ES2589134T3 - Inhibidores de la ruta de señalización de CD95 para el tratamiento de MDS - Google Patents

Inhibidores de la ruta de señalización de CD95 para el tratamiento de MDS Download PDF

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Abstract

Un inhibidor de la ruta de señalización de CD95 para su uso en el tratamiento del Síndrome Mielodisplásico (MDS), donde el MDS se selecciona de entre el subgrupo de MDS de bajo riesgo según el IPSS y el subgrupo de MDS de riesgo intermedio-1 (int-1) según el IPSS, y donde el inhibidor se une al receptor de CD95 (CD95) y/o al ligando de CD95 (CD95L).

Description

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Inhibidores de la ruta de senalizacion de CD95 para el tratamiento de MDS
La presente invencion se refiere a inhibidores de la ruta de senalizacion del CD95 para su uso en el tratamiento del Sfndrome Mielodisplasico (MDS) donde el MDS se selecciona de entre el subgrupo de MDS de bajo riesgo segun el IPSS y/o el subgrupo de MDS de riesgo intermedio-1 (int-1) segun el IPSS asf como un metodo para diagnosticar el MDS.
Los sfndromes mielodisplasicos (MDS) son trastornos de las celulas madre hematopoyeticas clonicas que se caracterizan por hematopoyesis ineficaz que da lugar a citopenias sangufneas, especialmente anemia, y a menudo estan implicados en la leucemia mieloide aguda (AML). En particular, los MDS se pueden caracterizar por el deficiente crecimiento del progenitor eritroide. Por consecuencia, los MDS se clasifican comunmente basandose en la morfologfa y el porcentaje de celulas blasticas en la sangre y la medula osea (clasificaciones French American British (FAB) y la OMS) (Bennett et al, 1982; Vardiman et al, 2009).
La eritropoyesis esta controlada por un equilibrio entre las senales positivas y negativas que implican la interaccion celula-celula y los factores solubles en las islas eritroblasticas de la medula osea. Una vision en conjunto de la eritropoyesis se muestra en la Figura 1. La diferenciacion de las celulas madre hematopoyeticas CD34+ (HSC) en linaje eritroide esta bajo el control de factores de transcripcion importantes tales como GATA-1 y citocinas como el ligando c-Kit, el factor de celulas madre (SCF). El tamano del compartimento eritroide esta regulado positivamente por la eritropoyetina que estimula la maduracion de CFU-E y pro-eritroblastos y evita su apoptosis. Las celulas eritroides adquieren la expresion de CD71 de membrana (receptor de transferencia) que continua con la de glucoforina A (GPA) en las celulas mas maduras (Figura 1).
La regulacion negativa de la eritropoyesis depende de Fas/FasL que contribuyen a la apoptosis de los eritroblastos inmaduros que expresan Fas por interaccion con FasL que se expresa en los precursores eritroides maduros (De Maria et al, 1999) y tambien por autorregulacion de los eritroblastos en el mismo estadio de diferenciacion (Socolovski et al, 2008). La maduracion de los precursores eritroides normales necesita la activacion de la caspasa- 3, mientras que la actividad de la caspasa-8 no se ha probado (De Maria et al, 1999; Zermati et al, 2001). La escision de los sustratos de la caspasa-3 es limitada. Por ejemplo, GATA-1 es un sustrato para la caspasa-3 en condiciones de privacion de eritropoyetina, aunque en presencia de Epo, GATA-1 esta protegido de la escision por la interaccion con la Hsp70 que se transloca desde el citosol al nucleo (Ribeil et al, 2007).
La alteracion de la eritropoyesis en MDS se asocia con la activacion ectopica de la caspasa-8 corriente abajo de Fas. El grupo de los solicitantes y otros habfan demostrado anteriormente que Fas esta sobre-expresado en la superficie de los progenitores inmaduros CD34+ y en progenitores eritroides diferenciados. La expresion de Fas aumentaba a lo largo de la diferenciacion de los eritroides con la aparicion de la expresion del ligando Fas en los precursores eritroides positivos a GPA dando como resultado la activacion ectopica de la caspasa-8 en el linaje eritroide. Esto se observo en celulas recien recolectadas de medula osea (Bouscary et al, 1997), asf como en celulas eritroides derivadas de un cultivo lfquido en 2 etapas (Claessens et al, 2002). La inhibicion de la senalizacion de Fas por la expresion ectopica de un mutante dominante negativo que se expreso lentivfricamente del adaptador FADD, disminufa la activacion de caspasa-8, e inhibfa la apoptosis de los precursores eritroides en los MDS (Claessens et al, 2005). Fas/FasL pueden contribuir a evitar la diferenciacion eritroide normal e inducir apoptosis en las celulas eritroides en los MDS.
Datos recientes demostraban que la maduracion de las celulas eritroides esta gravemente alterada en MDS de grado bajo. Los precursores de celulas eritroides se cuantificaron por el marcaie de CD71/GPA descrito por Socolovski et al (2007). Se observo que la fraccion de celulas con CD71a',t°/GPAbaj° esta aumentada y CD71int/GPAalto esta disminuida en los cultivos celulares de MDS en comparacion con los cultivos normales despues de 7 dfas. Los estudios transcriptomicos de precursores eritroides de 14 dfas demostraron una disminucion de 2 veces del GYPA que codifica la glucoforina A (GPA). Ademas, varios de otros genes eritroides estaban regulados negativamente.
Los MDS son enfermedades raras (incidencia de 3 a 5/100.000 personas/ano) y predominan entre los ancianos (edad media de 65 a 70 anos).
Habitualmente, el MDS se trata con la administracion de agentes estimulantes de la eritropoyesis clasicos (ESA).
Gupta, P. et al.:"Fas ligand expression in the bone arrow in myelodysplastic syndromes correlates with FAB subtype and anemia, and predicts survival", Leukemia (1999), 13:44-53 sugieren el tratamiento de MDS por bloqueo farmacologico de la ruta Fas-FasL para mejorar las citopenias del MDS.
Sin embargo, hasta la presente invencion los pacientes con MDS que son resistentes a los ESA eran diffciles de tratar.
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Por lo tanto, era un objetivo de la presente invencion proporcionar una nueva opcion de tratamiento para los MDS, en particular para el tratamiento de pacientes con MDS que son resistentes a los ESA.
Un primer aspecto de la invencion se refiere a un inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso en el tratamiento de un sfndrome mielodisplasico (MDS), que se selecciona de entre el subgrupo de MDS con bajo riesgo segun el IPSS y/o el subgrupo de mDs de riesgo intermedio (int-1) segun el IPSS.
De acuerdo con la invencion, los terminos CD95, CD95R y receptor de CD95 se pueden utilizar de manera intercambiable. Sinonimos adicionales son Apo-1 o Fas que se pueden utilizar de manera intercambiable en el presente documento. Ademas, los terminos CD95L, ligando de CD95 y los correspondientes sinonimos FasL, Apo- 1L, CD178 o TNF-SF6 se pueden utilizar de manera intercambiable.
Un “inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95” en terminos de la presente invencion puede ser cualquier compuesto que interfiera o bloquee al menos parcialmente la ruta de senalizacion de CD95. De acuerdo con una realizacion preferida un “inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95” bloquea la ruta de senalizacion de CD95. Los metodos para determinar y/o evaluar la actividad de la ruta de senalizacion de CD95 son conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, los descritos por Lavrik et. al., (Cell Death Differ. 2012 Ene; 19(1):36-41 Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC).
Un inhibidor de acuerdo con la divulgacion puede actuar a nivel proteico y/o a nivel de acido nucleico. Los inhibidores que actuan a nivel proteico pueden seleccionarse de entre anticuerpos, protefnas y/o moleculas pequenas. Los inhibidores que actuan a nivel de acido nucleico son por ejemplo, moleculas antisentido, moleculas de ARNi y/o ribozimas.
De acuerdo con una realizacion especialmente preferida, el inhibidor se une al receptor CD95 (CD95) y/o al ligando CD95 (CD95L). En una realizacion adicional, se puede inhibir la interaccion CD95/CD95L.
En una realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo. El inhibidor que es un anticuerpo se puede unir a CD95, pero, por supuesto, tambien a CD95L. Un ejemplo de anticuerpo que se une a CD95L es Nok-1.
El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo multiespecffico, o un fragmento de anticuerpo de los mismos (por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molecula de anticuerpo de cadena sencilla). El anticuerpo puede ser del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
El anticuerpo se puede utilizar con o sin modificacion, y se puede marcar, covalente o no covalentemente, con, por ejemplo, un grupo indicador o un grupo efector.
Un “fragmento de anticuerpo” de acuerdo con la invencion presenta esencialmente el mismo sitio de union al epftopo que el anticuerpo correspondiente y/o tiene sustancialmente la misma actividad inhibidora de CD95 y/o CD95L que el anticuerpo correspondiente.
Los metodos para producir anticuerpos son conocidos por los expertos en la tecnica.
Un tipo de inhibidor englobado en la presente invencion puede ser un inhibidor del ligando CD95. Por ejemplo, los inhibidores de ligando CD95 se pueden seleccionar de entre (a) un anticuerpo inhibidor anti-ligando CD95 o un fragmento del mismo como se ha descrito anteriormente; (b) una molecula soluble del receptor CD95 o una parte de union al ligando CD95 de la misma; y (c) un inhibidor del ligando CD95 que se selecciona de entre FLINT, DcR3 o fragmentos de los mismos.
Las moleculas solubles de receptor CD95, por ejemplo una molecula soluble de receptor CD95 sin dominio transmembrana se describen en el documento EP-A-0 595 659 y documento EP-A-0 965 637 o peptidos receptores CD95 como se describen en el documento WO 99/65935.
El inhibidor del ligando Fas como FLINT o DcR3 o un fragmento, por ejemplo un fragmento soluble de los mismos, por ejemplo el dominio extracelular fusionado opcionalmente a un polipeptido heterologo, particularmente una molecula de inmunoglobulina Fc se describe en el documento WO 99/14330 o el documento WO 99/50413. FLINT y DcR3 son protefnas que son capaces de unirse al ligando CD95.
En una realizacion mas el inhibidor es una protefna de fusion, en particular una protefna de fusion que se une a CD95L.
En una realizacion, un inhibidor CD95 comprende un dominio extracelular de la molecula de CD95R, tal como los aminoacidos 1 a 172 (MLG ... SRS) de la secuencia de CD95 maduro de acuerdo con la Pat. de EE. UU. N°
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5.891.434. Este dominio extracelular de la molecula CD95R se puede fusionar con un dominio de polipeptido heterologo, particularmente una molecula de inmunoglobulina Fc que incluya la region bisagra, por ejemplo de una molecula IgG1 humana. Una protefna de fusion que comprende un dominio extracelular de CD95 y un dominio Fc humano se describe en el documento WO 95/27735.
Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion preferida, el agente que se une a CD95L es una protefna de fusion que comprende un dominio CD95 extracelular y un dominio Fc, en particular un dominio Fc humano.
De acuerdo con una realizacion especialmente preferida, el agente que se une a CD95L es APG101 o fragmentos funcionales, isoformas y/o derivados del mismo. El APG101 comprende los dominios CD95R (aminoacidos 26-172; dominio extracelular ECD) y el Fc de IgG1 (aminoacidos 172-400) de SEQ ID NO: 1). El APG101 y los derivados del mismo se desvelan en los documentos WO95/27735 y WO2004/085478.
En otra realizacion adicional de la presente divulgacion el inhibidor es una molecula efectora de acido nucleico. La molecula efectora de acido nucleico puede ser ADN, ARN, APN o un hfbrido de ADN-ARN. Puede ser de cadena sencilla o doble. Se pueden utilizar vectores de expresion derivados de retrovirus, adenovirus, herpesvirus o vacunales o de varios plasmidos bacterianos para suministrar las secuencias de nucleotido al organo, tejido o poblacion celular diana. Dichas construcciones se pueden utilizar para introducir secuencias en sentido o antisentido no traducibles en una celula. Incluso en ausencia de integracion en el ADN, dichos vectores pueden continuar transcribiendo moleculas de ARN hasta que son incapacitados por las nucleasas endogenas. La expresion transitoria puede durar un mes o mas con un vector no replicante e incluso mas si ciertos elementos de replicacion apropiados son parte del sistema del vector.
La molecula efectora de acido nucleico se puede seleccionar en particular a partir de moleculas antisentido, moleculas ARNi y ribozimas que sean preferentemente capaces de inhibir la expresion del gen CD95R y/o CD95L. Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion se refiere al tratamiento de un sfndrome mielodisplasico (MDS) que se selecciona de entre el subgrupo de MDS de bajo riesgo segun el Sistema de valoracion de pronostico internacional (IPSS) y/o el subgrupo de MDS de riesgo intermedio-1 (int-1) segun el IPSS.
El IPSS es bien conocido por el experto en la tecnica. Los principales factores del pronostico de la progresion de MDS a AML y la supervivencia incluyen el numero e importancia de citopenias, el porcentaje de blastos de la medula y las anormalidades citogeneticas de la medula osea. Cada indicador se evalua de acuerdo con su gravedad y las evaluaciones se combinan en una “valoracion”, el IPSS.
El IPSS distingue 4 subgrupos con riesgos significativamente diferentes en cuanto a la progresion a AML y la supervivencia: bajo, intermedio-1 (int-1), intermedio-2 (int-2) y de alto riesgo. Los subgrupos de riesgo bajo e int-1 a menudo se agrupan juntos como «favorables» o MDS de bajo riesgo, y los subgrupos de riesgo intermedio-2 (int-2) y alto son «desfavorables» o MDS de alto riesgo (Greenberg et al, 1997).
El MDS de bajo riesgo (con IPSS bajo o int-1) se caracteriza por un aumento de apoptosis de progenitores de la medula que da lugar a una gran extension de citopenias. En la mayorfa de los pacientes, las celulas eritroides muestran una alteracion de la diferenciacion y un aumento de la apoptosis.
Por lo tanto, el subgrupo de MDS que se va a tratar de acuerdo con la presente invencion, es decir, con un IPSS de bajo riesgo o int-1 se puede caracterizar por un aumento de apoptosis durante la eritropoyesis.
De acuerdo con una realizacion adicional, el subgrupo de MDS que se va a tratar se puede caracterizar adicionalmente por un grave defecto de eritropoyesis sin exceso de blastos.
Otro rasgo caracterfstico del subgrupo de MDS que se va a tratar puede ser la resistencia a los agentes estimulantes de la eritropoyesis clasicos (ESA) y/o factores estimulantes de colonias. Un agente estimulante de la eritropoyesis de acuerdo con la invencion puede ser un compuesto que estimule la produccion de globulos rojos. Ejemplos de ESA y/o factores estimulantes de colonias comprenden pero no se limitan a Eritropoyetina (Epo), Epoetina alfa (Procrit/Epogen), Epoetina beta (NeoRecormon), Darbepoetina alfa (Aranesp), Metoxi polietileno de glucopoetina beta (Mircera) y/o algunas citocinas tales como IL-3 o IL-9.
El subgrupo de MDS que se va a tratar puede caracterizarse por un bajo valor del unidades formadoras de brotes- eritroide (BFU-E) y/o un valor bajo de unidades formadoras de colonias-eritroide (CFU-E).
Por supuesto, las caracterfsticas expuestas anteriormente se pueden combinar en cualquier combinacion posible para describir un subgrupo de MDS que se va a tratar.
Teniendo en mente un subgrupo de MDS como se ha descrito anteriormente, una realizacion adicional de la invencion se refiere al uso de los inhibidores que aumentan el numero de BFU-E y no afectan a las unidades formadoras de colonias de granulocitos monocitos (CFU-GM) y/o sin aumentar el riesgo de expansion celular
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leucemica. Preferentemente, el inhibidor tambien puede ser un compuesto que mejore el crecimiento de los progenitores eritroides.
Un inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 que se utiliza de acuerdo con el curso de la presente invencion se puede proporcionar como una composicion farmaceutica. Esta composicion puede comprender vehfculos, diluyentes y/o adyuvantes, etc. farmaceuticamente aceptables.
Detalles adicionales de tecnicas de formulacion y administracion se pueden encontrar en la ultima edicion de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa).
Las composiciones farmaceuticas que se utilizan en la presente invencion se pueden administrar por cualquier numero de rutas que incluyen, pero no se limitan a, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermica, subcutanea, intraperitoneal, intranasal, enterica, topica, sublingual o rectal.
Las composiciones farmaceuticas adecuadas para su uso en la invencion incluyen composiciones en las que los principios activos estan contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el fin que se pretende. La determinacion de una dosis eficaz esta en la capacidad de los expertos en la tecnica. Una dosis terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad de principio activo, por ejemplo, una protefna de la invencion o un anticuerpo, que es suficiente para tratar una afeccion especffica. La dosificacion exacta la determinara un facultativo, a la luz de los factores relativos al sujeto que necesita el tratamiento.
La dosificacion y administracion se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Un experto en la tecnica es consciente de los metodos adicionales para proporcionar suficientes niveles del resto activo y/o mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta, incluyen la gravedad de la enfermedad, la salud general del sujeto, edad, peso y genero del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administracion, combinaciones farmacologicas, reacciones de sensibilidad, y tolerancia/respuesta a la terapia. En una realizacion preferida la cantidad total del inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 de acuerdo con la presente invencion que se va a administrar a un paciente que padece MDS es desde aproximadamente 50 a aproximadamente 400 mg/semana, mas preferentemente aproximadamente 100 a aproximadamente 200 mg/semana. La dosis semanal preferida se puede administrar como una dosis unica o como varias dosis. Especialmente preferida es una unica dosis de 100 a 300 mg/semana que se administra por via intravenosa como dosis unica.
El tratamiento puede durar varias semanas. En cada caso individual, la duracion del tratamiento se determina por el supervisor medico y esta basado, por ejemplo, en el exito del tratamiento, la existencia de efectos secundarios, etc.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion esta composicion farmaceutica puede comprender al menos un principio activo adicional tal como un agente que se utiliza habitualmente para el tratamiento de MDS, tal como 5-azacitidina, decitabina o lenalidomida, un agente estimulante de eritropoyesis y/o un agente inhibidor de apoptosis.
Los ejemplos de los agentes estimulantes de eritropoyesis se han especificado anteriormente.
Los ejemplos de agentes inhibidores de la apoptosis comprenden inhibidores de la apoptosis tales como xlAP, c- IAP-1, c-IAP-2, survivina, compuestos inhibidores del TNF-a tales como Revlimid, Pomalidomida, inhibidores de la familia de protefnas Bcl-2, etc.
Un aspecto mas de la presente divulgacion es una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor en los terminos de la presente invencion, que comprende ademas un agente estimulante de la eritropoyesis, en particular un agente estimulante de la eritropoyesis como se ha definido anteriormente.
Un aspecto adicional de la divulgacion se refiere a un metodo de diagnostico de MDS, que comprende la etapa de determinar la expresion de CD95L en una muestra, donde la sobre-expresion de CD95L es predictiva de la enfermedad. Una etapa adicional del presente metodo inventivo puede ser inter alia la comparacion del valor de la expresion de CD95L con un valor de control tal como el de una muestra de un paciente con anemia de un origen distinto a MDS.
Por supuesto, el metodo de diagnostico desvelado puede combinarse con metodos conocidos tales como el sistema IPSS.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Vision en conjunto de la eritropoyesis. HSC: celula madre hematopoyetica. BFU-E: unidad formadora de brotes-eritroide, CFU-E: unidad formadora de colonias-eritroide, PER: proeritroblasto, ERB: eritroblasto basofilo, ERP: eritroblasto policromatofilo, ERA: eritroblasto acidofilo, reticulo: reticulocito, RBC: globulo rojo, SCF: factor de celula madre, EPO: eritropoyetina.
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Figura 2: Regulacion negativa de eritropoyesis normal y de MDS. La eritropoyesis normal se controla por una regulacion negativa de la proliferacion por medio de apoptosis dependiente de Fas de los progenitores inmaduros mediada por las celulas maduras que expresan FasL (flechas azules). En el MDS, Fas y FasL estan sobre-expresados dando lugar a una apoptosis excesiva e inapropiada (flechas rojas).
Figura 3: Papel/concentracion de Fas y FasL durante la eritropoyesis.
Figura 4: Expresion de FasL en MDS, sAML y controles. A. Distribucion de FasL RFI. B. Analisis ROC comparando el MDS con los controles.
Figura 5: Impacto de la expresion de Fas en celulas CD45baj°/CD34+ en el diagnostico sobre la supervivencia total.
Figura 6: Efecto de APG101 sobre el crecimiento de BFU-E y CFU-GM el dfa 14 en un cultivo de metilcelulosa.
Figura 7: Efecto de APG101 sobre el crecimiento de CFU-E y CFU-L el dfa 7 en un cultivo de metilcelulosa.
Figura 8: Efecto de APG101 sobre la procedencia de BFU-E y CFU-GM a partir de cultivos lfquidos el dfa 5.
Figura 9: Efecto del APG101 anadido a la fase de diferenciacion en un cultivo lfquido de progenitores eritroides.
Figura 10: Efecto del APG101 sobre la diferenciacion de celulas eritroides. Izquierda: Citospinas coloreadas MGG. Derecha: Analisis de citometrfa de flujo de CD71/GPA marcado doblemente.
Figura 11: Efecto del APG101 sobre el crecimiento de BFU-E. Una comparacion entre MDS positivo a Fas y negativo a Fas.
Figura 12: Efecto del APG101 segun la expresion de FasL sobre las celulas CD45bajo.
Figura 13: Efecto del APG101 sobre el crecimiento de BFU-E de acuerdo con el crecimiento de CFU-L y BFU-E en la lfnea base.
Materiales y metodos
Materiales de laboratorio
Descripcion
Lote Suministrador
Trfmero purificado estable del ligando CD95 (CD95L-T4) APG101
Apogenix
Citocinas SCF, IGF-1
SCF 02630 IGF-1 Promega SIGMA
Metilcelulosa
04100 Stem Cell technologies
Medio de cultivo IDMD glutamax
31980-022 Invitrogen
Anticuerpos y protefnas marcados con un fluorocromo
CD95 clon UB2 IM1506 CD235a (GPA) clon 11E4B IM2212 CD71 clon YDJ1.2.2 IM0483 Beckman Coulter
Muestras de medula osea
Se recolectaron medulas oseas normales y de MDS de pacientes en el Cochin Hospital, Paris y a partir de los departamentos relacionados que estan asociados al multicentro de estudios biologicos coordinado por el Prof. M. Fontenay por aspiracion esternal. Los pacientes habfan dado su consentimiento informado para los estudios biologicos y geneticos antes de la aspiracion de medula osea de acuerdo con las recomendaciones del comite local de etica.
Equipamiento
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Nombre
Numero de identificacion interna
Columna MIDI Macs
Milteny Biotech
Citometro de flujo FC 500
Beckman Coulter
Incubadoras (5% CO2, 37 DC)
Jouan
Microscopio
Zeiss
Metodos SOP relevantes
Se hizo referencia al SOP actual del laboratorio y se valido en la Guide de Bonne Execution des Analyses de Bioloige medicale por M. Fontenay y C. Lacombe in 2002.
SOP
N° Fecha de lanzamiento
Aislamiento de celulas CD34+
GBEA2v1 01/02/2002
Cultivo del progenitor eritroide
GBEA2v1 01/02/2002
Ensayos en metilcelulosa
GBEA1v1 01/02/2002
Herramientas y plataformas
• APG101 Fas-Fc quimerico (Apogenix): un inhibidor de la apoptosis dependiente de Fas; proporcionado por Apogenix GmbH.
• CD95L-T4: Ligando trimerico para Fas proporcionado por Apogenix.
• Los cultivos celulares eritroides se llevaron a cabo como se ha descrito: se aislaron las celulas CD34+ de medula osea en una columna MIDI Macs y se cultivaron con SCF, Epo, IGF-1 y dexametasona para inducir la diferenciacion de las celulas CD34+ en linaje eritroide y la proliferacion de las celulas eritroides. Tras 10 dfas, se obtuvo la maduracion terminal de celulas eritroides por cambio de las celulas a un medio que contenfa Epo e insulina.
• Se utilizo citometrfa de flujo para cuantificar la maduracion de celulas eritroides durante el cultivo lfquido in vitro Protocolos
Citometrfa de flujo
Se identificaron las subpoblaciones de celulas por doble marcado utilizando anticuerpos monoclonales contra CD71 (receptor de transferrina) y glucoforina A (GPA, CD235a). Los diferentes estadios de maduracion eran celulas CD71- /GPA-, CD71+/GPA-, CD71+/GPA+ y finalmente CD71-/GPA+. Se cuantifico la expresion de Fas de membrana por marcado y expresion de CD95 como la relacion de la intensidad de fluorescencia media respecto al control isotfpico (RFI). Se utilizo el analisis de la curva de la caracterfstica operativa del receptor (ROC) que es una representacion grafica de la relacion entre la proporcion de positivos verdaderos y la proporcion de falsos positivos para un intervalo de valores de corte para comparar 132 MDS con 25 controles demostraba que el umbral de positividad era de un RFI de 1,8. Se midio la apoptosis por marcado con AnexinaV/7-AAD. Las muestras se analizaron en un aparato FC500 (Beckman Coulter).
Aislamiento celular y cultivo
Las muestras de medula osea de los pacientes y los sujetos sanos de control se recolectaron por aspiracion esternal y se purificaron las celulas CD34+ (>85% de celulas CD34+) en columnas de inmunoafinidad MiDi-MaCs (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) (Claessens et al, 2002). Las celulas CD34+ purificadas se cultivaron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenfa un 20% de BIT (seroalbumina bovina, insulina, holotransferrina), y las citocinas apropiadas: 50 ng/ml de factor de celulas madre (SCF), 1 Ul/ml de eritropoyetina (Epo), 40 ng/ml de factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1), y 10'6 M de dexametasona hasta el dfa 10 de cultivo, y 1 Ul/ml de Epo y 10'6 M de insulina a partir de entonces. Una vision en conjunto de las etapas de cultivo se muestra en la Figura 3. Las celulas se dividfan activamente hasta el dfa 10 y mostraban poca maduracion eritroide. Tras el cambio de citocinas, la mayorfa de las celulas se diferenciaron en eritroblastos sobre el dfa 14.
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Induccion de apoptosis por CD95L-T4 en celulas eritroides normales
Las celulas eritroides normales se trataron con concentraciones crecientes de CD95L-T4. A una concentracion determinada, se midio el impacto de la adicion de CD95L-T4 en una fase temprana de la diferenciacion de celulas eritroides sobre el crecimiento de celulas eritroides (BFU-E y amplificacion total de los precursores eritroides). Se ensayo el impacto de la adicion de CD95L-T4 antes de la aparicion de la activacion de caspasa-3 que precede a la maduracion eritroide. La caspasa-3 y las dianas se siguieron por analisis de citometrfa de flujo y de transferencia de Western.
Considerando la estequiometrfa 1/1 del complejo CD95L-T4/APG101 con una afinidad de union de 11 nM en seres humanos, la concentracion de CD95L-T4 y APG101 que se iba a ensayar en el cultivo estaban en el mismo intervalo (0,01 a 10 pg/ml).
Inhibicion de la apoptosis inducida por CD95L-T4 por APG101 en celulas eritroides normales
Las celulas eritroides normales se pre-trataron con APG101 a una concentracion creciente antes del tratamiento con la concentracion de CD95L-T4 determinada previamente en la fase temprana de la amplificacion de las celulas eritroides o en la fase tardfa de diferenciacion (o en ambas). Es importante senalar que se evitaba la adicion de CD95L-T4 en las muestras con altos niveles de apoptosis en la lfnea base. Se evaluaron los efectos del APG101 sobre la amplificacion total de celulas eritroides, el crecimiento de BFU-E, apoptosis, actividad de caspasa-3, escision direccionada por caspasa-3, y la diferenciacion (GPA, citologfa).
Inhibicion de la apoptosis de celulas eritroides de MDS por APG101
Se ensayaron concentraciones crecientes de APG101 (0,001 a 100 pg/ml)
- sobre el numero de BFU-E en ensayos clonogenicos
- sobre la tasa de amplificacion
- sobre la apoptosis (actividad de caspasa-3, exposicion a fosfatidilserina, dianas de la caspasa-3)
- sobre la diferenciacion de celulas eritroides (GPA/CD71, examen citologico, expresion genetica eritroide en micromatrices).
Se habfa demostrado anteriormente que el Fas se sobre-expresaba en la fraccion celular CD34+ de la medula osea. Por lo tanto, se hizo una comparacion entre las celulas progenitoras granulocfticas y eritroides en las muestras de MDS en condiciones de cultivo especfficas para cada linaje. Se ensayo si el tratamiento con APG101 restauraba la cinetica normal de la actividad de caspasa-3 y evitaba la escision direccionada de la caspasa-3.
Ensayo en metilcelulosa
Se sembraron celulas mononucleares aisladas de los aspirados de medula osea despues de un gradiente Ficoll, en un 0,8% de metilcelulosa que contenfa suero fetal bovino, BSA y citocinas (IL-3 0,1 Ul/ml, IL-6 10 ng/ml, GM-CSF 5 ng/ml, Epo 1 Ul/ml, y SCF 20 ng/ml a una concentracion de 106 celulas/ml). Se contaron las CFU-E y CFU-L el dfa 7 del cultivo y se contaron las BFU-E y CFU-GFM el dfa 14. Se anadieron concentraciones crecientes de APG101.
Estadfstica
Los datos biologicos se analizaron como valores medios ± el error estandar de la media. Los ensayos de sensibilidad y especificidad de la citometrfa de flujo para Fas y FasL se evaluaron con la curva de caracterfstica operativa del receptor (ROC) y se dedujo el valor del umbral. Se compararon las variables continuas con el ensayo-t de Student (software Excel 2003, Microsoft). Se utilizo el estimador de Kaplan-Meier para evaluar el impacto de Fas y FasL sobre la supervivencia total a lo largo del tiempo, en los dos subgrupos de poblacion bajo estudio, y se comparo con el ensayo Log-Rank. Todos los analisis estadfsticos eran de 2 lados y los valores de P menores de 0,05 se consideraron significativos. Los analisis estadfsticos se llevaron a cabo utilizando un software GraphPad.
Resultados
Expresion FasL y diagnostico de MDS
Se midio la expresion de FasL tanto en poblaciones celulares de medula osea CD45low/CD34+ y CD71+ de 84 MDS, 21 sAML y 17 controles. El FasL estaba significativamente mas elevado en MDS que en sAML o los controles (Figura 4A) y de acuerdo con la ROC, el umbral de positividad era 6. Cuando se comparaba los MDS con los controles, el valor predictivo de la expresion de FasL para discriminar entre MDS y los controles era bueno (area bajo la curva: 0,73; P=0,002; Figura 4B).
Se recogio la informacion clfnica de 166 pacientes de MDS o sAML con un valor conocido de la expresion de Fas en el momento del diagnostico y en 42 pacientes MDS/sAML con un valor conocido de FasL en el momento del
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diagnostico para analizar el impacto de la expresion de Fas o FasL sobre el diagnostico. En el grupo de los 166 pacientes con MDS, el 41% eran positivos para Fas y no se demostro ninguna diferencia en terminos de edad, sexo, parametros del hemograma, % de blastos en medula osea, displasia multilinaje, cariotipo, IPSS y tratamientos. La expresion de Fas no tenia impacto en la supervivencia total (Figura 5). Ademas, la expresion de Fas no era predictiva de la respuesta a la Epo.
En el grupo de 42 pacientes con MDS/sAML, 18 pacientes eran positivos a FasL (RFI>5). El nivel de Hb y la media de supervivencia total eran equivalentes en los pacientes positivos a FasL y negativos a FasL (P=0,57 y P=0,97, respectivamente). Ademas, la expresion de FasL en una pequena cohorte de pacientes (n=22) no era predictiva de la respuesta al tratamiento.
En resumen, estos datos muestran que Fas y FasL estaban sobre-expresados en MDS, y la sobre-expresion de FasL es predictiva de MDS. Ni la expresion de Fas ni la expresion de FasL eran parametros pronosticos para la supervivencia total.
Efecto de APG101 sobre el crecimiento del progenitor hematopoyetico
Los estudios han demostrado que bloqueando FasL con un exceso de Fas soluble (Fas: Fc) asf como la destruccion de la senalizacion Fas por medio de expresion ectopica de una forma dominante negativa del adaptador FADD rescataba el crecimiento de BFU-E. Cuando se analizo el efecto de las concentraciones crecientes de APG101 (0, 0,01, 0,1, 1, 10 pg/ml) sobre los progenitores eritroides y granulo-monocfticos en ensayos de metilcelulosa llegaba a ser evidente que el APG101 no estimulaba el crecimiento de CFU-GM mientras que se notaba un efecto positivo moderado sobre el crecimiento de BFU-E (Figura 6).
Ademas se analizo efecto de APG101 sobre el crecimiento de los progenitores eritroides maduros (CFU-E) y la respuesta de los blastos leucemicos contando el numero de CFU-L (agrupamientos no eritroides de al menos 50 celulas) el dia 7 del cultivo en metilcelulosa (Figura 7). Se encontro que el APG101 no rescataba el crecimiento de CFU-E y no aumentaba el numero de CFU-L incluso en muestras de pacientes RAEB2 (MDS con mas de un 10% de blastos en el momento del diagnostico) sugiriendo que el APG101 no estimula el crecimiento de blastos leucemicos.
Para adquirir mas conocimientos del efecto de APG101 sobre la eritropoyesis en MDS, se aislaron y sembraron las celulas CD34+ de medula osea de pacientes MDS en “condiciones eritroides” para la diferenciacion. Las celulas se recolectaron el dia 5 en el cultivo lfquido y luego se sembraron en metilcelulosa para evaluar el numero de BFU-E y CFU-GM. Como se muestra en la Figura 7, el numero inicial de BFU-E era reducido en MDS en comparacion con los controles. El APG101 inducfa un aumento de 3 veces del numero de BFU-E sin alcanzar un nivel normal. El CFU- GM estaba menos gravemente alterado que las BFU-E y no los afectaba el APG101. Estos resultados sugieren un efecto especffico de APG101 sobre el linaje eritroide.
Para ensayar el efecto del APG101 en la diferenciacion de celulas durante la eritropoyesis se anadieron diferentes concentraciones de APG101 al cultivo celular cuando el cultivo se cambio a Epo e insulina, que coincidfa con la aparicion de la expresion de FasL. El dia 14 del cultivo del cultivo el numero total de celulas habfa aumentado una media del 60% y la apoptosis parecfa que se habfa reducido hasta un 33% (Figura 9).
El APG101 no tenia efecto en la diferenciacion eritroide, de manera mas importante, no bloqueaba la maduracion celular (Figura 10).
Para delinear el grupo de pacientes que podrfa beneficiarse del farmaco, los datos de los ensayos de metilcelulosa se re-analizaron de acuerdo a las caracterfsticas clfnicas y biologicas iniciales. Los ensayos de metilcelulosa se validaron previamente como una herramienta util para predecir la respuesta a Epo y se correlacionaba bien con la calidad de la eritropoyesis (Frisan et al, 2010).
Primero se analizaron los ensayos clonogenicos de acuerdo con la expresion inicial de Fas. Como se muestra en la Figura 11, la mejorfa del crecimiento de BFU-E en presencia de 10 pg/ml de APG101 no era diferente significativamente en pacientes positivos a Fas y negativos a Fas.
Despues, se analizo el efecto de APG101 de acuerdo con la expresion de FasL sobre la poblacion positiva a CD71. En esta serie, el umbral de positividad era 2,8. Los MDS positivos a FasL tenia un RFI de FasL medio de 3,7 y los pacientes negativos a FasL tenfan un RFI FasL medio de 2,2. El efecto de APG101 no se diferenciaba entre pacientes positivos a FasL que mostraban una alta expresion de FasL y los pacientes negativos a FasL que mostraban una baja expresion de FasL.
Tercero, se busco una posible correlacion entre el efecto de APG101 sobre el crecimiento de BFU-E y el crecimiento inicial de CFU-L en el momento del diagnostico. En pacientes con exceso de agrupamientos leucemicos, el APG101 fallaba en la recuperacion el crecimiento de BFU-E mientras que aumentaba muy eficazmente el numero de BFU-E en pacientes con un crecimiento inicial bajo de CFU-L (Figura 13, a la izquierda).
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Finalmente, el APG101 mejoraba mas eficazmente el crecimiento de BFU-E en las celulas de medula osea de los pacientes de MDS con alteracion grave de la eritropoyesis en la lfnea base que en pacientes con la eritropoyesis conservada (Figura 13, derecha).
Resumen
Se demostro que en el cultivo in vitro de celulas madre hematopoyeticas (celulas CD34+) de los pacientes de MDS de grado bajo o int-1 con alteracion grave de la eritropoyesis, el APG101 rescata el crecimiento celular eritroide. El APG101 no promovfa el crecimiento de celulas leucemicas y por lo tanto no aumentaba el riesgo de una expansion de celulas leucemicas.
La sobre-expresion de FasL era predictiva de la enfermedad. Sin embargo, ni la expresion de Fas ni la de FasL demostraban claramente que tuvieran un impacto sobre la supervivencia total.
Fas es uno de los principales actores de la muerte celular apoptotica de las celulas precursoras hematopoyeticas lo que da como resultado anemia. Por lo tanto al inhibir la interaccion Fas y FasL utilizando un receptor soluble Fas (por ejemplo, el APG101) se podia rescatar la eritropoyesis en pacientes con MDS.
El APG101 rescata el crecimiento celular eritroide en el subgrupo de pacientes con MDS con un grave defecto en la eritropoyesis y sin exceso de blastos leucemicos. El APG101 no estimula el crecimiento de celulas leucemicas como se evalua por el recuento de CFU-L, sin embargo, el APG101 era incapaz de rescatar el crecimiento de BFU-E en pacientes que presentaban un exceso de CFU-L en el momento del diagnostico. En conjunto, el APG101 es eficaz en el rescate del crecimiento de BFU-E en celulas madre hematopoyeticas de pacientes con MDS con alteracion grave de la eritropoyesis en el momento del diagnostico y sin exceso de blastos. Estos pacientes se identificaron anteriormente como resistentes a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA) en parte debido a la sobre- expresion de Fas y un alto nivel de apoptosis (Frisan et al, 2010).
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<220>
<221> DISULFURO <222> (85)..(101)
<220>
<221> DISULFURO <222> (104)..(119)
<220>
<221> DISULFURO <222> (107)..(127)
<220>
<221> CARBOHIDRATO <222> (118)..(118)
<223> Glucosilacion unida a N en la posicion N118 <220>
<221> DISULFURO <222> (129)..(143)
<220>
<221> DISULFURO <222> (135)..(140)
<220>
<221> CARBOHIDRATO <222> (136)..(136)
<223> Glucosilacion unida a N en la posicion N136 <220>
<221> DISULFURO <222> (146)..(157)
<220>
<221> DISULFURO <222> (149)..(165)
<220>
<221> DOMINIO <222> (172)..(400)
<223> Dominio fC de IgG1 humana
<220>
<221> DISULFURO <222> (173)..(173)
<223>Resto formador de cistefna intercadena del homodfmero APG101. <220>
<221> DISULFURO <222> (179)..(179)
<223> Resto formador de cistefna intercadena del homodfmero APG101. <220>
<221> DISULFURO <222> (182)..(182)
<223> Resto formador de cistefna intercadena del homodfmero APG101. <220>
<221> DISULFURO <222> (214)..(274)
<221> CARBOHIDRATO <222> (250)..(250)
<223> Glucosilacion unida a N en la posicion N250
5 <220>
<221> DISULFURO <222> (320)..(378)
<400> 1

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Un inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso en el tratamiento del Sfndrome Mielodisplasico (MDS), donde el MDS se selecciona de entre el subgrupo de MDS de bajo riesgo segun el IPSS y el subgrupo de MDS de riesgo intermedio-1 (int-1) segun el IPSS, y donde el inhibidor se une al receptor de CD95 (CD95) y/o al ligando de CD95 (CD95L).
  2. 2. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el inhibidor es un compuesto que mejora el crecimiento de progenitores eritroides.
  3. 3. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el inhibidor es un anticuerpo, en particular un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a CD95L.
  4. 4. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde el inhibidor es una molecula receptora de CD95 o una porcion de union al ligando CD95 de la misma y/o un inhibidor del ligando CD95.
  5. 5. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, donde el inhibidor es una protefna de fusion que se une al CD95L.
  6. 6. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, donde la protefna de fusion comprende un dominio extracelular o un fragmento funcional del mismo y un dominio Fc humano o un fragmento funcional del mismo.
  7. 7. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, donde el inhibidor es APG101 y/o un derivado funcional del mismo, donde el APG101 comprende los dominios de CD95R (aminoacidos 26-172) de SEQ ID NO: 1 y el Fc de IgG1 (aminoacidos 172-400) de SEQ ID NO: 1.
  8. 8. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    7, donde la poblacion de MDS se caracteriza por un aumento de la apoptosis durante le eritropoyesis.
  9. 9. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    8, donde la poblacion de MDS se caracteriza por un grave defecto de la eritropoyesis sin exceso de blastos.
  10. 10. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la poblacion de MDS se caracteriza por ser resistente a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA) y/o factores estimulantes de colonias.
  11. 11. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10, que se proporciona como una composicion farmaceutica que comprende vehfculos, diluyentes y/o adyuvantes farmaceuticamente aceptables.
  12. 12. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se proporciona como una composicion farmaceutica que comprende al menos un principio activo adicional tal como un agente estimulante de la eritropoyesis y/o un agente inhibidor de la apoptosis.
  13. 13. El inhibidor de la ruta de senalizacion de CD95 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que se administra a una cantidad total de 50 a 400 mg/semana, preferentemente a 100 a 200 mg/semana.
    CDJ4
    imagen1
    Marcadores de diferenciacion eritroide
    imagen2
    Diferenciacion
    Diferenciacion
    HSC
    Progenitor
    multipotente BFU-E
    imagen3
    imagen4
    osteoblastos (Kovacic NefoJ 2007)
    Fas
    Restriction a los linajes
    Fas Fas
    FasL
    i '
    _______ ______ u
    (Socotoviky et el, 2007)
    (Camle
    *
    Activation de caspasa etui, ZOOMS'
    Diferenciacion etm. 2001
    (Rioetl et d , 2007)) )
    (DeMaria cfni, 1999, 2)
    (DeMana etai., 1999. t)
    Apoptosis
    Regulation del factor de transcription
    Homeostasis
    hematopoyetica
    Di'a 0
    imagen5
    Epo - SCF - Dexa - IGF-1
    Dia 10
    imagen6
    imagen7
    Epo Unsulina +/-
    APG101
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    imagen11
    K>
    hO
    100 150 200
    Tiempo
    Porcentaje de supervivencia ^ ro ^ o) oo o
    imagen12
    imagen13
    Figura 6
    CFU-GM controles vs MDS
  14. 250.0 -------------------------------------------------------------------------------------------
    n
    imagen14
    Op^mi 0,01 pg/ml 0.1 pg^ml 1 pg'mi 10 pgiml
    BFU-E controles vs MDS
    70,0 r
    imagen15
    0 pg/ml 0,01 pg/ml 0,1 pg/ml 1 pg/ml 10 pg/ml
    CFU-E I | CFU4-
    imagen16
    imagen17
    NJ
    cn
    BFU-E
    Controles
    imagen18
    imagen19
    APG101 o pg/ml
    1
    10
    09
    C
    QJ
    00
    MDS
    25i----------------------------------------
    imagen20
    APG101 0 0,01 0,1 1 10
    pg/mt
    80,
    imagen21
    APG101 0 0,01 0,1 1 10
    pg;ml
    % AnxV+
    ° o s s s a
    imagen22
    o 5 8 S S S
    imagen23
    imagen24
    APG101
    Numero de celulas
    o
    ro o 00 •A OJ
    m
    m
    rn 'm (71 rn u>
    ♦ g
    ♦ 6 Ln £ U\ V> I s
    imagen25
    CL
    o
    a
    u>
    imagen26
    imagen27
    i
    MGG
    Control
    MDS
    100% y-
    l
    80% j- 60% | 40% 4- 20%
    0%
    100% 80% 60% 40% 20%
    0%
    1-1
    normal
    10 pg/ml
    ■ i
    Opg/ml 10 pg/ml
    □ Eritro. acidofilos ■ Eritro. basofilos
    C3 Eritro. policromatofilos 113 Proeritroblastos
    Citometria de flujo
    1 00 %T-
    imagen28
    Opg/ml
    10 pg/ml
    imagen29
    0 pg/ml 10 pg/ml
    □ GPA+/CD71- B GPA-/CD71 +
    □ GPA+/CD71 + ££] GPA-/CD71*
    imagen30
    imagen31
    BFU-E ei P**L negative* en blastos (n*6)
    45 0
    400
    35 0
    300
    25 0
    e 200
    = 15 0
    100
    10 pyn*
    0 pam(
    001 pain*
  15. 0.1 pin*
    Figura 12
    BFU-E en FasL potltlvos
    40 0
    35 0
    30 0
    250
    200
  16. 16.0
  17. 10.0
    10 |»/rrt
  18. 0.1 voltri
    1 vwrt
  19. 0.01 poAnl
    0p3>ml
    imagen32
    imagen33
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