ES2589884T3 - Derivados de ácido aspártico - Google Patents

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ES2589884T3 ES14003926.4T ES14003926T ES2589884T3 ES 2589884 T3 ES2589884 T3 ES 2589884T3 ES 14003926 T ES14003926 T ES 14003926T ES 2589884 T3 ES2589884 T3 ES 2589884T3
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Julian Willibald
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Abstract

Compuestos de las fórmulas Ia y/o Ib**Fórmula** en las que R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis átomos de carbono, R4 representa un grupo benciloxicarbonilo, 9-fluorenil metiloxicarbonilo o H.

Description

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DESCRIPCION
Derivados de acido aspartico Campo de la invencion
La presente invencion esta dirigida a derivados de acido aspartico con un nuevo tipo de grupo protector de cadena lateral. La presente invencion esta dirigida ademas a metodos de su preparacion y su uso en slntesis de peptidos en fase solida a base de Fmoc as! como la slntesis de peptidos en solucion a base de Z/tBu. El uso de derivados de acido aspartico de acuerdo con la presente invencion conduce a la minimizacion de formacion de aspartimida catalizada por base durante la slntesis de peptidos y soporta la prevencion de impurezas derivadas de aspartimida.
Fundamento de la invencion
Los peptidos pueden ser fabricados por slntesis en fase solida. Una aproximacion ampliamente usada de fabricacion de peptidos es la slntesis de peptidos en fase solida a base de Fmoc/tBu (Fmoc SPPS), que involucra el uso de proteccion con 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) para los bloques de construccion de alfa aminoacido. Con ello se protegen los grupos funcionales de cadena lateral en aminoacidos trifuncionales, mediante grupos que son labiles a los acidos como esteres de ferf-butilo, dejando abierto solo el extremo C para elongacion gradual especlfica de cadena de peptidos. Para ensamblar el peptido del extremo C al extremo N, se inmoviliza el primer aminoacido terminal en C sobre un soporte solido, como una resina de poliestireno entrecruzado. Un ciclo que puede ser automatizado de eliminacion de la proteccion de Fmoc y formacion de enlace peptido facilita el ensamblaje del peptido. Se aseguran las conversiones completas en la formacion de enlace amida, mediante un exceso del aminoacido Fmoc y reactivo de acoplamiento in-situ (vease Sheppard. R.C. J. Peptide Sci., 9:545- 552(2003)).
Ademas, los peptidos pueden ser fabricados a traves de slntesis convergente. Mediante Fmoc SPPS se ensamblan fragmentos de peptidos que tienen en su mayorla seis a diez aminoacidos de longitud o alternativamente en solucion donde se usa predominantemente la proteccion (Z) benciloxicarbonilo del extremo N.
Entre todas las reacciones laterales en la Fmoc SPPS as! como en la slntesis en solucion a base de Z, la aparicion de aspartimida es uno de los problemas mas severos (vease Subiros-Funosas R. et al., Tetrahedron, 67:8595-8606 (2011)). En secuencias susceptibles, ocurre en todos los pasos precedentes de eliminacion de proteccion con Fmoc y formaciones de enlace amida que usan catalisis de amina terciaria despues de la introduccion de acido aspartico. De ese modo conduce a una acumulacion significativa de subproductos relacionados. La aspartimida es generada por formacion de ciclo catalizada por base, de grupo carboxllico de cadena lateral con el nitrogeno de amida terminal en C. La apertura de anillo del fragmento de succinimida es acompanada entonces por la epimerizacion y beta-isomerizacion que forman ocho subproductos bien sea a traves de su hidrolisis o adicion de piperidina (figura 1). Todos estos subproductos son modificaciones del nucleo de peptido y estan presentes en el peptido deseado as! como en cualquier eliminacion o secuencias truncadas que contienen la cadena lateral de acido aspartico. De ese modo se forma una mezcla compleja de impurezas de peptidos que impone dificultades para la separacion del compuesto deseado. En solucion esta reaccion lateral ocurre solamente durante la formacion de enlaces amida que usa catalisis con amina terciaria (vease Martinez, J.; Bodanszky M., Int. J. Pept. Protein Res., 12:277-283 (1978)).
Las secuencias particularmente susceptibles a la formacion de aspartimida son -Asp-Gly-, Asp-Asp-, -Asp-Asn-, - Asp-Arg- y Asp-Cys- (vease Mergler M., et al., J. Peptide Sci., 9: 518-526 (2003)). Mientras para cualquier otra secuencia puede ser suficiente el derivado estandar Fmoc-Asp(OtBu)-OH, el mejor derivado de Fmoc-Asp(OMpe)- OH (vease Karlstrom, A. et al., Tetraedron Letters, 37:4243-4246 (1996)) disponible en el mercado actualmente, no es aun suficientemente protector contra la formacion de aspartimida en las secuencias arriba mencionadas.
La aplicacion de calentamiento con microondas a SPPS es particularmente ventajosa para peptidos largos o susceptibles a agregacion, en la medida que la aceleracion del acoplamiento y reaccion de eliminacion de proteccion conduce a menores tiempos de ciclo, rendimientos mayores repetitivos y en ultimas peptidos mas puros (vease Pedersen L., et al., Chem. Soc. Rev., 41:1826-1844 (2012)). Sin embargo, el uso de energla de microondas conduce tambien a aumento en los niveles de subproductos tlpicos de SPPS incluyendo formacion de aspartimida, la cual puede ser limitada solo mediante uso rutinario de metodos optimizados (vease Palasek S.A., et al., J. Peptide Sci., 13,143-148 (2007)).
El documento WO 95/26975 divulga grupos alquilo alifaticos ramificados como constituyentes de grupos protectores para cadenas laterales de aminoacidos. Es base de esta aproximacion la generacion de grupos protectores voluminosos, estericamente demandantes para evitar reacciones laterales como la formacion de aspartimida. Pero estos grupos protectores nunca ganaron mucho interes en la medida en que, debido al grupo estericamente demandante, tambien se reduce la reactividad de los aminoacidos protegidos en la slntesis de peptido. Tambien Mergler M., et al., J. Peptide Sci., 9: 518-526 (2003) discuten el uso de grupos alquilo voluminosos para proteccion
de cadena lateral de acido aspartico, pero concluyen que no puede lograrse una supresion total de la formacion de aspartimida mediante el simple incremento del volumen de la proteccion de la cadena lateral.
Un ejemplo de una familia de peptidos terapeuticamente importantes que sufre de niveles significativos de formacion de aspartimida son los peptidos 2(GLP-2) similares a glucagon, y sus analogos relacionados (WO 5 2012/028602). Estos peptidos son sugeridos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, osteoporosis y como
terapia adyuvante en quimioterapia. El ejemplo mas prominente es Revestive® (teduglutide) que es usado para el tratamiento de slndrome de intestino corto. Los analogos de GLP-2 como Revestive® son fabricados actualmente de manera recombinante y serla una alternativa interesante un metodo efectivo de produccion por slntesis, para reducir los costos de produccion y omitir los materiales de partida derivados de animales as! como para reducir la 10 carga de endotoxinas. Sin embargo, estos peptidos contienen una secuencia Asp-Gly as! como una Asp-Asn, que reduce su accesibilidad sintetica, debida a los subproductos derivados de aspartimida (vease WO 2012/028602).
Claramente, el problema de aspartimida aun impone inconvenientes a la slntesis de peptidos y persiste una necesidad en la tecnica por un grupo protector versatil y eficiente de la cadena lateral de acido aspartico que prevenga esta reaccion lateral, y es una causa legltima de preocupacion el que terapeuticos importantes de 15 peptidos encuentran severas dificultades en su produccion sintetica. Se ha hallado que los grupos de proteccion de cadena lateral de acido aspartico que tienen un atomo de carbono terciario enlazado a O con solo sustituyentes alifaticos lineales, pueden ser usados eficientemente para slntesis de peptidos. De manera sorprendente, este tipo de grupos protectores combina el impedimento efectivo de la reaccion lateral con la elevada reactividad de acido aspartico protegido en slntesis de peptidos.
20 Resumen de la invencion
La presente invencion se dirige por ello a compuestos de las formulas la y/o Ib
imagen1
en las que R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono, por ejemplo -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2- 25 CH 2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
R4 representa un grupo benciloxicarbonilo o un 9-fluorenil metiloxicarbonilo o H.
La formula II muestra los grupos benciloxicarbonilo o un 9-fluorenil metiloxicarbonilo.
imagen2
En la formula II, P representa un grupo fenilo o 9-fluorenilo.
30 Las dos formulas Ia y Ib representan los enantiomeros D y el L (R y S) de acido aspartico. El compuesto puede ser bien sea el enantiomero D puro o el enantiomero L puro o una mezcla de los enantiomeros D y L. Se prefiere el enantiomero L.
En una realizacion preferida R1, R2, R3 tienen todos el mismo numero de atomos de carbono.
En otra realizacion preferida R1, R2, R3 son -CH2-CH3 o -CH2-CH2-CH3
35 La presente invencion esta dirigida ademas a un metodo para fabricar los compuestos de la formula Ia y/o Ib mediante
a) suministro de un acido aspartico con grupos protectores que pueden ser sometidos a hidrogenolisis en los extremos N y C
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b) esterificacion del acido carboxllico de cadena lateral con el alcohol terciario de acuerdo a la formula III
HO-CR1R2R3 formula III
en la que R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono, por ejemplo -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2- CH 2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
c) hidrogenolisis de los grupos protectores que pueden ser sometidos a hidrogenolisis en los extremos N y C
d) introduccion de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un benciloxicarbonilo en el extremo N.
En una realizacio n preferida, la esterificacion del paso b) es ejecutada con una carbodiimida, preferiblemente diciclohexilcarbodiimida.
La presente invencion esta dirigida ademas a un metodo para la slntesis de peptidos por
a) suministro de un aminoacido o un peptido unido a una fase solida a traves de su extremo C
b) reaccion del aminoacido o peptido unido a la fase solida del paso a) con un compuesto de la formula Ia y/o Ib en la que el compuesto de la formula Ia y/o Ib esta unido al extremo N.
c) escision del grupo Fmoc mediante tratamiento alcalino.
En una realizacion preferida, el tratamiento alcalino del paso c) es ejecutado con una o mas aminas secundarias, preferiblemente piperidina, 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), pirrolidina y/o dietilamina.
En una realizacion muy preferida, el tratamiento alcalino del paso c) es ejecutado con una mezcla que comprende una o mas aminas secundarias y un acido organico o preferiblemente un alcohol acido, por ejemplo etilcianoglioxilato-2-oxima. La concentracion del acido organico o el alcohol acido deberla ser elegida tal que es subestequiometrica comparada con las aminas secundarias.
En otra realizacion preferida, la reaccion en el paso b) es ejecutada en presencia de HBTU, TBTU, HATU, TATU, HCTU, TCTU y/o PyBOP.
Figuras
Figura 1. Mecanismo de la formacion de subproductos derivados de aspartimida.
Figuras 2-7 muestran trazas por HPLC y UPLC relacionadas con los ejemplos.
Definiciones
De acuerdo con la presente invencion, un acido organico es un compuesto organico con propiedades acidas. Los acidos organicos mas comunes son los acidos carboxllicos, cuya acidez esta asociada con su grupo carboxilo - COOH. Los acidos sulfonicos que contienen el grupo -SO2OH son acidos relativamente fuertes. Los alcoholes, con -OH, pueden actuar como acidos pero ellos son usualmente muy debiles. La estabilidad relativa de la base conjugada del acido determina su acidez. Otros grupos pueden conferir tambien acidez, usualmente debilmente: el grupo tiol -SH, el grupo enol y el grupo fenol. Los acidos organicos preferidos de acuerdo con la presente invencion son alcoholes acidos.
Un alcohol acido de acuerdo con la presente invencion es un alcohol con un grupo OH que puede actuar de modo acido. Son ejemplos (Z)-etil cianoglioxilato-2-oxima (Oxyma Pure), N-hidroxibenzotriazoles y fenoles.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion suministra derivados de acido aspartico para la slntesis de peptidos bien sea en solucion o sobre un soporte solido. La proteccion de cadena lateral comprende un alcohol terciario enlazado como ester, que tiene un atomo de C terciario, con cadenas rectas de hidrocarburo con dos a seis atomos de carbono. Los derivados de acido aspartico protegido en la cadena lateral de acuerdo con la presente invencion, son mostrados en la formula Ia y Ib
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en las que
Ri, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono, por ejemplo -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH3, - CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
R4 representa un grupo benciloxicarbonilo o un 9-fluorenilmetoxicarbonilo o H.
Las dos formulas la y Ib representan los enantiomeros D y L (R y S) de acido aspartico. Los enantiomeros pueden ser usados como compuesto D o L puro o como una mezcla.
Se ha hallado que es favorable si Ri, R2 y R3 tienen el mismo numero de atomos de carbono. Eso significa que todas las tres cadenas de alquilo tienen la misma longitud.
Se ha hallado ademas que incluso pueden alcanzarse muy buenos resultados respecto a la supresion de la formacion de aspartimida cuando se usan cadenas comparativamente cortas con longitudes de dos o tres atomos de carbono. Preferiblemente Ri, R2 y R3 son -CH2-CH3 o Ri, R2 y R3 son -CH2-CH2-CH3.
La presente invencion esta dirigida ademas a un metodo para fabricar los compuestos de la formula la y/o Ib. Esto es hecho preferiblemente suministrando primero un acido aspartico con grupos protectores en los extremos N y C, que pueden ser sometidos a hidrogenolisis. Por ejemplo, son grupos protectores adecuados para los extremos N y C, benciloxicarbonilo (Z) y bencilo respectivamente. Una persona experta en la tecnica conoce como introducir tales grupos protectores. En el ejemplo 1 y 2 puede encontrarse mayor informacion.
En un paso siguiente se hace reaccionar el acido carboxllico de cadena lateral del derivado de acido aspartico del paso a), con un alcohol terciario de acuerdo con la formula Ill
HO-CR1R2R3 formula Ill
en la que R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono, por ejemplo -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2- CH2-CH2-CH3, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3.
En este paso se introduce el grupo protector de cadena lateral. En una realizacion preferida, el paso de esterificacion es ejecutado con derivados de acil urea de carbodiimidas, preferiblemente diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida en la presencia de N,N-dimetilaminopiridina (vease Neises, B. y Steglich, W. Angew. Chem.- Int. Ed., 17:522-524 (1978)). Despues de la introduccion del grupo protector de cadena lateral de acuerdo con la presente invencion, los grupos protectores en los extremos N y C que pueden ser sometidos a hidrogenolisis, son escindidos por hidrogenolisis. Este paso es conocido por una persona experta en la tecnica. Es ejecutado tlpicamente con hidrogeno y un catalizador de Pd/C. Para uso del derivado de acido aspartico en slntesis de peptidos, finalmente se introduce un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o benciloxicarbonilo en el extremo N. Tambien la introduccion de tales grupos protectores es conocida por una persona experta en la tecnica de slntesis de peptidos. Tlpicamente es hecha por activacion con N- hidroxisuccinimida, usando Fmoc-OSu o Z-OSu.
Los derivados de acido aspartico protegido en la cadena lateral de acuerdo con la presente invencion, pueden ser usados entonces para slntesis de peptidos en fase llquida o solida. Ellos son usados tlpicamente de la misma manera que por ejemplo derivados de acido aspartico protegidos en la cadena lateral por tBu. La slntesis de peptidos en fase solida es hecha preferiblemente de acuerdo con la estrategia Fmoc/tBu (Atherton E., et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 539 (1978)).
Para slntesis en fase solida, los derivados de acido aspartico protegido en la cadena lateral de acuerdo con la presente invencion, pueden ser usados por ejemplo como sigue: en un primer paso, se suministra un aminoacido o peptido unido a una fase solida a traves de su extremo C. Despues se hace reaccionar el aminoacido o peptido unido a una fase solida del paso a), con compuestos de la formula la y/o Ib, en la que los compuestos de la formula la y/o Ib estan unidos al extremo N. En una realizacion preferida, esta reaccion es ejecutada en presencia de HBTU,
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TBTU, HATU, TATU, HCTU, TCTU o PyBOP.
La escision del grupo Fmoc es ejecutada mediante tratamiento alcalino. Los procedimientos y reactivos adecuados son conocidos por una persona experta en la tecnica.
En una realizacion preferida, el tratamiento alcalino es ejecutado con una o mas aminas como piperidina, dietilamina, pirrolidina o DBU, preferiblemente aminas secundarias, muy preferido con piperidina al 20 % en dimetilformamida.
En una realizacion muy preferida, el tratamiento alcalino del paso c) es ejecutado con una mezcla que comprende una o mas aminas, preferiblemente aminas secundarias, por ejemplo piperidina, y un acido organico como acido formico, acido acetico o preferiblemente un alcohol acido como fenol o 2,4-diclorofenol, (Z)-etil cianoglioxilato-2- oxima, disponible comercialmente como Oxyma Pure (Merck KGaA, Alemania, formula IV) o hidroxibenzotriazol.
imagen4
La concentracion del acido organico o el alcohol acido deberla ser elegida tal que es subestequiometrica comparada con las aminas.
Preferiblemente, la relacion molar del acido organico o el alcohol acido comparada con las aminas (acido : amina) esta entre 0.01 : 1 y 0.4 : 1, preferiblemente entre 0.1 : 1 y 0.4 : 1, con maxima preferencia entre 0.35 : 1 y 0.37 : 1.
Se ha hallado que la adicion del acido organico o preferiblemente el alcohol acido reduce adicionalmente la formacion de aspartimida. Se ha hallado ademas que la etil cianoglioxilato-2-oxima es especialmente adecuada en relaciones molares (acido : amina) entre 0.1 : 1 y 0.4 : 1, preferiblemente entre 0.35 : 1 y 0.37 : 1. En consecuencia, la combinacion del derivado de acido aspartico de la invencion de acuerdo con la formula la y/o Ib y la adicion de una cantidad subestequiometrica de un acido organico o un alcohol acido cuando se remueve el grupo protector Fmoc, suministra condiciones optimas evitar la formacion de aspartimida.
La invencion esta dirigida tambien al uso de derivados protegidos en la cadena lateral de acido aspartico de la invencion, para la slntesis de peptidos en solucion aplicando el grupo Z terminal en N. El grupo Z es escindido mediante hidrogenacion que no afecta el enlace ester de los alcoholes terciarios. Esta ortogonalidad es especialmente valiosa para la preparacion de peptidos que contienen acido aspartico en solucion (vease Subiros- Funosas R. et al., Tetrahedron, 67:8595-8606 (2011)).
La proteccion de cadena lateral de acido aspartico de la invencion esta disenada para suprimir cualquier subproducto formado a traves de la formacion de aspartimida catalizada por base. Cualquier slntesis en una fase de solucion a base de Fmoc SPPS y Z, puede ser ejecutada o modificada con los derivados de la invencion. Tlpicamente, dichos derivados son estables contra el tratamiento con aminas secundarias y terciarias como piperidina, pirrolidina, trietilamina o etildiisopropilamina as! como contra la hidrogenacion y son escindidos con acidos fuertes como acido trifluoroacetico. Por ello, los derivados representan un grupo de protecciones semipermanentes de cadena lateral. En la presente invencion el impedimento esterico es apalancado por la longitud creciente de la cadena recta de alquilo de alcoholes terciarios. Se ha hallado que esta homologacion construye una estructura voluminosa mas bien flexible, capaz de aproximarse muy cerca a la columna vertebral de peptidos impidiendo de ese modo la formacion de aspartimida as! como anadiendo suficiente flexibilidad al sistema, para permitir el acoplamiento eficiente de cualquier aminoacido precedente.
En un aspecto adicional, esta invencion esta dirigida a la combinacion de dichos derivados de acido aspartico y el uso de alcoholes ligeramente acidos como Oxyma Pure o hidroxibenzotriazoles en las soluciones de escision de Fmoc. Esta combinacion revela ser un metodo poderoso para reducir la formacion de aspartimida.
Por lo tanto, la aspartimida catalizada con base surge especialmente durante la escision con Fmoc; los derivados mencionados son probados con Fmoc SPPS. Para investigar la aparicion de aspartimida, en los ejemplos, se escogen las secuencias del hexapeptido de toxina II de escorpion (H-Val-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH), como un peptido modelo siguiendo estudios previos y una variante de este hexapeptido (H-Val-Lys-Asp-Asn-Tyr-Ile-OH) representando un segundo motivo Asp-Asn con probada susceptibilidad a formacion de aspartimida (vease Mergler M., et al., J. Peptide Sci., 9: 36-46 (2003)). Se examinan sistematicamente el impacto de remociones multiples de
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Fmoc en slntesis gradual de peptidos largos y condiciones de remocion de Fmoc mas severas, necesarias en la agregacion de secuencias de peptidos susceptibles. Por ello las resinas de hexapeptido son expuestas por un lado a tratamientos prolongados con piperidina y por el otro lado expuestos a tratamientos con 1,8- diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU). Para vigilar completamente la aparicion de reaccion lateral de aspartimida, se identifican todos los subproductos derivados de aspartimida, mediante analisis LCMS y se cuantifican por analisis en HPLC o UPLC. En los ejemplos, las protecciones de cadena lateral mencionadas se comparan con el compuesto estandar Fmoc-Asp(OtBu)-OH y Fmoc-Asp(OMpe)-OH, el mejor compuesto disponible comercialmente, respecto a la prevencion de aspartimida.
Como un resultado, no pudo detectarse eliminacion de Asp ni eliminaciones de cualquier aminoacido precedente, cuando se usaron los derivados de Asp de acuerdo con la presente invencion. Puede asumirse que los derivados de acido aspartico suministrados en esta invencion no afectan la eficiencia de acoplamiento en la slntesis de peptidos. Ademas, los resultados del tratamiento con piperidina prueban que el derivado de Fmoc-Asp(OPhp)-OH de acuerdo con la invencion es significativamente mas efectivo en la prevencion de formacion de aspartimida que los otros derivados probados.
Adicionalmente, el derivado de Fmoc-Asp(OPhp)-OH casi inhibe la reaccion lateral de aspartimida cuando se combina con una solucion de remocion de Fmoc de Oxyma Pure 1 M en piperidina/DMF 1 : 4, incluso en la secuencia Asp-Gly que muestra la mas alta susceptibilidad en estudios previos.
La presente invencion es descrita en mas detalle en los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Materiales: todos los reactivos y solventes son comprados en su mejor calidad disponible bien sea de Merck- Millipore o Sigma-Aldrich. Los carbinoles 3-etil-3-pentanol y 4-(n-propil)-4-heptanol son comprados de ABCR. El carbinol 5-(n-butil)-5-nonanol fue preparado mediante reaccion estandar de Grignard.
Ejemplo 1: slntesis de 4-((3-etil)pent-3-il) ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-ilmetiloxi)carbonil)aspartico
(a) slntesis de 1-bencil-4-(3-etil)pent-3-il) ester de acido (2S)-N-benciloxicarbonilaspartico
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qulmica: C26H33NO6, masa exacta: 455.23, peso molecular: 455.54
Se disuelven 6.7 g (18.7 mmol) de Z-Asp-Obzl (1-bencilester de acido N-benciloxicarbonilaspartico) en 30 ml de diclorometano a temperatura ambiente. Despues de la adicion de 6.6 g (57.1 mmol) de 3-etil-pentan-3-ol, se enfrla la mezcla a 2-3 °C y se anaden 0.5 g (4.1 mmol) de 4-(N,N dimetilamino)piridina. A continuacion se anaden en 4 porciones iguales durante 32 horas, 4.6 g (22.3 mmol) de diciclohexil carbodiimida. Se detiene el enfriamiento despues de la adicion de la primera porcion de diciclohexil carbodiimida. Se continua la reaccion por dos dlas a temperatura ambiente, dando una suspension espesa. Se destruye el exceso de diciclohexil carbodiimida con acido acetico y se separa el precipitado por filtracion y se evapora el solvente hasta sequedad. Se disuelve el residuo en una cantidad minima de una mezcla de tolueno/acetato de etilo 95 : 5 y se purifica mediante cromatografia en columna usando SiO2 como fase solida y tolueno/acetato de etilo 95 : 5 como eluyente. Despues de evaporacion de las fracciones de producto se obtuvieron 8.0 g (17.6 mmol, 94 % de la teoria) del compuesto del titulo, como un solido incoloro. 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno) desplazamiento quimico en ppm: 7.41-7.25 (m, 10H, Fenil), 5.81 (d, 1H, NH), 5.18 (s, 2H, CH2, bzl), 5.10 (s, 2H, CH2, bzl), 4.62(m, CHa, 1H), 3.05 + 2.78 (d, 2H, CH2p), 1.82-1.68 (m, 6H, 3x alquil-CH2), 0.74-0.68 (t, 9H, 3x alquil-CH3).
(b) sintesis de 4-((3-etil)pent-3-il)ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-ilmetiloxi)carbonil)aspartico
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Formula qulmica: C26H31NO6, masa exacta: 453.22;
peso molecular: 453.53
Se disuelven 8.0 g (17.6 mmol) de Z-Asp(OEpe)Obzl (a-bencil-Y-(3-etil)pent-3-il)ester de acido N- benciloxicarbonilaspartico en 80 ml de dioxano a temperatura ambiente y se transfieren a un autoclave. Se anade 1 g de Pd/C suspendido al 5 % en 10 ml de agua, y se purga la solucion con nitrogeno para transformarla en inerte. Despues de ello se lleva a cabo la hidrogenacion a una presion de 0.5 bar de hidrogeno por 7 horas. Se separa por filtracion el catalizador y el filtrado resultante es aplicado directamente a la proteccion de Fmoc. Para esto, se anaden a temperatura ambiente 38 ml de una solucion al 5 % de NaHCO3 y una solucion de 5.9 g (17.6 mmol) de Fmoc-OSu en 50 ml de dioxano. Despues de 4 horas se remueve el solvente y se purifica el residuo mediante extraccion. Se remueve el solvente residual mediante mezcla de ebullicion constante con metil-tert-butileter para dar 5.0 g (10.9 mmol, 62 % de la teorla) de una espuma blancuzca. Pureza por HPLC: 95.2 % de area, tiempo de retencion 22.7 minutos (columna ACE C18-AR, 5 pm, 150 x 4.6 mm, gradiente lineal de acetonitrilo de 0 % a 100 % B en 30 minutos, amortiguador A= 2% de acetonitrilo y 0.1 % de acido trifluoroacetico en agua, amortiguador B= 0.1% de acido trifluoroacetico en acetonitrilo, flujo 1 ml/min; 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno), desplazamiento qulmico en ppm: 7.78 (d, 2H, Fmoc), 7.62 (m, 2H, Fmoc), 7.45-7.25 (m, 4H, Fmoc), 5.82 (d, 1H, NH), 4.68 (d, 1H, CH, Fmoc), 4.48-4.28 (m, 2H, Fmoc), 4.24-4.17 (m, 1H, CHa), 3.05 + 2.78 (d, 2H, CH2P), 1.911.78 (m, 6H, 3x alquil-CH2), 0.94-0.75 (t, 9H, 3x alquil-CH3); ESI-MS: monoisotopico Mw calc. = 453.2, Mw [M+Na]+ = 476.1.
Ejemplo 2: sintesis de 4-(4-(n-propil)hept-4-il) ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-
ilmetiloxi)carbonil)aspartico
(a) sintesis de 1-bencil-4-(4-(n-propil)hept-4-il) ester de acido (2S)-N-benciloxicarbonilaspartico
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Formula qulmica: C29K39NO6, masa exacta: 497.28, peso molecular: 497.63
Se disuelven 25.0 g (70.0 mmol) de Z-Asp-Obzl (1-bencilester de acido N-benciloxicarbonilaspartico) en 100 ml de diclorometano a temperatura ambiente. Despues de la adicion de 12.2 g (77.0 mmol) de 4-(n-propil)-4-heptanol, se enfrla la mezcla a 2-3 °C y se anaden 1.7 g (14.0 mmol) de 4-(N,N dimetilamino)piridina. A continuacion se anaden en 4 porciones iguales durante 48 horas, 10.6 g (84.0 mmol) de diisopropil carbodiimida. Se remueve el enfriamiento despues de la adicion de la primera porcion de diciclohexil carbodiimida. Se continua la reaccion por dos dlas a temperatura ambiente. Se destruye el exceso de diisopropil carbodiimida con acido acetico y se filtra sobre silica gel la mezcla de reaccion y se evaporan las fracciones de producto hasta sequedad. Se purifica el residuo mediante cromatografia en columna usando SiO2 como fase solida y tolueno/acetato de etilo 95 : 5 como eluyente. Despues de evaporacion de las fracciones de producto se obtuvieron 19.4 g (39.0 mmol, 56% de la teoria) del compuesto del titulo, como una espuma incolora. 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno) desplazamiento qulmico en ppm 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno), desplazamiento qulmico en ppm: 7.41-7.25 (m, 10H, fenil), 5.79 (d, 1H, NH), 5.18 (m, 2H, CH2, bzl), 5.10 (s, 2H, CH2, bzl), 4.62(m, CHa, 1H), 3.00 + 2.71 (d, 2H, CH2p), 1.77-1.61 (t, 6H, 3x alquil-CH2), 1.32-1.08 (m, 6H, 3x alquil-CH2), 0.95-0.78 (t, 9H, 3x alquil CH3).
(b) sintesis de 4-(4-(n-propil)hept-4-il)ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-ilmetiloxi)carbonil)aspartico
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Formula qulmica: C2gH37NO6, masa exacta: 495.26;
peso molecular: 495.61
Se disuelven 18.0 g (36.2 mmol) de Z-Asp(OPhp)-Obzl (a-bencil-Y-(4-(n-propil)hept-4-il)ester de acido N- benciloxicarbonilaspartico) en 200 ml de dioxano a temperatura ambiente y se transfieren a un autoclave. Se anaden 2.8 g de Pd/C suspendido al 5 % en 20 ml de agua, y se purga la solucion con nitrogeno para transformarla en inerte. Despues de ello se lleva a cabo la hidrogenacion a una presion de 0.5 bar de hidrogeno por 7 horas. Se separa por filtracion el catalizador y el filtrado resultante es aplicado directamente a la proteccion de Fmoc. Para esto, se anaden a temperatura ambiente 20 ml de una solucion al 10 % de NaHCO3 y 13.5 g (40.0 mmol) de Fmoc- OSu. Despues de 6 horas se remueve el solvente y se purifica el residuo mediante extraccion. Se remueve el solvente residual mediante mezcla de ebullicion constante con metil-tert-butileter. El aceite resultante es purificado mediante RP-HPLC. Se liofilizan las fracciones de producto para dar 1.4 g (2.8 mmol, 8 % de la teorla) de espuma blanca. Pureza por HPLC: 97.1 % de area, tiempo de retencion 25.4 minutos (columna ACE C18-AR, 5 pm, 150 x 4.6 mm, gradiente lineal de acetonitrilo de 0 % a 100 % B en 30 minutos, amortiguador A= 2% de acetonitrilo y 0.1 % de TFA en agua, amortiguador B= 0.1% de TFA en acetonitrilo, flujo 1 ml/min; 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno), desplazamiento qulmico en ppm: 7.82 (d, 2H, Fmoc), 7.63 (m, 2H, Fmoc), 7.25-7.45 (m, 4H, Fmoc), 5.87 (d, 1H, NH), 4.65 (m, 1H, CH, Fmoc), 4.28-4.48 (m, 2H, Fmoc), 4.17-4.25 (m, 1H, CHa), 2.72 + 3.05 (2xd, 2H, CH2p), 1.68-1.85 (m, 6H, 3x alquil-CH2), 1.18-1.37(m, 6H, 3x alquil-CH2), 0.82-1.01 (t, 9H, 3x alquil-CHa); ESI-MS: monoisotopico Mw calc. = 495.26, Mw [M+Na]+ = 518.26.
Ejemplo 3: sintesis de 4-(5(n-butil)nonan-3-il) ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-
ilmetiloxi)carbonil)aspartico
(a) sintesis de 1-bencil-4-(5-(n-butil)nonan-5-il) ester de acido (2S)-N-benciloxicarbonilaspartico
Formula qulmica: C32H45NO6, masa exacta: 539.32, peso molecular: 539. 71
Se disuelven 14.3 g (40.0 mmol) de Z-Asp-Obzl (1-bencilester de acido N-benciloxicarbonilaspartico) en 60 ml de diclorometano a temperatura ambiente. Despues de la adicion de 23.2 g (116 mmol) de 5-n-butil-5-nonanol, se enfrla la mezcla a 0 °C y se anade la primera porcion de 4.1 g (20.0 mmol) de diciclohexil carbodiimida. Despues de 15 minutos de activacion previa a 0 °C se anade 1.0 g (8.0 mmol) de 4-(N,N dimetilamino)piridina. Se continua la reaccion a temperatura ambiente por cuatro dlas anadiendo diariamente 1.65 g (8.0 mmol) de diciclohexil carbodiimida por los primeros tres dlas, dando una suspension espesa. Se destruye el exceso de diciclohexil carbodiimida con acido acetico. Se diluye la suspension con 500 ml de tolueno/acetato de etilo 95 : 5 y se filtra sobre 40 g de silica gel. Despues de evaporacion hasta sequedad, se disuelve el residuo en una cantidad minima de una mezcla de ciclohexano/acetato de etilo 9 : 1 y se purifica mediante cromatografla en columna usando 500 g de SiO2 como fase solida y ciclohexano/acetato de etilo 9 : 1 como eluyente. Despues de evaporacion de las fracciones de producto se obtuvieron 15.3 g (28.4 mmol, 71 % de la teorla) del compuesto del tltulo, como una cera llquida blancuzca. 1H-RMN en CDCl3 (TMS como estandar interno), desplazamiento qulmico en ppm: 7.39-7.25 (m, 10H, fenil), 5.82 (d, 1H, NH), 5.07-5.25 (m, 2H, CH2, bzl), 5.10 (s, 2H, CH2, bzl), 4.54-4.65 (m, 1H, CHa), 2.78 + 3.01 (2xd, 2H, CH2p), 1.65-1.81 (m, 6H, 3x alquil-CH2), 1.09-1.34 (m, 12H, 3x alquil-CH2), 0.83-0.96 (t, 9H, 3x alquil-CH3)).
(b) sintesis de 4-(5-(n-butil)nonan-5-il)ester de acido (2S)-N-((9H-fluoren-9-ilmetiloxi)carbonil)aspartico
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Formula qulmica: C32H43NO6, masa exacta: 537.31
peso molecular: 537.70
Se disuelven 14.6 g (26.9 mmol) de Z-Asp(OBno)-Obzl (a-bencil-Y-(5-(n-butil)nonan-5-il)ester de acido N- benciloxicarbonilaspartico) en 120 ml de dioxano a temperatura ambiente y se transfieren a un autoclave. Se anaden 2.4 g de Pd/C al 10 %, y se purga la solucion con argon para transformarla en inerte. Despues de ello se lleva a cabo la hidrogenacion a una presion de 0.5 bar de hidrogeno por 27 horas. Se mantiene el pH entre 7.5 y 8 durante la hidrogenacion, mediante adicion de carbonato de sodio. Se separa por filtracion el catalizador y el filtrado resultante es aplicado directamente a la proteccion de Fmoc. Para esto, se diluye el filtrado con 300 ml de dioxano/agua (8 : 2) y se ajusta el pH a 8 con 2 g de bicarbonato de sodio. Se anaden a temperatura ambiente 10.0 g (29.6 mmol) de Fmoc-OSu y se deja reaccionar la mezcla durante la noche. Se purifica la mezcla de reaccion mediante extraccion y se evaporan las capas organicas combinadas. Despues de evaporacion hasta sequedad se disuelve el residuo en una cantidad minima de una mezcla de diclorometano/metanol 98 : 2 y se purifica por cromatografla en columna usando 500 g de SiO2 como fase solida y diclorometano/metanol 98 : 2 como eluyente. Despues de la evaporacion de las fracciones de producto se obtuvieron 10.0 g del compuesto del tltulo. Para aumentar la pureza se purifica el material mediante una segunda corrida de cromatografla en columna usando 300 g de SiO2 como fase solida y ciclohexano/acetato de etilo/acido acetico (6 : 4 : 0.005) como eluyente. Despues de la evaporacion de las fracciones de producto se obtuvieron 6.5 g del compuesto del tltulo, como una cera blancuzca (12.1 mmol, 45 % de la teoria). Pureza por HPLC: 99.0 % de area, tiempo de retencion 27.6 minutos (columna ACE C18-AR, 5 pm, 150 x 4.6 mm, gradiente lineal de acetonitrilo de 0 % a 100 % B en 30 minutos, amortiguador A= 2% de acetonitrilo y 0.1 % de acido trifluoroacetico en agua, amortiguador B= 0.1% de acido trifluoroacetico en acetonitrilo, flujo 1 ml/min 1H-RMN en CDCh (TMS como estandar interno), desplazamiento quimico en ppm: 10.33 (s, 1H, COOH), 7.75 (d, 2H, Fmoc), 7.55 (m, 2H, Fmoc), 7.19-7.43 (m, 4H, Fmoc), 5.90 (d, 1H, NH), 4.66 (d, 1H, CH, Fmoc), 4.26-4.52 (m, 2H, Fmoc), 4.14-4.26 (m, 1H, CHa), 3.05 + 2.81 (d, 2H, CH2P), 1.62-1.83 (m, 6H, 3x alquil- CH2), 1.07-1.38 (m, 12H, 6x alquil-CH2), 0.79-0.95 (t, 9H, 3x alquil-CHs); ESI-MS: monoisotopico Mw calc. = 537.3, Mw [M+Na]+ = 560.3.
Ejemplo 4: slntesis de H-Val-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (VKDGYI) usando Fmoc-Asp(OEpe)-OH, Fmoc- Asp(OPhp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH
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La sintesis de peptidos en fase solida es llevada a cabo usando la estrategia Fmoc/tBu (Atherton E., et al., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 539 (1978)). Se usan 0.44 g de resina Fmoc-Ile-Wang (0.54 mmol/g) en un ABI 431 para sintesis automatizada de peptidos empleando activacion con HBTU/etildiisopropilamina (3.6 eq./8.0 eq.) para formacion de enlace amida, y una solucion de piperidina al 20% en dimetilformamida para la remocion del Fmoc. Los correspondientes aminoacidos Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(OtBu/OMpe/OEpe/OPhp)-OH, Fmoc-Gly-OH y Fmoc-Tyr(tBu)-OH som usados en un exceso de cuatro veces. Se exponen muestras de 50 mg de las resinas de peptido resultantes, a 0.5 ml de TFA al 95 % en agua por 1.5 horas, se retira por filtracion la resina y se precipita el filtrado de peptido en diisopropileter para dar los peptidos crudos totalmente desprotegidos.
Se tratan otros 50 mg de muestra de resina de peptido con una solucion de piperidina al 20% en dimetilformamida por 18 horas, para simular remociones multiples de Fmoc. Despues se exponen las muestras de resina de peptidos a TFA al 95 % en agua para escision final en analogia al protocolo descrito arriba y se identifican todas las impurezas relevantes por analisis de MS (Xevo Waters Q-TOF-1, masa de referencia = 556.277 (leu-encefalina) y
se cuantifican por analisis HPLC (condiciones de HPLC: halo peptidos 2,7 pm (150 x 4.6 mm) a 40 °C; gradiente de agua acetonitrilo de 5 % a 35 % B en 30 minutos donde el amortiguador A es TFA 0.1 % y acetonitrilo 2% en agua y el amortiguador B es TFA al 0.1 % en acetonitrilo, flujo 1 ml/minuto).
Como se esperaba, la prolongada exposicion de las resinas de peptido a piperidina exhibio diferentes niveles de 5 descomposicion respecto a la proteccion aplicada de cadena lateral. La figura 2 ilustra las correspondientes trazas de HPLC para el mejor derivado de Fmoc-Asp(OMpe)-OH disponible comercialmente, en comparacion con Fmoc- Asp(OPhp)-OH. En la tabla 1 se resumen las cantidades de subproductos despues de tratamiento prolongado con piperidina. El tratamiento con piperidina por 18 horas iguala a 108 ciclos por 10 minutos de remocion de Fmoc.
Por esto, este experimento tiene correlacion con un ensamble Fmoc SPPS de un hectamero despues de introducir 10 el residuo de acido aspartico.
Asp(OR) R -
objetivo [%] Asu [%] piperididas E%] Asu por ciclos de 10 minutos m Semivida en ciclos de 10 minutos
tBu
8.0 6.4 85.6 2.3 30
Mpe
42 3 6.7 51 0 0.8 90
Epe
64 4 4 1 31.5 0.4 175
Php
80.6 29 16.5 0.2 356
Tabla 1: resultados despues de 110 ciclos de remocion de Fmoc usando piperidina, peptido objetivo = VKDGYI, los subproductos derivados de aspartimida (Asu) son la aspartimida en s^ misma y la suma de piperididas
Como se ve en la tabla 1, la semivida del peptido objetivo que contiene la secuencia mas susceptible Asp-Gly, 15 aumenta en mas de 10 veces usando proteccion de Php en lugar de tBu, y en 4 veces respecto a Mpe. Es de especial interes la comparacion de la proteccion con Epe vs. Mpe, puesto que su principal diferencia es un escudo simetrico vs. uno asimetrico en el grupo Y-carboxilo del residuo aspartilo. La proteccion con Epe minimiza la formacion de aspartimida por un factor de dos comparado con Mpe, lo cual es una primera evidencia de las propiedades ventajosas de las protecciones de cadena lateral presentadas en esta invencion, para superar la 20 formacion de aspartimida.
Ejemplo 5: sintesis de H-Val-Lys-Asp-Asn-Tyr-Ile-OH (VKDNYI) usando Fmoc-Asp(OEpe)-OH, Fmoc- Asp(OPhp)-OH, Fmoc-Asp(OBno)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH
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La sintesis automatizada de peptidos, tratamientos con piperidina de las muestras de resina y escisiones finales 25 con TFA son ejecutadas como se describio en los protocolos del ejemplo 4. Adicionalmente, se tratan muestras de 50 mg de resina de peptido con una solucion de DBU/piperidina/DMF (1 : 19 : 79) durante 225 minutos para investigar la formacion de aspartimida a condiciones mas severas de eliminacion de proteccion con Fmoc, usadas frecuentemente para remociones completas de Fmoc en secuencias susceptibles a la agregacion.
Se analizan las muestras de peptidos resultantes y se identifican todas las impurezas relevantes por analisis de 30 UPLC-MS (Xevo Waters Q-TOF-1, masa de referencia = 556.277 (leu-encefalina), condiciones de LC: CHS 18 1.7 pm (100 X 2.1 mm) a 40 ° C; gradiente de agua acetonitrilo de 5 % a 35 % B en 10 minutos donde el amortiguador A es acido formico 0.1 % en agua y el amortiguador B es acido formico al 0.1 % en acetonitrilo, flujo 0.6 ml/minuto).
La figura 3 muestra las trazas por UPLC de los peptidos crudos directamente despues de la sintesis para el derivado Asp(OBno) mas demandante desde el punto de vista esterico, en comparacion con Asp(OMpe). En el 35 limite de deteccion no se detectaron eliminacion de Asp ni eliminaciones de un aminoacido precedente.
En la tabla 2 se resumen las cantidades de subproductos formados despues de la exposicion prolongada de las
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resinas de peptidos a piperidina (110 ciclos de remocion de Fmoc), para todas las protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion. La figura 4 muestra las trazas correspondientes de UPLC para el derivado Fmoc- Asp(OMpe)-OH en comparacion con Fmoc-Asp(OBno)-OH.
Asp(OR)
objetivo D/L-Asu piperididas Asu por ciclos Semivida
R =
[%] [%] m de 10 minutos en ciclos
tBu
16.1 4.9 79.0 1.6 40
Mpe
58.2 4.3 37.5 0.5 140
Epe
81.0 3.0 16.0 0.2 365
Php
90.8 1.0 8 2 0.09 800
Bno
95.5 0.9 3.6 0 04 1670
Tabla 2: resultados despues de 110 ciclos de remocion de Fmoc usando piperidina, peptido objetivo = VKDNYI, los subproductos derivados de aspartimida (Asu) son la aspartimida en s^ misma y la suma de piperididas
De manera analoga al ejemplo 4, el motivo de secuencia Asp-Gly, los resultados para el motivo Asp-Asn exhibieron diferentes niveles de descomposicion respecto a la proteccion de cadena lateral aplicada. El grupo protector Bno que muestra el grupo mas demandante estericamente en esta corrida no impone ningun impedimento a la slntesis de peptido usado bajo condiciones estandar, pero es capaz de limitar la reaccion lateral de aspartimida durante las remociones de Fmoc a una rata de 0.05 % por ciclo con una semivida mayor a 1500 ciclos. En comparacion, el mejor derivado Fmoc-Asp(OMpe)-OH disponible comercialmente dio diez veces mas aspartimida por ciclo de remocion de Fmoc, con una semivida de 140 ciclos.
En la tabla 3 se resumen las cantidades de subproductos formados despues de tratamientos prolongados con DBU, para todas las protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion. La figura 5 muestra las trazas correspondientes de UPLC para el derivado Fmoc-Asp(OMpe)-OH en comparacion con Fmoc-Asp(OBno)-OH. Dado que las remociones de Fmoc mediadas por DBU son mucho mas rapidas que las mediadas por piperidina, este experimento representa de nuevo un ensamble de Fmoc SPPS de un hectamero despues de introducir el residuo de acido aspartico usando exclusivamente DBU para la escision de Fmoc.
Asp(OR) R =
objetivo [%] D/L-Asu [%] piperididas [%] Asu por ciclos de 2 minutos Semivida en ciclos
tBu
0.3 2.6 97.1 5 2 13
Mpe
18.8 7.5 73.7 1.5 46
Epe
57,1 5.6 37.3 05 133
Php
71.0 3.3 25.7 0.4 192
Bno
74,5 3.5 22.0 0.3 263
Tabla 3: resultados despues de 110 ciclos de remocion de Fmoc usando DBU, peptido objetivo = VKDNYI, los subproductos derivados de aspartimida (Asu) son la aspartimida en s^ misma y la suma de piperididas
En el caso de secuencias susceptibles a la agregacion, la eficiencia incompleta de acoplamiento es acompanada frecuentemente por remociones incompletas de Fmoc durante el SPPS estandar. Se requiere emplear condiciones mas severas de remocion de Fmoc para resolver este ultimo problema. Sin embargo, los tratamientos con DBU dan lugar a impurezas derivadas de aspartimida en todos los motivos de secuencia Asp-Xaa (vease Mergler M., et al., J. Peptide Sci., 9: 36-46 (2003)). Este hecho limita fuertemente el uso de condiciones mas severas de remocion de Fmoc en Fmoc SPPS. En estos experimentos la proteccion con Bno representa la mejor solucion para esta situacion, reduciendo la formacion de aspartimida a menos de 0.3 % por ciclo de remocion de Fmoc de dos minutos, con una semivida de 260 ciclos. De este modo, Bno permite por primera vez ponderar las ventajas de las remociones completas de Fmoc versus el riesgo asociado de formacion de aspartimida mediada por DBU.
Ejemplo 6: sfntesis de H-Val-Lys-Asp-Arg-Tyr-Ile-OH (VKDRYI) usando Fmoc-Asp(OEpe)-OH, Fmoc- Asp(OPhp)-OH, Fmoc-Asp(OBno)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH
5
10
15
20
25
30
35
imagen13
La slntesis automatizada de peptidos, tratamientos con piperidina de las muestras de resina y escisiones finales con TFA son ejecutadas como se describio en los protocolos del ejemplo 4. Adicionalmente, para evaluar la ventaja de los grupos protectores usados en esta invencion en SPPS acelerado con calor, se trataron muestras de 50 mg de resina de peptido con una solucion de piperidina al 20% en DMF a 60 °C durante 200 minutos. Frecuentemente se usan condiciones de slntesis de peptidos asistidas por microondas, para reducir los tiempos de slntesis de peptidos e incrementar la reaccion de acoplamiento y desproteccion de Fmoc.
Se cuantifican todas las impurezas relevantes por analisis de HPLC (condiciones de HPLC: columna Kinetex XB- C18 2,6 pm (150 x 4.6 mm) a 50 °C gradiente de agua acetonitrilo de 5 % a 30 % B en 18 minutos donde el amortiguador A es formiato de amonio 20 mM y acetonitrilo 2 % en agua y el amortiguador B es formiato de amonio 20 mM en acetonitrilo, flujo 1 ml/minuto) y se identifican por analisis de MS (Xevo Waters Q-TOF-1, masa de referencia = 556.277 (leu-encefalina).
La figura 6 muestra las trazas por HPLC de los peptidos crudos directamente despues de la slntesis para el derivado Asp(OBno) mas demandante estericamente en comparacion con Asp(OMpe). En el llmite de deteccion no se detectaron eliminacion de Asp ni eliminaciones de un aminoacido precedente.
En la tabla 4 se resumen las cantidades de subproductos formados despues de exposicion prolongada de las resinas de peptidos a piperidina (110 ciclos de remocion de Fmoc), para todas las protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion.
Asp(OR) R =
objetivo [%] D/L-Asu [%] piperididas [%] Asu por ciclos de 10 minutos Semivida en ciclos
tBu
24.7 16.9 58.4 1.3 55
Mpe
64.2 6 9 28 9 0,4 173
Epe
86.7 3.90 9.4 0.1 539
Php
91.3 3.2 5 5 0.00 845
Bno
93.8 2.6 3.6 0.06 1202
Tabla 4: resultados despues de 110 ciclos de remocion de Fmoc usando piperidina, secuencia de peptido objetivo = VKDRYI, los subproductos derivados de aspartimida (Asu) son la aspartimida en si misma y la suma de piperididas
El motivo de secuencia Asp-Arg mostro en completa concordancia con los resultados previos, niveles reducidos de descomposicion especialmente cuando se aplica un escudo simetrico a la proteccion de cadena lateral. Aunque el grupo protector Bno despliega el grupo mas demandante estericamente, no impone ningun impedimento para la slntesis de peptidos usados bajo condiciones estandar. Por otro lado, el escudo esterico optimizado es muy bien capaz de suprimir la reaccion lateral de aspartimida durante remociones de Fmoc, a menos de 0.06 % por ciclo con una semivida por ciclo mayor a 1000. En comparacion, el mejor derivado Fmoc-Asp(OMpe)-OH comercialmente disponible dio aproximadamente siete veces mas aspartimida por ciclo de remocion de Fmoc con una semivida de aproximadamente 170 ciclos.
La aplicacion de calentamiento con microondas a SPPS esta acelerando el acoplamiento y reacciones de eliminacion de proteccion, conduciendo a tiempos mas cortos de ciclo, rendimientos mayores repetitivos y en ultimas peptidos mas puros. Por otro lado, la energla de microondas puede conducir tambien a aumento en los niveles de subproductos de aspartimida. Para superar esta limitacion se evaluo la ventaja de protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion, por exposicion de las resinas de peptido a ciclos de remocion de Fmoc a 60 grados Celsius.
En la tabla 5 se resumen las cantidades de subproductos formados despues de exposicion prolongada de las resinas de peptido a piperidina a 60 grados Celsius (100 ciclos de remocion de Fmoc), para todas las protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion. La figura 7 muestra las trazas correspondientes de HPLC para el
derivado Fmoc-Asp(OMpe)-OH en comparacion con Fmoc-Asp(OBno)-OH.
Asp(OR) R =
objetivo p/oj D/L-Asu I%] piperididas [%] Asu por ciclos de 10 minutos Semivida en ciclos
tBu
30.3 28.7 41.0 1.2 58
Mpe
63.5 16.9 19 6 0.5 153
Epe
85.4 7.8 6.8 0.2 439
Php
87 8 7.1 5.1 0 1 532
Bno
90.8 4.9 4.3 0.1 718
Tabla 5: resultados despues de 100 ciclos de remocion de Fmoc usando piperidina a 60 °C, secuencia de peptido objetivo = VKDRYI, los subproductos derivados de aspartimida (Asu) son la aspartimida en s^ misma y la suma de 5 piperididas
Primero que todo, los resultados muestran que la secuencia Asp-Arg es altamente susceptible a la formacion de aspartimida bajo calentamiento con microondas. Usando el grupo protector asimetrico Mpe se forma 0.5 % de subproductos de aspartimida por ciclo, lo cual esta representado por una semivida de 153 ciclos mientras el grupo simetrico Epe conduce solo a la formacion de 0.2 % de aspartimida con una semivida de 439 ciclos. Esto puede ser 10 atribuido al punto debil de la proteccion de Mpe, que esta compuesto solo de dos ramificaciones etilo y un metilo. Sin embargo, debido al movimiento browniano, las diferencias entre los homologos se vuelven marginales a 60 grados Celsius.
Este ejemplo demuestra que el escudo esterico optimizado en las protecciones de cadena lateral usadas en esta invencion, puede ser aplicado para suprimir de manera eficiente reacciones laterales de aspartimida, incluso a 15 elevadas temperaturas, para el motivo de secuencia susceptible Asp-Arg.
Ejemplo 7: sfntesis de H-Val-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH (VKDGYI) usando Fmoc-Asp(OEpe)-OH, Fmoc- Asp(OPhp)-OH, Fmoc-Asp(OMpe)-OH y Fmoc-Asp(OtBu)-OH asf como Oxyma Pure 1 M en la solucion de escision de Fmoc.
imagen14
20 Se tratan muestras de 50 mg de los correspondientes derivados de acido aspartico del ejemplo 4, durante 18 horas con una solucion de Oxyma Pure 1 M y piperidina al 20% en dimetilformamida. Los peptidos son escindidos de la resina con TFA 95 % y analizados por HPLC as! como MS para identificar todos los productos relacionados con aspartimida (vease las condiciones en el ejemplo 4). Los resultados se resumen en la tabla 6
Asp(OR)
Oxyma objetivo Asu piperididas Asu por ciclos
R ■
Pure [%] [%J [%] de 10 minutos
tBu
+ 61.1 8.8 30.1 0.45
- 8.0 6.4 85.6 2.3
Mpe
+ 84.2 3.8 12.0 0.16
- 42.3 6.7 51.0 0.8
Epe
+ 85.7 2,6 11.7 0.14
- 64.4 4.1 31.5 0.4
Php
+ 95.4 1.3 3.3 0.04
- 80.6 2.9 16.5 0.2
25 Tabla 6: resultados despues de 110 ciclos de remocion de Fmoc usando un modificador acido en los cocteles de
remocion de Fmoc mediada por piperidina, peptido objetivo VKDGYI, los subproductos derivados de aspartimida son la aspartimida en sf misma y la suma de piperididas
Aparte del hecho de que la adicion de Oxyma Pure al coctel de remocion de Fmoc de piperidina estandar en general reduce la ocurrencia de reaccion lateral de aspartimida (vease R. Subiros-Funosas, et al., Chem. Eur. J., 5 2009, 9394), de modo sorprendente se observa un efecto sinergico combinando este metodo con protecciones de
cadena lateral de la presente invencion, especialmente en el caso de la proteccion Php. Puesto que los tratamientos de resina de peptidos nuevamente se parecen a 110 ciclos de eliminacion de proteccion de Fmoc, la combinacion de Asp(OPhp) con Oxyma Pure 1 M en piperidina al 20% conducen a un nivel despreciable de 0,05 % de subproductos derivados de aspartimida por cada remocion de Fmoc, con una semivida mayor a 1500 ciclos. 10 Puesto que esto es valido para el motivo de secuencia mas susceptible Asp-Gly, la proteccion Asp(OPhp) en combinacion con un metodo suave de eliminacion de proteccion de Fmoc, representa una solucion altamente eficiente para el problema de la aspartimida en Fmoc SPPS en general. Sin embargo, es importante notar que cocteles de remocion de Fmoc que contienen un modificador acido son algunas veces demasiado debiles para conducir la escision de Fmoc hasta el final, dentro de 10 minutos. Frecuentemente se requiere exposicion 15 prolongada.
Abreviaturas
Fmoc-OSu N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)-succinimida
Asp(OPhp) 4-(4-(n-propil)hept-4-il-) ester de acido aspartico Asp(OMpe) 4-(3-metilpent-3il-) ester de acido aspartico Asp(OEpe) 4-(3-etilpent-3il-) ester de acido aspartico
Php 4-(n-propil)hept-4-il-
Mpe 3-metilpent-3il-
Epe 3-etilpent-3-il-
tBu tert-butilo
DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
HBTU 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1, 1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato
HATU 2-(7-aza-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato
HCTU 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato
PyBOP Benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato
TBTU 2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1, 1,3,3,-tetrametiluronio tetrafluoroborato
TATU 2-(7-aza-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio tetrafluoroborato
TCTU 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio tetrafluoroborato

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Compuestos de las formulas la y/o Ib
    imagen1
    imagen2
    en las que
    R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono,
    R4 representa un grupo benciloxicarbonilo, 9-fluorenil metiloxicarbonilo o H.
  2. 2. Compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque R1, R2, R3 tienen todos el mismo numero de atomos de carbono.
  3. 3. Compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2 caracterizado porque R1, R2, R3 son -CH2-CH3, -CH2-CH2-CH3.
  4. 4. Un metodo para producir el compuesto de las formulas la y/o Ib por
    a) suministro de un acido aspartico con grupos protectores que pueden ser sometidos a hidrogenolisis en los extremos N y C
    b) esterificacion del acido carboxllico de cadena lateral con el alcohol terciario de acuerdo a la formula Ill
    HO-CR1R2R3 formula Ill
    en la que R1, R2, R3 representan, independientemente uno de otro, una cadena de hidrocarburo lineal con una longitud de dos a seis atomos de carbono
    c) hidrogenolisis de los grupos protectores que pueden ser sometidos a hidrogenolisis en los extremos N y C
    d) introduccion de un grupo fluorenilmetoxicarbonilo o un grupo benciloxicarbonilo en el extremo N.
  5. 5. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado porque la esterificacion del paso b) es ejecutada con una carbodiimida.
  6. 6. Un metodo para la slntesis de peptidos por
    a) suministro de un aminoacido o un peptido unido a una fase solida a traves de su extremo C
    b) reaccion del aminoacido o peptido unido a la fase solida del paso a) con un compuesto de la formula la y/o Ib como se definio en la reivindicacion 1, en la que R4 es fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), en la que el compuesto de la formula la y/o Ib esta unido al extremo N.
    c) escision del grupo Fmoc mediante tratamiento alcalino.
  7. 7. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 6 caracterizado porque el tratamiento alcalino del paso c) es ejecutado con una o mas aminas secundarias.
  8. 8. Metodo de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado porque el tratamiento alcalino del paso c) es ejecutado con una mezcla que comprende una o mas aminas secundarias y un acido organico y/o un alcohol acido.
  9. 9. Metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 6 a 8 caracterizado porque la reaccion del paso b) es ejecutada en presencia de HBTU, TBTU, HATU, TATU, HCTU, TCTU y/o PyBOP.
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