMN (CDCl3) δ: 11,6, 15,9, 20,6, 21,7, 21,8, 22,1, 23,1, 26,7, 29,6, 30,9, 31,1, 31,7, 32,2, 34,5, 34,9, 35,0, 35,7, 37,9, 41,3, 44,8, 47,5, 51,4, 51,7, 74,1, 74,7, 93,9, 121,4, 128,9, 130,1, 132,3, 138,6, 141,7, 158,5, 164,6, 170,7, 174,4.

3α,7α,16α,24-tetrahidroxi-6α-etil-5β-colano (7)

La olefina 6 (0,3 g, 0,42 mmol) se disolvió en BH3-THF (10,6 ml 1 M en THF) a 0 ºC y después se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de este tiempo la reacción se enfrió a 0 ºC y se añadió gota a gota una mezcla de NaOH acuoso 4 M (20 ml) y H2O2 (20 ml) y la mezcla resultante se agitó a esta temperatura durante 3 h. La reacción se acidificó con HCl 1 N y se extrajo con CH2Cl2 (3 x 60 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro y se evaporaron a sequedad a presión reducida. El residuo oleoso se disolvió en tolueno (52 ml), se añadió KOH al 5 % en MeOH (7 ml) y la mezcla resultante se calentó a reflujo durante una noche. El disolvente se retiró a presión reducida, el residuo se disolvió en agua (25 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro y se evaporaron a sequedad a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc/EtOH (95:5, v/v) para producir 0,085 g (0,2 mmol, 47 %) del tetrol deseado en forma de un sólido de color blanco. 1H RMN (CDCl3) δ: 0,64 (3H, s, 18-CH3), 0,85-0,91 (6H, m, 19-CH3 + 26-CH3), 0,92 (3H, d, J = 6,4 Hz, 21-CH3), 1,211,91 (21H, m), 3,33-3,35 (1H, m, 3-CH), 3,54-3,61 (3H, m, 7-CH + 24-CH2), 3,94 (1H, s a, 16-CH).13C RMN(CDCl3) δ: 11,7, 13,1, 14,1, 18,8, 20,4, 21,9, 22,4, 23,1, 28,7, 30,4, 31,8, 33,1, 33,5, 34,0, 35,4 (x 2), 35,5, 35,8, 39,5, 39,9, 41,3, 43,9, 45,3, 47,4, 62,6, 66,1, 70,6, 72,0.

3,7,16-Trioxo-6α-etil-5β-colan-24-oato de metilo (8)

Se añadió gota a gota reactivo de Jones (2 ml) a una solución agitada del tetrol 7 (0,19 g, 0,45 mmol) en acetona (25 ml) a 0 ºC y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después, se añadió metanol (8 ml) y el producto oxidado se extrajo con EtOAc (2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato sódico anhidro y se evaporaron a sequedad a presión reducida. El residuo se disolvió en MeOH (80 ml), se añadió pTSA y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se evaporó a presión reducida, el residuo se disolvió en CHCl3 (50 ml), se lavó con una solución saturada acuosa de bicarbonato sódico (2 x 50 ml), agua (50 ml) y salmuera (50 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro y se evaporó a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida usando EtOAc del 20 al 30 % en éter de petróleo para proporcionar el éster metílico 8 (0,115 g, 0,26 mmol, 58 %) en forma de un sólido de color blanquecino.1H RMN (CDCl3) δ: 0,82 (3H, s, 18-CH3); 0,85 (3H, m, 26-CH3); 1,0 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3); 1,37 (3H, s, 19-CH3); 1,55-2,35 (23H,m); 2,63-2,87 (2H, m).

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cada gen diana. El valor de cuantificación relativa se expresó y se muestra como 2-∆∆CT. Todos los cebadores de PCR abarcaban intrones diseñados usando el software Beacon Designer sobre los datos de secuencia publicados de la base de datos NCBI. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 2C: Citotoxicidad in vitro del compuesto 10 en líneas celulares intestinales y hepáticas humanas

Se midió la viabilidad celular usando Perkinelmer ATP-Lite 1 STEP. El ATP es un marcador para la viabilidad celular porque está presente en todas las células metabólicamente activas y la concentración disminuye muy rápidamente cuando las células experimentan necrosis o apoptosis. Se sembraron células humanas NCI-H716 o HepG2 (1x104) en placas de 96 pocillos y se estimularon con diluciones de factor 10 de 1 nM a 300 µM del compuesto 10 durante 4 h a 37 ºC. Las placas se equilibraron a TA durante 10 minutos y se añadieron 100 µl de reactivo ATP-Lite 1 STEP a 100 µl de medio de cultivo que contenía células. Se leyó la luminiscencia con Victor Light (PerkinElmer). La señal experimental se restó del fondo. Se usó tamoxifeno como control positivo de citotoxicidad celular, mientras que las células no tratadas sirvieron como control negativo. Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5.

Ejemplo 3: Actividades metabólicas de compuestos de la invención en un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta

El objetivo del estudio es definir si agonistas de TGR5 (ácido oleanólico (OA) o compuesto de la invención (por ejemplo, un "compuesto de ensayo")) corrigen el desarrollo de la obesidad y la resistencia a la insulina asociada in vivo. Para ensayar esta posibilidad, se administró OA/compuesto de ensayo mediante administración en la comida durante 16 semanas a ratones C57BL6J macho que previamente se sometieron durante 10 semanas a una dieta alta en grasas.

II-Protocolo

En un estudio previo, se observó OA como agonista selectivo de TGR5 que no causaba aversión a la comida. Los animales tratados con una dosis de 100 mg/kg/día de OA mostraron, sin embargo, algunos signos de toxicidad, mientras que una dosis inferior era bien tolerada. Por lo tanto, se administra OA a la dosis de 50 mg/kg/día en este estudio.

Estudios in vitro han identificado compuestos de la invención como ligandos potentes y selectivos de TGR5. No se esperan problemas con la toxicidad con compuestos de la invención, que se administran a una concentración ~50 veces inferior.

Para este estudio, 48 ratones C57BL6J macho (5 semanas de edad) se dividen en dos grupos: un grupo de 24 (grupo 1, 2 y 3) animales recibe dieta de pienso mientras que el otro grupo de 24 recibe una dieta alta en grasas durante un período de 10 semanas (grupo 4, 5 y 6). Los animales después se analizan durante un período de 16 semanas. Cinco grupos de 10 animales se asignaron del siguiente modo:

1: dieta de pienso

2: dieta de pienso + OA 50 mg/kg/día

3: dieta de pienso + compuesto de ensayo, por ejemplo, 30 mg/kg/día

4: dieta alta en grasas

5: dieta alta en grasas + OA 50 mg/kg/día

6: dieta alta en grasas + compuesto de ensayo, por ejemplo. 30 mg/kg/día

Durante el estudio completo, se controló el peso corporal y la ingesta de comida dos veces a la semana.

Semana -2: Se analiza la composición corporal, para todos los grupos, por absorciometría de rayos-X de energía dual (dexascan).

Semana -1: se miden los niveles en suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos después de un período de ayunas de 12 h y los ratones después se asignan a las dietas indicadas (día 0).

Semana 2: Se miden los niveles en suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos después de un período de ayunas de 12 h (día 14).

Semana 4: Se determina la tolerancia de glucosa sometiendo a todos los animales a un ensayo de tolerancia a glucosa intraperitoneal (IPGTT). Los animales se dejan en ayunas durante 12 h antes de este ensayo. Se mide el gasto de energía nocturna de los grupos 1, 4, y 6 (dieta de pienso, dieta alta en grasas y dieta alta en grasas OA/compuesto de ensayo por calorimetría indirecta.

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Semana 8: Se analiza de nuevo la composición de peso corporal por dexascan para todos los grupos. Se miden los niveles en suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos después de un período de ayunas de 12 h (día 56).

Semana 9: Se estudia la actividad circadiana de los grupos 4, 5 y 6 (animales alimentados con dieta alta en grasas) durante un período de 30 h.

Semana 10: Se realiza la medición de la presión sanguínea y el ritmo cardíaco en los grupos 4, 5 y 6.

Semana 11: Se mide la temperatura rectal de todos los animales a temperatura ambiente a las 10:00 a.m. La medición de la actividad circadiana se realiza en los grupos 1, 2, 3 y 4.

Semana 12: Se analiza la tolerancia de glucosa realizando un ensayo de tolerancia de glucosa intraperitoneal (IPGTT) en los grupos 4, 5 y 6. Durante el IPGTT, también se recoge sangre para analizar los niveles de insulina. Los animales se dejan en ayunas 12 h antes de estos ensayos. Se recogen heces en todos los grupos durante un período de tiempo de 24 h y se mide el contenido de lípidos fecales.

Semana 16: Se realiza ensayo frío en todos los animales midiendo la temperatura corporal de animales expuestos a 4 ºC.

Tres días después, los animales se sacrificaron. En el sacrificio, se recoge sangre y se analiza para: lípidos en plasma (TC, TG, HDL-C, FFA); funciones hepáticas (ALAT, ASAT, Pasa alcalina, y-GT); glucosa e insulina; perfiles de lipoproteínas de grupos seleccionados de plasma (cromatografía por exclusión de tamaño).

Se recogen el hígado, intestino delgado, tejidos adiposos (WAT y BAT), páncreas, corazón y músculo, se pesan y se mantienen para análisis adicionales incluyendo: histología convencional (tinción HE, tinción con succinato deshidrogenasa, tinción con aceite rojo-O y morfología celular); el contenido de lípidos tisulares; microscopia electrónica en BAT y músculo para analizar las mitocondrias; aislamiento de ARN para estudios de expresión de genes seleccionados implicados en el metabolismo y homeostasis energética por RT-PCR cuantitativa; extracción de proteínas para el estudio de modificaciones postraduccionales tales como acetilación de proteínas de interés (por ejemplo, PGC-1α).

III-Procedimientos detallados

A-Procedimiento en animales y dietas

Alojamiento y manipulación de animales

Los ratones se alojaron en grupos (5 animales/jaula) en condiciones sin patógenos específicos con un ciclo de luzoscuridad de 12 h:12 h (activado a las 7:00), en un vivario de temperatura (20-22 ºC) y humedad controladas, de acuerdo con las especificaciones de la Comunidad Europea. Se permitió a los animales acceso libre al agua y al alimento.

Agua para beber

La composición química del agua corriente se analiza de forma regular para verificar la ausencia de sustancias tóxicas potenciales en el Institut d’Hydrologie, ULP, Estrasburgo. El agua para beber se trata con HCl y HClO4 para mantener el pH entre 5 y 5,5 y la concentración de cloro entre 5 y 6 ppm.

Dieta

La dieta de pienso de roedores convencional se obtiene de UAR y la dieta alta en grasa se obtiene de Research Diet. Los ratones se alimentan, con dieta de pienso (proteínas al 16 %, grasas al 3 %, fibras al 5 %, cenizas al 5%) o con dieta alta en grasas (proteínas al 20 %, carbohidratos al 20 %, grasas al 60 %). Se mezclan ácido oleanólico y compuesto de ensayo con la dieta de pienso pulverizada o la dieta alta en grasas pulverizada en las siguientes proporciones: 0,5 g de OA/kg de alimento para el tratamiento de 50 mg/kg/día y 0,08 g de compuesto de ensayo/kg de alimento para el tratamiento de 10 mg/kg/día. Los gránulos después se reconstituyen. Los grupos de control reciben gránulos de alimento sin compuesto de ensayo u OA. Debido a la consistencia de la dieta alta en grasas, no se añade agua en la mezcla con OA. En el caso de la dieta de pienso, que es más difícil de reconstituir, se añade una cantidad mínima de agua al polvo para reconstituir los gránulos, que después se secan al aire. Se preparan semanalmente lotes nuevos de alimento.

Recogida de sangre

La sangre se recoge del seno retroorbital con anestesia o de la vena de la cola.

5

15

25

35

45

55

65

Anestesia

Para el experimento dexascan, los animales se anestesian con una mezcla de ketamina (200 mg/kg) / xilazina (10 mg/kg) administrada por inyección intraperitoneal. Para la venipunción, se anestesia a los animales por inhalación de una mezcla de isoflurano-O2.

B-Bioquímica

Los ensayos se realizan con una estación de trabajo de laboratorio automatizada Olympus AU-400 usando reactivos comerciales (Olympus).

Análisis de lípidos y lipoproteínas

Se determinan los triglicéridos, colesterol total y HDL en suero por ensayos enzimáticos. El contenido de colesterol HDL en suero se determina después de la precipitación de lipoproteínas que contienen apo B con ácido fosfotúngstico/Mg (por ejemplo, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El nivel de ácidos grasos libres se determina con un kit de Wako (por ejemplo, Neuss, Alemania) como se especifica por el proveedor.

Exploración metabólica y endocrina

La concentración de glucosa en sangre se mide por un analizador Precision Q.I.D (por ejemplo, sistema Medisense), usando electrodos Medisense Precis (por ejemplo, Abbot Laboratories, productos Medisense, Bedford, EE.UU.). Este método se valida, por comparación de los valores del analizador Precision Q.I.D con mediciones clásicas de glucosa. El método Precision Q.I.D se eligió ya que requiere una cantidad mínima de sangre y, por tanto, puede emplearse para múltiples mediciones tales como durante un IPGTT. La insulina en plasma (por ejemplo, Mercodia, Uppsala, Suecia) se determina por ELISA de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

C-Ensayo metabólico

Perfiles de lipoproteínas

Los perfiles de lipoproteínas se obtienen por cromatografía líquida rápida de proteínas, que permite la separación de las tres clases principales de lipoproteínas VLDL, LDL, y HDL.

Ensayo de tolerancia de glucosa intraperitoneal (IPGTT) - Ensayo de tolerancia a glucosa oral

Se realiza IPGTT en ratones que se han dejado en ayunas durante una noche (12 h). A los ratones se les inyecta por vía intraperitoneal (IPGTT) una solución de glucosa al 20 % en solución salina estéril (NaCl al 0,9 %) a una dosis de 2 g de glucosa/kg de peso corporal. Se recoge sangre de la vena de la cola, para el control de la glucosa y la insulina, antes y 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 min después de la administración de la solución de glucosa- el área de incremento de la curva de glucosa se calcula como una medida de la sensibilidad a insulina, mientras que los niveles correspondientes de insulina indican reservas de secreción de insulina.

Gasto de energía

El gasto de energía se evalúa a través de calorimetría indirecta midiendo el consumo de oxígeno con el aparato Oxymax (por ejemplo, Columbus Instruments, Columbus, OH) durante 12 h. este sistema consiste en un circuito abierto con aire que entra y sale de las jaulas de plástico (un ratón por jaula). Se permite a los animales acceso libre al alimento y al agua. Un detector muy preciso de CO2 y O2 mide la diferencia en las concentraciones de O2 y CO2 en ambos volúmenes de aire, lo que da la cantidad de oxígeno consumida en un período de tiempo dado que el flujo de aire del aire proveniente de la jaula es constante. Los datos provenientes del aparato se procesan en un ordenador conectado, se analizan y se muestran en un archivo Excel exportable. Los valores se expresan como ml.kg-1.h-1, que se conoce habitualmente como el VO2.

Determinación del contenido de grasa corporal por Dexascan

Los análisis Dexa se realizan por el densitómetro de resolución ultra alta de la serie PIXIMUS (píxeles de 0,18 x 0,18 mm, GE Medical Systems, Madison, WI, EE.UU.). La densidad de minerales en hueso (BMD en g/cm2) y la composición corporal se determinan usando el software PIXIMUS (versión 1.4x, GE Medical Systems).

D-Medición no invasiva de la presión sanguínea y el pulso

El sistema de análisis de presión sanguínea Visitech BP-2000 es un sistema de manguito en la cola automatizado por ordenador que se usa para recoger múltiples mediciones en 4 ratones despiertos simultáneamente sin intervención del operario. Los ratones están contenidos en cámaras oscuras individuales en una plataforma calentada con sus colas enroscadas a través de un manguito en la cola. El sistema mide la presión sanguínea

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5

15

25

35

45

55

65

Se empleó cromatografía en capa fina (TLC), utilizando placas de gel de sílice de 0,25 mm de grosor (Merck, Darmstat, Alemania), como el primer ensayo de exploración. El sistema disolvente usado para la separación de BA conjugado estaba compuesto de ácido propiónico/acetato isoamílico/agua/N-propanol (3:4:1:2, v/v/v/v; disolvente I), y el del BA no conjugado era ácido acético/tetracloruro de carbono/éter isopropílico/acetato isoamílico/agua/Npropanol/benceno (1:4:6:8:2:2, v/v/v/v/v/v; disolvente II). El BA separado se reveló con solución en etanol de ácido fosfomolíbdico al 5 %.

El compuesto 10 era muy estable cuando se incubaba en cultivos de deposiciones humanas y, incluso después de 24 horas, más del 85 % del compuesto se recuperaba sin modificar. Por el contrario, el análogo natural de referencia quenodesoxicólico (CDCA) presentaba un tiempo de semivida de casi 1 hora y después de 8 horas de incubación se había metabolizado casi completamente (7-deshidroxilado) para formar ácido litocólico. Además, después de un largo tiempo de incubación, la 7 deshidroxilación y la formación de intermedio de un derivado 7 oxo estaba prácticamente anulada.

Estabilidad de cadena lateral

De acuerdo con los primeros resultados, la cadena lateral no se modificaba por las actividades enzimáticas de las bacterias intestinales.

Estos datos sugieren que la presencia del grupo etilo en la posición C-6 protege el grupo 7-hidroxilo hacia la oxidación o retirada por impedancia estérica. Además, el compuesto 10 también es muy estable para el metabolismo de cadena lateral.

Ejemplo 6: Secreción biliar y metabolismo del compuesto 10 en rata con fístula biliar después de administración duodenal (id) y femoral (iv)

Objetivo y fundamento

La modificación estructural de los nuevos análogos de BA podría afectar a su captación hepática, los transportadores hepáticos y la secreción y absorción intestinal. Por lo tanto, el conocimiento de la secreción biliar después de administración iv e id junto con su metabolismo es un punto clave en la selección de candidatos para estudios adicionales.

Para evaluar el modo y eficacia de la absorción intestinal, el compuesto 10 se administró de forma intravenosa (infusión femoral) y por vía oral (infusión duodenal) a la misma dosis y se evaluó su tasa de secreción biliar en el modelo de rata con fístula biliar. También se evaluó el efecto colerético sobre la producción de bilis. Las diferencias en el área bajo la curva (AUC) de la secreción biliar frente al tiempo entre la administración iv e id justifica su absorción intestinal y da información acerca de su biodisponibilidad. Además, el metabolismo hepático e intestinal también podría ser bastante diferente y, por lo tanto, la secreción biliar de compuesto 10 y se determinaron sus metabolitos principales (intestinales) y hepáticos.

Efecto colerético

-Infusión duodenal

El modelo de rata con fístula biliar se desarrolló en las instalaciones del University of Bologna Lab. Los compuestos se administraron a una dosis de 1 µmol/kg/min (infusión de 1 hora) a un grupo de ratas mediante infusión duodenal (id). Las ratas tenían una fístula biliar para recoger muestras de bilis en diferentes momentos antes y durante la infusión. Para el experimento de infusión duodenal, se trataron 6 ratas (250±10 g). Las muestras de bilis se recogieron cada 15 minutos durante 4 horas. Además, 3 ratas de control se trataron con solución salina en las mismas condiciones para los tiempos y el muestro (ratas de control duodenal).

La Figura 7 muestra el flujo de bilis durante la recogida de muestras (un animal). La infusión duodenal empieza después de 30 minutos de la recogida de bilis inicial y continúa durante 1 hora. El compuesto 10 no es colerético y el flujo de bilis es similar al grupo de control.

-Infusión intravenosa

Para el experimento de infusión femoral, se trataron 6 ratas (peso corporal, 250 ± 10 g) con compuesto 10 a 1 µmol/min/kg. La Figura 8 muestra el flujo de bilis durante el estudio. La infusión femoral empieza después de 75 minutos de régimen permanente y continúa durante 60 minutos. Las muestras de bilis se recogieron cada 15 minutos cada 4 horas. Además, 3 ratas se trataron con solución salina en las mismas condiciones para los tiempos y el muestreo (ratas de control femoral).

El flujo de bilis durante la infusión iv de vehículo de solución salina BSA al 3 % (control, n = 1) mantuvo un valor que variaba de 40 a 80 µl/min/kg durante el periodo completo del experimento. La Figura 8 presenta el flujo de bilis

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La Tabla 4 muestra los valores de concentración y secreción para el compuesto 10 obtenidos de muestras de bilis de rata recogidas durante la infusión femoral (1 h que varía de 75 a 135 min).

Tabla 4.

Tiempo (min)

Conc. (mmol/l) Secreción (µmol/kg/min)

75

0,04 0,002

90

2,3 0,127

120

0,90 0,065

150

0,06 0,004

180

0,04 0,003

210

0,02 0,001

240

n.d.b a-

a-: no calculado n.d.b: no detectado

5 La secreción biliar de compuesto 10 después de infusión iv no es eficaz y la tasa de secreción máxima es baja (Fig. 9). El compuesto se metaboliza para formar el conjugado con taurina y esto contribuye a mejorar ligeramente su recuperación. La secreción biliar después de administración id es mucho menor que los experimentos iv, lo que sugiere una mala absorción intestinal de la molécula.

10

Metabolismo hepático

El compuesto 10 experimenta un metabolismo hepático como el BA de origen natural. Después de administración iv se secreta en la bilis tal cual y se conjuga principalmente con taurina. También se han encontrado metabolitos

15 minoritarios tales como los metabolitos lactona y monoglucurónido. Después de administración id, la molécula se recupera tal cual y se metaboliza principalmente para formar los conjugados con taurina. Figura 10a: Compuesto 10 y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masas en el experimento iv. Los datos se presentan como valores absolutos de área. Figura 10b: Presentación ampliada de la Figura 10a.

20 Figura 10c: Compuesto 10 y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masas en el experimento id. Los datos se presentan como valores absolutos de área.

El compuesto 10 es moderadamente hidrófilo con una baja detergencia. La captación hepática es eficaz y también la absorción intestinal. El compuesto se secreta en bilis tal cual y principalmente como conjugado con taurina y la 25 recuperación en la bilis es casi completa.

Ejemplo 7: Toxicidad in vitro sobre células HepG2

Los compuestos de la invención se evaluaron para toxicidad in vitro usando un ensayo de células HepG2. Se 30 determinó la citotoxicidad en células HepG2 controlando la disminución de ATP y se determinó la apoptosis de células HepG2 controlando la activación de caspasa-3. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Citotoxicidad

35 Se midió la viabilidad celular usando Perkinelmer ATP-Lite 1 STEP. El ATP es un marcador para la viabilidad celular porque está presente en todas las células metabólicamente activas y la concentración disminuye muy rápidamente cuando las células experimentan necrosis o apoptosis. Se sembraron células humanas NCI-H716 o HepG2 (1x104) en placas de 96 pocillos y se estimularon con diluciones de factor 10 de 1 nM a 300 µM del compuesto 10 durante 4 horas a 37 ºC. Las placas se equilibraron a TA durante 10 minutos y se añadieron 100 µl de reactivo ATP-Lite 1

40 STEP a 100 ATP-Lite 1 STEP de medio de cultivo que contenía células. Se leyó la luminiscencia con Victor Light (PerkinElemr). La señal experimental se restó del fondo. Se usó tamoxifeno como control positivo de citotoxicidad celular, mientras que el control negativo eran las células no tratadas.

Apoptosis

45 Las caspasas participan en el control molecular de la apoptosis y el sustrato de Caspasa-3 TruPoint posibilita un ensayo de fluorescencia resuelto en el tiempo sensible, robusto y homogéneo para la actividad caspasa-3.

Se sembraron células de hepatocitos humanos (HepG2) (1x104) en placa de 96 pocillos con medio de HepG2 sin

50 piruvato sódico. Las células se estimularon 4 horas a 37 ºC con diluciones en serie de compuesto de ensayo de 1 nM a 300 µM por triplicado. Se usó estaurosporina como control positivo de células apoptóticas. Los controles negativos fueron: 1. Células no estimuladas; 2. Medio solo sin células; 3. Células incubadas sin el sustrato de caspasa. Se añadieron tampón de lisis y sustrato de caspasa-3 a las células y 1 hora y 24 horas después se midió la fluorescencia con EnVision.

55

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Claims (1)

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