ES2583985T3 - Proceso para enriquecer una población de células espermáticas - Google Patents

Abstract

Un proceso para disminuir selectivamente la capacidad de una subpoblación de células espermáticas no humanas en una dispersión de células espermáticas comprendiendo el proceso: a) marcar una muestra de células espermáticas con una mezcla de marcado que incluye un agente químico que induce la inmovilidad del esperma y un colorante selectivo al ADN a una temperatura entre 30 ºC y 39 ºC para formar una dispersión de células espermáticas marcadas en un líquido, en el que la cantidad de marca asociada con una célula espermática indica una característica genética, estructural proteómica, o funcional de una subpoblación de células espermáticas en la dispersión; b) inspeccionar ópticamente la dispersión para identificar células espermáticas individuales como miembros de la subpoblación; c) determinar la posición de los miembros de la subpoblación en la dispersión; y d) suministrar una dosis de energía a diferentes posiciones dentro de la dispersión para disminuir selectivamente la capacidad de los miembros de la subpoblación para fertilizar un óvulo sin afectar de forma similar las células espermáticas en otras posiciones en la dispersión para producir una población de células espermáticas enriquecidas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Proceso para enriquecer una poblacion de celulas espermaticas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general al enriquecimiento de una poblacion de celulas espermaticas. En particular, la presente invencion se refiere en general al enriquecimiento de una poblacion de celulas espermaticas viables sin clasificar ffsicamente las celulas.

Antecedentes

La fertilizacion de animales mediante inseminacion artificial (IA) y el trasplante de embriones tras la fertilizacion in vitro es una practica establecida. En la industria ganadera, la capacidad de afectar el resultado reproductivo hacia una progenie que tenga una o mas caractensticas deseadas tiene ventajas evidentes. A modo de ejemplo, existina un beneficio economico en la industria lactea para preseleccionar la progenie en favor de las hembras para asegurar la produccion de vacas productoras de leche. La separacion del esperma en poblaciones enriquecidas de celulas que contienen el cromosoma X y el cromosoma Y, conocida como semen enriquecido por genero o esperma enriquecido por genero, es un metodo para conseguir la progenie preseleccionada.

Johnson et al. (patente de Estados Unidos n.° 5.135.759) describen la separacion de poblaciones de esperma que contienen el cromosoma X y el cromosoma Y intactos de acuerdo con el contenido de ADN utilizando un citometro de flujo/clasificador de celulas en poblaciones enriquecidas en esperma que contiene el cromosoma X y el cromosoma Y. Como se ha descrito, el esperma se combina con un colorante selectivo al ADN a una temperatura de 30°C a 39°C durante un periodo de 1 hora (39°C) a 1,5 horas (30°C). A continuacion se usa un citometro de flujo para medir la cantidad de luz fluorescente desprendida cuando el esperma pasa a traves de un haz de rayos laser. Como el esperma que contiene el cromosoma X tiene mas ADN que el esperma que contiene el cromosoma Y, aproximadamente de un 3 % a un 5 % dependiendo de la especie, el esperma que contiene el cromosoma X da como resultado una mayor intensidad de la luz fluorescente que el esperma que contiene el cromosoma Y. Las goffculas que contienen un unico esperma de una intensidad fluorescente predeterminada reciben una carga y se desvfan electrostaticamente a recipientes de recogida. La poblacion de esperma enriquecido por genero recogida se usa a continuacion para la microinyeccion o la inseminacion artificial. De forma notable, este metodo requiere que las celulas espermaticas se clasifiquen ffsicamente para conseguir la poblacion de esperma enriquecido por genero. La clasificacion ffsica de acuerdo con Johson requiere tiempo y es costosa.

Koller et al. (documento WO 01/68110A) describen metodos y equipos para identificar selectivamente, y dirigir individualmente mediante un haz de energfa, celulas espedficas de una poblacion de celulas mixtas para inducir una respuesta en las celulas diana.

Didion et al. (documento WO 02/41906A2) describen metodos, composiciones de materia, y equipos para clasificar esperma para producir subpoblaciones enriquecidas en esperma que contienen determinantes cromosomicos de la progenie de machos o hembras y describe ademas la preparacion de celulas espermaticas tinendolas mediante colorantes de union a ADN para las celulas espermaticas a baja temperatura en un citometro de flujo.

Sumario de la invencion

La presente invencion se dirige a un proceso para disminuir selectivamente la capacidad de una subpoblacion de celulas espermaticas no humanas en una dispersion de celulas espermaticas, el proceso comprende a) marcar una muestra de celulas espermaticas con una mezcla de marcado que incluye un agente qmmico que induce la inmovilidad del esperma y un colorante selectivo al ADN a una temperatura entre 30 °C y 39 °C para formar una dispersion de celulas espermaticas marcadas en un ffquido, en el que la cantidad de marca asociada con una celula espermatica indica una caractenstica genetica, estructural proteomica, o funcional de una subpoblacion de celulas espermaticas en la dispersion, b) inspeccionar opticamente la dispersion para identificar celulas espermaticas individuales como miembros de la subpoblacion, c) determinar la posicion de los miembros de la subpoblacion en la dispersion; y d) suministrar una dosis de energfa a diferentes posiciones en la dispersion para disminuir selectivamente la capacidad de los miembros de la subpoblacion para fertilizar un ovulo sin afectar de forma similar las celulas espermaticas en otras posiciones en la dispersion para producir una poblacion de celulas espermaticas enriquecidas.

Otros aspectos y caractensticas de la invencion seran en parte evidentes y en parte se apuntan a partir de ahora en el presente documento.

Descripcion detallada de la invencion

De manera ventajosa, una poblacion de celulas espermaticas viables puede estar enriquecida con respecto a una caractenstica de acuerdo con la presente invencion sin clasificar ffsicamente las celulas. Esta caractenstica puede

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ser, por ejemplo, si las celulas espermaticas contienen un cromosoma X o un cromosoma Y. Como alternativa, la caractenstica puede ser otra caractenstica genetica tal como la presencia de un polimorfismo de nucleotido unico ("SNP") que codifica una productividad animal mejorada (tal como, por ejemplo, produccion de leche mejorada) o que codifica un ffpido para mejorar la crioconservacion de las celulas seleccionadas. La caractenstica puede ser tambien una caractenstica proteomica tal como una protema para mejorar el comportamiento del esperma, tal como, por ejemplo, una protema que mejorare el comportamiento en el utero mejorando las caractensticas acrosomicas beneficiosas. La caractenstica puede ser tambien una caractenstica estructural, tal como, por ejemplo, integridad acrosomica, o una caractenstica funcional, tal como, por ejemplo, motilidad progresiva.

El enriquecimiento de una poblacion de celulas espermaticas con respecto a una caractenstica genetica, proteomica, estructural, o funcional se puede conseguir, por ejemplo, marcando las celulas espermaticas en la poblacion que tiene (o, como alternativa, que carece) la caractenstica, convirtiendo convierte las celulas espermaticas en sustancialmente inmoviles, y dosificar selectivamente las celulas espermaticas inmoviles con una dosis de energfa para disminuir la viabilidad de las celulas dosificadas o disminuir al menos la capacidad de las celulas dosificadas de fertilizar un ovulo in vitro o in vivo (es decir, tras la inseminacion). Como las celulas espermaticas de la dispersion denominada algunas veces como suspension, son sustancialmente inmoviles y estan marcadas selectivamente, el haz de energfa puede suministrarse a una posicion espedfica de la dispersion para dosificar una celula espermatica individual; repitiendo esta etapa de proceso, es decir, dosificando individualmente celulas espermaticas inmoviles en posiciones discretas en la dispersion, se puede enriquecer eficazmente una subpoblacion de celulas espermaticas que tengan una caractenstica deseada en la dispersion, por ejemplo, con respecto al porcentaje de celulas de la subpoblacion que tiene las caractenstica deseada; con respecto el porcentaje de progenie que tiene una determinada caractenstica genetica o proteomica como resultado de producirse mediante fertilizacion con las celulas espermaticas; o con respecto a ambas.

En cualquier caso, la poblacion de celulas espermaticas puede estar enriquecida para una subpoblacion concreta sin separar ffsicamente las celulas que tienen la caractenstica deseada de las que carecen de la caractenstica deseada (es decir, sin separar las celulas dosificadas de las celulas no dosificadas). Opcionalmente, puede conseguirse el enriquecimiento adicional de las celulas mediante purificacion adicional de las celulas separando ffsicamente las celulas dosificadas y no dosificadas en subpoblaciones separadas de acuerdo con los metodos descritos a continuacion.

Dispersion de celulas espermaticas Densidad de las celulas espermaticas

Por lo general, las dispersiones de celulas espermaticas que tienen una poblacion que puede estar enriquecida en alguna caractenstica pueden prepararse con un amplio intervalo de densidades de celulas espermaticas. Normalmente, sin embargo, la densidad de celulas espermaticas sera al menos de aproximadamente 1 x 103 espermatozoides/ml, y generalmente no excede de aproximadamente 5 X 1010 espermatozoides/ml, y mas preferentemente no excede de aproximadamente 5 X l08 espermatozoides/ml de dispersion. Por ejemplo, en un ejemplo, las dispersiones pueden contener espermatozoides en una densidad "relativamente baja", es decir, en una densidad de menos de aproximadamente 1 x 107 espermatozoides/ml, preferentemente menos de aproximadamente 1 x 106 espermatozoides/ml, mas preferentemente aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 5 X 106 espermatozoides/ml, aun mas preferentemente aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 106 espermatozoides ml, incluso de forma mas preferente aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 105 espermatozoides/ml, y lo mas preferente aproximadamente 1 x 105 espermatozoides/ml de dispersion. En un ejemplo alternativo, las dispersiones pueden contener espermatozoides en una densidad "intermedia", es decir, en una densidad de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 108 espermatozoides/ml de dispersion. En otro ejemplo alternativo mas, las dispersiones pueden contener espermatozoides en una densidad "relativamente elevada", es decir, en una densidad de al menos aproximadamente 1 x 108 espermatozoides/ml, preferentemente aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 5 x 1010 espermatozoides/ml, mas preferentemente aproximadamente 1,5 x 108 a aproximadamente 2 x 1010 espermatozoides/ml, incluso de forma mas preferente aproximadamente 1,5 x 108 a aproximadamente 2 x 108 espermatozoides/ml, y lo mas preferente aproximadamente 1,5 x 108 espermatozoides/ml de dispersion. De esta manera, por ejemplo, las dispersiones pueden contener al menos aproximadamente 0,04 x 106 espermatozoides/ml de dispersion en un ejemplo; al menos aproximadamente 1 x 106 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 1,5 x 106 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 2 x 106 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 3 x 106 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 0,5 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 1 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 1,25 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 2 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 3 x 107 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 4 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 5 x 107 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 6 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 7,0 x 107 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 8 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 9 x 107 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 10 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 11 x 107 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 12 x 107 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 1,0 x 108 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 1,25 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 1,5 x 108 en otro ejemplo; al menos

aproximadamente 1,75 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 2,0 x 108 en otro ejemplo; al menos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

aproximadamente 2,25 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 2,5 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 2,75 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 3 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 5 x 108 en otro ejemplo; al menos aproximadamente 7,0 x 108 en otro ejemplo; o incluso al menos aproximadamente 8 x 108 espermatozoides/ml de dispersion. En un ejemplo alternativo, la dispersion puede contener menos de aproximadamente 9 x 105, menos de aproximadamente 7 x 105, menos de aproximadamente 5 x 105, menos de aproximadamente 2 x 105, menos de aproximadamente 1 x 105, menos de aproximadamente 1 x 104, o incluso menos de aproximadamente 1 x 103 espermatozoides/ml de dispersion.

La densidad de espermatozoides puede variar basandose en numerosos factores, que incluyen, por ejemplo, las variaciones entre diferentes especies de mairnferos, las diferencias entre los mairnferos de una unica especie, e incluso las variaciones entre diferentes eyaculados de un unico mairnfero. Por ejemplo, los espermatozoides de bovino pueden estar en una dispersion a una mayor densidad, pero normalmente en un volumen mas pequeno, tal como por ejemplo 0,5 x 106 espermatozoides /ml a aproximadamente 8 x 107 espermatozoides/ml en un volumen de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 25 ml. Los espermatozoides de porcino, sin embargo, pueden estar en una dispersion a una baja densidad, pero normalmente en un volumen mayor, tal como por ejemplo 0,04 x 106 espermatozoides/ml a aproximadamente 1 x 107 espermatozoides/ml en un volumen de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 250 ml.

La densidad de espermatozoides en las dispersiones de esperma puede depender tambien del metodo por el cual las celulas espermaticas pueden enriquecerse o clasificarse sustancialmente. Por ejemplo, las celulas espermaticas pueden clasificarse utilizando citometna de flujo como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2005/0112541. En tal caso, la dispersion puede ser normalmente de densidad "intermedia" o "relativamente alta" de espermatozoides. Otras tecnicas de clasificacion o enriquecimiento, que se describe con mayor detalle en lo sucesivo, pueden beneficiarse de una densidad menor de espermatozoides, tal como una densidad "relativamente baja" de espermatozoides, marcados con un marcador, tales como, por ejemplo, los colorantes y marcas descritos en el presente documento.

La densidad de los espermatozoides en las dispersiones de esperma puede tambien manipularse artificialmente para conseguir una dispersion con una densidad espedfica de espermatozoides. Las manipulaciones de la densidad de espermatozoides en una dispersion de esperma, por ejemplo, en una pajilla de inseminacion, pueden basarse en factores tales como la temperatura a la cual se puede almacenar la dispersion, la duracion del periodo de almacenamiento, si los espermatozoides en la dispersion de esperma estan clasificados o no, las especies de mairnferos machos de los que se recogieron los espermatozoides, la fertilidad del mairnfero del que se recogieron los espermatozoides, y las especies de mairnferos hembras que se van a inseminar.

La densidad de los espermatozoides en una dispersion de esperma puede tambien verse afectada mediante concentracion simple de los espermatozoides, tal como por ejemplo, mediante centrifugacion. En tal caso, la dispersion se separana sustancialmente en lo que se denomina comunmente como aglomerado (una masa de celulas que contiene una cantidad minima de fluido) y un sobrenadante (una fraccion lfquida soluble). El sobrenadante puede decantarse a continuacion sin perturbar el aglomerado, dando como resultado por tanto un aglomerado relativamente denso de celulas espermaticas que contiene una cantidad minima del inhibidor, siendo el efecto reducir el volumen de la dispersion sin cambiar los componentes de la dispersion. Como resultado, las celulas espermaticas del aglomerado permanecen en un estado inmovil.

Inmovilidad de las celulas espermaticas

La dispersion de celulas espermaticas contiene celulas espermaticas que tienen una motilidad sustancialmente reducida. Se puede conseguir una reduccion sustancial de la motilidad de las celulas espermaticas en la dispersion de celulas espermaticas de numerosas maneras, incluyendo, por ejemplo, poner en contacto las celulas espermaticas con un inhibidor de la motilidad, reducir la temperatura de las celulas espermaticas o del entorno inmediato que rodea las celulas espermaticas (es decir, la dispersion espermatica), o mediante una combinacion de ambos. Las celulas espermaticas en la dispersion espermatica pueden comportarse, en determinados aspectos, de una manera caractenstica de los espermatozoides del epidfdimo; por ejemplo, las celulas espermaticas de la poblacion son sustancialmente inmoviles y/o pueden tener una menor velocidad de respiracion endogena en comparacion con los espermatozoides lavados o eyaculados recientemente. De manera ventajosa, las celulas espermaticas inmoviles, denominadas algunas veces celulas espermaticas quiescentes, tienen la capacidad, tras la separacion del inhibidor(es) o la exposicion a un aumento en la temperatura, de comportarse de una manera caractenstica de los espermatozoides eyaculados (y no caractenstica de los espermatozoides del epidfdimo) con respecto a la motilidad.

En un ejemplo, el inhibidor, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambas reduce la velocidad de la ruta (denominada algunas veces motilidad o motilidad de la ruta), velocidad progresiva (denominada algunas veces movilidad progresiva), o ambos, determinadas mediante el analisis HTM-IVOS del esperma (sistema de analisis del esperma asistido por ordenador Hamilton-Thorne HTM-IVOS de Hamilton-Thome Research, Beverly MA) de al menos aproximadamente un 50 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 60 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Mas preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 70 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. De forma aun mas preferente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 80 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Incluso mas preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 90 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Incluso mas preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 95 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. De manera mas preferida, el inhibidor de la movilidad reduce la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante un analisis HTM-IVOS del esperma, de al menos aproximadamente un 99 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la velocidad de la ruta, la velocidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie.

Se puede usar un inhibidor de la movilidad para reducir sustancialmente la movilidad de las celulas espermaticas en la dispersion de celulas espermaticas. El inhibidor puede ser cualquiera de una gama de composiciones que tienen un efecto depresor de la movilidad del esperma. Dichas composiciones incluyen, por ejemplo, inhibidores del canal de sodio, tal como, ouabaina; composiciones que comprenden iones potasio; y composiciones que comprenden iones potasio y sodio. Por ejemplo, concentraciones relativamente altas de iones potasio en la dispersion tienden a deprimir la motilidad del esperma. Por lo general, por tanto, se prefiere que la dispersion contenga una fuente de iones potasio y que la concentracion de potasio en la dispersion sea al menos de aproximadamente 0,05 moles/l. Mas preferentemente, la concentracion de potasio puede ser al menos aproximadamente de 0,05 moles/l a aproximadamente 0,5 moles/l. De forma aun mas preferente, la concentracion de potasio puede ser al menos aproximadamente de 0,1 moles/l a aproximadamente 0,3 moles/l. De manera mas preferida, la concentracion de potasio puede ser de aproximadamente 0,173 moles/l. Dichas dispersiones contendran normalmente, pero no de manera necesaria, una fuente de iones sodio. Cuando esta presente sodio, la relacion molar de potasio a sodio es generalmente igual a o mayor de 1:1, respectivamente, pero generalmente no excedera de una relacion molar de 8:1. Preferentemente, la relacion molar de potasio a sodio es al menos de aproximadamente 1,25:1, De forma aun mas preferente, la relacion molar de potasio a sodio es al menos de aproximadamente 1,5:1, De forma aun mas preferente, la relacion molar de potasio a sodio es al menos de aproximadamente 1,75:1, De forma aun mas preferente, la relacion molar de potasio a sodio es al menos de aproximadamente 1,78:1, En un ejemplo concreto, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 2:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 3:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 4:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 5:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 6:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 7:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de potasio a sodio puede ser al menos de aproximadamente 8:1.

La dispersion del esperma puede comprender adicionalmente un ion o una fuente de dioxido de carbono capaz de potenciar la regulacion por defecto de la motilidad. En un ejemplo, la fuente de dioxido de carbono puede ser, por ejemplo, uno o mas carbonatos. En un ejemplo, la dispersion del esperma comprende NaHCO3 y KHCO3, proporcionando por tanto una fuente de iones potasio y sodio, asf como una presion parcial aumentada del dioxido de carbono (con respecto a la atmosfera ambiente). Por ejemplo, la dispersion puede comprender NaHCO3 y KHCO3 en una solucion acuosa, preferentemente NaHCO3, KHCO3, y C6H8O7-H2O en agua; por lo general, la concentracion de KHCO3 en la dispersion puede ser al menos aproximadamente de 0,05 moles/l. Mas preferentemente, la concentracion de KHCO3 puede ser al menos aproximadamente de 0,05 moles/l a aproximadamente 0,5 moles/l. De forma aun mas preferente, la concentracion de KHCO3 puede ser al menos aproximadamente de 0,1 moles/l a aproximadamente 0,3 moles/l. En un ejemplo, la dispersion puede formarse utilizando un inhibidor de la motilidad que comprende 0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua como se describe en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963). Las celulas espermaticas permaneceran generalmente quiescentes siempre que se expongan al (a los) inhibidor(es) de la motilidad.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Cuando C6H8O7-H2O esta presente en la dispersion, la relacion molar de KHCO3 a NaHCO3 puede ser como se ha descrito anteriormente. La relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O puede ser generalmente igual a o mayor de 1:1, respectivamente, pero generalmente no excedera de una relacion molar de 8:1. Preferentemente, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 1,25:1. De forma aun mas preferente, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 1,5:1. De forma aun mas preferente, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 1,75:1. En un ejemplo, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 1,78:1. En otro ejemplo concreto, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 2:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 3:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 4:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 5:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 6:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C5H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 7:1. En otro ejemplo mas, la relacion molar de KHCO3 a C6H8O7-H2O es al menos de aproximadamente 8:1. En un ejemplo particularmente preferido, la dispersion puede formarse utilizando un tampon inhibidor que comprende 0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua como se describe en Salisbury & Graves, J. Reprod. Fertil., 6:351-359 (1963). Las celulas espermaticas permaneceran generalmente quiescentes siempre que se expongan al (a los) inhibidor(es) de la motilidad.

Las evidencias experimentales hasta la fecha sugieren ademas que la salud global y otras caractensticas vitales de las celulas espermaticas pueden mejorarse si la dispersion del esperma se mantiene en una atmosfera que reduce o evita la difusion del oxfgeno en la dispersion. Esto se puede conseguir sustituyendo la atmosfera de gas por encima de la dispersion del esperma con una atmosfera que tenga una presion parcial potenciada de, por ejemplo, dioxido de carbono, nitrogeno, u otros gases inertes con respecto al aire ambiente. En un ejemplo, la dispersion puede mantenerse en una atmosfera que tenga una presion parcial potenciada de dioxido de carbono con respecto al aire. En otro ejemplo, la atmosfera sobre la dispersion tiene una presion parcial de dioxido de carbono de al menos aproximadamente 0,0001 atm (10,13 Pa), pero generalmente menos de aproximadamente 5 atm (506,72 kPa) a presion atmosferica. En un ejemplo, la presion parcial del dioxido de carbono puede ser aproximadamente de 0,5 atm (50,67 kPa) a aproximadamente 2 atm (202,65 kPa) a presion atmosferica; en otro ejemplo, la presion parcial del dioxido de carbono puede ser aproximadamente de 0,9 atm (91,2 kPa) a aproximadamente 2 atm (202,65 kPa) a presion atmosferica; en otro ejemplo, la presion parcial del dioxido de carbono puede ser de aproximadamente 0,95 atm (96,26kPa) a aproximadamente 2 atm a presion atmosferica. En un ejemplo particularmente preferido, la atmosfera sobre la dispersion tiene una presion parcial de dioxido de carbono de al menos 0,9 atm (91,2 kPa); mas preferentemente, al menos aproximadamente 0,95 atm (96,26kPa).

Como alternativa, o ademas del uso de un inhibidor de la motilidad, la temperatura de las celulas espermaticas o la dispersion puede estar alterada a fin de inducir a las celulas espermaticas a volverse inmoviles. Se puede inducir la inmovilidad del esperma inducida por la temperatura, por ejemplo, reduciendo la temperatura de las celulas espermaticas o la dispersion de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 15 °C, preferentemente de aproximadamente 1°C a aproximadamente 10°C; mas preferentemente de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C, de forma aun mas preferente desde aproximadamente 3°C a aproximadamente 6 °C, e incluso de forma mas preferente de aproximadamente 4°Ca aproximadamente 5 °C, y de forma aun mas preferente aproximadamente 5 °C. Preferentemente, sin embargo, las celulas espermaticas no se exponen a temperaturas que afecten negativamente a la viabilidad de las celulas o afecten significativamente la capacidad de las celulas espermaticas de unirse o captar una marca.

En otro ejemplo, la temperatura de las celulas espermaticas o la dispersion del esperma puede alterarse de tal manera que las celulas espermaticas o la dispersion del esperma puede ser a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 50 °C, -preferentemente de aproximadamente 7°C a aproximadamente 43°C; mas preferentemente de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 39 °C; de forma aun mas preferente de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 30 °C; y lo mas preferente de aproximadamente 17 °C a aproximadamente 25 °C. En una realizacion especialmente preferida, la temperatura de las celulas espermaticas o de la dispersion que las rodea puede ser de aproximadamente 4 °C.

Las celulas espermaticas pueden exponerse a la temperatura reducida y, por tanto, volverse sustancialmente inmoviles, en cualquier momento una vez que las celulas se han obtenido del mairnfero fuente. Por ejemplo, se puede reducir la temperatura de las celulas espermaticas, induciendo por tanto la inmovilidad del esperma, tras la recogida de las celulas del mamffero fuente, tras combinar las celulas con un tampon, tras la formacion de la mezcla de marcado, incluyendo antes, durante, o despues del proceso de marcado, o tras la formacion de la dispersion de las celulas marcadas. En general, sin embargo, se puede inducir la inmovilidad del esperma mediante una reduccion de la temperatura antes de la inspeccion optica de la dispersion.

Por ejemplo, se puede reducir la temperatura de las celulas espermaticas (es decir, se puede inducir la inmovilidad del esperma) posterior al marcado de las celulas, permitiendo por tanto que se produzca el marcado a una temperatura mas preferida como se describe a continuacion. En un ejemplo, se puede reducir la temperatura de las celulas espermaticas o de la dispersion que las rodea (es decir, se puede inducir la inmovilidad del esperma) tras el marcado y antes de la inspeccion optica de las celulas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La exposicion de las celulas espermaticas al inhibidor, a temperature reducida, o a una combinacion de ambas induce que las celulas espermaticas se vuelvan inmoviles. En una realizacion, por ejemplo, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperature, o una combinacion de ambos reduce la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas de al menos un 60 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas de al menos un 70 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Mas preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas de al menos un 80 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas de al menos un 90 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie. Preferentemente, el inhibidor de la movilidad, la reduccion de la temperatura, o una combinacion de ambos reduce la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas de al menos un 99 % de las celulas espermaticas en la dispersion con respecto a la motilidad, la motilidad progresiva, o ambas, de las celulas espermaticas en un eyaculado reciente de la misma especie.

Las celulas se vuelven preferentemente inmoviles, independientemente del metodo utilizado, durante un tiempo suficiente para permitir la inspeccion optica de la dispersion, la determinacion de la posicion de las celulas miembro de la subpoblacion; y la dosificacion de las celulas miembro de la subpoblacion con una fuente de energfa. Si se desea separar ffsicamente las celulas dosificadas de las celulas no dosificadas, puede preferirse tambien mantener las celulas espermaticas en un estado inmovil a traves de esta etapa de proceso. De manera similar, si las celulas espermaticas se van a crioconservar, se pueden mantener en un estado inmovil durante la etapa de crioconservacion (independientemente de si las celulas dosificadas se separaron ffsicamente de las celulas no dosificadas antes de la crioconservacion). En una realizacion preferida, las celulas se mantienen inmoviles durante la etapa de crioconservacion.

Puede devolverse a las celulas inmoviles a un estado activo, es decir, comportamiento caractenstico de un eyaculado reciente, separando las celulas del inhibidor de la motilidad, exponiendolas al aire, aumentado la temperatura de las celulas o la dispersion celular (preferentemente a la temperatura ffpica de los espermatozoides eyaculados recientemente), mediante dilucion con suero salino fisiologico (Salisbury et al., 1963) o un tampon tal como un tampon TCA o PBS, o cualquier combinacion de los anteriores, dependiendo de, por ejemplo, el metodo usado para inducir la inmovilidad. Normalmente, al menos aproximadamente un 20 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 50 %, mas preferentemente al menos aproximadamente un 60 %, y de forma mas preferente al menos un 70 %, aun de forma mas preferente al menos un 80 %, aun de forma mas preferente al menos un 90 %, y de forma mas preferente al menos un 95 %, y lo mas preferente al menos aproximadamente un 99 % de las celulas que vuelven a un estado activo (es decir, las celulas reactivadas) tendran una velocidad de ruta, la velocidad progresiva, o ambos, como se ha medido mediante el analisis HTM-IVOS del esperma, que es al menos aproximadamente un 50 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 60 %, mas preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, y de forma mas preferente al menos un 80 %, aun de forma mas preferente al menos un 90 %, aun de forma mas preferente al menos un 95 %, y lo mas preferente al menos aproximadamente un 99 % de la velocidad de ruta, la velocidad progresiva, o ambas de las celulas espermaticas antes de combinarse con el inhibidor de la motilidad (es decir, de las celulas espermaticas de un eyaculado reciente).

Recogida de las celulas de un mairfffero

Se conocen diversos metodos de recogida de esperma viable. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, el metodo de la mano enguantada, el uso de una vagina artificial, y la electroeyaculacion.

En el momento de la recogida, o posteriormente, el esperma recogido puede combinarse con cualquiera de numerosos tampones diferentes que sean compatibles con el esperma, tales como TCA, HEPES, PBS, o cualquier otro tampon descrito en la publicacion de patente de Estados Unidos n.° US 2005/0003472. Por ejemplo, se puede recoger una muestra de semen de bovino, que contiene normalmente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10.000 millones de celulas espermaticas por mililitro, directamente del mairfffero fuente en un recipiente que contiene un tampon para formar una suspension de esperma. Como alternativa, la muestra de semen puede recogerse en un recipiente vacfo y a continuacion ponerse en contacto posteriormente con un tampon de varios minutos a horas tras la recogida para formar la suspension de esperma.

Como alternativa, las celulas espermaticas pueden recogerse directamente con un inhibidor de la motilidad en lugar de o ademas de un tampon, formando por tanto una dispersion de esperma. Las celulas espermaticas pueden recogerse directamente del animal en un recipiente que contiene un inhibidor de la motilidad para formar la dispersion del esperma, o como alternativa, pueden recogerse en un recipiente vacfo y a continuacion combinarse posteriormente con un inhibidor de la motilidad en varios minutos (o incluso horas) de recogida para formar la dispersion del esperma.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La dispersion del esperma puede contener tambien un intervalo de aditivos diferentes para potenciar la viabilidad del esperma. Los aditivos ilustrativos incluyen fuentes de protemas, antibioticos, factores de crecimiento, y composiciones que regulan las reacciones de oxidacion/reduccion intracelular y/o extracelularmente. Son bien conocidos en la tecnica los ejemplos de cada uno de estos aditivos, como se ha demostrado en la divulgacion de, por ejemplo, las solicitudes estadounidenses con numeros de serie 60/557.407 y 11/092.313.

Marcado de las celulas

Las celulas espermaticas se pueden marcar con cualquiera de numerosas marcas diferentes, incluyendo marcas que se unen al exterior de la celula (tales como, por ejemplo, anticuerpos marcados fluorescentemente) asf como marcas que cruzan la membrana celular y se unen a los contenidos internos de la celula (tales como, por ejemplo, colorantes fluorescentes selectivos para el ADN). En general, el proceso de marcado comprende poner en contacto las celulas espermaticas con una concentracion de marca (formando por tanto una mezcla de marcado, denominada algunas veces mezcla de tincion), a una temperatura y un pH que permiten una union rapida y eficaz o la captacion de la marca, durante un tiempo suficientemente largo para obtener el grado deseado de marcado, sin afectar sustancialmente la viabilidad de las celulas.

El esperma puede estar en la forma de un semen puro, o como alternativa, un derivado de semen que contiene esperma obtenido mediante centrifugacion o el uso de otros medios para separar el semen en fracciones. Las celulas espermaticas se ponen en contacto a continuacion o se combinan de otra forma con la marca para formar una mezcla de marcado; opcionalmente, la marca puede estar en la forma de un solido o una solucion. En general, sin embargo, la marca, las celulas espermaticas, o ambas estan en un medio tal como un tampon.

Las celulas espermaticas pueden combinarse con un tampon para formar una suspension de esperma. Se puede usar cualquiera de numerosos tampones diferentes que sean compatibles con el esperma, tales como por ejemplo, TCA, HEPES, PBS, o los tampones descritos en la publicacion de patente de Estados Unidos n.° US 2005/0003472. Una vez formada, la suspension de esperma puede combinarse con una fuente de una marca para formar una mezcla de marcado; opcionalmente, la marca puede estar en forma solida o lfquida y, como opcion adicional, puede comprender adicionalmente cualquiera de los tampones anteriormente mencionados.

En un ejemplo, la marca puede combinarse con un tampon para formar una suspension marcada y la suspension marcada combinarse con una fuente de esperma en la forma de semen puro, un derivado de semen que contiene esperma, o una suspension de esperma para formar una mezcla de marcado.

Se puede usar tampon que contenga un inhibidor de la motilidad para formar la mezcla de marcado. Por ejemplo, se puede incluir el inhibidor de la motilidad en el tampon usado para formar una suspension de esperma (que se combina a continuacion con la marca) o una suspension de marcado (que se combina a continuacion con una fuente de esperma) para formar la mezcla de marcado. En cualquier caso, el resultado es una dispersion de esperma que contiene un inhibidor de la motilidad y una marca.

Se puede formar la mezcla de marcado utilizando cualquiera de numerosas marcas, tales como por ejemplo, uno o mas colorantes excitables por UV o luz visible, colorantes selectivos para el ADN, como se ha descrito previamente en la patente de Estados Unidos n.° 5.135.759 y en el documento WO 02/41906. Los colorantes excitables a la luz UV ilustrativos selectivos para el ADN incluyen Hoechst 33342 y Hoechst 33258, cada uno de los cuales esta comercialmente disponible de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los colorantes excitables a la luz visible ilustrativos incluyen SYBR-14, comercialmente disponible de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) y el conjugado de bisbenzimida-BODIPY® 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboril)-3, 5-dimetil-1H-pirrol-2-il] metileno} -2H-pirrol-5-il) propanoil] amino}-N-[3-(metil {3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-ilo)-1H, 3'H-2,5'-bibenzimidazol-2'-

il]fenoxi{acetil)amino]propil}amino)-propil]hexanamida ("BBC") descrito en el documento WO 02/41906. Cada uno de estos colorantes puede usarse solo o en combinacion; como alternativa, se pueden usar otros colorantes excitables al UV y a la luz visible que penetran en las celulas, solos o combinados con los colorantes anteriormente mencionados, con la condicion de que el colorante no afecte negativamente a la viabilidad de las celulas espermaticas hasta un grado inaceptable cuando se usa en concentraciones que permiten la clasificacion como se describe en otra parte.

Como alternativa, la mezcla de marcado se puede formar utilizando poliamidas fluorescentes, y mas espedficamente poliamidas con una marca fluorescente o un indicador conjugado al anterior. Dichas marcas fluoresceran cuando se unan a los acidos nucleicos. Los ejemplos de poliamidas con una marca o indicador fluorescente unido al anterior incluyen, por ejemplo, las descritas en Best et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21): 12063-12068 (2003); Gygi, et al., Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002); patente de Estados Unidos n.° 5.998.140; patente de Estados Unidos n.° 6.143.901; y la patente de Estados Unidos n.° 6.090.947.

Se pueden usar tambien secuencias de nucleotidos fluorescentes para marcar las celulas espermaticas. Dichas secuencias de nucleotidos fluorescen cuando se hibridan con un acido nucleico que contiene una diana o una secuencia complementaria, pero sin embargo no son fluorescentes cuando estan en un estado no hibridado. Se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

describen dichos oligonucleotidos, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2003/0113765.

Se pueden usar tambien anticuerpos espedficos de sexo para marcar las celulas espermaticas en una mezcla de marcado. Por ejemplo, se puede conjugar un anticuerpo espedfico de sexo con un resto fluorescente (o una molecula indicadora equivalente). Como el anticuerpo se une a los antigenos presentes solamente en una celula que contiene un cromosoma X o, alternativamente, un cromosoma Y, se pueden identificar selectivamente dichas celulas basandose en su fluorescencia (frente a la no fluorescencia de una celula sin marcar). Ademas, se puede usar de forma simultanea mas de un anticuerpo espedfico de sexo, teniendo cada anticuerpo un resto fluorescente diferente unido al anterior. Esto permite la diferenciacion de las celulas que contienen un cromosoma X y un cromosoma Y basandose en la fluorescencia diferente de cada uno.

Se pueden usar tambien nanocristales luminiscentes selectivos al color para marcar celulas espermaticas en una mezcla de marcado. Denominadas tambien puntos cuanticos, estas partfculas son bien conocidas en la materia, como se ha demostrado mediante la patente de Estados Unidos n.° 6.322.901 y la patente de Estados Unidos patente n.° 6.576.291. Estos nanocristales se han conjugado con numerosos materiales biologicos, incluyendo, por ejemplo, peptidos, anticuerpos, acidos nucleicos, estreptavidina, y polisacaridos, (vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 6.207.392; 6.423.551; 5.990.479, y 6.326.144), y se han usado para detectar dianas biologicas (veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 6.207.392 y 6.247.323).

La concentracion preferida de la marca en la mezcla de marcado es funcion de diferentes variables entre las que se incluyen, por ejemplo, si la marca se une al exterior de la celula o si debe cruzar la membrana celular; si debe cruzar la membrana celular, la permeabilidad de las celulas a la marca seleccionada; la temperatura de la mezcla de marcado; el lapso de tiempo que se deja para que se produzca la mezcla; y el grado de selectividad deseado. Por lo general, la concentracion de la marca es preferentemente suficiente para conseguir el grado deseado de marcado de las celulas en un periodo de tiempo razonablemente corto sin afectar sustancialmente de forma perjudicial la viabilidad del esperma. Por ejemplo, la concentracion de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC, en la mezcla de marcado estara generalmente entre aproximadamente 0,1 |jM y aproximadamente 1,0 M, preferentemente de aproximadamente 0,1 jM a aproximadamente 700 jM, y mas preferentemente de aproximadamente 100 jM a aproximadamente 200 jM. La concentracion de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR- 14, o BBC, en la mezcla de tincion puede ser generalmente de aproximadamente 400 jM a aproximadamente 500 jM, y lo mas preferente aproximadamente 450 jM. De acuerdo con ello, para un conjunto de condiciones de marcado, la concentracion de Hoechst 33342 es preferentemente de aproximadamente 100 jM. En otro conjunto de condiciones de marcado, la concentracion de Hoechst 33342 es aproximadamente 150 jM. En otro conjunto adicional de condiciones de marcado, la concentracion es preferentemente de aproximadamente 200 jM. En otro conjunto mas de condiciones de marcado, la concentracion de Hoechst 33342 es lo mas preferente de aproximadamente 450 jM.

Como ejemplo adicional, la concentracion de una poliamida fluorescente, tales como por ejemplo, las descritas en la publicacion de aplicacion de Estados Unidos n.° 2001/0002314, estara generalmente entre aproximadamente 0,1 jM y aproximadamente 1 mM, preferentemente entre aproximadamente 1 jM a aproximadamente 1 mM, mas preferentemente de aproximadamente 5 jM a aproximadamente 100 jM, incluso mas preferentemente aproximadamente 10 jM.

Una vez formada, la mezcla de marcado se puede mantener en cualquiera de un intervalo de temperaturas. Por ejemplo, el marcado con Hoechst 33342 o Hoechst 33258 se llevara a cabo normalmente en un intervalo de aproximadamente 4°C a aproximadamente 50°C. Por ejemplo, la mezcla de marcado puede mantenerse a una temperatura "relativamente baja", es decir, una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 30°C; preferentemente de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 30 °C, mas preferentemente de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C, y lo mas preferente a aproximadamente 28 °C. Como alternativa, y de acuerdo con la presente invencion, la mezcla de marcado puede mantenerse en un intervalo de temperatura "intermedio", es decir, una temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 39°C. En otro ejemplo, la mezcla de marcado puede mantenerse en un intervalo de temperatura "relativamente alto", es decir, una temperatura de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 50°C; preferentemente de aproximadamente 40°C a aproximadamente 45°C, mas preferentemente de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 43 °C, lo mas preferente a aproximadamente 41°C. La seleccion de una temperatura preferida depende generalmente de una gama de variables, incluyendo, por ejemplo, si la marca se une al exterior de la celula o si debe cruzar la membrana celular; si debe cruzar la membrana celular, la permeabilidad de las celulas a la marca seleccionada; la concentracion de la(s) marca(s) en la mezcla de marcado; el lapso de tiempo que se deja para que se produzca la mezcla; y el grado de selectividad deseado.

El pH de la mezcla de marcado puede mantenerse a cualquiera de un intervalo de pH. Por ejemplo, el marcado con Hoechst 33342 o Hoechst 33258 se llevara a cabo normalmente en un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0. Por ejemplo, la mezcla de marcado puede mantenerse a un pH "ligeramente acido", es decir, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En un ejemplo, el pH puede ser preferentemente de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0, mas preferentemente de aproximadamente 6,0 a aproximadamente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6,5, y lo mas preferente a aproximadamente 6,2. En un ejemplo alternativo, la mezcla de marcado puede mantenerse a un pH "ligeramente basico", es decir, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,0. El pH puede ser preferentemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0, mas preferentemente de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5, y lo mas preferente a aproximadamente 7,3. En general, sin embargo, si el marcado se lleva a cabo a un pH diferente de aproximadamente 7,0, una vez durante un periodo de tiempo suficiente para obtener que se produzca el grado deseado de marcado, la mezcla de marcado se ajustara a un pH de aproximadamente 7,0.

Opcionalmente, la mezcla de marcado puede contener tambien aditivos para potenciar la viabilidad del esperma. Los aditivos ilustrativos incluyen un antibiotico, un factor de crecimiento, o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion intracelular y/o extracelularmente como se ha descrito anteriormente a la recogida de muestras celulares. Estos aditivos pueden anadirse a la mezcla de marcado de acuerdo con lo anteriormente expuesto.

Se deja que la captacion de la marca por o la union de la marca a las celulas espermaticas en la mezcla de marcado transcurra durante un periodo de tiempo suficiente para obtener una dispersion de celulas espermaticas marcada en el grado deseado. Este periodo es normalmente un periodo suficiente para que la marca se una a las celulas espermaticas o al ADN de las celulas espermaticas de tal manera que un miembro de una subpoblacion de celulas puede identificarse en su posicion en la dispersion determinada. La seleccion de un periodo preferido depende generalmente de un intervalo de variables, incluyendo, por ejemplo, si la marca se une al exterior de la celula o si debe cruzar la membrana celular; si debe cruzar la membrana celular, la permeabilidad de las celulas a la marca seleccionada; la concentracion de la(s) marca(s) en la mezcla de marcado; la temperatura de la mezcla de marcado; y el grado de selectividad deseado. Por ejemplo, el periodo puede ser un periodo suficiente para que un colorante fluorescente selectivo al ADN se una al ADN de las celulas espermaticas que contienen el cromosoma X y el cromosoma Y de tal manera que se puedan seleccionar basandose en la diferenciacion y en la intensidad de la fluorescencia medibles entre las dos. Cuando, se realiza el marcado con Hoechst 33342 o Hoechst 33258, por ejemplo, normalmente, este periodo no sera superior a aproximadamente 160 minutos, preferentemente no superior a aproximadamente 90 minutos, de forma aun mas preferente no superior a aproximadamente 60 minutos, y lo mas preferente no superior a aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 40 minutos.

Determinadas marcas, y en particular determinados colorantes, son capaces de penetrar en las celulas espermaticas y unirse espedficamente al ADN sin intervencion adicional para aumentar la permeabilidad de las celulas. Con otras marcas, sin embargo, puede ser deseable tratar las celulas espermaticas antes del marcado para aumentar la velocidad de permeacion sin reducir de forma inaceptable la viabilidad o la motilidad. Se puede usar cualquier metodo conocido por los expertos en la materia. Dichos metodos incluyen la electroporacion, el uso de soluciones potenciadoras de la permeacion celular, por ejemplo, tensioactivos suaves, o choque qrnmico. Cuando se desea o es ventajoso utilizar otras tecnicas mas rigurosas, dichos tratamientos pueden incluir el uso de liposomas o muchas de las tecnicas que usan los expertos en la materia para colorantes, tintes, genes, o vectores en celulas vivas. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a microinyeccion tal como se ha utilizado por Gordon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(12): 7380-4 (1980)) y desde entonces se ha extendido a conejos, ovejas, ganado y cerdos; transferencia mediada por DEAE-dextrano; coprecipitacion con fosfato de calcio; y otras tecnicas, todas las cuales son conocidas por un experto en la materia. En otros casos, puede ser deseable centrifugar el esperma y volver a suspender el esperma centrifugado en otro medio, basandose practicamente en el mismo o sustancialmente el mismo sistema tampon, para eliminar determinados componentes (que se habfan anadido previamente a la dispersion de esperma) que pueden interferir con etapas de procesamiento posteriores.

Un metodo particularmente preferido de aumentar la permeabilidad de una celula espermatica a una marca es el metodo bien conocido de optoinyeccion que se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.753.161. En general, la optoinyeccion es un metodo de permeabilizar transitoriamente una celula poniendo en contacto la celula con un pulso de radiacion. Se ilumina una celula, se identifica y se localiza basandose en la deteccion de la iluminacion de la celula, y se irradia con un pulso de radiacion suficiente para permeabilizar transitoriamente la celula. Por ejemplo, se puede usar la optoinyeccion para permeabilizar transitoriamente celulas espermaticas y permitir por tanto que se unan marcas al contenido interno de una celula (tal como, por ejemplo, marcas que se unen a aDn o ARN) para penetrar mas facil y eficazmente en las celulas. Por tanto, se puede usar la optoinyeccion, por ejemplo, para disminuir el tiempo necesario para marcar suficientemente las celulas espermaticas con un colorante fluorescente selectivo al ADN, tal como Hoechst 33342, Hoechst 33258, o con una poliamida fluorescente.

Se puede usar tambien la optoinyeccion para marcar celulas a temperaturas reducidas. Anteriormente, las celulas espermaticas se marcaban generalmente con, por ejemplo, colorantes fluorescentes selectivos al ADN, a temperaturas superiores a 30 °C e incluso 40 °C, ya que las temperaturas mas elevadas ayudaban a aumentar la captacion de colorante. Aunque el marcado a dichas temperaturas es ciertamente factible, puede ser beneficioso evitar la exposicion de las celulas espermaticas a mayores temperaturas, especialmente durante un periodo de tiempo prolongado. Por tanto, se puede usar la optoinyeccion para permeabilizar las celulas espermaticas, permitiendo de esta forma el marcado de las celulas a una temperatura menor, manteniendo o excediendo ademas a la vez la eficacia de la tincion y la velocidad tfpicamente asociada con el marcado a temperaturas mayores.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Por ejemplo, la mezcla de marcado se puede formar utilizando comprendiendo celulas espermaticas, un inhibidor de la motilidad, y un colorante en una concentracion de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 200 pM, y la mezcla de tincion se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 41 °C. En otro ejemplo, el inhibidor de la motilidad comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7-H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l C6H8O7-H2O en agua).

En un ejemplo, la mezcla de marcado se puede formar utilizando comprendiendo celulas espermaticas, un inhibidor de la motilidad, y un colorante en una concentracion de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 500 pM, y la mezcla de tincion se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 41 °C. En otro ejemplo, la concentracion del colorante puede ser de 450 pM. En otro ejemplo, el inhibidor de la motilidad comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7-H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l C6H8O7-H2O en agua).

En otro ejemplo mas, la mezcla de marcado se puede formar utilizando comprendiendo celulas espermaticas, un inhibidor de la motilidad, y un colorante en una concentracion de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 200 pM y la mezcla de tincion se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28 °C. En otro ejemplo, el inhibidor de la motilidad comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7-H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l C6H8O7-H2O en agua).

En otro ejemplo mas, la mezcla de marcado se puede formar utilizando comprendiendo celulas espermaticas, un inhibidor de la motilidad, y un colorante en una concentracion de aproximadamente 400 pM a aproximadamente 500 pM, y la mezcla de tincion se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28 °C. En otro ejemplo, la concentracion del colorante puede ser de 450 pM. En otra realizacion, el inhibidor de la motilidad comprende 0,204 g de NaHCO3, 0,433 g de KHCO3, y 0,473 g de C6H8O7-H2O por 25 ml de agua purificada (0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l C6H8O7-H2O en agua).

Formacion de una dispersion de celulas marcadas

Una vez que se forma una mezcla de marcado, la mezcla de marcado se usa para formar una dispersion de celulas marcadas, que posteriormente se inspecciona y dosifica. Dicha dispersion comprende celulas espermaticas marcadas y un agente qmmico que induce la inmovilidad del esperma. Como alternativa, o ademas de, la dispersion puede comprender un lfquido, tal como un tampon como se ha descrito anteriormente, ademas de las celulas espermaticas marcadas, y en el que la temperatura de las celulas o el lfquido induce la inmovilidad del esperma.

Las celulas espermaticas marcadas pueden estar en cualquiera de numerosas formas. Por ejemplo, las celulas marcadas pueden ademas ser parte de la mezcla de marcado. De este modo, las celulas marcadas pueden estar ademas en exceso o en una marca sin unir. Como alternativa, las celulas marcadas pueden haber sido separadas de cualquier exceso o en una marca sin unir, tal como por ejemplo lavando las celulas o centrifugando las celulas, tal como mediante centrifugacion, y a continuacion separando las celulas de la marca sin unir. En tal caso, las celulas marcadas se combinaran posteriormente con un tampon como se ha descrito anteriormente con respecto a la recogida de una muestra de celulas. En cualquier caso, las celulas espermaticas de la dispersion se marcan de tal manera que la ausencia o la cantidad de la marca asociada con una o mas de las celulas espermaticas permite la identificacion de una caractenstica genetica, proteomica, estructural, o funcional de una subpoblacion de celulas espermaticas en la dispersion. Las celulas espermaticas pueden mantenerse a una temperatura que induce o aumenta la inmovilidad del esperma.

La dispersion de las celulas marcadas puede contener tambien un agente qmmico que induce la inmovilidad del esperma, tal como, por ejemplo, un inhibidor de la motilidad como se ha descrito anteriormente. Se puede anadir el agente qmmico a la mezcla de marcado o a las celulas marcadas en cualquier momento antes de la inspeccion optica de la dispersion, tales como por ejemplo, antes, durante, o despues del marcado de las celulas espermaticas. El agente qmmico puede combinarse con celulas marcadas, estando las celulas marcadas en cualquiera de las numerosas formas descritas anteriormente (es decir, aun en la mezcla de marcado o extrafdas de la misma). En un ejemplo concreto, puede formarse una mezcla de marcado que comprende celulas espermaticas y una marca, y a continuacion se puede combinar la mezcla de marcado con el agente qmmico que induce la inmovilidad del esperma. Como alternativa, o ademas del agente qmmico, se puede reducir la temperatura de la mezcla de marcado como se ha descrito anteriormente para inducir o aumentar la inmovilidad del esperma.

Inspeccion, determinacion, y dosificacion de las celulas

Una vez que se ha formado una dispersion de celulas marcadas, la dispersion se examina opticamente para identificar las celulas espermaticas individuales como miembros de la subpoblacion, se determinan las posiciones de los miembros de la subpoblacion en la dispersion, y se suministra un haz de energfa en diferentes posiciones en la dispersion para dosificar selectivamente a los miembros de la subpoblacion con una fuente de energfa,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

disminuyendo por tanto la viabilidad de las celulas dosificadas, o al menos su capacidad para fertilizar un ovulo, sin afectar de forma similar a las celulas espermaticas en otras posiciones en la dispersion.

Estas etapas se llevan a cabo normalmente mediante un dispositivo que se denomina de forma comercial Plataforma Tecnologica LEAP® (analisis y procesamiento conseguido por laser) (Cyntellect, Inc., San Diego, CA). En general, este proceso requiere que las celulas se marquen con un marcador para identificar y localizar celulas individuales de una subpoblacion de celulas en una mezcla o una poblacion mas grande de celulas. A continuacion se ilumina la poblacion de celulas, permitiendo identificar la posicion de las celulas individuales de la subpoblacion. A continuacion se situa un tratamiento con laser de tal manera que pueda emitir un haz de energfa para inducir un cambio en las celulas identificadas de la subpoblacion. El cambio inducido es usualmente la muerte celular. Estos procesos y dispositivos se describen adicionalmente en las patentes de Estados Unidos con numeros 6.534.308; 6.514.722; 6.753.161; y 6.642.018.

La fuente de energfa utilizada puede ser cualquier fuente que, cuando se aplica en una determinada dosis a las celulas espermaticas, disminuye la viabilidad de las celulas dosificadas, o al menos su capacidad para fertilizar un ovulo, con efecto mmimo o sin efecto similar para las celulas espermaticas situadas en otras posiciones de la dispersion. Normalmente, la fuente de energfa estara en la forma de un haz de energfa. Los ejemplos de fuentes de energfa adecuadas que incluyen laseres, luz no de laser colimada o focalizada, energfa RF, partfculas aceleradas, energfa ultrasonica focalizada, haces de electrones, u otros haces de radiacion. Preferentemente, sin embargo, la fuente de energfa es un laser, ya que un laser proporciona las ventajas de una elevada intensidad y un uso relativamente eficaz de la energfa en un tamano compacto con minima generacion de calor, permitiendo por tanto la dosificacion de una celula individual sin afectar significativamente de forma adversa las celulas que los rodean.

Las celulas se pueden colocar en cualquier superficie adecuada para la inspeccion optica y la dosificacion de las celulas. En general, dichas superficies tendran una superficie horizontal (tanto la parte superior, la parte inferior, o ambas), que es opticamente transparente para la fuente de energfa utilizada para inspeccionar opticamente las celulas, asf como la fuente de energfa utilizada para dosificar los miembros de la subpoblacion. Dichas superficies adecuadas incluyen, por ejemplo, vidrio, plasticos u otros polfmeros relacionados, y Pyrex®, y pueden estar en la forma de un porta plano, una placa Petri, una placa de un unico pocillo, o una placa de muchos pocillos. Se describen ejemplos en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos con numeros 6.534.308 y 6.514. 722.

Se puede dividir una muestra de celulas espermaticas en varias muestras individuales mas pequenas, tales como por ejemplo, dividiendose en varias muestras individuales para su uso con una placa de muchos pocillos. Cada muestra (por ejemplo, en cada pocillo) puede enriquecerse para la misma caractenstica, produciendo por tanto multiples muestras, cada una de las cuales esta enriquecida una unica caractenstica. De manera ventajosa, sin embargo, cada una de las muestras puede enriquecerse para una caractenstica diferente. A modo de ejemplo, una muestra de celulas espermaticas puede dividirse en muestras individuales mas pequenas, y cada muestra individual colocarse en un pocillo de una placa de 96 pocillos. La muestra individual de cada pocillo puede a continuacion enriquecerse con respecto a una unica caractenstica diferente de la de las muestras en cada uno de los otros pocillos, dando como resultado 96 muestras individuales, cada una enriquecida con respecto a una caractenstica diferente.

Una vez que las celulas miembros de la subpoblacion se han dosificado con una fuente de energfa, la poblacion de celulas se puede enriquecer purificando las celulas no dosificadas (es decir, las celulas espermaticas que no se dosificaron con energfa). Se puede producir la purificacion de las celulas no dosificadas mediante la eliminacion tanto de las celulas dosificadas como de las celulas no dosificadas de la dispersion, dando como resultado una subpoblacion que comprende celulas no dosificadas que estan enriquecidas para una caractenstica concreta. Por ejemplo, si la caractenstica concreta son las celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y, las celulas no dosificadas pueden purificarse de tal manera que comprendan al menos aproximadamente un 85 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; mas preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; incluso de forma mas preferente al menos un 97 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y, - y lo mas preferido al menos un 99 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y. Como alternativa, si la caractenstica concreta deseada son las celulas espermaticas que contienen el cromosoma X, las celulas no dosificadas pueden purificarse de tal manera que comprendan al menos aproximadamente un 85 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; mas preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; incluso de forma mas preferente al menos un 97 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; y lo mas preferente al menos aproximadamente un 99 % de celulas que contienen el cromosoma X.

La eliminacion tanto de las celulas dosificadas como de las celulas no dosificadas procedentes de la dispersion dosificada (es decir, procedente de la poblacion mas grande de celulas espermaticas que comprenden las celulas dosificadas y las no dosificadas) puede conseguirse mediante cualquiera de numerosos medios conocidos en la materia. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, centrifugando la dispersion completa, tal como mediante centrifugacion, y a continuacion retirando o absorbiendo el sobrenadante que contiene las celulas dosificadas. Otro

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

metodo incluye la adicion de medio de alta densidad a la dispersion. Los medios de alta densidad que se pueden anadir a la dispersion incluyen, por ejemplo, Percoll® e Isolate®. En general, en una separacion de alta densidad, celulas viables (es decir, celulas no dosificadas con respecto a la presente solicitud) son capaces de flotar hacia la parte superior del medio de alta densidad y pueden por tanto separarse de la parte superior del medio, mientras que las celulas danadas o muertas (es decir, las celulas dosificadas) seguiran dispersas en el medio de alta densidad, generalmente en la fase voluminosa. Son bien conocidos en la materia los metodos para utilizar dichos medios.

De manera ventajosa, una dispersion de celulas marcadas puede contener una subpoblacion de celulas marcadas con diferentes marcas. Cada marca puede identificar una caractenstica diferente, proteomica, estructural, o funcional de una subpoblacion de celulas espermaticas en la dispersion. Ademas, cada marca puede ser detectable individualmente cuando se une a una celula espermatica; es decir, es posible detectar por separado las diferentes marcas. Por ejemplo, cada una de las marcas puede fluorescer a diferentes longitudes de onda.

Se puede anadir una marca diferente a la mezcla de marcado o a la dispersion de las celulas marcadas. Como alternativa, una marca diferente puede anadirse posteriormente a cualquiera de las etapas de inspeccion, determinacion, o dosificacion de las celulas. Preferentemente, sin embargo, se anadira posteriormente una marca diferente a la dosificacion de la dispersion. Por ejemplo, una vez que se han dosificado los miembros de una subpoblacion de celulas espermaticas, la dispersion dosificada (incluyendo las celulas dosificadas y las celulas no dosificadas) o una dispersion dosificada purificada (incluyendo solo las celulas no dosificadas) puede marcarse de nuevo, pero con una marca diferente, y se puede repetir el proceso de inspeccion, determinacion, y dosificacion de las celulas, generalmente como se ha descrito anteriormente, basandose en la ausencia o en la cantidad de las diferentes marcas asociadas con una celula espermatica.

En general, se puede utilizar la marca diferente para identificar una caractenstica genetica adicional, proteomica, estructural, o funcional de las celulas no dosificadas que pueden ser diferentes de la caractenstica usada paraa identificar previamente los miembros de una subpoblacion a los cuales se administro una dosis de energfa (es decir, que es diferente de la caractenstica usada para determinar previamente las celulas que se van a dosificar o que no se van a dosificar). Esto proporciona una manera de enriquecer adicionalmente una poblacion de celulas ya enriquecida.

A modo de ejemplo, la dispersion de celulas marcadas puede formarse utilizando colorante fluorescente selectivo para ADN. A continuacion, la dispersion puede inspeccionarse opticamente para identificar celulas espermaticas individuales que contienen un cromosoma X. La posicion de las celulas que contienen el cromosoma X puede determinarse posteriormente, y a continuacion se puede suministrar una dosis de energfa a una o mas de las celulas que contienen el cromosoma X, consiguiendo por tanto una poblacion de celulas viables que contienen el cromosoma Y enriquecido. A continuacion, la dispersion dosificada (que incluye tanto celulas dosificadas (que contienen el cromosoma X) y como no dosificadas (que contienen el cromosoma Y)) o una dispersion dosificada purificada (que incluye solo las celulas no dosificadas) puede marcarse con otra marca que indique la integridad acrosomica, tales como por ejemplo, aglutinina de cacahuete conjugada con ficoeritrina (PE-PNA) que induce la fluorescencia de la celula, y en particular la fluorescencia acrosomica, cuando se pone en contacto con una celula que tiene un acrosoma que se ha hecho reaccionar o danado. Se pueden llevar a cabo a continuacion las etapas de identificacion y determinacion optica de la posicion de las celulas fluorescentes con PE-PNA, y dosificar dichas aquellas celulas con energfa. El resultado es una subpoblacion de celulas no dosificadas que contienen el cromosoma Y y que tienen acrosomas que no han reaccionado y no estan danados (es decir, estan intactos). Vease, por ejemplo, Nagy y col., Biol Reprod, 68: 1828-1835 (2003).

Crioextension de las celulas

Una vez que las celulas miembros de la subpoblacion se han dosificado con una fuente de energfa, la poblacion completa de celulas espermaticas (celulas dosificadas y celulas no dosificadas) o un subconjunto de la poblacion (las celulas no dosificadas solo) puede enfriarse o congelarse para su uso en una fecha posterior, por ejemplo, en procedimientos de fertilizacion. En dichos casos, las celulas espermaticas no dosificadas pueden beneficiarse de la adicion de un crioextensor para minimizar el impacto tras la viabilidad o la motilidad posterior a la congelacion como resultado del enfriamiento y la congelacion.

En general, un crioextensor puede comprender una fuente de protema, un crioprotector, y un inhibidor de la motilidad. Si se incluye, se puede anadir una fuente de protemas para proporcionar soporte a las celulas. La fuente de protemas puede ser cualquier fuente de protemas que no interfiera con la viabilidad de las celulas espermaticas no dosificadas y sea compatible con el inhibidor de la motilidad. Los ejemplos de fuentes de protemas comunes incluyen leche (incluyendo leche homogeneizada y desnatada tratada termicamente), extracto lacteo, yema de huevo, extracto de yema de huevo, protema de soja y extracto de protema de soja. Dichas protemas pueden encontrarse en una concentracion de aproximadamente 10 % (v/v) a aproximadamente 30 % (v/v), preferentemente de aproximadamente 10 % (v/v) a aproximadamente 20 % (v/v), y mas preferentemente aproximadamente un 20 % (v/v).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se puede incluir preferentemente un crioprotector en el crioextensor para disminuir o evitar el choque fno o para mantener la fertilidad de las celulas espermaticas no dosificadas. Se conocen en la materia numerosos crioprotectores. Puede variar la seleccion de un crioprotector adecuado para su uso con un extensor dado, y depende de las especias a partir de las cuales se obtuvieron los espermas que se iban a congelar. Los ejemplos de crioprotectores adecuados incluyen, por ejemplo, glicerol, dimetil sulfoxido, etilenglicol, propilenglicol, trehalosa, Triladyl®, y combinaciones de los mismos. Si se incluye, en general, estos crioprotectores estan presente en el crioextensor en una cantidad de aproximadamente 1 % (v/v) a aproximadamente l5 % (v/v), preferentemente en una cantidad de aproximadamente 5 % (v/v) a aproximadamente 10 % (v/v), mas preferentemente en una cantidad de aproximadamente 7 % (v/v), y lo mas preferente en una cantidad de aproximadamente 6 % (v/v).

Ademas, el crioextensor puede contener un inhibidor de la motilidad como se ha descrito anteriormente con respecto a la recogida de muestras celulares. El (los) inhibidor (es) de la motilidad pueden anadirse al crioextensor de acuerdo con lo anterior.

En un ejemplo, el crioextensor comprende un inhibidor de la motilidad, agua, Triladyl®, yema de huevo, y acido piruvico. En otro ejemplo mas, el crioextensor comprende 0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua, y 25 g de Triladyl®, 25 g de yema de huevo, y acido piruvico 10 mM por 75 ml de agua.

En otro ejemplo concreto, el crioextensor comprende un inhibidor de la motilidad, agua, Triladyl®, y yema de huevo. En otro ejemplo mas, el crioextensor comprende 0,097 moles/l de NaHCO3, 0,173 moles/l de KHCO3, 0,090 moles/l de C6H8O7-H2O en agua, y 25 g de Triladyl®, y 25 g de yema de huevo por 75 ml de agua.

Opcionalmente, el crioextensor puede contener tambien un antibiotico o una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion intracelular y/o extracelularmente como se ha descrito anteriormente con respecto a la recogida de muestras celulares. Se puede anadir cada uno de estos aditivos al crioextensor de acuerdo con lo anterior.

La crioconservacion de la poblacion completa de esperma (es decir, la crioconservacion de la dispersion dosificada) da como resultado la formacion de una dispersion congelada que tiene dos subpoblaciones, siendo cada una de estas dos subpoblaciones sustancialmente diferente de la otra. Sin embargo, cada subpoblacion se compone de celulas sustancialmente homogeneas. Es decir, cada subpoblacion esta comprendida por celulas, cada una de las celulas individuales de una subpoblacion individual tiene una caractenstica comun a cada una de las otras celulas en la misma subpoblacion. En el ejemplo, la dispersion puede enriquecerse ademas antes de la crioconservacion purificando la dispersion, en funcion de la presencia o la ausencia de la(s) caractenstica(s) comun(es), de acuerdo con los metodos descritos anteriormente.

Por tanto, por ejemplo, el presente proceso podna utilizarse para formar una dispersion de esperma congelado, comprendiendo la dispersion una subpoblacion dosificada de celulas, en la que todas las celulas de la subpoblacion dosificada son celulas que contienen el cromosoma X, y una subpoblacion no dosificada de celulas, en la que todas las celulas de la subpoblacion no dosificada son celulas que contienen el cromosoma Y. De acuerdo con este ejemplo, las celulas que no reciben una dosis de energfa (es decir, las celulas no dosificadas que contienen el cromosoma Y) comprenderan al menos aproximadamente un 85 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; mas preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; incluso de forma mas preferente al menos aproximadamente un 97 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma Y; y lo mas preferente al menos aproximadamente un 99 % de celulas que contienen el cromosoma Y.

Como alternativa, el presente proceso podna utilizarse para formar una dispersion de esperma congelado, comprendiendo la dispersion una subpoblacion dosificada de celulas, en el que todas las celulas de la subpoblacion dosificada son celulas que contienen el cromosoma Y, y una subpoblacion no dosificada de celulas, en la que todas las celulas de la subpoblacion no dosificada son celulas que contienen el cromosoma X. De acuerdo con este ejemplo, las celulas no dosificadas que contienen el cromosoma X comprenderan al menos aproximadamente un 85 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; mas preferentemente al menos aproximadamente un 95 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X, incluso de forma mas preferente al menos un 97 % de celulas espermaticas que contienen el cromosoma X; y lo mas preferente al menos aproximadamente un 99 % de celulas que contienen el cromosoma X.

Fertilizacion

Se puede usar un novedoso proceso para fertilizar un ovulo o un mairnfero hembra para disminuir selectivamente la viabilidad de una subpoblacion de celulas espermaticas en una dispersion celular como se ha descrito anteriormente.

5

10

15

20

25

30

Una vez que se ha producido la dosificacion de la dispersion de las celulas marcadas, se puede usar la dispersion dosificada (que comprende tanto las celulas dosificadas como no dosificadas) para fertilizar un mairnfero hembra. La fertilizacion se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquiera de los numerosos metodos bien conocidos por los expertos en la materia. Estos metodos incluyen, por ejemplo, microinyeccion, inseminacion artificial, y otros metodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, una dispersion dosificada que comprende las celulas dosificadas y no dosificadas, dispersion purificada que comprende solo las celulas no dosificadas, o un derivado de cualquiera de las anteriores, se puede usar para inseminar un marnffero hembra, tales como por ejemplo, mediante inseminacion artificial.

Como alternativa, una vez que se ha producido la dosificacion de la dispersion de las celulas marcadas, la dispersion puede utilizarse para fertilizar un ovulo, y mas especialmente, un ovulo in vitro. El ovulo fertilizado puede introducirse posteriormente en el utero de un mamffero hembra mediante cualquiera de numerosos medios bien conocidos por los expertos en la materia, tales como por ejemplo el trasplante de embriones. Por ejemplo, se puede utilizar una dispersion dosificada, una dispersion purificada, o un derivado de cualquiera para fertilizar un ovulo in vitro. Posteriormente, el ovulo fertilizado puede introducirse en el utero de un mamffero hembra.

Se puede producir la fertilizacion de un mamffero hembra o de un ovulo in vitro usando cualquiera de las dispersiones anteriormente mencionadas dosificando poco despues que se ha completado la dispersion, tales como por ejemplo, en aproximadamente 7 dfas, preferentemente en aproximadamente 5 dfas, mas preferentemente en aproximadamente 3 dfas, aun mas preferentemente en aproximadamente 2 dfas, y en un ejemplo, en aproximadamente 1 dfa despues que se ha completado la dispersion. En tal caso, la dispersion, en general, puede no haberse crioconservado antes de la fertilizacion de un mamffero hembra o de un ovulo in vitro (es decir, la dispersion es reciente o comprende celulas espermaticas recientes); en vez de esto, puede haberse mantenido en un inhibidor de la motilidad y/o puede haberse refrigerado a temperaturas de aproximadamente 2°C a aproximadamente 7 °C, mas preferentemente de aproximadamente 3°C a aproximadamente 5 °C, y lo mas preferente a aproximadamente 4°C. Como alternativa, la dispersion puede crioconservarse y a continuacion descongelarse antes de la fertilizacion de un marnffero hembra o de un ovulo in vitro (es decir, la dispersion se congela/descongela o comprende celulas espermaticas congeladas/descongeladas). Normalmente, en dicho caso, la dispersion crioconservado se descongelara inmediatamente antes de la fertilizacion de un mai^ero hembra o de un ovulo in vitro.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un proceso para disminuir selectivamente la capacidad de una subpoblacion de celulas espermaticas no humanas en una dispersion de celulas espermaticas comprendiendo el proceso:

   a) marcar una muestra de celulas espermaticas con una mezcla de marcado que incluye un agente qmmico que induce la inmovilidad del esperma y un colorante selectivo al ADN a una temperatura entre 30 °C y 39 °C para formar una dispersion de celulas espermaticas marcadas en un lfquido, en el que la cantidad de marca asociada con una celula espermatica indica una caractenstica genetica, estructural proteomica, o funcional de una subpoblacion de celulas espermaticas en la dispersion;

   b) inspeccionar opticamente la dispersion para identificar celulas espermaticas individuales como miembros de la subpoblacion;

   c) determinar la posicion de los miembros de la subpoblacion en la dispersion; y

   d) suministrar una dosis de energfa a diferentes posiciones dentro de la dispersion para disminuir selectivamente la capacidad de los miembros de la subpoblacion para fertilizar un ovulo sin afectar de forma similar las celulas espermaticas en otras posiciones en la dispersion para producir una poblacion de celulas espermaticas enriquecidas.
2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la cantidad de la marca asociada con la celula espermatica indica que la celula espermatica es una celula espermatica que contiene un cromosoma X o una celula espermatica que contiene un cromosoma Y.
3. 3. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la marca se selecciona entre el grupo que consiste en colorantes fluorescentes, colorantes selectivos para el ADN, poliamidas, oligonucleotidos, y un polipeptido que se une a una caractenstica espedfica superficial de una celula espermatica.
4. 4. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado por que la marca es un colorante fluorescente selectivo para ADN.
5. 5. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizado por que la marca es Hoechst 33342, Hoechst 33258 o SYBR-14.
6. 6. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la dosis de energfa se selecciona entre el grupo que consiste en haces de radiacion, haces laser, luz no de laser colimada, luz no de laser focalizada, y energfa ultrasonica focalizada.
7. 7. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el proceso comprende ademas purificar las celulas espermaticas que no reciben una dosis de energfa, las celulas no dosificadas.
8. 8. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 7, caracterizado por que purificar las celulas no dosificadas comprende centrifugar la dispersion y retirar las celulas dosificadas.
9. 9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que inspeccionar opticamente la dispersion para identificar celulas espermaticas individuales como miembros de la subpoblacion comprende inspeccionar opticamente una imagen capturada de las celulas.
10. 10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que antes de inspeccionar opticamente la dispersion, la dispersion se distribuye en una placa con muchos pocillos.
11. 11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la dosis de energfa es suficiente para disminuir la viabilidad y/o producir la muerte de los miembros de la subpoblacion en comparacion con la viabilidad de las celulas espermaticas que no reciben una dosis de energfa.
12. 12. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el proceso comprende ademas crioconservar la dispersion posterior para suministrar la dosis de energfa.
13. 13. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por que el mairnfero hembra es un bovino, equino, porcino, o cerdo.
14. 14. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, caracterizado por que la dispersion se crioconserva.
15. 15. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que el proceso comprende ademas:

    a) marcar la dispersion dosificada con una marca adicional, en la que la presencia, ausencia o cantidad de marca asociada con una celula espermatica indica una caractenstica genetica, proteomica, estructural, o funcional de una subpoblacion de celulas espermaticas en la dispersion dosificada;

    b) inspeccionar opticamente la dispersion dosificada para identificar las celulas espermaticas individuales con la 5 marca adicional;

    c) determinar la posicion de las celulas espermaticas asociadas con la marca adicional en la dispersion dosificada; y

    d) suministrar una dosis de energfa en diferentes posiciones en la dispersion.