ES2582861T3 - Ensayo de sangre completa para medir la activación de AMPK - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar el estado de energía de un sujeto que comprende: a) marcar células de una muestra sanguínea del sujeto usando un anticuerpo que se une específicamente con fosfo- AMPK, fosfo-acetil-CoA carboxilasa o fosfo-HMG-CoA reductasa, para producir una muestra marcada; y b) medir la unión de anticuerpo con células individuales de una población de células sanguíneas de dicha muestra marcada usando citometría de flujo, obteniendo de este modo una evaluación de la activación de AMPK de dicha población de células, en la que la activación de AMPK evaluada en dicha población de células puede usarse para evaluar el estado de energía del sujeto.

Description

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DESCRIPCION

Ensayo de sangre completa para medir la activacion de AMPK Antecedentes

La AMPK (adenosm monofosfato quinasa) es una quinasa heterotrimerica, multisustrato compuesta de una subunidad catalftica (a1 o a2), un reguladora (p1 o p2) y una de union AMP/ATP (y1, y2 o y3). El extremo C terminal de la subunidad p interacciona con las subunidades tanto a como y, y las pruebas actuales indican que la subunidad p es un componente obligatorio del complejo AMPK activo. El mecanismo exacto por el que AMPK esta regulada por el estado de energfa de una celula no se entiende completamente. Se cree que cuando los niveles de energfa intracelulares descienden (es decir, cuando hay una baja relacion de ATP:AMP), AMP desplaza ATP de la subunidad y, provocando un cambio conformacional que permite que las quinasas corriente arriba (por ejemplo, LKB1 o CaMKKp) fosforilen y activen la subunidad a. Como alternativa, AMPK puede fosforilarse de forma constitutiva, pero se desfosforila rapidamente en condiciones normales. A altos niveles de AMP, sin embargo, la union con AMP conduce a un cambio conformacional que protege el sitio de activacion de dicha accion por fosfatasa.

AMPK actua como un sensor del estado de energfa dentro de las celulas y puede considerarse un interruptor maestro del metabolismo energetico porque, tras su activacion, la enzima fosforila varios sustratos proteicos corriente abajo que tienen un efecto en la biosmtesis de lfpidos, oxidacion de acidos grasos, captacion de glucosa, gluconeogenesis y lipogenesis, por ejemplo. La fosforilacion de dianas corriente abajo por AMPK reduce el uso de ATP por la celula que, a su vez, aumenta la relacion ATP:AMP en la celula que, a su vez, reduce la actividad AMPK.

Todas estas propiedades se combinan para hacer a la AMPK una diana atractiva en el tratamiento de la diabetes, obesidad y una diversidad de otros trastornos metabolicos.

Rivera et al: Biochemical Pharmacology vol. 77, n.° 6, marzo 2009, paginas 1053-1063 indican que la administracion de resveratrol a largo plazo reduce perturbaciones metabolicas y disminuye la presion sangumea en ratas Zucker obesas. Campas et al, Blood, vol. 101, n.° 9, mayo 2003, paginas 3674-3680, indican que la acadesina activa AMPK e induce apoptosis en celulas de leucemia linfodtica cronica de linfocitos B pero no linfocitos T. Towler et al, Circulation Research, vol. 100, n.° 3, 1 de febrero de 2007, paginas 328-348, describen protema quinasa activada por AMP en el control metabolico y senalizacion de insulina.

Sumario

Se proporciona un metodo de analisis de muestras. La presente invencion proporciona un metodo para evaluar el estado de energfa de un sujeto, que comprende: a) marcar celulas de una muestra sangumea del sujeto usando un anticuerpo que se une espedficamente con fosfo-AMPK, fosfo-acetil-CoA carboxilasa o fosfo-HMG CoA reductasa, para producir una muestra marcada; y b) medir la union de anticuerpo con celulas individuales de una poblacion de celulas sangumeas de dicha muestra marcada usando citometna de flujo, obteniendo de este modo una evaluacion de la activacion por AMPK de dicha poblacion de celulas, en la que la activacion de AMPK evaluada en dicha poblacion de celulas puede usarse para evaluar el estado de energfa del sujeto. En realizaciones particulares, el metodo puede comprender ademas, antes de la etapa de marcaje: poner en contacto sangre con un agente de ensayo ex vivo; y comparar la evaluacion con resultados obtenidos de una muestra de referencia de celulas sangumeas.

Sin desear quedar ligado a ninguna teona cientffica, se cree que: a) el efecto de un compuesto modulador de AMPK o estilo de vida (por ejemplo, dieta o ejercicio) que modula AMPK puede determinarse analizando la sangre de un organismo, y b) la sangre, que es un tejido que no esta asociado en general a la produccion de energfa o su uso, puede actuar como un sustituto de tejidos que estan asociados con la produccion de energfa o su uso (por ejemplo, hngado y musculo, etc.). Por lo tanto, el estado de energfa de un organismo puede evaluarse usando la sangre del organismo por citometna de flujo usando un anticuerpo que se une espedficamente con fosfo-AMPK o una diana fosforilada de la misma. Estos metodos no requieren un procedimiento invasivo (por ejemplo, una biopsia tisular) y son mas rapidos y mas economicos en comparacion con enfoques anteriores (por ejemplo, transferencia de western).

Breve descripcion de los dibujos

Ciertos aspectos de algunas realizaciones de la invencion pueden entenderse mejor a partir de la siguiente descripcion detallada cuando se lee en conjunto con los dibujos adjuntos. Se enfatiza que, de acuerdo con la practica comun, los diversos elementos de los dibujos no estan a escala. Por el contrario las dimensiones de los diversos elementos estan arbitrariamente expandidas o reducidas para mayor claridad. Se incluyen en los dibujos las siguientes figuras:

La Figura 1 ilustra esquematicamente la ruta de AMPK.

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Las Figuras 2A y 2B son graficas que muestran los resultados de una activacion de AMPK basada en FACS realizada en celulas HepG2.

La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de pAMPK FACS usando sangre completa humana. Los resultados muestran una ventana septuple para linfocitos.

La Figura 4 muestra los resultados de un ensayo de pAMPK FACS en sangre completa humana y de raton. El protocolo fue el mismo que se uso para los datos mostrados en la Figura 3. Los resultados muestran una ventana robusta en linfocitos. El pico de control esta a la izquierda de cada uno de cada grafica, y el pico para el compuesto 2 esta a la derecha.

La Figura 5 muestra resultados de un ensayo de pAMPK FACS usado sangre completa de raton. El compuesto 2, un modulador conocido de AMPK, se usa como el compuesto de ensayo.

La Figura 6 muestra resultados de un ensayo de FACS que muestra que los datos de CE50 obtenidos para pACC se correlacionan con los datos de CE50 para pAMPK.

La Figura 7 es una serie de graficas que muestra que el ensayo de FACS de sangre completa humana pAMPK es altamente espedfico por que diferentes donantes y diferentes anticuerpos proporcionan resultados muy similares.

Figuras 8A-8C. La Figura 8A es una tabla que muestra que hay baja variabilidad entre donantes en la estimulacion de pAMPK y pACC usando dos activadores de AMPK. Las Figuras 8B y 8C presentan graficas que muestran un analisis de los datos presentados en la tabla de la Figura 8A.

La Figura 9 es una serie de graficas que muestran el efecto del tiempo de incubacion en la CE50 del compuesto 2, un modulador conocido de AMPK.

La Figura 10 es una representacion de dispersion que muestra la correlacion entre ensayos de pAMPK usando globulos blancos humanos y celulas HepG2. Se ensayaron 200 compuestos.

La Figura 11 es una representacion de dispersion que muestra la correlacion entre pAMPK y pACC usando globulos blancos humanos.

La Figura 12 es una ilustracion esquematica de un unico estudio in vivo.

La Figura 13 es una serie de graficas que muestran que la fosforilacion de AMPK despues del tratamiento por el compuesto 2, un modulador conocido de AMPK, depende de la dosis en ratones in vivo.

La Figura 14 muestra dos graficas de barras que muestran que el Compuesto 2, un modulador conocido de AMPK, aumenta la fosforilacion de AMPK en linfocitos de sangre de raton.

La Figura 15 muestra graficas de barras que muestran los resultados de un ensayo de FACS de pAMPK usando celulas del bazo y compuesto 2.

Las Figuras 16A y 16B son paneles de graficas que muestran que los niveles de estimulacion maximos de pAMPK son significativamente mayores en ratones en ayunas y delgados en comparacion con ratones alimentados y obesos, mientras que los niveles sin estimulacion permanecen sin cambios.

Figuras 17A y 17B. La Figura 17A muestra un plan experimental mientras que la Figura 17B muestra que hay una correlacion razonable entre los resultados de OGTT y PK/PD.

DEFINICIONES

La expresion “muestra biologica” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier muestra que contenga o este compuesta de material vivo. Una muestra biologica puede contener celulas intactas obtenidas de un organismo multicelular. Una muestra biologica puede aislarse de un individuo, por ejemplo, de un tejido blando o de un fluido corporal, o de un cultivo celular que se deja crecer in vitro. Una muestra biologica puede componerse de un tejido blando tal como cerebro, glandula adrenal, piel, pulmon, bazo, rinon, Idgado, bazo, ganglio linfatico, medula osea, vejiga, estomago, intestino delgado, intestino grueso o musculo, etc. Los fluidos corporales incluyen sangre, plasma, saliva, moco, flema, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural, lagrimas, lfquido de los conductos galactoforos, linfa, esputo, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido sinovial, orina, lfquido amniotico y semen, etc. Las muestras biologicas tambien incluyen celulas que han crecido en cultivo in vitro.

La expresion “celulas intactas” incluye celulas que se han fijado y/o permeabilizado. Las celulas que se han lisado y/o se han seccionado no son celulas intactas. Las transferencias de western y ensayos en los que las protemas de un lisado celular o un anticuerpo se fijan a un soporte solido (por ejemplo, ELISA) no implican celulas intactas.

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La expresion “muestra sangumea” o equivalentes gramaticales de la misma se refieren a una muestra de sangre completa o una subpoblacion de celulas en sangre completa. Las subpoblaciones de celulas en sangre completa incluyen plaquetas, globulos rojos (eritrocitos), plaquetas y globulos blancos (es decir, leucocitos de sangre periferica, que estan compuestos de neutrofilos, linfocitos, eosinofilos, basofilos y monocitos). Estos cinco tipos de globulos blancos pueden dividirse ademas en dos grupos, granulocitos (que tambien se denominan leucocitos polimorfonucleares e incluyen neutrofilos, eosinofilos y basofilos) y leucocitos mononucleares (que incluyen monocitos y linfocitos). Los linfocitos pueden dividirse adicionalmente en linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK. Se encuentran celulas sangumeas perifericas en el grupo de sangre en circulacion y no secuestradas dentro del sistema linfatico, bazo, Idgado o medula osea. Si la sangre se pone primero en contacto con un agente y despues se usa una muestra en la sangre en un ensayo, entonces puede usarse en el ensayo una parte de la sangre, o toda la sangre, que ha entrado en contacto.

La expresion “agente de captura” se refiere a un agente que se une con una molecula diana mediante una interaccion que es suficiente para permitir que el agente se una con y concentre la molecula diana de una mezcla homogenea de diferentes moleculas. La interaccion de union esta mediada tfpicamente por una region de afinidad del agente de captura. Los agentes de captura tfpicos incluyen cualquier resto que pueda unirse espedficamente con una molecula diana. En ciertas realizaciones, puede emplearse un polipeptido, por ejemplo, un anticuerpo.

El termino “anticuerpo” se usa en el presente documento para hacer referencia a un agente de captura que tiene al menos un dominio de union a epftopo de un anticuerpo. Los tipos de anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales y fragmentos de union a antfgeno de los mismos (por ejemplo, Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, etc.) que se conocen y no es necesario describirlos en mas detalle.

Los agentes de captura “se unen espedficamente” con una molecula diana. En consecuencia, la expresion “agente de captura” se refiere a una molecula o un complejo multimolecular que puede unirse espedficamente con una molecula diana, por ejemplo un polipeptido fosforilado, con una constante de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 10-6 M (por ejemplo, menos de aproximadamente 10-7 M, menos de aproximadamente 10-8 M, menos de aproximadamente 10-9 M, menos de aproximadamente 10-10 M, menos de aproximadamente 10-11 M, menos de aproximadamente 10-12 M, hasta tan poco como 10-16 M) sin unirse significativamente con otras moleculas. La expresion “union espedfica” se refiere a la capacidad de un agente de captura para unirse preferentemente con una molecula diana particular que esta presente en una mezcla homogenea de diferentes moleculas diana. Una interaccion de union espedfica diferenciara entre moleculas diana deseables (por ejemplo, fosforiladas) e indeseables (por ejemplo, no fosforiladas) en una muestra, tfpicamente mas de aproximadamente 10 a 100 veces o mas (por ejemplo, mas de aproximadamente 1.000 o 10.000 veces).

Como se usa en el presente documento, la expresion “citometna de flujo” se refiere a un metodo por el que las celulas individuales de una muestra se analizan por sus propiedades opticas (por ejemplo, absorbancia lummica, dispersion luirnnica y propiedades fluorescentes, etc.) a medida que pasan en una corriente estrecha en fila de a uno a traves de un haz de laser. Los metodos de citometna de flujo incluyen metodos de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) por los que una poblacion de celulas que tienen propiedades opticas particulares se separan de otras celulas.

Como se usa en el presente documento, el termino “marcaje” incluye marcaje directo e indirecto. Un anticuerpo puede marcarse con fluorescencia con un fluoroforo o un punto cuantico, muchos de los cuales se conocen.

El termino “predeterminado” se refiere a un elemento cuya identidad se conoce antes de su uso. Un elemento puede conocerse por su nombre, secuencia, peso molecular, su funcion, una cantidad, propiedades opticas o cualquier otro atributo o identificador.

El termino “mezcla”, como se usa en el presente documento, se refiere a una combinacion de elementos, por ejemplo, celulas, que estan intercalados y no en ningun orden particular. Una mezcla es homogenea y no esta separada espacialmente en sus diferentes constituyentes. Los ejemplos de mezclas de elementos incluyen varias celulas diferentes que estan presentes en la misma solucion acuosa de una manera espacialmente desnuda.

“Aislado” o “purificado” se refiere al aislamiento de una sustancia (compuesto, polinucleotido, protema, polipeptido, composicion polipeptfdica) de modo que la sustancia comprenda un porcentaje significativo (por ejemplo, mas de 2 %, mas de 5 % , mas de 10 %, mas de 20 %, mas de 50 %, o mas, habitualmente hasta aproximadamente 90 %- 100%) de la muestra en la que reside. Un componente sustancialmente purificado comprende al menos 50%, 80 %-85 % o 90-95 % de la muestra.

El termino “evaluar” incluye cualquier forma de medicion, e incluye determinar si un elemento esta presente o no. Los terminos “determinar”, “medir”, “evaluar”, “valorar” y “ensayar” se usan indistintamente y pueden incluir determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. La evaluacion puede ser relativa o absoluta. “Evaluar la presencia de” incluye determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si esta presente o ausente.

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El termino “usar” tiene su significado convencional y, como tal, significa emplear, por ejemplo, poner en servicio, un metodo o composicion para obtener un fin. Por ejemplo, si se usa un programa para crear un archivo, se ejecuta un programa para realizar un archivo, siendo el archivo habitualmente el resultado del programa. En otro ejemplo, si se usa un archivo informatico, habitualmente se accede a el, se lee y la informacion almacenada en el archivo se emplea para obtener un fin. De forma similar, si se usa un identificador unico, por ejemplo, un codigo de barras, el identificador unico habitualmente se lee para identificar, por ejemplo, un objeto o archivo asociado con el identificador unico.

Como se usa en el presente documento, la expresion “media geometrica” se refiere a la media de n numeros expresada como la rafz enesima de su producto.

Como se usa en el presente documento, la expresion “in vivo" se refiere al cuerpo de un organismo vivo completo, por ejemplo, un mairnfero vivo.

Como se usa en el presente documento, la expresion “ex vivo" se refiere a tejido vivo que se ha retirado del cuerpo de un organismo vivo completo, por ejemplo, un marnffero vivo. Una muestra de sangre que se ha extrafdo de un mamffero y contiene celulas vivas es un ejemplo de una muestra ex vivo.

Como se usa en el presente documento, la expresion “in vitro" se refiere a celulas que se han dejado crecer en cultivo.

Como se usa en el presente documento, la expresion “AMPK” o “protema quinasa activada por AMP” se refiere a una quinasa heterotrimerica compuesta de una subunidad catalttica alfa y subunidades no catalfticas beta y gamma. AMPK es una enzima sensora de energfa importante que supervisa el estado de energfa celular. En respuesta a tensiones metabolicas celulares, AMPK se activa y fosforila e inactiva acetil-CoA carboxilasa (ACC) y beta-hidroxi- beta-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzimas claves implicadas en la regulacion de biosmtesis de novo de acido graso y colesterol, asf como otras protemas implicadas en el metabolismo. AMPK y su papel como sensor de energfa se ha revisado en diversas publicaciones, incluyendo: Kemp et al (Trends Biochem. Sci. 1999 24: 22-5), Hardie et al (Bioessays. 2001 23: 1112-9), Musi et al (Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 2002 2: 119-27), Musi et al (Biochem. Soc. Trans. 2003 31: 191-5) y Hardie (Endocrinology. 2003 144: 5179-83) y Aschenbach (Sports Med. 2004 34: 91-103).

Como se usa en el presente documento, la expresion “fosfo-AMPK” o “p-AMPK” se refiere a una forma de AMPK en la que la subunidad a tiene una treonina fosforilada en la posicion 172. La fosforilacion en esta posicion se realiza por una AMKP quinasa (AMPKK) corriente arriba. La fosforilacion en esta posicion provoca que la quinasa fosforile dianas corriente abajo. Una diana corriente abajo de fosfo-AMPK es ACC (acetil-CoA carboxilasa), aunque hay muchas otras.

Como se usa en el presente documento, la expresion “activacion de AMPK” se refiere al estado de fosforilacion de AMPK o una diana directa de la misma. AMPK puede activarse por modulacion de una protema corriente arriba de AMPK (por ejemplo, el receptor de aponectina, el receptor de leptina, el receptor a-adrenergico, o el receptor de insulina, etc.) o por AMPK en sf misma. La activacion de AMPK puede determinarse ensayando AMPK en sf misma o una diana corriente abajo de AMPK.

Un anticuerpo que es espedfico para fosfo-AMPK o una diana fosforilada de la misma se une espedficamente con las formas fosforiladas de esas protemas pero no las formas no fosforiladas de esas protemas.

Otras definiciones de terminos aparecen a lo largo de la memoria descriptiva.

Descripcion detallada

Antes de describir en mas detalle la presente invencion, debe entenderse que la presente invencion no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que estas pueden, por supuesto, variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento es para el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invencion estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta un decimo de la unidad del lfmite inferior a no ser que el contexto claramente indique otra cosa, entre el lfmite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado esta abarcado dentro de la invencion.

A no ser que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque tambien puede usarse cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la practica o el ensayo de la presente invencion, se describen ahora los metodos y materiales preferidos.

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Todas las publicaciones y patentes citadas en la presente memoria descriptiva son para desvelar y describir los metodos y/o materiales en relacion con los que se citan las publicaciones. La cita de cualquier publicacion es para su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no debena interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publicacion en virtud de invencion anterior. Ademas, las fechas de publicacion proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicacion reales que puede ser necesario confirmar independientemente.

Debe observarse que como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un” y “el” incluyen referentes plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. Se observa ademas que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta declaracion actue como base antecedente para su uso en terminologfa exclusiva tal como “solamente”, “unicamente” y similares en relacion con la enumeracion de elementos de las reivindicaciones, o uso de una limitacion “negativa”.

Puede llevarse a cabo cualquier metodo enumerado en el orden de acontecimientos enumerado o en cualquier otro orden que sea logicamente posible.

Metodo de analisis de muestras

El metodo descrito posteriormente emplea una muestra de sangre. Tambien se describen en el presente documento otras muestras biologicas que pueden emplearse en el metodo. Dichas muestras incluyen celulas intactas de otros tejidos (por ejemplo, otros tejidos blandos tales como hngado o bazo, etc.) o pueden emplearse celulas cultivadas en cultivo celular. Se conocen metodos para tratar dichos tejidos para proporcionar una suspension celular adecuada para citometna de flujo. Una vez producida, puede emplearse una suspension celular de una manera similar a la descrita posteriormente.

En terminos generales, el metodo objeto implica: a) marcar celulas de una muestra sangumea del sujeto usando un anticuerpo que se une espedficamente con fosfo-AMPK, fosfo-acetil-CoA carboxilasa o fosfo-HMG-CoA reductasa, para producir una muestra marcada; y b) medir la union de anticuerpos con celulas individuales de una poblacion de celulas sangumeas de dicha muestra marcada usando citometna de flujo, obteniendo de este modo una evaluacion de la activacion de AMPK de dicha poblacion de celulas, en el que la activacion de AMPK evaluada en dicha poblacion de celulas puede usarse para evaluar el estado de energfa del sujeto. Ya que los resultados obtenidos de la sangre se correlacionaron bien con resultados obtenidos de tejidos asociados con consumo de energfa (por ejemplo, musculo o hngado), la evaluacion de la activacion de AMPK en sangre puede extenderse para proporcionar una evaluacion de la activacion de AMPK en el sujeto del que se obtuvo la sangre.

Aunque el metodo puede realizarse en sangre completa, en realizaciones particulares, la poblacion de celulas sangumeas analizadas puede ser globulos blancos o una subpoblacion de los mismos (por ejemplo, una poblacion de linfocitos o una poblacion de granulocitos). En realizaciones particulares, la sangre puede ponerse en contacto con un agente de ensayo ex vivo (es decir, usando sangre extrafda de un sujeto) y los resultados del ensayo pueden compararse con resultados obtenidos de una muestra de referencia de celulas sangumeas (por ejemplo, celulas sangumeas que no han estado en contacto con el agente de ensayo o con una cantidad diferente del agente de ensayo) para determinar el efecto del compuesto en la activacion de AMPK en el sujeto del que se obtuvo la muestra sangumea.

El efecto puede medirse en ciertos casos calculando la diferencia en la media geometrica de fluorescencia de la poblacion de celulas sangumeas y la media geometrica de fluorescencia de la muestra de referencia de celulas sangumeas. Como resultana evidente, en ciertas realizaciones, la puesta en contacto puede implicar administrar el agente de ensayo a un sujeto y despues extraer sangre del sujeto despues de un periodo de tiempo especificado. En otras realizaciones, la puesta en contacto puede implicar extraer sangre de un sujeto y despues poner en contacto el agente con la sangre extrafda durante un periodo especificado. El agente de ensayo puede ser o no un modulador conocido de la ruta de AMPK. En realizaciones particulares, la muestra de referencia puede contener celulas sangumeas obtenidas del mismo individuo que la muestra de sangre de ensayo. La muestra de referencia puede haberse puesto en contacto o no con el agente de ensayo. En casos particulares, los datos obtenidos del metodo pueden expresarse como una grafica de las medias geometricas de fluorescencia de varias muestras, como se ilustra en la Figura 2. Dicha grafica puede mostrar un ciclo temporal, o la diferencia entre diferentes dosis de un agente de ensayo, por ejemplo.

Como se ilustra en la Figura 1, AMPK actua como un interruptor maestro metabolico que regula varios sistemas intracelulares incluyendo la captacion celular de glucosa, la p oxidacion de acidos grasos y la biogenesis de transportador de glucosa 4 (GLUT4) y mitocondria. La capacidad sensora de energfa de AMPK puede atribuirse a su capacidad para detectar y reaccionar a fluctuaciones en la relacion AMP:ATP que tienen lugar durante el descanso y el ejercicio (estimulacion muscular). Durante la estimulacion muscular, AMP aumenta mientras que ATP se reduce, lo que cambia AMPK a un buen sustrato para activacion mediante un complejo de quinasa corriente arriba, AMPKK, o como alternativa, cuando la union de aMp activa AMPK que se fosforila en Thr-172, un sustrato peor para protema fosfatasa 2Ca. AMPKK es un complejo de tres protemas, adaptador relacionado con STE (STRAD), protema de

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raton 25 (MO25) y LKB1 (una serina/treonina quinasa). Durante una ronda de ejercicio, la actividad AMPK aumenta mientras que las celulas musculares experimentan tension metabolica provocada por una demanda celular extrema de ATP. Tras la activacion, AMPK aumenta los niveles de energfa celulares inhibiendo las rutas de consumo de ene^a anabolicas (smtesis de acidos grasos, smtesis de protemas, etc.) y estimulando rutas catabolicas, de produccion de energfa, (oxidacion de acidos grasos, transporte de glucosa, etc.).

Puede llevarse a cabo desencadenamiento de activacion de AMPK siempre que se cumplan dos condiciones. En primer lugar, la subunidad y de AMPK debe experimentar un cambio conformacional para exponer el sitio activo (Thr-172) en la subunidad a. El cambio conformacional de la subunidad y de AMPK y puede conseguirse en concentraciones aumentadas de AMP. Las concentraciones aumentadas de AMP daran lugar al cambio conformacional en la subunidad y de AMPK ya que dos AMP se unen a los dos dominios de Bateman localizados en esa subunidad. Es este cambio conformacional proporcionado por concentraciones aumentadas de AMP lo que expone el sitio activo (Thr-172) en la subunidad a. Este papel de AMP se confirma adicionalmente en experimentos que demuestran activacion de AMPK mediante un analogo de AMP 5-amino-4-imidazolcarboxamida ribotida (ZMP) que deriva de la conocida 5-amino-4-imidazolcarboxamida ribosida (AICAR). La segunda condicion que debe cumplirse es la fosforilacion y posterior activacion de AMPK en su bucle de activacion en Thr-172 de la subunidad a proporcionada por una quinasa corriente arriba (AMPKK). El complejo formado entre LKB1 (STK 11), protema de raton 25 (MO25) y la protema adaptadora relacionada con pseudoquinasa STE (STRAD) se ha identificado recientemente como la principal quinasa corriente arriba responsable de fosforilacion de AMPK en su bucle de activacion en Thr-172. Aunque AMPK debe fosforilarse por el complejo LKB1/MO25/STRAD, tambien puede regularse por moduladores alostericos que aumentan directamente la actividad AMPK general y modifican AMPK para convertirla en un mejor sustrato para AMPKK y un peor sustrato para fosfatasas. Se ha descubierto recientemente que 3-fosfoglicerato (intermedio de glucolisis) actua para pronunciar adicionalmente la activacion de AMPK mediante AMPKK.

Tambien se ha identificado CaMKK como una AMPKK corriente arriba. CaMKK fosforila y activa AMPK de una manera independiente de AMP, que se desencadena en su lugar por un aumento en la concentracion de Ca2+ intracelular. El descubrimiento de que CaMKK actua como una AMPKK indica que ademas de un aumento de la relacion de AMP con respecto a ATP, AMPK tambien puede activarse por un aumento en la concentracion de Ca2+ intracelular en respuesta a nutrientes, farmacos o estimulacion fisiologica.

Algunas dianas corriente abajo de AMPK se ilustran en la Figura 1. Como se ilustra, las dianas corriente abajo de AMPK incluyen protemas que regulan el metabolismo de carbohidratos (por ejemplo, GEF, MEF, glucogeno sintasa, PFK2 y TORC2), metabolismo de lfpidos (por ejemplo, HMGCoAR, aCc, HnF-4, SREBP-1 y HSL), crecimiento celular y apoptosis (eNOS, p53, HRR y eEF2K) y metabolismo de protemas. Una diana corriente abajo ejemplar de AMPK es acetil-CoA carboxilasa (ACC). Acetil-CoA carboxilasa es una enzima dependiente de biotina que cataliza la carboxilacion irreversible de acetil-CoA para producir malonil-CoA mediante sus dos actividades catalfticas, biotina carboxilasa (BC) y carboxiltransferasa (CT). ACC es una enzima multisubunitaria en el retmulo endoplasmico en el retmulo endoplasmico de la mayona de eucariotas. La funcion mas importante de ACC es proporcionar el sustrato de malonil-CoA para la biosmtesis de acidos grasos. La actividad de ACC puede controlarse en el nivel transcripcional asf como por moleculas pequenas moduladoras y modificacion covalente. El genoma humano contiene los genes para dos ACC diferentes: ACACA y ACACB.

Puede resultar fosforilacion de AMPK cuando las hormonas glucagon o epinefrina se unen con los receptores de superficie celular, pero la causa principal de fosforilacion se debe a un aumento en los niveles de AMP cuando el estado de energfa de la celula es bajo, lo que conduce a la activacion de la protema quinasa activada por AMP (AMPK). AMPK es la principal quinasa reguladora de ACC, capaz de fosforilar varios restos de serina en ambas isoformas de ACC. En AcC1, AmPK fosforila Ser79, Ser1200 y Ser1215. En ACC2, AMPK fosforila Ser218. La protema quinasa A tambien tiene la capacidad de fosforilar ACC, con una capacidad mucho mayor de fosforilar ACC2 que ACC1. Sin embargo, la significacion fisiologica de protema quinasa A en la regulacion de ACC se desconoce en la actualidad. Cuando la insulina se une con sus receptores en la membrana celular, activa una fosfatasa para desfosforilar la enzima; retirando de este modo el efecto inhibidor.

AMPK y sus dianas son generalmente intracelulares. Como tal, el metodo implica en general permeabilizar las celulas sangumeas y despues marcar las celulas permeabilizadas usando un anticuerpo que se une espedficamente con fosfo-AMPK o una diana fosforilada de la misma. Aunque las etapas exactas de dichos metodos de marcaje intracelular puede variar en gran medida, generalmente implican permeabilizar las celulas, marcar las celulas usando un anticuerpo marcado y despues fijar las celulas tenidas de manera que los contenidos de las celulas permanezcan intactos durante manipulaciones posteriores. Se describen en diversas publicaciones metodos ejemplares por los que pueden marcarse celulas usando anticuerpos fluorescentes que son espedficos para protemas intracelulares, incluyendo: (Cytometry. 1998 32: 206-13), Sartor et al (Cytometry. 1994 18: 119-22), Gadol et al (Cytometry 1994 15: 359-70) y Far et al (Cytometry. 1994 15: 327-34), a los que se hace referencia para divulgacion de estos metodos. Los kits para marcaje intracelular de celulas para analisis de FACS incluyen el kit de FACS intracelular INTRACYTE™ de Orion BioSolutions, Inc (Vista CA), los kits INTRASURE™ o FASTIMMUNE™ de Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) y los kits Cytofix™ o Cytoperm™ Plus de PharMingen (San Diego, CA). Dependiendo del metodo empleado, el globulo rojo de la muestra puede lisarse antes permeabilizar y marcar los

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globulos blancos. Dichas tecnicas de lisis pueden adaptarse a partir de las empleadas habitualmente en un analisis de sangre.

Se mide la union del anticuerpo con celulas individuales de la poblacion de celulas sangumeas usando citometna de flujo. Dichos metodos se conocen y se revisan en diversas publicaciones, incluyendo Brown et al (Clin Chem. 2000 46: 1221-9), McCoy et al (Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2002 16: 229-43) y Scheffold J. Clin. Immunol. 2000 20: 400-7) y libros tales como Carey et al (Flow Cytometry in Clinical Diagnosis, 4a Edicion ASCP Press, 2007), Ormerod (Flow Cytometry -A practical approach 3a Edicion. Oxford University Press, Oxford, Reino Unido 2000), Ormerod (Flow Cytometry 2a Edicion. BIOS Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido 1999) y Ormerod (Flow Cytometry -A basic introduction 2009 Cytometry Part A 75A, 2009), a las que se hace referencia en el presente documento para divulgacion de esos metodos.

En casos particulares, los datos para una unica muestra pueden procesarse para proporcionar para cada uno de varios acontecimientos una medicion de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 3, los datos pueden expresarse en ciertos casos como un histograma de un unico parametro que muestra las unidades de fluorescencia en el eje x y el recuento celular en el eje y. La fluorescencia puede ser un valor logantmico y en ciertos casos puede ser el logaritmo de un valor absoluto (por ejemplo, sin procesar) o normalizado. El pico del histograma proporciona una evaluacion de la activacion de AMPK en el sujeto del que se obtuvo la muestra sangumea. El pico de histograma puede ser la media geometrica de los valores de fluorescencia, sin embargo pueden emplearse otros analisis estadfsticos para proporcionar un resultado similar. Ya que las diversas subpoblaciones de celulas sangumeas (es decir, globulos rojos, plaquetas y globulos blancos que estan compuestos de neutrofilos, linfocitos, monocitos, eosinofilos y basofilos) se pueden distinguir facilmente usando citometna de flujo, los datos pueden analizarse para proporcionar una evaluacion de la activacion de AMPK en cualquier subpoblacion de celulas sangumeas. En una realizacion, los datos pueden analizarse para proporcionar una evaluacion de la activacion de AMPK en linfocitos. En realizaciones adicionales, las celulas sangumeas pueden marcarse con un segundo anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo en superficie celular, y los datos pueden analizarse para proporcionar una evaluacion de la activacion de AMPK en celulas que estan marcadas con el segundo anticuerpo.

La metodologfa descrita en el presente documento puede emplearse en general en cualquier citometro de flujo adecuado, cuyos ejemplos se conocen en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.378.633, 5.631.165, 6.524.858, 5.266.269, 5.017.497 y 6.549.876, publicacion de PCT WO99/54494 asf como las Solicitudes de Patente de Estados Unidos publicadas US20080153170, 20010006787, US20080158561, US20100151472, US20100099074, US20100009364, US20090269800, US20080241820, US20080182262,

US20070196870y US20080268494.

El anticuerpo usado para marcar las celulas debena ser capaz de unirse espedficamente con fosfo-AMPK nativa (es decir, plegada) o una diana fosforilada de la misma. En casos particulares, el anticuerpo puede unirse con afinidad muy reducida (es decir, en un factor de al menos 2, 5, 10, 50 o 100) con la forma lineal (es decir, desplegada, desnaturalizada) de la protema. La estructura con la que se une dicho anticuerpo contiene muchos aminoacidos que no son contiguos en la protema. En otras palabras, en ciertos casos la union de dicho anticuerpo con un polipeptido puede depender de que el polipeptido este plegado en una conformacion tridimensional particular.

Dichos anticuerpos pueden prepararse, por ejemplo, inmunizando un animal adecuado, por ejemplo, un animal de sangre caliente, en particular un mairnfero tal como un conejo, raton, rata, camello, oveja, vaca o cerdo o un ave tal como un pollo o pavo, con una fosfo-AMPK plegada o diana corriente abajo de la misma usando cualquiera de las tecnicas bien conocidas en este campo adecuadas para generar una respuesta inmunitaria. Se conocen bien en la tecnica procedimientos para inmunizar animales, y se describen en Harlow (Antibodies: A Laboratory Manual, Primera Edicion (1988) Cold Spring Harbor, N. Y.) y Weir (Handbook of Experimental Immunology Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Como se apreciara por un experto habitual en la materia, el inmunogeno puede mezclarse con un adyuvante o hapteno para aumentar la respuesta inmunitaria (por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund o lfpido A), o con un veldculo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH).

Una vez que se ha inmunizado un animal adecuado y se ha establecido una respuesta inmunitaria contra el antfgeno por el animal, se exploran celulas productoras de anticuerpos del animal para identificar celulas que produzcan anticuerpos que tengan una actividad deseada. En algunas realizaciones, estos metodos pueden emplear tecnologfa de hibridoma en la que se fusionan celulas del bazo del animal inmunizado con una celula inmortal adecuada para producir celulas de hibridoma. Pueden explorarse sobrenadantes de estas celulas de hibridoma, y se expanden clones positivos de acuerdo con procedimientos convencionales (Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Primera Edicion (1988) Cold spring Harbor, N. Y.; y Spieker-Polet et al., mencionado anteriormente).

Los anticuerpos pueden explorarse con respecto a union con AMPK fosforilada o diana fosforilada de la misma plegada una conformacion nativa, por ejemplo, mediante tincion celular para identificar los anticuerpos que son espedficos para formas fosforiladas de estas protemas. En realizaciones particulares, pueden explorarse anticuerpos disponibles en el mercado para identificar un anticuerpo adecuado.

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En realizaciones alternativas, puede emplearse un anticuerpo de presentacion en fago, cuyos metodos de produccion se conocen bien (vease, por ejemplo, Scott et al. Science 1990 249: 386; Devlin et al., Science 1990 249: 404; Patentes de Estados Unidos n.° 5.223.409, 5.733.731, 5.498.530, 5.432.018, 5.338.665 y 5.922.545, por ejemplo).

En casos particulares, en lugar de un anticuerpo que sea espedfico para AMPK o una diana corriente abajo de la misma, el metodo descrito anteriormente y posteriormente puede realizarse usando un anticuerpo que es espedfico para una quinasa relacionada con AMpK fosforilada (por ejemplo, BRSK1, BRSK2 , NUAK1, NUAK2, QlK, QSK, SIK, MARK1, MARK2, MARK3, MARK4, MELK o SNARK; Manning et al, Science 2002 298: 1912-1934) que estan estrechamente relacionadas con AMPKa1 y AMPKa2, algunas de las cuales tambien estan implicadas en la homeostasis de energfa (Koh et al PNAS 2010 107: 15541-15546).

En realizaciones alternativas, puede emplearse un metodo de transferencia de western cuantitativo, por ejemplo, usando un sistema basado en capilares tal como una maquina Bioscences CB1000. Como alternativa, puede emplearse espectrometna de masas o citometna de masas. En ciertos casos, los ensayos pueden realizarse en un formato de alto rendimiento, por ejemplo, usando placas de 96 o 384 pocillos.

Utilidad

El metodo descrito anteriormente puede emplearse para identificar compuestos que modulan la activacion de AMPK, para determinar si un compuesto administrado tiene un efecto deseado, o para determinar una dosis optima de un compuesto que se sabe que modula la activacion de AMPK, por ejemplo. En estas realizaciones, la medicion obtenida usando el metodo anterior puede compararse con resultados obtenidos de una muestra de sangre de referencia. Como se ha observado anteriormente, la muestra de ensayo de sangre puede ponerse en contacto con un agente de ensayo ex vivo. La muestra de sangre de referencia puede no haber estado en contacto con el agente de ensayo o puede haber estado en contacto con una cantidad diferente del agente de ensayo, por ejemplo. En una realizacion, las muestras tanto de ensayo como de referencia pueden haber estado en contacto con la misma cantidad del compuesto de ensayo, pero en momentos diferentes y durante tiempos diferentes. Las muestras de ensayo y referencia pueden obtenerse de mismo sujeto o de diferentes sujetos. El sujeto puede haber ayunado durante al menos 8-12 horas o, en ciertos casos, el metodo puede realizarse antes, durante o despues del ejercicio. El metodo puede acoplarse con otros ensayos medicos, tales como un ensayo de colesterol (es decir, un panel de lfpidos) o un ensayo de glucosa en sangre para proporcionar una evaluacion de la salud del sujeto. La diana del agente de ensayo puede ser corriente arriba de AMPK, puede ser AMPK en sf misma, o corriente abajo de AMPK. En algunos casos, el mecanismo de accion de un agente de ensayo puede ser desconocido.

En una realizacion ejemplar, se ponen en contacto alfcuotas separadas de sangre del mismo individuo con dos o mas cantidades de un agente de ensayo que se sabe que modulan la activacion de AMPK. La sangre que ha entrado en contacto puede ensayarse usando el metodo descrito anteriormente, y puede determinarse una dosis eficaz del agente de ensayo.

En otra realizacion ejemplar, se ponen en contacto alfcuotas separadas de sangre del mismo individuo con: a) un agente de ensayo que no se sabe que module la activacion de AMPK y b) una solucion de control que no contiene el agente de ensayo. La sangre que se ha puesto en contacto puede ensayarse usando el metodo descrito anteriormente, y puede determinarse el efecto del compuesto en la activacion de AMPK.

En estas realizaciones, el grado en que la muestra de ensayo y la muestra de control difieren puede determinarse comparando, por ejemplo, la media geometrica de los resultados obtenidos de una muestra de ensayo con la media geometrica de los resultados obtenidos de una muestra de referencia. Una mayor diferencia entre las medias geometricas indica que el agente tiene un mayor efecto en la activacion de AMPK. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 3, el compuesto 1 tiene un mayor efecto en la activacion de AMPK en linfocitos que en granulocitos. En relacion con la media geometrica de fluorescencia de una muestra que no se ha puesto en contacto con el compuesto, un compuesto que modula la activacion de AMPK puede alterar la media geometrica de fluorescencia en al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 % o al menos 50 %. En realizaciones particulares, el compuesto puede conducir a una reduccion de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 70 % o al menos 80 % en la media geometrica de fluorescencia. En otras realizaciones, el compuesto puede conducir a un aumento de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 70 %, al menos 100 % o al menos 200 % o al menos 500 % o mas en la media geometrica de fluorescencia.

Como se ha observado anteriormente, tambien se describe en el presente documento que el agente de ensayo pueda administrarse in vivo, en cuyo caso el contacto puede comprender administrar el agente de ensayo a un sujeto y despues extraer sangre del sujeto despues de un periodo de tiempo espedfico (por ejemplo, de 5 minutos a 1 hora, de 1 h a 12 h, de 12 h a 24 h o de 24 h a 1 semana o mas) antes del analisis por citometna de flujo. En aplicaciones ex vivo, el contacto puede comprender extraer sangre de un sujeto y despues poner en contacto el agente de ensayo con la sangre extrafda durante un periodo de tiempo espedfico (por ejemplo, de 5 minutos a 1 h, de 1 h a 12 h, de 12 h a 24 h o de 24 h a 1 semana o mas) antes del analisis por citometna de flujo.

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En un metodo in vivo descrito en el presente documento, puede administrarse una cantidad de un modulador de AMPK a un sujeto y, despues de un periodo de tiempo espedfico, puede extraerse sangre del sujeto y ensayarse usando el metodo descrito anteriormente. Basandose en los resultados del ensayo, puede administrarse una segunda cantidad del modulador de AMPK al sujeto y, despues de un periodo de tiempo espedfico, puede extraerse sangre del sujeto y ensayarse usando el metodo descrito anteriormente. Estas etapas pueden repetirse hasta que se consigue un efecto deseado (por ejemplo, una dosis del modulador de AMPK que da como resultado un nivel de activacion de AMPK deseado, estable). Este metodo puede usarse para optimizar la dosificacion de un modulador de AMPK para un sujeto particular.

En terminos generales la sangre usada en el ensayo puede obtenerse de cualquier sujeto mairnfero incluyendo las ordenes carmvoro (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpances y monos). En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede estar sano o en algunos casos puede tener cancer, una enfermedad inflamatoria o una enfermedad metabolica tal como obesidad o diabetes. En realizaciones particulares, el sujeto puede tener uno o mas factores de riesgo para smdrome metabolico, tales como, tension, sobrepeso, estilo de vida sedentario, envejecimiento, enfermedad cardiaca coronaria, insuficiencia cardfaca cronica, lipodistrofia, esquizofrenia, enfermedad de las arterias perifericas, enfermedades neurodegenerativas, atrofia muscular/debilidad/miopatfa, enfermedades renales, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, degeneracion macular relacionada con la edad o enfermedad reumatica. Por ejemplo, un sujeto puede tener hiperglucemia en ayunas (provocada, por ejemplo, por diabetes mellitus de tipo 2 o resistencia a insulina), alta presion sangmnea, obesidad central, colesterol HDL reducido y/o trigliceridos elevados.

En algunas realizaciones, puede saberse que el agente de ensayo afecta a la activacion de AMPK. Dichos agentes se conocen e incluyen: metformina, cilostazol, 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleosido (AICAR), 2- desoxiglucosa, tiazolidinedionas tales como troglitazona rosiglitazona, resveratrol y pioglitazona, asf como una diversidad de compuestos adicionales descritos en las publicaciones de PCT WO08/083124, WO09/065131, WO09/076631, wOo9/132136 y WO10/088392, solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas US20100009992, US20090253764, US20090105293, US20090094709, US20080221088, US20070244202,

US20070054965, US20070015665, US20060287356, US20060134240, US20050038068 y patente de Estados Unidos 7.119.205, a cuyas divulgaciones se hace referencia para divulgacion generica y espedfica de esos compuestos.

En otras realizaciones, el efecto del agente de ensayo en la activacion de AMPK puede ser desconocido. Dichos agentes pueden ser de cualquier clase qmmica y en ciertos casos pueden ser moleculas sinteticas, semisinteticas o inorganicas u organicas de origen natural. Los agentes de ensayo incluyen los hallados en bibliotecas grandes de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, estan disponibles en el mercado bibliotecas de compuestos sinteticos de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), ComGenex (South San Francisco, CA) y MicroSource (New Milford, CT). Como alternativa, estan disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales de Pan Labs (Bothell, WA) o se pueden producir facilmente.

Los agentes de ensayo pueden ser compuestos organicos o inorganicos pequenos que tienen un peso molecular de mas de 50 y menos de aproximadamente 2.500 Da. Los agentes de ensayo pueden comprender grupos funcionales necesarios para la interaccion estructural con protemas, particularmente enlaces de hidrogeno y pueden incluir al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, y pueden contener al menos dos de los grupos qmmicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender carbono dclico o estructuras heterodclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas con uno o mas de los grupos funcionales anteriores. Tambien se encuentran agentes candidatos entre biomoleculas incluyendo peptidos, sacaridos, acidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, analogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Pueden obtenerse agentes de ensayo de una amplia diversidad de fuentes incluyendo bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, estan disponibles numerosos medios para smtesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos organicos y biomoleculas, incluyendo expresion de oligopeptidos aleatorios. Como alternativa, estan disponibles o se producen facilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos naturales o producidos de forma sintetica se modifican facilmente mediante medios qmmicos, ffsicos y bioqmmicos convencionales, y pueden usarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacologicos conocidos pueden someterse a modificaciones qmmicas dirigidas o aleatorias, tales como acilacion, alquilacion, esterificacion, amidificacion, etc., para producir analogos estructurales. Tambien pueden crearse nuevos agentes terapeuticos potenciales usando metodos tales como diseno de farmacos racional o modelizacion por ordenador.

La exploracion puede dirigirse a compuestos farmacologicamente activos conocidos y analogos qmmicos de los mismos, o a nuevos agentes con propiedades desconocidas tales como los creados mediante diseno de farmacos racional.

El sujeto puede ponerse en contacto con el agente candidato, por ejemplo, el agente se administra al animal por cualquier via de administracion aceptable, incluyendo, pero son limitacion, via oral (por ejemplo, sonda oral),

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intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutanea, intragastrica, etc., por ejemplo, cualquiera enterica o parenteral. Se administra una unica dosis, o se administran multiples dosis durante un periodo de tiempo.

Se proporcionan formulaciones, incluyendo formulaciones farmaceuticas, que comprenden un agente identificado por un metodo de exploracion presentado en el presente documento. Una formulacion comprende una cantidad eficaz de un agente. Una “cantidad eficaz” significa una dosificacion suficiente para producir un resultado deseado.

Aunque la dosificacion usada variara dependiendo de los objetivos clmicos para conseguir, un intervalo de dosificacion adecuado es uno que proporciona hasta aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 1.000 |jg o pueden administrarse aproximadamente IO.0O0 jg de un agente que produce un resultado deseado en una unica dosis. Como alternativa, puede considerarse que una dosificacion diana de un agente que produce un resultado deseado esta aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 0,1-1.000 jM, aproximadamente 0,5-500 jM, aproximadamente 1-100 jM o aproximadamente 5-50 jm en una muestra de sangre del hospedador extrafda en las primeras 24-48 horas despues de la administracion del agente.

Los expertos en la materia apreciaran facilmente que los niveles de dosis pueden variar en funcion del compuesto espedfico, la gravedad de los smtomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosificaciones preferidas para un compuesto dado se pueden determinar facilmente por los expertos en la materia por diversos medios.

En realizaciones particulares, el metodo objeto puede emplearse para proporcionar una lectura de la salud metabolica de un sujeto de una manera similar a un ensayo de glucosa o colesterol. El metodo objeto puede realizarse solo o en combinacion con otras tecnicas clmicas (por ejemplo, un examen ffsico u otro ensayo de sangre). Por ejemplo, los resultados obtenidos del ensayo objeto pueden combinarse con otra informacion, por ejemplo, informacion con respecto a los niveles de glucosa en sangre, el peso u otros marcadores sangumeos proteicos que indican la salud metabolica de un individuo.

En una realizacion ejemplar, antes del marcaje de las celulas, el metodo puede comprender someter un mairnfero a un cambio de estilo de vida (por ejemplo, un cambio de la dieta o en la cantidad de ejercicio), y obtener una muestra sangumea del mamffero que se analiza posteriormente. La evaluacion puede compararse despues con resultados obtenidos de una muestra de referencia de celulas sangumeas, determinando de este modo el efecto del cambio de estilo de vida en la activacion de AMPK del mam^era.

En una realizacion, puede recogerse una muestra de un paciente en una primera localizacion, por ejemplo, en una situacion clmica tal como en un hospital o en la consulta de un medico, y la muestra puede enviarse a una segunda localizacion, por ejemplo, un laboratorio en el que se procesa y se realiza el metodo descrito anteriormente para generar un informe. Un “informe” como se describe en el presente documento es un documento electronico o tangible que incluye elementos de informe que proporcionan resultados de ensayo que pueden incluir la media geometrica obtenida del ensayo asf como, por ejemplo, un intervalo de medias geometricas que se consideran “normales”. Una vez generado, el informe puede enviarse a otra localizacion (que puede ser la misma localizacion que la primera localizacion), donde puede interpretarse por un profesional de la salud (por ejemplo, un especialista clmico, un tecnico de laboratorio o un medico tal como un oncologo, cirujano, patologo), como parte de un diagnostico clmico.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgacion completa y descripcion de como preparar y usar la presente invencion. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precision con respecto a los numeros usados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.), pero debenan considerarse algunos errores experimentales y desviaciones, A no ser que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura es en grados centfgrados, y la presion es atmosferica o cercana a la atmosferica.

Se emplean tres activadores de AMPK diferentes en los ejemplos descritos posteriormente. El Compuesto 1 se describe en la publicacion de PCT WO10/088392, el Compuesto 2 se describe en la publicacion de PCT WO09/065131.

Ejemplo 1

Se trataron celulas MEF o C2C12 con DMSO o Compuesto 2 y se exploraron por transferencia de western con un anticuerpo anti pAMPK de senalizacion celular. El anticuerpo reconoda exclusivamente pAMPK y no se observo ninguna otra banda. El mismo anticuerpo se uso para FACS en experimentos posteriores.

Se tripsinizaron celulas de cancer de tugado humano HepG2, se resuspendieron en un medio completo a 2x106 celulas por ml y se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo de pocillos profundos, 100 jl por pocillo. Se anadio compuesto en 1 jl de DMSO a la suspension celular, se mezclo y se incubo 1 h a 37 °C. Despues

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de la incubacion, se anadieron 900 pl de solucion de lisado-fijacion (BD) y la placa se incubo a 37 °C durante otros 10 min, se centrifugo durante 5 min y se retiro el sobrenadante. Se resuspendio sedimento celular en 250 pl de metanol helado y se incubo durante 30 min a 4 °C. Despues de una transferencia a una placa de fondo redondo de 96 pocillos regular, las celulas se sedimentaron por centrifugacion durante 5 minutos, se lavaron en 250 pl de PBS que contema 2 % de FCS (PBS2) y se resuspendieron en 100 pl de PBS2 que contema dilucion 1:100 de anticuerpo pACC (Millipore). La suspension se incubo durante una noche a temperature ambiente en un agitador. A la manana siguiente, las celulas se lavaron una vez con PBS2 y se incubaron con anticuerpo de cabra secundario anti conejo conjugado con Alexa 488 a una dilucion 1:200 durante 1 h a temperatura ambiente. Despues de un unico lavado las celulas se clasificaron en un clasificador FACS BD. Se realizo cuantificacion usando software FlowJo. Se uso la media geometrica de una senal de Alexa 488 para clasificacion de celulas vivas para representar los resultados y se determino CE50 en matlab.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Las CE50 obtenidas por FACS se correlacionan fuertemente con las de transferencia de western en celulas para el mismo epttopo, validando el enfoque basado en FACS.

Ejemplo 2

Se separaron alfcuotas de sangre humana completa a 100 pl por pocillo en placa de fondo redondo, se anadio 1 pl de solucion de Compuesto 1/DMSO 1 pM o dMsO solo, se mezclo y se incubo durante 1 h a 37 °C, despues se anadieron 900 pl de solucion de lisado-fijacion (BD). El resto del procedimiento se realizo como se ha descrito para celulas HepG2 anteriormente, excepto que se uso anticuerpo de conejo pAMPK (Cell Signaling) a dilucion 1:100 en lugar de pACC como primario. Los linfocitos y granulocitos se seleccionaron como se indica.

Los resultados se muestran en la Figura 3. La ventana de senal 4-7 veces mayor permite crear un ensayo basado en sangre robusto.

Ejemplo 3

Se separo en alfcuotas sangre humana y de raton completa a 100 pl por pocillo en placa de fondo redondo, se anadio 1 pl de solucion de DMSO de Compuesto 1 1 pM o DMSO solamente, se mezclo y se incubo durante 1 h a 37 °C, despues se anadieron 900 pl de solucion de lisado-fijacion (BD). El resto del procedimiento se realizo como se ha descrito para celulas HepG2 anteriormente, excepto que se uso anticuerpo de conejo pAMPK (Cell Signaling) a dilucion 1:100 en lugar de pACC como primario. Los resultados se muestran en la Figura 4. El anticuerpo actua usando sangre tanto humana como de roedor.

Ejemplo 4

Se compararon histogramas de canal FL-1 para linfocitos humanos o de raton seleccionados y granulocitos tenidos para pAMPK. En ambas especies los linfocitos demostraron uniformemente mejor ventana que los granulocitos. Los linfocitos T purificados propagados en presencia de IL-2 demostraron ser un mal reemplazo para la sangre completa debido a una ventana de estimulacion muy estrecha. Como resultado, todos los experimentos de seguimiento usaron linfocitos WB para generar CE50.

Ejemplo 5

Determinacion de CE50 para estimulacion de fosforilacion de AMPK por Compuesto 2 en linfocitos T humanos in vitro propagados y en celulas sangumeas humanas y de raton. Los resultados se muestran en la Figura 5. La ventana para linfocitos T purificados es muy estrecha debido al alto nivel de fondo de fosforilacion de AMPK, supuestamente inducida por tension celular. La CE50 para sangre de raton es significativamente (aproximadamente 10 veces en promedio) mayor que la de un ser humano. Las CE50 tanto del ser humano como de raton son significativamente mayores que la CE50 correspondiente para HepG2 (hasta varios cientos de veces).

Ejemplo 6

Efectos de la privacion en la fosforilacion de AMPK en sangre del raton. Los ratones macho C57B1/6J se sometieron a ayunas durante 14 horas o se les alimento de forma normal antes de la recogida de sangre. Se realizo estimulacion de AMPK por el Compuesto 2 y el Compuesto 1 ex vivo durante 1 h en 50 pl. El procedimiento de tincion fue el mismo que para las HepG2, excepto que se uso una dilucion 1:500 para los anticuerpos tanto primarios como secundarios. El nivel maximo de fosforilacion de AMPK en animales en ayunas fue uniformemente mayor en casi el doble en comparacion con los alimentados, mientras que el nivel de fondo permanecio intacto.

Ejemplo 7

Efectos de la privacion en la fosforilacion de ACC por AMPK en sangre de raton. Todas las observaciones para fosforilacion de AMPK son relevantes tambien para la tincion de pACC. Los resultados se muestran en la Figura 6. Las CE50 para ambas protemas son identicas cuando se usa el mismo compuesto, como se esperaba.

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Ejemplo 8

La tincion usando anticuerpo monoclonal y policlonal de conejo anti pAMPK es altamente espedfica e independiente del donante. Se usaron muestras de sangre completa de dos donantes humanos para tenir con respecto a pAMPK en ausencia (perfil azul) y en presencia (perfil rojo) de Compuesto 2 10 pM que induce fosforilacion de AMPK. Ambos anticuerpos detectaron de forma robusta un aumento similar de fosforilacion de AMPK tras el tratamiento con el Compuesto 2, lo que confirma la selectividad de tincion.

Ejemplo 9

Las CE50 para el Compuesto 2 en sangre completa humana de dos donantes diferentes fueron identicas cuando se usaron dos anticuerpos diferentes para tincion de linfocitos. Los resultados se muestran en la Figura 7. La ventana fue significativamente mejor cuando se uso anticuerpo de conejo monoclonal.

Ejemplo 10

Las curvas obtenidas tinendo las celulas sangumeas con respecto a pAMPK despues de valorar el compuesto en sangre completa ex vivo son mas reproducibles cuando se usa clasificacion de linfocitos en lugar de la de granulocitos, pero las CE50 obtenidas por ambos metodos son esencialmente iguales independientemente del anticuerpo, el tipo celular o el donante.

Ejemplo 11

Uniformidad y estabilidad del ensayo de pAMPK. Curvas de valoracion y CE50 para el Compuesto 1 y el Compuesto 2 obtenidas en semanas diferentes usando la sangre del mismo donante. Las CE50 finales son estrechamente coincidentes entre sf. Las Figuras 8A-8C muestran que hay una baja variabilidad entre donantes en la estimulacion de pAMPK y PACC usado dos activadores de AMPK.

Ejemplo 12

Efectos del tiempo de incubacion con el compuesto en CE50 resultante en un ensayo de WB. Se trato sangre completa humana del unico donante con diversas cantidades de Compuesto 1 durante periodos de tiempo dados a 37 °C. La sangre se proceso de acuerdo con el metodo convencional para detectar fosforilacion de AMPK por FACS. Se determinaron las CE50 matlab. Los resultados se muestran en la Figura 9. Se observo muy poco efecto en linfocitos (2 paneles de la derecha). Los granulocitos son extremadamente sensibles al tiempo de incubacion debido a una deriva hacia arriba significativa y continua en un nivel de lmea basal de pAMPK detectada, incluso aunque no de como resultado un cambio significativo en la CE50 (2 paneles izquierdos). Por lo tanto, el tiempo de incubacion mas largo reduce inesperadamente la ventana y robustez general del ensayo. En ambos tipos celulares, el Compuesto 2 demuestra una cinetica extremadamente rapida de activacion de AMPK, en el intervalo de 5 min se puede ver una estimulacion completa de la quinasa a concentraciones de saturacion del compuesto. El nivel de activacion maximo permanece igual, los niveles no estimulados aumentan marginalmente.

Ejemplo 13

La Figura 10 muestra una fuerte correlacion lineal entre CE50 obtenidas por in-cell-western (ICW) de pACC en celulas HepG2 (eje X) y las obtenidas por pAMPK FACS en sangre completa humana (eje Y). Se uso la escala logantmica para ambos ejes. La mayona de los compuestos demostro una perdida significativa de potencia (hasta 100 veces) en la sangre en comparacion con celulas HepG2, supuestamente debido a combinacion de alta union de protemas y alto nivel de distribucion a globulos rojos (alto VSS) para los compuestos ensayados.

Ejemplo 14

La Figura 11 muestra una excelente correlacion lineal entre CE50 de PACC y pAMPK FACS en sangre completa humana (eje Y) para los compuestos ensayados. ACC es una diana corriente abajo de AMPK y AMPK es la unica quinasa que se dirige al sitio de fosforilacion inhibidor en ACC.

pAMPK como un biomarcador sangumeo in vivo. La Figura 12 muestra un perfil del efecto del Compuesto 2 en el estudio in vivo de activacion de AMPK. La Figura 13 muestra una representacion de FACS unidimensional de tincion con pAMPK en sangre de raton despues de una unica dosis oral del Compuesto 2. Se observa un claro aumento en poblacion de celulas positiva para pAMPK a la mayor dosis de Compuesto 2.

Ejemplo 15

pAMPK como biomarcador sangumeo in vivo. Los resultados se muestran en la Figura 14. Parte superior, media geometrica para senal de pAMPK en linfocitos derivados de sangre de ratones tratados con una unica dosis de Compuesto 2 a 5 y 20 mg/kg o con un control de vehmulo, como se indica. Las mediciones de los niveles de pAMPK de muestras de sangre tomadas antes de tratamiento se muestran en azul y las medidas correspondientes tomadas

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1 h despues del tratamiento estan en rojo. Parte inferior, relacion de la media geometrica de senal de pAMPK a 1 h con respecto a la de 0,5 h antes del tratamiento para el mismo grupo de animales. Se observo un claro aumento dependiente de dosis en la senal para muestras sangumeas de animales tratados con Compuesto 2.

Ejemplo 16

La Figura 15 muestra que un ensayo de pAMPK basado en FACS puede usarse para detectar efectos de los compuestos en tejidos distintos en sangre. Se homogeneizaron bazos de los animales tratados con Compuesto 2 (parte superior) o R043 (parte inferior) en suspension celular individual y las muestras resultantes se procesaron de la misma manera que la sangre y se tineron con respecto a pAMpK. Parte superior, media geometrica para muestras de animales tratados con vetnculo (derecha) o Compuesto 2 (izquierda), factor con respecto al control de vetnculo. No estim, muestras procesadas sin ningun tratamiento adicional. Estim, muestras tratadas con Compuesto 1 3,2 |jM durante 5 min a 37 °C antes del procesamiento para determinar el nivel de estimulacion de AMPK maxima para celulas en suspension.

Parte inferior, media geometrica de pAMPK para muestras de bazo de animales tratados con vetnculo o Compuesto 3 a dosis indicadas y en puntos temporales despues de dosis oral, factores por encima del control de vetnculo en el punto temporal de 0,5 h.

Conclusion: puede usarse el mismo metodo para evaluar los niveles de pAMPK en tejidos solidos susceptibles de procesamiento por suspension celular individual, tal como bazo e tngado.

Ejemplo 17

Las Figuras 16A y 16B muestran que los niveles de estimulacion maxima de pAMPK son significativamente mayores en ratones en ayunas y delgados en comparacion con ratones alimentados y obesos, mientras que los niveles no estimulados permanecieron sin cambios. La Figura 15A muestra que la CE50 para cualquiera de los compuestos ensayados no dependfa de la saciedad. Los niveles de lmea basal de fosforilacion tanto de AMPK como de ACC permanecieron sin cambios en ambos grupos, mientras que los niveles de estimulacion maxima para ambos fueron significativamente mayores en el grupo en ayunas. La Figura 15B panel superior muestra los niveles de pAMPK en la sangre de ratones obesos y delgados antes y despues de la estimulacion ex vivo con el Compuesto 1. El panel inferior de la Figura 15B muestra niveles de pAMPK en los esplenocitos de ratones obesos y delgados antes y despues de la estimulacion ex vivo con R283.

La Figura 17A muestra un plan experimental y la Figura 17B muestra que hay una correlacion razonable entre los resultados de OGTT y PK/PD.

La enumeracion de cualquier publicacion es para su divulgacion antes de la fecha de presentacion y no debena interpretarse como una admision de que la presente invencion no tiene derecho a antedatar dicha publicacion en virtud de invencion previa.

Claims (18)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para evaluar el estado de ene^a de un sujeto que comprende:

   a) marcar celulas de una muestra sangumea del sujeto usando un anticuerpo que se une espedficamente con fosfo- AMPK, fosfo-acetil-CoA carboxilasa o fosfo-HMG-CoA reductasa, para producir una muestra marcada; y

   b) medir la union de anticuerpo con celulas individuales de una poblacion de celulas sangumeas de dicha muestra marcada usando citometna de flujo, obteniendo de este modo una evaluacion de la activacion de AMPK de dicha poblacion de celulas, en la que la activacion de AMPK evaluada en dicha poblacion de celulas puede usarse para evaluar el estado de energfa del sujeto.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha evaluacion es la fluorescencia media geometrica de dicha poblacion de celulas sangumeas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha poblacion de celulas sangumeas son globulos blancos o una subpoblacion de los mismos.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que dicha subpoblacion esta compuesta de linfocitos o granulocitos.
5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anticuerpo se une espedficamente con fosfo- AMPK.
6. 6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho anticuerpo se une espedficamente con fosfo- ACC
7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho metodo comprende ademas: antes de dicha etapa de marcaje: a) poner en contacto sangre con un agente de ensayo ex vivo; y

   comparar dicha evaluacion con resultados obtenidos de una muestra de referencia de celulas sangumeas, determinando de este modo el efecto de dicho compuesto en la activacion de AMPK en dicha poblacion de celulas sangumeas.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que dicho efecto se mide calculando la diferencia en la fluorescencia de media geometrica de dicha poblacion de celulas sangumeas y la fluorescencia de media geometrica de dicha muestra de referencia de celulas sangumeas.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 7 u 8, en el que dicha muestra sangumea se ha extrafdo de un sujeto al que se ha administrado dicho agente de ensayo.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 7 u 8, en el que dicha puesta en contacto comprende poner en contacto dicho agente de ensayo durante un periodo de tiempo espedfico despues de la provision de una muestra de sangre.
11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que se sabe que dicho agente de ensayo afecta a la activacion de AMPK.
12. 12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que el efecto de dicho agente de ensayo en la activacion de AMPK no se conoce.
13. 13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en el que dicha muestra de referencia comprende celulas sangumeas obtenidas del mismo individuo que dicha muestra de sangre.
14. 14. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en el que dicha muestra de referencia no se ha puesto en contacto con dicho agente de ensayo.
15. 15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que dicha muestra de sangre se pone en contacto

    con una primera cantidad de dicho agente de ensayo y la muestra de referencia se pone en contacto con una

    segunda cantidad de dicho agente de ensayo.
16. 16. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que dicho metodo comprende evaluar los resultados obtenidos de una muestra de sangre de un mairnfero que se ha sometido a un cambio en su estilo de vida y comparar dicha evaluacion con resultados obtenidos de una muestra de referencia de celulas sangumeas, determinando de este modo el efecto de dicho cambio en el estilo de vida en la activacion de AMPK de dicho mamffero.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 16, en el que dicho cambio en el estilo de vida es una dieta.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 16, en el que dicho cambio en el estilo de vida es aumentar el ejercicio.