ES2590757T3 - Péptidos que se dirigen al receptor activador del factor nuclear kappa B (Rank) y sus aplicaciones - Google Patents
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Abstract
Polipéptido aislado que consiste en una secuencia de hasta 20 aminoácidos, en el que dicha secuencia comprende o consiste en una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: - SEC ID nº 32; y - una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con SEC ID nº 32 a lo largo de la longitud total de SEC ID nº 32; para la utilización como un medicamento en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad de resorción ósea.
Description
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El biomaterial puede seleccionarse de entre el grupo que consiste en cerámica fosfocálcica (por ejemplo hidroxiapatito (HAP) y fosfato beta-tricálcico), polímeros (por ejemplo copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, hidrogeles), materiales de origen natural (por ejemplo celulosa y colágeno), particularmente cerámica fosfocálcica y todavía más particularmente, cerámica fosfocálcica que consiste en 40% de fosfato beta-tricálcico y 60% de hidroxiapatito.
Las cerámicas de hidroxiapatito HAP) y de fosfato tricálcico (en particular el fosfato beta-tricálcico) presentan la ventaja de ser bioresorbibles y osteoconductoras.
La composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral puede formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de Hank, la solución de Ringer o la solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como la carboximetilcelulosa sódica, el sorbitol y el dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse en forma de suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Entre los solventes o vehículos lipofílicos adecuados se incluyen los aceites grasos, tales como el aceite de sésamo o los ésteres de ácido graso sintéticos, tales como el oleato de etilo o los triglicéridos, o los liposomas. También pueden utilizarse polímeros amino policatiónicos no lipídicos para la administración. Opcionalmente, la suspensión puede contener además estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
La invención se refiere además a un polipéptido aislado según la invención para la utilización en un método para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad de la resorción ósea que comprende la etapa de administrar en un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un polipéptido aislado según la invención, una molécula aislada de ácidos nucleicos según la invención y un vector según la invención. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La presente exposición describe además un método para inhibir la osteoclastogénesis que comprende la etapa de administrar en un paciente que lo requiere, en particular en un paciente que presenta una enfermedad ósea y más particularmente en un paciente que presenta una enfermedad de la resorción ósea, una cantidad terapéuticamente eficaz de por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un polipéptido aislado según la invención, una molécula aislada de ácidos nucleicos según la invención y un vector según la invención. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a un polipéptido aislado según la invención para la utilización como medicamento. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a una molécula aislada de ácidos nucleicos según la invención para la utilización como medicamento. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a un vector según la invención para la utilización como medicamento. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a la utilización de un polipéptido aislado según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad ósea, en particular una enfermedad de la resorción ósea. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a la utilización de una molécula aislada de ácidos nucleicos según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad ósea, en particular una enfermedad de la resorción ósea. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a la utilización de un vector según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad ósea, en particular una enfermedad de la resorción ósea. Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
La invención se refiere además a un producto de combinación que comprende:
-por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un polipéptido aislado según la invención, una molécula aislada de ácidos nucleicos según la invención y un vector según la invención, y
-otro agente antirresorción ósea,
para la utilización simultánea, separada o secuencial como medicamento.
Las formas de realización ventajosas son las definidas anteriormente.
8
- Nombre del polipéptido
- Secuencia de aminoácidos Modificaciones* % de identidad respecto a SEC ID nº 32 en toda la longitud de SEC ID nº 32, de una secuencia comprendida en el polipéptido % de identidad respecto a SEC ID nº 33 en toda la longitud de SEC ID nº 33, de una secuencia comprendida en el polipéptido % de identidad respecto a SEC ID nº 1, en toda la longitud de SEC ID nº 1, de una secuencia comprendida en el polipéptido SEC ID nº
- Pep822
- LKLCS N-(IPEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 1
- Pep8
- NVLKLCSGE N-(IPEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 2
- Pep801
- ELANVLKLCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 3
- Pep802
- NVLKLCSGEAY N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 4
- Pep803
- ELANVLKLCSGEAY N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 5
- Pep804
- NVLKLCSGEAYR N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 6
- Pep805
- NVLKLACSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 83% 83% 83% 7
- Pep806
- NVLKLCSE N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 8
- Pep808
- NVLKFCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 80% 9
- Pep809
- NVIKLCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 80% 80% 80% 10
- Pep810
- NVLKLCHGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 80% 80% 80% 11
- Pep811
- ENVLKLCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 12
- Pep812
- NALKLFCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 13
- Pep813
- EVLKLCSGN N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 14
- Pep814
- NALKLCSGEMR N-(PEG)5 / N(PEG)8 100% 100% 100% 15
- Pep815
- NALKLFCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 83% 83% 83% 16
- Pep816
- NALKLFCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 83% 83% 83% 17
- Pep817
- NALRLCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 80% 80% 80% 18
- Pep818
- NALHLCSGE N-(PEG)5 / N(PEG)8 80% 80% 80% 19
- Pep819
- NALFLCSGE N-(PEG)5/ N(PEG)8 80% 80% 80% 20
- Pep820
- NALHLCSGE N-(PEG)5/ N(PEG)8 80% 80% 80% 21
- Pep823
- YCNVLKLCSGECY N-(PEG)5/ N(PEG)8 100% 100% 100% 22
- Pep824
- NALKHCSGE N-(PEG)5/ N(PEG)8 100% 100% 80% 23
- Pep501
- ELASFLKISQLG N-(PEG)5/ N (PEG)8 X** X** X** 24
- Pep401
- ELASFNKITQLG N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 25
- Pep402
- ELASFNRITQLG N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 26
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10
15
20
25
30
35
40
- Nombre del polipéptido
- Secuencia de aminoácidos Modificaciones* % de identidad respecto a SEC ID nº 32 en toda la longitud de SEC ID nº 32, de una secuencia comprendida en el polipéptido % de identidad respecto a SEC ID nº 33 en toda la longitud de SEC ID nº 33, de una secuencia comprendida en el polipéptido % de identidad respecto a SEC ID nº 1, en toda la longitud de SEC ID nº 1, de una secuencia comprendida en el polipéptido SEC ID nº
- PepA17
- WLETRLTNHMELQ N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 27
- PepA18
- AKFHGELMADQWQ N-(PEG)5/ N (PEG)8 X X X 28
- PepA19
- NEMDLPKKSCLMN N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 29
- PepA20
- WAARLGDPT N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 30
- Pep1
- ELASYIIITQLG N-(PEG)5/ N(PEG)8 X X X 31
* Modificaciones evaluadas para mejor la estabilidad y biodisponibilidad de los péptidos.
** Datos no calculados.
II.3 Capacidad cinética de unión de los polipéptidos inhibidores
Se estudió la unión de los polipéptidos a RANK utilizando la resonancia del plasmón superficial (figura 1C). Varios polipéptidos se unieron a RANK inmovilizado de una manera dependiente de la dosis; en la presente memoria se proporciona Pep1 (SEC ID nº 33). Basándose en la cinética de asociación y disociación obtenida utilizando un modelo de Langmuir 1:1 para las interacciones bimoleculares simples, la afinidad de unión medida (Kd) de Pep1 (figura 1) a RANKh fue de 20,6 µM (kon=1,35x101 M-1 s-1, koff=2,78x10-4 s-1). El polipéptido de la invención Pep8 se unió a RANK con una Kd de 10,5 µM y se estimaron las constantes aparentes de asociación (kon) y de disociación (koff) en 4,95x102 M-1 s-1 y 5,20x10-3 s-1, respectivamente.
Dichos resultados demuestran que la afinidad de unión (Kd) del polipéptido de la invención, Pep8, a RANKh es mayor que la de otros polipéptidos sometidos a ensayo, tales como Pep1.
II.4 Pep8 inhibe la formación de osteoclastos inducida por RANKL
A continuación se examinó la actividad inhibidora del polipéptido de la invención, Pep8, más en detalle sobre la formación de osteoclastos inducida por RANKL en CD14+ humanas, así como en células CD11b+ murinas de ratones C57/bl6. RANK de ratón y humana mostraba una identidad de secuencia de aminoácidos de 77%; por lo tanto, los inventores predijeron que los polipéptidos generados sobre RANK humana también inhibirían el homólogo de receptor de ratón y por lo tanto podrían someterse a ensayo en modelos de ratón de pérdida ósea.
Pep8 provocó una reducción dependiente de la dosis del número de células multinucleadas positivas para TRAP formadas en células CD14+ humanas (figuras 2A y B), así como en cultivos celulares murinos (datos no mostrados). En presencia de Pep8 100 µM, el número de células multinucleadas positivas para TRAP era de 39% y 28% del número formado en cocultivos humanos o murinos, respectivamente, realizados sin el polipéptido. La IC50 de Pep8 era de 40 µM para las CD14+ humanas y de 30 µM para las células CD11b+ murinas. Pep8 solo, en ausencia de RANKL, no moduló el desarrollo de los osteoclastos (datos no mostrados).
Pep8 no presentaba toxicidad intrínseca, ya que no se observó efecto citotóxico de Pep8 100 µM sobre los monocitos o células RAW264.7 de tipo macrófago murinas (datos no mostrados), ni el polipéptido a 100 µM mostró ningún efecto sobre la mineralización de las células madre mesenquimales (CMM), tal como puso de manifiesto la tinción de rojo Alizarin (datos no mostrados).
De esta manera, estos datos sugieren que Pep8 anula la osteoclastogénesis inducida por RANKL sin producir citotoxicidad.
Con el fin de elucidar adicionalmente la función de Pep8 sobre la diferenciación de los osteoclastos, los inventores examinaron su efecto sobre la expresión génica de la catepsina K, TRAP y el factor nuclear de las células T
17
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