ES2582581T3 - Ajuste prefiltración de solutos tampón para la preparación de inmunoglobulinas a alta concentración - Google Patents

Abstract

Método para concentrar una solución de inmunoglobulinas que comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una solución de inmunoglobulinas con un valor de pH, con una primera concentración de proteína inmunoglobulina, y una primera concentración S+ o S- de una sustancia tampón, b) ajustar la primera concentración de la sustancia tampón a una segunda concentración S' y mantener el valor del pH, de manera que la segunda concentración S' se calcula con la ecuación 2 en el caso de que la sustancia tampón sea una pareja de catión/neutro o con la ecuación 3 en el caso de que la sustancia tampón sea una pareja de neutro/anión, c) concentrar la solución de b) con una filtración de flujo tangencial a una segunda concentración de proteína inmunoglobulina, en el que la ecuación 2 es:**Fórmula** y la ecuación 3 es:**Fórmula** la concentración molar en el retenido de solutos cargados positivamente/negativamente (S+/S-), la carga de la proteína (z), la concentración molar (P) y el peso molecular (Pm) de la proteína, la densidad de la solución en el retenido (ρ ) y el filtrado (ρ '), y la concentración molar teórica del soluto difundible (S'), en donde la concentración teórica de soluto difundible S' se corrige con un factor de corrección en el que el incremento relativo de cada valor del pH se utilizó como el factor de corrección respectivo, en el que la proporción entre el anión del tampón/el catión del tampón y ácido del tampón se calcula para cada valor de pH determinado en el retenido mediante la utilización de la ecuación de Henderson-Hasselbach y se utiliza el incremento relativo a cada valor del pH como el factor de corrección respectivo.

Description

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DESCRIPCION

Ajuste prefiltracion de solutos tampon para la preparation de inmunoglobulinas a alta concentration

En la presente memoria se informa de un metodo para el ajuste prefiltracion de la concentracion del soluto antes de una filtracion de flujo tangencial con el fin de obtener un ingrediente proteico farmaceuticamente activo concentrado.

Antecedentes de la invention

Los polipeptidos desempenan un papel importante en el abanico actual de productos medicos. Los sistemas de expresion para la production de polipeptidos recombinantes son bien conocidos. Para la aplicacion en el ser humano toda sustancia farmaceutica debe cumplir claros criterios. Con el fin de garantizar la seguridad de los agentes biofarmaceuticos en el ser humano, por ejemplo los acidos nucleicos, virus y protemas de la celula huesped que provocarian graves danos deben ser eliminados. Para cumplir la norma reguladora, tras el procedimiento de fabrication deben llevarse a cabo una o mas etapas de purification. Entre otros, la pureza, la produccion y el rendimiento desempenan un papel importante en la determination de un procedimiento de purificacion apropiado.

Debido a sus propiedades quimicas y fisicas, tales como el peso molecular y la arquitectura de dominios, incluyendo las modificaciones secundarias, resulta esencial el procesamiento posterior de las inmunoglobulinas. Por ejemplo, se requieren soluciones concentradas no solo para los farmacos formulados sino tambien para intermediarios en el procesamiento posterior (PP) para conseguir volumenes bajos para una manipulation economica y el almacenamiento de la aplicacion. Ademas, resultan favorecidos los procedimientos de concentracion rapidos para garantizar procedimientos sin problemas y tiempos operativos cortos. En el presente contexto, se utilizan procedimientos de filtracion de flujo tangencial (FFT).

Saxena A. et al. informan de tecnicas basadas en membranas para la separation y purificacion de protemas (Adv. Colloid Interfacial Sci. 145:1-22, 2009). En el documento n° WO 2009/010269 se informa de un metodo de filtracion de flujo tangencial variable. Mignard D. et al. informan de ensuciamiento durante la ultrafiltracion de flujo cruzado de las protemas (J. Membr. Sci. 186:133-143, 2001). Se informa de un diagrama de optimization para las separaciones de membranas en Van Reis R. et al., J. Membr. Sci. 129:19-29, 1997).

Se ha informado de no idealidad termodinamica de las soluciones que contienen protemas durante los procedimientos basados en membranas en Donnan F.G., Z. Elektrochem. 17:572-581, 1911. Stoner et al. (J. Pharm. Sci. 93:2332-2342, 2004) han informado de la concentracion de solutos cargados, comprendiendo cloruro, histidina y acetato, durante la dialisis de las diferentes protemas a las diversas concentraciones de las mismas.

Description resumida de la invencion

Un aspecto tal como se informa en la presente memoria es un metodo de ultrafiltracion para concnetrar una solution de inmunoglobulinas que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una solucion de inmunoglobulinas con un valor de pH y con una primera concentracion S+ o S- de una sustancia tamponadora,

b) ajustar la primera concentracion de la sustancia tamponadora a una segunda concentracion S' y mantener el valor del pH, en donde la segunda concentracion S' se calcula con la ecuacion 2 en el caso de que la sustancia tamponadora sea una pareja cation/neutro, o con la ecuacion 3 en el caso de que la sustancia tamponadora sea una pareja neutro/anion,

c) concentrar la solucion de b) mediante una filtracion de flujo tangencial, en la que la ecuacion 2 es:

y la ecuacion 3 es:

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con

la concentracion molar en el retenido de solutos cargados positivamente/negativamente (S+/S-), la carga de la

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protema (z), la concentracion molar (P) y el peso molecular (Pm) de la protema, la densidad de la solucion en el retenido (p) y el permeado (p'), y la concentracion molar teorica del soluto difundible (S'), en donde la concentracion teorica de soluto difundible S' se corrige con un factor de correccion que considera el valor del pH en el que la proporcion entre anion del tampon/cation del tampon y acido del tampon se calcula para cada valor de pH determinado en el retenido mediante la utilizacion de la ecuacion de Henderson-Hasselbach y se utiliza el incremento relativo a cada valor del pH como el factor de correccion respectivo.

En una realizacion, la sustancia tamponadora es histidina y la segunda concentracion se calcula con la ecuacion 2. En una realizacion, el valor del pH es de entre 5,0 y 6,0. En una realizacion adicional, el valor del pH es 5,5. En otra realizacion, la primera concentracion es de aproximadamente 20 mM. En una realizacion adicional, la segunda concentracion es de entre 24 mM y 37 mM, con una concentracion de protema de la solucion concentrada de entre 100 g/l y 300 g/l, respectivamente. En una realizacion, la concentracion de protema es de aproximadamente 200 g/l y la segunda concentracion es de entre 28 mM y 31 mM. En otra realizacion, la primera concentracion es de aproximadamente 46 mM. En una realizacion adicional, la segunda concentracion es de entre 52 mM y 72 mM, con una concentracion de protema de la solucion concentrada de entre 100 y 300 g/l, respectivamente. En una realizacion, la concentracion de protema es de aproximadamente 200 g/l y la segunda concentracion es de entre 59 mM y 62 mM.

En otra realizacion, la sustancia tamponadora es acetato y la concentracion se calcula con la ecuacion 3. En una realizacion, el valor del pH es de entre 4,5 y 6,0. En una realizacion adicional, el valor del pH es 5,5. En otra realizacion, la primera concentracion es de aproximadamente 20 mM. En una realizacion adicional, la segunda concentracion es de entre 8 mM y 19 mM, con una concentracion de protema de la solucion concentrada de entre 100 g/l y 300 g/l, respectivamente. En una realizacion, la concentracion de protema es de aproximadamente 200 g/l y la segunda concentracion es de entre 12 mM y 17 mM. En otra realizacion, la primera concentracion es de aproximadamente 45 mM. En una realizacion adicional, la segunda concentracion es de entre 41 mM y 48 mM, con una concentracion de protema de la solucion concentrada de entre 300 y 100 g/l, respectivamente. En una realizacion, la concentracion de protema es de aproximadamente 200 g/l y la segunda concentracion es de entre 43 mM y 47 mM.

En una realizacion, la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-selectina P o un anticuerpo anti-Ap.

Otro aspecto tal como se informa en la presente memoria es un metodo para producir una inmunoglobulina in vitro, comprendiendo:

a) cultivar una celula que comprende un acido nucleico codificante de la inmunoglobulina, b) recuperar la inmunoglobulina a partir del medio de cultivo o la celula de la etapa a), c) purificar la inmunoglobulina, d) concentrar la inmunoglobulina con un metodo tal como se informa en la presente memoria, para producir de esta manera una inmunoglobulina.

Descripcion detallada de la invencion

En la presente memoria se informa de un metodo de filtracion de flujo tangencial con un ajuste de la concentracion de soluto prefiltracion con el fin de garantizar una concentracion definida de los componentes de la solucion tras la filtracion de flujo tangencial.

La expresion "pareja cation/neutro" se refiere a una sustancia tamponadora que proporciona un sistema tamponador que consiste de la sustancia tamponadora en forma neutra y la sustancia tamponadora en forma protonada, es decir, con carga positiva, como cation. Un ejemplo del mismo es la histidina. La expresion "pareja neutro/anion" se refiere a una sustancia tamponadora que proporciona un sistema tamponador que consiste de la sustancia tamponadora en forma neutra y la sustancia tamponadora en forma desprotonada, es decir, en forma cargada negativamente, como anion. Un ejemplo es el acetato.

La expresion "filtracion de flujo tangencial" o, abreviadamente, "FFT", se refiere a un procedimiento de filtracion en el que una solucion que contiene un polipeptido que debe concentrarse fluye a lo largo, es decir, tangencialmente, a la superficie de una membrana de filtracion. La membrana de filtracion presenta un tamano de poro con un determinado valor de corte. En una realizacion, el valor de corte se encuentra comprendido en el intervalo de entre 20 y 50 kDa; en otra realizacion, es de 30 kDa. La FFT se llevo a cabo como ultrafiltracion. La expresion "flujo cruzado" se refiere al flujo de la solucion que debe concentrarse tangencialmente a la membrana (flujo del retenido). El termino "flujo" o "flujo de filtrado", que pueden utilizarse intercambiablemente, se refiere al flujo de lfquido a traves de la membrana, es decir, a traves de los poros de la membrana. Es decir, se refiere a la tasa volumetrica del flujo de filtrado a traves de la membrana. El flujo habitualmente se expresa en terminos de volumen por unidad de area de membrana por unidad de tiempo, en litros/m2/h (LMH). El filtrado comprende el solvente de la solucion que debe concentrarse en el lado del filtrado, asf como moleculas con un peso molecular inferior al valor de corte de la

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membrana utilizada, pero no el polipeptido que debe concentrarse. La expresion "presion transmembranal" o "PTM", que pueden utilizarse intercambiablemente, se refiere a la presion que se aplica para impulsar el solvente y los componentes menores que el valor de corte de la membrana a traves de los poros de la misma. La presion transmembranal es una presion media de la entrada, la salida y el filtrado y puede calcularse como:

imagen3

(ecuacion 1)

El termino "soluto" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a todos los componentes, es decir los ionicos y los no ionicos, de una solution que debe concentrarse excepto las moleculas de agua y las moleculas del polipeptido que debe concentrarse. Generalmente la solucion que debe concentrarse comprende un polipeptido, agua y una sal tampon, y opcionalmente una sal no tampon, tal como cloruro sodico.

Un “polipeptido” es un poffmero que consiste de residuos aminoacidos unidos mediante enlaces pepffdicos, producidos natural o sinteticamente. Los polipeptidos de menos de aproximadamente 20 residuos aminoacidos se denominan "peptidos". Una protema es una macromolecula que comprende una o mas cadenas polipepffdicas o por lo menos una cadena polipepffdica de mas de 100 residuos aminoacidos. Un polipeptido puede comprender ademas componentes no pepffdicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no pepffdicos pueden ser anadidos a un polipeptido por la celula en la que se produce el polipeptido variara segun el tipo de celula. Los polipeptidos se definen en la presente memoria en terminos de sus estructuras del esqueleto de aminoacidos; algunos sustituyentes, tales como grupos carbohidratos, no se especifican generalmente, aunque sin embargo pueden encontrarse presentes.

El termino "inmunoglobulina" se refiere a una protema que consiste de uno o mas polipeptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Entre los genes de inmunoglobulina reconocidos se incluyen los diferentes genes de region constante, asi como la multitud de genes de region variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, asi como cadenas sencillas (scFv) o diacuerpos (en general, Hood L.E. et al., Immunology, The Benjamin, N.Y., 2a edition, 1984). De esta manera, el termino "inmunoglobulina" se refiere a una inmunoglobulina completa que consiste de dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, asi como un "fragmento de inmunoglobulina" que comprende por lo menos un dominio seleccionado de entre el dominio variable, el dominio Ch1, la region bisagra, el dominio Ch2, el dominio Ch3 o el dominio Ch4 de una cadena pesada, o el dominio variable o el dominio Cl de una cadena ligera y un "conjugado de inmunoglobulinas" que comprende por lo menos un dominio de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina conjugado mediante un enlace pepffdico con un polipeptido adicional. El polipeptido adicional es un peptido no inmunoglobulina, tal como una hormona, o toxina, o receptor de crecimiento, o peptido antifusogenico, o factor complemento, o similar.

Para la purification de inmunoglobulinas producidas biotecnologicamente, con frecuencia se utiliza una combination de diferentes etapas de cromatograffa de columna. En una realization, tras una cromatograffa de afinidad con protema A puede llevarse a cabo una o dos etapas adicionales de separation. La etapa de purificacion final es una denominada "etapa de pulido", para la eliminacion de impurezas y contaminantes residuales, tales como inmunoglobulinas agregadas, PCH (protemas de la celula huesped) residuales, ADN (acidos nucleicos de la celula huesped), virus o endotoxinas. Para la etapa de pulido, en una realizacion se utiliza un material de intercambio anionico en un modo de elucion.

Una serie de diferentes metodos se encuentran bien establecidos y son ampliamente utilizados para la recuperacion y purificacion de protemas, tales como la cromatograffa de afinidad con protemas microbianas (por ejemplo la cromatograffa de afinidad de protema A o de protema G), la cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo de intercambio cationico (resinas carboximetilo), de intercambio anionico (resinas aminoetilo) y de intercambio de modo mixto), la adsorcion tiofflica (por ejemplo con beta-mercaptoetanol y con otros ligandos de SH), la cromatograffa de interaction hidrofobica o de adsorcion aromatica (por ejemplo con fenil-sefarosa, resinas aza-arenofflicas o acido m- aminofenilboronico), la cromatograffa de afinidad de quelato metalico (por ejemplo con material de afinidad por el Ni(II) y por el Cu(II)), la cromatograffa de exclusion por tamano, y metodos electroforeticos (tales como la electroforesis en gel y la electroforesis capilar). Estos metodos pueden combinarse independientemente en diferentes realizaciones de la presente invention.

La expresion "inmunoglobulina en forma monomerica" y los equivalentes gramaticales de la misma se refieren a una molecula de inmunoglobulina no asociada a una segunda molecula de inmunoglobulina, es decir ni covalentemente ni no covalentemente a otra molecula de inmunoglobulina. La expresion "inmunoglobulina en forma agregada" y

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equivalentes gramaticales de la misma se refiere a una molecula de inmunoglobulina que se encuentra asociada, covalente o no covalentemente, a por lo menos una molecula adicional de inmunoglobulina o fragmento de la misma, y que se eluye en un unico pico a partir de una columna de cromatograffa de exclusion por tamano. La expresion "en forma monomerica" y equivalentes gramaticales de la misma tal como se utiliza en la presente solicitud no se refiere necesariamente a que el 100% de una molecula de inmunoglobulina se encuentra presente en forma monomerica. Se refiere a que una inmunoglobulina se encuentra esencialmente en forma monomerica, es decir, por lo menos 90% de la inmunoglobulina se encuentra en forma monomerica, en una realizacion por lo menos 95% de la inmunoglobulina se encuentra en forma monomerica, en otra realizacion por lo menos 98% de la inmunoglobulina se encuentra en forma monomerica, en una realizacion adicional por lo menos 99% de la inmunoglobulina se encuentra en forma monomerica, y en una realizacion adicional mas de 99% de la inmunoglobulina se encuentra en forma monomerica, determinada como el area de pico de una cromatograma de exclusion por tamano de la preparacion de inmunoglobulinas. La expresion "en forma monomerica y en forma agregada" se refiere a una mezcla de moleculas de inmunoglobulina no asociadas a otras moleculas de inmunoglobulina y de moleculas de inmunoglobulina asociadas a otras moleculas de inmunoglobulina. En dicha mezcla, ni la forma monomerica ni la forma agregada se encuentra presente de manera exclusiva. La expresion "forma de elevado peso molecular (EPM)" se refiere a una inmunoglobulina polimerica, es decir, agregada, en la que el agregado todavfa es soluble en una solucion tamponada acuosa.

El termino "100%" tal como se utiliza en la presente solicitud se re fiere a que la cantidad de componentes diferentes de un componente especificado es inferior al ffmite de deteccion del metodo analffico al que se hace referencia bajo las condiciones especificadas.

Los terminos "90%", "95%, "98%, "99% tal como se utilizan en la presente solicitud se refieren no a valores exactos sino a valores dentro de la precision del metodo analftico al que se hace referencia, bajo las condiciones especificadas.

Generalmente la cromatograffa de intercambio ionico en modo de elucion es la etapa cromatografica final en los procedimientos de purificacion de las inmunoglobulinas monoclonales para eliminar el ADN residual de la celula huesped, las endotoxinas y las parffculas de tipo retrovmco. Por lo tanto, la agrupacion de cromatograffa de intercambio ionico purificada se encuentra en, por ejemplo, un tampon de fosfato o de tris(hidroximetil)- aminometano. Posteriormente las condiciones deben cambiarse a un sistema tampon para, por ejemplo, garantizar la estabilidad del ingrediente farmaceutico activo durante el almacenamiento. Generalmente el valor del pH es ligeramente acido, por ejemplo de entre 5 y 6, y con frecuencia se requiere una conductividad inferior a 5 mS/cm (Daugherty A.L. y Mrsny R.J., Adv. Drug Deliv. Rev. 58:686-706, 2006).

Concomitantemente, la agrupacion de intercambio ionico es el tampon base para la formulacion mediante la utilizacion/adicion de diferentes soluciones madre de excipientes como surfactantes y azucares. Por lo tanto, la agrupacion de cromatograffa de intercambio ionico se concentra y se diafiltra en una composicion tampon adecuada mediante ultrafiltracion con el fin de proporcionar una composicion definida de protemas, solutos tampon, pH y conductividad.

Las interacciones electrostaticas de iones y polipeptidos a valores de pH no isoelectrico conducen a una division desigual de los mismos durante un procedimiento de ultrafiltracion en el lado de retenido y en el lado de permeado de la membrana de ultrafiltracion. Lo anterior resulta en una variacion significativa de la concentracion de soluto antes y despues de la filtracion de flujo tangencial (para la concentracion y diafiltracion) y resulta en variaciones del pH y la conductividad antes, durante y despues de la filtracion de flujo tangencial.

Por ejemplo, una agrupacion de inmunoglobulinas de cromatograffa de intercambio ionico se diafiltro frente a tampon de histidina 20 mM (pH 5,5, 1,6 mS/cm) de un volumen de diafiltracion (VD) de 1 a 10 veces con respecto al volumen de agrupacion. A continuacion, la agrupacion diafiltrada se concentro a mas de 210 mg/ml de concentracion de protema en una filtracion de flujo tangencial. Se ha encontrado que incluso tras aplicar un volumen de diafiltracion de 10 veces, las condiciones predefinidas para el sistema tampon de histidina referidas al valor del pH y la conductividad no pudieron mantenerse constantes tras completar el procedimiento de concentracion. Tras iniciar el procedimiento de concentracion, el valor del pH se incremento a 5,7 y la conductividad alcanzo 2,2 mS/cm a una concentracion de protemas de 215 mg/ml en el retenido.

Ademas, se realizo un seguimiento de la conductividad y del pH durante el procedimiento de concentracion de UF en tampon de histidina 20 mM a pH 5,5. Con una concentracion incrementada de protemas se observo nuevamente un incremento de la conductividad. Ademas, tambien se observo un incremento del valor del pH hasta 5,8.

Se llevo a cabo una observacion diferente aunque tambien similar durante un procedimiento de concentracion mediante UF con otro sistema tampon (tampon de acetato 20 mM a pH 5,5). Durante el procedimiento de UF, el valor del pH se incremento a 5,8, de manera similar a la observada con el tampon de histidina 20 mM, aunque la

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conductividad se redujo a mayores concentraciones de protema. Se observo esencialmente lo mismo a una concentration de acetato mas alta, de 45 mM, a pH 5,0.

Durante el procedimiento de concentracion mediante UF de la inmunoglobulina monoclonal en dos sistemas tampon definidos diferentes, se observo una acumulacion significativa de la sustancia tampon en el caso del acetato en el retenido, y una perdida significativa de la sustancia tampon en el caso de la histidina en el retenido (ver, por ejemplo, las figuras 1 y 3). La concentracion de acetato practicamente se duplico, mientras que la concentracion de histidina se redujo a la mitad, a una concentracion de inmunoglobulina de aproximadamente 200 mg/ml. Ambos indujeron cambios de conductividad y del pH durante el procedimiento de concentracion.

La division desigual de los compuestos solutos durante las operaciones de diafiltracion y concentracion resultaron en concentraciones de excipiente, pH y conductividad que eran significativamente diferentes de las del tampon de diafiltracion al inicio del procedimiento. Debido a que lo anterior puede influir sobre la estabilidad de la inmunoglobulina formulada final, se requiere la concentracion de compuesto soluto prefijada en la preparation de inmunoglobulina concentrada.

Son posibles diferentes opciones para corregir los cambios durante la filtracion de flujo tangencial:

- reposicion/dilucion con solution tampon tras la concentracion,

- ajuste del valor de pH a un valor proximo al valor del punto isoelectrico antes de la filtracion de flujo tangencial (ver, por ejemplo, la figura 2),

- adicion/reduccion definida de soluto antes de la filtracion de flujo tangencial (ver, por ejemplo, la figura 4).

La dilution tras la UF con solucion tampon no resulta adecuada, ya que resultara tambien en una dilution y reduction de la concentracion de inmunoglobulina. Lo anterior es exactamente lo contrario del objetivo del procedimiento de UF de proporcionar soluciones de inmunoglobulinas concentradas.

Ahora se ha encontrado que la adicion/reduccion definida de concentracion de soluto antes del procedimiento de filtracion de flujo tangencial resulta ventajosa para corregir los cambios de concentracion con independencia del dispositivo de concentracion, material de la membrana y parametros de concentracion. Se ha encontrado que, tal como en una realization de tampon de histidina (=soluto), se requiere un ajuste a pH aproximadamente 5,0 a 29,6 mM y 60 mM de histidina, respectivamente, antes de la filtracion de flujo tangencial, para alcanzar una concentracion predefinida de tampon de histidina de 20 mM y 46 mM de histidina, respectivamente, tras la filtracion de flujo tangencial en la concentracion de una inmunoglobulina de la clase IgG1 e IgG4 a 215 mg/ml.

En un modo alternativo de considerar los cambios de concentracion durante el procedimiento de ultrafiltracion, se reajustaron los concentrados a un valor de pH de 5,0 mediante la adicion de acido clorhidrico (HCl) a 0,5 M a la solucion bajo agitation tras el procedimiento de UF. Lo anterior solo resulto necesario para las soluciones que se concentraron a pH 7,5 y con histidina 20 mM, pH 5,0, debido al cambio del pH durante la UF. Los experimentos, realizados con histidina 29,6 mM, pH 5,0, no mostraron un cambio de pH tal como se ha indicado anteriormente. La Tabla 1 muestra los valores del pH antes de la UF, despues de la UF y tras el reajuste a pH 5,0.

Tabla 1: valores de pH antes de la UF, despues de la UF y para el producto final con pH reajustado a 5,0; se utilizo acido clorhidrico 0,5 M para reajustar el pH a 5,0 en el producto final; se proporcionan los valores medios de tres

mediciones ±SD.

Condiciones iniciales

pH antes de la UF pH despues de la UF pH del producto final

Tampon de histidina 20 mM, pH 5,0

4,97 +/- 0,04 5,40 +/- 0,06 4,90 +/- 0,14

Tampon de histidina 32 mM, pH 5,0

5,0 +/- 0,04 5,20 +/- 0,05 --

Tampon de histidina 20 mM, pH 7,4

7,37 +/- 0,06 7,47 +/- 0,05 4,81 +/- 0,22

El ajuste de la concentracion de soluto antes de la UF se calculo basandose en las ecuaciones 2 y 3, a continuation.

-zP+ j(z P)2 + 4(— (p - ^-^))2

V V 1000

2

(ecuacion 2)

La Ecuacion 2 describe la concentracion molar en el retenido en el que los solutos con carga positiva (S+) pueden pasar la membrana. S+ depende de la carga de la protema (z), de la concentracion molar (P) y del peso molecular

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(Pm) de la protema, si como de la densidad de la solution en el retenido (p) y en el filtrado (p'). S' es la concentration molar teorica del soluto difundible.

zP+ (z P)2 +4(— (p-?-Mp))1 V p 1000

(ecuacion 3)

La Ecuacion 3 describe la concentracion molar en el retenido en el que los solutos con carga negativa (S') pueden pasar la membrana.

Para una inmunoglobulina ejemplar contra el peptido amiloide p (anticuerpo anti-AP) tal como se informa en el documento n° WO 2003/070760 o n° US 2005/0169925, el calculo se lleva acabo tal como se indica de manera general a continuation.

Para obtener una solucion con una concentracion final de inmunoglobulina de 200 mg/ml en tampon de histidina 20 mM a pH 5,5. La concentracion de histidina antes de que se calcule la etapa de concentracion con la ecuacion 2 reorganizada para calcular S' como molecula de soluto es una molecula con carga positiva.

La Ecuacion 2 reorganizada (ecuacion 2') es:

imagen4

Se utilizaron los valores siguientes de los parametros:

(ecuacion 2’)

masa molecular de la inmunoglobulina: 150.000 g/mol

densidad del permeado: 0,9989 g/ml

concentracion molar a la concentracion final: 0,00133 moles/l

carga de la protema: (para la determination, ver el Ejemplo 13) +9

concentracion inicial de protema: (para la determinacion, ver el Ejemplo 4) 15 mg/ml

concentracion de tampon diana: 0,020 M

densidad de la solucion de protema al final de la concentracion: 1.055,1 g/ml

(para la determinacion, ver el Ejemplo 14)

Los valores se introdujeron en la Ecuacion 2', resultando en:

imagen5

Por lo tanto, con el fin de llevar a cabo el calculo, por ejemplo para una concentracion final de 200 mg/ml, deben determinarse experimentalmente la carga de la inmunoglobulina que debe concentrarse segun el Ejemplo 13, la densidad de la solucion de inmunoglobulinas tras la concentracion segun el Ejemplo 14, y la concentracion de la inmunoglobulina en la solucion inicial de inmunoglobulina segun el Ejemplo 4.

Tambien resulta posible utilizar valores de la literatura para la densidad de la solucion inicial, segun la Tabla 2, a continuacion.

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Tabla 2: densidad de soluciones de protemas.

concentracion de protema [mg/mll

densidad de la solucion [g/ml]

15

1,0105

28

1,0140

41

1,0174

55

1,0211

68

1,0246

85

1,0291

100

1,0331

112

1,0362

120

1,0384

138

1,0431

185

1,0556

200

1,0596

La Ecuacion 3 reorganizada (ecuacion 3') es:

(2 *[S + ]-z*P)2 — (z * P)~

S’=----------------1^*7*-------------V (ecuacion 3’)

P*M

p---------------

1000

En el caso de una sal tampon anionica (soluto) debido al incremento del valor del pH durante el procedimiento de UF, el porcentaje de sal tampon (soluto) en forma anionica tambien se incrementa. Por lo tanto, en la practica se pierden mas aniones de sal tampon que las repuestas segun el calculo utilizando las ecuaciones anteriormente proporcionadas sin considerar el valor del pH. Por lo tanto, la concentracion de soluto difundible teorica S' debe corregirse utilizando un factor que considera el valor del pH. La proporcion entre anion de tampon/cation de tampon y acido del tampon puede calcularse para cada valor de pH determinado en el retenido mediante la utilizacion de la ecuacion de Henderson-Hasselbach. El incremento relativo a cada valor de pH puede utilizarse como el factor de correccion respectivo.

Se aproximo la concentracion molar de soluto mediante la insercion del valor de carga real de la inmunoglobulina al valor del pH en las ecuaciones 2 y 3, respectivamente. Se determino la carga global de la protema mediante mediciones del potencial zeta (ver el Ejemplo 13).

Se encuentran disponibles varias posibilidades para determinar la valencia de la protema dependiendo del valor del pH. Aparte de las curvas de titulacion calculadas basadas en la secuencia proteica mediante la combinacion de los valores de pKa medios de todas las cadenas laterales de aminoacidos acidas y basicas, resulta posible la determinacion experimental basada en la movilidad electroforetica, al igual que la medicion del potencial zeta (FAude A. et al., J. Chromatogr. A 1161:29-35, 2007; Salinas B.A., J. Pharm. Sci. 99:82-93, 2009) o la electroforesis en gel y capilr (Winzor D.J. et al., Anal. Biochem. 333:225-229, 2004). Debido a que la valencia de la protema depende no solo del pH sino tambien de la composicion de electrolitos del tampon del medio, no se dispone de ninguna alternativa realista para determinar la carga real de la protema.

Se concentraron dos soluciones de inmunoglobulinas (ver la seccion de Ejemplos para mas informacion) de 15 mg/ml a 200 mg/ml. Una solucion utilizada contema histidina 20 mM a pH 5,0, y una solucion utilizada contema histidina 20 mM a pH 5,5 antes de la UF. Ambas soluciones de inmunoglobulinas debfan presentar histidina 20 mM al pH predefinido tras el procedimiento de concentracion. Durante la UF, se observo el desplazamiento de la histidina, que se corrigio cuantitativamente mediante la utilizacion de la Ecuacion 2 con una carga de protema de + 11. A una concentracion de inmunoglobulinas de 200 mg/m, solo quedaba 10,8 mM de histidina sin reposicion antes de la UF. Se calculo que debfan encontrarse presentes 29,6 mM de histidina antes de la UF, para acabar con 20 mM de histidina tras el procesamiento a una concentracion de protema de 200 mg/ml. Los datos experimentales con un sistema tampon que contema 30,3 ± 0,7 mM de histidina a pH 5,5 demostraron que los concentrados de 200 mg/ml mostraban una concentracion de histidina de 18,6 ± 0,4 mM, tal como se habfa predicho. De esta manera, se confirmo que, mediante la utilizacion de una concentracion de histidina mas alta al inicio de la UF, calculada mediante la utilizacion de la Ecuacion 2', la concentracion pretendida de histidina se encontraba presente tras la UF hasta una concentracion diana de protema de 200 mg/ml.

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Ademas, la concentracion de histidina deseada de 46 mM a una concentracion de protema de 200 mg/ml puede alcanzarse mediante la aplicacion de una concentracion de histidina inicialmente mas alta, de 60 mM, antes de la UF, tal como se calcula utilizando la ecuacion 2'. En este caso se aplica una carga de la protema de +7.

En el caso de la histidina, la molaridad de soluto mas alta calculada antes de iniciar el procedimiento de concentracion mediante UF resulto en las molaridades deseadas de histidina en las soluciones concentradas. Ademas, durante y despues del procedimiento de UF, el valor del pH permanecio practicamente constante en comparacion con los experimentos llevados a cabo a una molaridad mas baja.

A una concentracion de protema de 200 mg/ml, el valor del pH cambio de pH 5,44 ± 0,04 a pH 5,80 ± 0,05, en el caso de que la concentracion de histidina no se incrementase a 29,6 mM de histidina antes de la UF. En el caso de que la concentracion de histidina se incrementase a 29,6 mM, el pH era practicamente constante, es decir, pH 5,45 ± 0,04 antes y pH 5,57 despues del procesamiento mediante UF.

Se ha encontrado ademas que no resultaba necesario un ajuste del valor del pH.

En el caso de que el valor del pH se ajustase a un valor proximo al punto isoelectrico antes del procedimiento de filtracion de flujo tangencial, se inducfa la formacion de agregados y partroulas durante el procedimiento de filtracion de flujo tangencial. En contraste con lo anterior, la correccion sistematica de los parametros de concentracion antes del procedimiento de filtracion de flujo tangencial no induce la formacion de agregados y/o partroulas.

Se inmunofiltraron soluciones de inmunoglobulinas a una concentracion de 20 mg/ml hasta 200 mg/ml. Se utilizaron sistemas tampon basados en histidina. Por una parte, se llevaron a cabo experimentos en un tampon de histidina 29,6 mM, pH 5,0. Por otra parte, se llevo a cabo la UF en un tampon de histidina 20 mM, pH 7,4. Se compararon los resultados con los de experimentos llevados a cabo en un sistema de tampon que contema histidina 20 mM a pH 5,0 (ver las figuras 6 y 7).

Se observo que la formacion de partroulas durante la UF se incrementaba a pH 7,4. Durante el curso de la UF, se formaban hasta 8x106 partroulas de tamano superior a 1 mm y la turbidez se incrementa de 0,1 UA a 1,6 UA. Las soluciones que conteman diferentes inmunoglobulinas ultrafiltradas a un valor de pH de 5,0 se analizaron con respecto a la formacion de partroulas y la turbidez. La formacion de partroulas y la turbidez se redujeron claramente a dicho valor del pH. Lo anterior puede atribuirse a que el valor del pH, de 7,4, es proximo al punto isoelectrico (PI) de uno de los anticuerpos, que se ha determinado que es de aproximadamente 8 (Nakatsuka S. y Michaels A.S., J. Membr. Sci. 69:189-211, 1992).

Se llevo a cabo la medicion de las partroulas y de la turbidez a 350 nm y la HPLC-ET, para llevar a cabo un seguimiento de la induccion de agregados debido a la adicion de acido clorhndrico. Para el producto final reajustado, se observo una induccion de partroulas de tamano superior a 1 mm y un incremento de la turbidez para las soluciones concentradas en histidina 20 mM a pH 5,0.

Se determino un incremento de los PMe de 2,23 ± 0,05% a 2,71%. Para la solucion que contema histidina 29,6 mM a pH 5,0 antes de la UF, el numero de partroulas por cada ml mayor que 1 mm, los valores de turbidez y el porcentaje de PME permanecio constante.

Tras reajustar el valor del pH de 7,4 a 5,0, el porcentaje de PME se incremento de 0,74% a 17,15 ± 0,97%. Concomitantemente, el numero de partroulas mayores de 1 mm y los valores de turbidez se redujeron. Sin embargo, el numero de partroulas y los valores de turbidez se mantuvieron mucho mas altos en comparacion con los otros dos procedimientos.

Se ha observado que la adicion de un HCl de molaridad mas alta incrementa el porcentaje de dfmeros, asf como el de oligomeros. Lo anterior se previno mediante la adicion de HCl 0,02 M. Concomitantemente, la adicion de un HCl diluido resulto en una dilucion masiva de la masa concentrada de protemas, resultando finalmente en aproximadamente un tercio de la concentracion de protemas tras el ajuste del pH.

Se ha encontrado ademas que un cambio del pH antes del procedimiento de filtracion tangencial resulta una reduccion del flujo transmembranal que resulta en un tiempo de concentracion drasticamente incrementado (ver la figura 8). En el caso de que se lleve a cabo una correccion de la concentracion de soluto antes de la UF, no se produce ninguna reduccion del flujo transmembranal y el tiempo de concentracion no resulta afectado.

Se observo que el flujo de filtrado se reducfa significativamente durante el procesamiento en comparacion con los experimentos realizados a pH 5,0. El tiempo del procedimiento se mas que duplico, de 120 ± 2 min. a 300 ± 2 min. al ajustar el valor del pH a 7,4 antes de iniciar la UF. Tambien se observo que la adicion de histidina antes de la etapa de UF no presentaba ninguna influencia sobre el flujo de filtrado.

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Se encontro ademas que con la composicion de tampon alterada durante el procedimiento de filtracion de flujo tangencial, resultaba afectada la estabilidad de la protema concentrada.

Se llevaron a cabo procedimientos de UF durante el procedimiento y el desarrollo de la formulacion. Se aplicaron diferentes sistemas de UF, materiales de membrana y parametros operativos para concentrar el volumen principal de protemas. Con el objetivo de alcanzar una prueba de que el modelo presentado en la presente memoria reflejaba adecuadamente los valores experimentales respecto a la perdida de histidina durante la concentracion mediante UF, se sometieron a ensayo diferentes materiales de membrana, sistemas de UF y parametros operativos (ver la Tabla 3 y la figura 5).

Tabla 3: diferentes configuraciones.

Concentracion de histidina [mMl

Valor de pH Material de membrana de UF / tamano de poro [kDal Sistema de UF Ap [bar]

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5,0 RC / 30 Celda bajo agitacion 2,0

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5,0 RC / 30 Flujo cruzado 0,8

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5,0 RC / 30 Flujo cruzado 1,5

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5,0 PES/30 Flujo cruzado 1,5

Especialmente la polietersulfona (PES) es conocida que adsorbe protemas en mayor grado que la celulosa regenerada (CR), debido a su hidrofobicidad incrementada. Ademas, las protemas y los solutos pueden interactuar con la superficie de la membrana basandose en interacciones de carga-carga. En consecuencia, el resultado de la molaridad del soluto en los concentrados puede resultar influida por la eleccion de material de membrana.

Con independencia del sistema de UF aplicado, del material de la membrana o de las condiciones operativas, los datos experimentales referentes a la molaridad de la histidina durante la UF puede aproximarse mediante la utilizacion de las ecuaciones indicadas anteriormente.

En la figura 10, se muestra un grafico que muestra la concentracion de la histidina que debe ajustarse antes de la ultrafiltracion dependiendo de la concentracion final deseada de protema con el fin de presentar una solucion final con tampon de histidina 20 mM a pH 5,5, ejemplificado con un anticuerpo anti-Ap, calculada segun el metodo informado en la presente memoria.

Los ejemplos y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprension de la presente invencion, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse del espmtu de la invencion.

Descripcion de las figuras

Figura 1 Concentracion de iones de tampon antes y despues de la filtracion de flujo tangencial ejemplificadas con un tampon de histidina y un tampon de acetato, ejemplificado con un anticuerpo anti-Ap; negro=tampon de histidina; blanco=tampon de acetato.

Figura 2 Concentraciones de iones de tampon antes y despues de la filtracion de flujo tangencial, ejemplificada con un tampon de histidina y un tampon de acetato antes del ajuste del valor de pH a un valor proximo al punto isoelectrico antes de la filtracion de flujo tangencial; negro=tampon de histidina 20 mM, pH 5; blanco=tampon de histidina, 20 mM, pH 7,5.

Figura 3 Curso de las concentraciones de ion del tampon durante la filtracion de flujo tangencial ejemplificado con un tampon de histidina y un tampon de acetato con ajuste de la concentracion de iones de tampon antes de la filtracion de flujo tangencial; rombos pequenos: datos experimentales de tampon de histidina 20 mM, lmea continua: ajuste para los presentes datos; rombos grandes: datos experimentales de tampon de histidina 29,6 mM, lmea discontinua: ajuste de los presentes datos.

Figura 4 Concentraciones de iones de tampon antes y despues de la filtracion de flujo tangencial, ejemplificada con un tampon de histidina y un tampon de acetato con ajuste de la concentracion de iones de tampon antes de la filtracion de flujo tangencial; negro=tampon de histidina 20 mM; blanco=tampon de histidina, 29,6 mM.

Figura 5 Cambio de la concentracion de iones de tampon en un procedimiento de concentracion con diferentes dispositivos de concentracion; lmea continua: ajuste; triangulos blancos: Hydrosart™; triangulos grises: celda de agitacion; triangulos pequenos negros: PESU; triangulos grandes negros: AP=0,8 bar.

Figura 6 Induccion de compuestos de elevado peso molecular durante la concentracion debido al ajuste del pH; negro=concentrado a pH 5,0; gris claro=concentrado a pH 7,5; gris oscuro=concentrado a pH 5 y adicion de histidina adicional antes de la concentracion.

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Figura 7 Induccion de partmulas durante la concentracion debido al ajuste del pH; negro=concentrado a pH 5,0; gris claro=concentrado a pH 7,5; gris oscuro=concentrado a pH 5 y adicion de histidina adicional antes de la concentracion.

Figura 8 Dependencia del flujo transmembrana respecto de la concentracion de retenido y del metodo de ajuste; rombos pequenos blancos=pH 7,5; rombos arises=pH 5,0 con una P de 0,8 bar; rombos negros=pH 5,0 PESU; rombos grandes blancos=pH 5,0 Hydrosart™; triangulos negros=pH 5,0 con adicion de histidinas antes de la concentracion.

Figura 9 Potencial zeta determinado segun el Ejemplo 13 para un anticuerpo anti-IL-IR.

Figura 10 Grafico que muestra la concentracion histidina que debe ajustarse antes de la ultrafiltracion segun la concentracion final de protema deseada con el fin de obtener una solucion final con tampon de histidina 20 mM a pH 5,5 ejemplificada con un anticuerpo anti-Ap.

Ejemplo 1

Materiales y metodos Compuestos quimicos

Todos los compuestos quimicos y reactivos utilizados eran de por lo menos grado analttico. El acido clortudrico y el hidroxido sodico se obtuvieron de Merck KG (Darmstadt, Alemania). Se utilizo L-histidina de Ajinomoto (Raleigh, EUA). El acido se obtuvo de Fluka (Steinheim, Alemania). El cloruro sodico se obtuvo de Merck KG (Darmstadt, Alemania).

Anticuerpo

El metodo tal como se informa en la presente memoria se ejemplifica con una inmunoglobulina contra el peptido p- amiloide (anticuerpo anti-Ap), tal como se informa en los documentos n° WO 2003/070760 o n° US 2005/0169925.

Otra inmunoglobulina ejemplar es un anticuerpo anti-selectina P tal como se informa en el documento n° WO 2005/100402 o en n° US 2005/0226876.

Ejemplo 2

Preparacion de muestras

Se utilizo una solucion de la inmunoglobulina en tampon de histidina 20 mM a pH 5,5 y a una concentracion de 50 mg/ml para los experimentos de concentracion en tampon de histidina. Con el fin de obtener material que contuviese una molaridad mas alta de histidina, se anadio base histidina a la solucion de protema y se ajusto el pH a 5,5 mediante la adicion de acido clortudrico 0,1 M.

Con el fin de obtener soluciones que contienen tampon de acetato 20 mM y 45 mM, pH 5,0, respectivamente, el material de histidina 20 mM se diafiltro frente al volumen 10 veces mayor de tampon de acetato sodico, pH 5,0, mediante la utilizacion de FFT.

Se utilizo una solucion de la inmunoglobulina en tampon de histidina 20 mM a pH 5,0 y a una concentracion de 20 mg/ml para los experimentos en tampon de histidina.

Antes del procesamiento de ultrafiltracion (UF), las soluciones se diluyeron a una concentracion de protema de 10 mg/ml mediante la utilizacion del tampon correspondiente y se filtraron a traves de un cartucho de membrana de 0,22 pm (Sartorius, Gottingen, Alemania).

Ejemplo 3

Filtracion de flujo tangencial

Para la preparacion de soluciones concentradas de inmunoglobulina, se utilizo el sistema automatico de filtracion de flujo tangencial (FFT) AKTAcrossflow™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se utilizo el metodo tal como se informa en el documento n° WO 2009/010269 para todos los experimentos.

Brevemente, se selecciono un caudal de retenido de 240 l/m2/h y una PTM de 1,25 bar como las condiciones al inicio del procedimiento de UF para una concentracion de inmunoglobulina de entre 5 mg/ml y 25 mg/ml. De 25 mg/ml a 50 mg/ml, se redujo la PTM a 0,85 bar. Ademas, el caudal del retenido se incremento a 450 l/m2/h, llevando el flujo

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de filtrado de 30 hasta 45 l/m2/h. Para un intervalo de concentracion de entre 50 mg/ml y hasta la concentracion diana, de 140 mg/ml o superior, se fijo una PTM de 0,85 bar y un caudal de retenido incrementado de 390 l/m2/h.

Se utilizo un cartucho de lamina plana para Sartocon Slice con una membrana HydrosartTM de celulosa regenerada, con un corte nominal de peso molecular (CNPM) de 30 kDa y un area de membrana de 0,02 m2 (Sartorius, Gottingen, Alemania). La carga total de membrana era de aproximadamente 400 g/m2 para cada experimento. Tras la concentracion, se lavo el modulo de membrana con hidroxido sodico 1 M. Se determino la tasa de flujo normalizada para agua (FAN) tras cada ciclo de lavado y se comparo con el valor obtenido antes del uso inicial. El cartucho solo se aplico para los experimentos siguientes en el caso de que la cafda del FAN en (1/m2/h)/l bar a 20°C fuese inferior a 10% del valor inicial a fin de garantizar un lavado completo y propiedades de membrana comparables.

Ejemplo 4

Determinacion de la concentracion

Se determino la concentracion de inmunoglobulina mediante la utilizacion de la absorbancia fotometrica a 280 nm y 320 nm tras la resta del blanco de tampon (espectrofotometro de UV-Vis Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). Se resto la absorbancia a 320 nm de la absorbancia a 280 nm y este valor de absorbancia se utilizo para calcular el contenido de protema segun la ley de Lambert-Beer.

Ejemplo 5

Seguimiento de la conductividad y del pH

Durante el procedimiento de FFT cada vez que se duplicaba la concentracion se extrafa 1 ml del retenido Se determino el pH mediante la utilizacion del pH-metro del microprocesador pH 196 dotado de una celda medidora de un solo soporte del pH E50-1.5 de WTW (Weilheim, Alemania). Se determino la conductividad mediante la utilizacion del conducffmetro ProfiLine LF 197 dotado de una celda de conductividad estandar TetraCon 325 de WTW (Weilheim, Alemania). Todas las muestras se templaron en un bano de agua a 25°C antes de medir el pH y la conductividad.

Ejemplo 6

Cromatograffa ffquida de alto rendimiento de exclusion por tamano

Se llevaron a cabo experimentos de cromatograffa ffquida de alto rendimiento-exclusion por tamano (HPLC-ET) con una columna TSK 3000 SWXL (Tosoh Bioseparation GmbH, Stuttgart, Alemania) en un sistema de HPLC Summit (Dionex, Idstein, Alemania). Se realizo un seguimiento de los picos de elucion a 280 nm con el detector de matriz de diodos de UV UVD170U de Dionex (Idstein, Alemania). Se llevo a cabo una cromatograffa isocratica a temperatura ambiente utilizando un tampon acuoso compuesto de fosfato potasico 200 mM y cloruro potasico 250 mM a pH 7,0 y a un caudal de 0,5 ml/min. Cada muestra contema 100 mg de carga de inmunoglobulina en cada inyeccion. Los cromatogramas se integraron manualmente mediante la utilizacion del software Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania). El porcentaje de especies de peso molecular elevado (PME), incluyendo los dfmeros y oligomeros solubles de mayor tamano, se determino como area relativa (mUA*min.) referido al area total de los dos picos de PME, el pico de monomero y el pico de especies de peso molecular bajo (PMB).

Ejemplo 7

Ensayo de histidina

Por cada duplicacion de la concentracion de protema en el retenido se determino la concentracion de histidina. Las muestras se diluyeron a aproximadamente 100 pM de concentracion de histidina con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, EUA). A continuacion, se mezclaron 500 pl de muestra diluida con 500 pl de acido perclorico (al 5%) (Fluka, Steinheim, Alemania). Tras 10 min., la muestra se centrifugo a 25°C con 13.000 rpm durante 10 min. (minSpin, Eppendorf, Hamburg, Alemania). Se inyectaron 100 pl del sobrenadante en una columna MonoS 5/50 GL CEX (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Se llevaron a cabo cromatograffas en un sistema de HPLC Ultimate 3000 (Dionex, Idstein, Alemania) a temperatura ambiente utilizando una elucion en gradiente aplicando dos tampones acuosos compuestos de acetato 50 mM, pH 3,2 (tampon A) y acetato 50 mM, pH 3,2, cloruro sodico 1 M (tampon B). Se aplico un caudal de 1,0 ml/min. Se realizo un seguimiento de la elucion a 210 nm. Los cromatogramas se integraron manualmente mediante la utilizacion del software Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania). Para cuantificar la cantidad de histidina, se comparo el area (mUA*min.) del pico definido con una curva estandar (r2=0,9998).

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Ejemplo 8 Ensayo de acetato

Por cada duplicacion de la concentracion de protema en el retenido se determino la concentracion de acetato. Las muestras se diluyeron a aproximadamente 25 mM de concentracion de acetato con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, EUA). A continuacion, se mezclaron 500 pl de muestra diluida con 500 pl de acido perclorico (al 5%) (Fluka, Steinheim, Alemania). Tras 10 min., la muestra se centrifugo a 25°C con 13.000 rpm durante 10 min. (minSpin, Eppendorf, Hamburg, Alemania). Se inyectaron 100 pl del sobrenadante en una columna LiChrosorb RP C18 4/250 (Merck KG, Darmstadt, Alemania). Se llevaron a cabo tandas cromatograficas en un sistema de HPLC Ultimate 3000 (Dionex, Idstein, Alemania) a temperatura ambiente utilizando una elucion isocratica durante 15 min. aplicando un tampon acuoso compuesto de acido fosforico 6 mM (Fluka, Steinheim, Alemania), pH 2,6 (Kordis- Krapez M. et al., Food Technol. Biotechnol. 39:93-99, 2001). Tras cada tanda de muestra, la columna se lavo con 3 ml de acetonitrilo (Merck KG, Darmstadt, Alemania) para evitar la contaminacion cruzada entre muestras. Se aplico un caudal de 1,0 ml/min. Se realizo un seguimiento de la elucion a 210 nm. Los cromatogramas se integraron manualmente mediante la utilizacion del software Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania). Para cuantificar la cantidad de acetato, se comparo el area (mUA*min) del pico definido con una curva estandar (r2=0,9999).

Ejemplo 9

Ensayo de cloro

Por cada duplicacion de la concentracion de protema en el retenido se determino la concentracion de cloro. Las muestras se diluyeron 1:200 con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, EUA). Se inyectaron 10 pl de la muestra diluida en una columna lonPac AS11-HC 2/250 (Merck KG, Darmstadt, Alemania).

Se llevaron a cabo tandas cromatograficas en un sistema de cromatograffa ionica sin reactivos ICS 3000 (Dionex, Idstein, Alemania) a temperatura ambiente utilizando una elucion en gradiente durante 30 min., aplicando una solucion acuosa hasta 100 mM de hidroxido sodico. Se aplico un caudal de 0,38 ml/min. Se llevo a cabo la deteccion en un detector de conductividad ICS 3000 CD. Los cromatogramas se integraron manualmente mediante la utilizacion del software Chromeleon (Dionex, Idstein, Alemania). Para cuantificar la cantidad de cloro, se comparo el area (mUA*min.) del pico definido con una curva estandar (r2=0,9963).

Ejemplo 10

Ensayo de sodio

Para cuantificar la cantidad de iones sodio, se analizaron las muestras con el sistema multisensor BioProfile100plus (NOVA Biomedical, Waltham, USA). Se cuantificaron los iones sodio a 25°C tras una calibracion de dos puntos. Las muestras se diluyeron 1:1 con agua purificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, EUA) antes de la medicion.

Ejemplo 11

Medicion de la turbidez

Se determino la turbidez como absorbancia fotometrica de los concentrados no diluidos a 350 nm y a 550 nm tras la resta del blanco de tampon, en donde no absorbe ningun cromoforo intrmseco de la inmunoglobulina monoclonal (espectrofotometro de UV-Vis Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) (Capelle M.A.H. et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 65:131-148, 2007). Las muestras se mezclaron antes de la medicion. En presencia de partfculas suspendidas, se produce un incremento de la absorbancia de UV a todas las longitudes de onda debido a efectos de dispersion (Eberlein G.A. et al., PDA J. of Pharmac. Science and Technol. 48:224-230, 1994).

Ejemplo 12

Extincion de la luz

Se utilizo el oscurecimiento de la luz (OL) para monitorizar la formacion de partfculas en un intervalo de 1 a 200 mm de manera similar al metodo <788> Particulate Matter of Injection in the United States Pharmacopoeia and the European Pharmacopoeia method 2.9.1. (Direccion Europea para la Calidad de los Medicamentos (Ed.), Farmacopea Europea, Deutscher Apotheker Verlag/ Govi-Verlag, Stuttgart/Eschborn, 2001 a, 140-141; United States Pharmacopeia Convention (Ed.), Farmacopea estadounidense, United States Pharmacopeia Convention, Rockville, MD, 2002, 2046-2051. El contador de partmulas SVSSC (PAMAS Partikelmess-und Analysesysteme, Rutesheim, Alemania) estaba equipado con un diodo laser y un detector de fotodiodos con el fin de terminar la fotocorriente

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residual tras atravesar las partmulas el curso del haz. Como sensor de partmulas se utilizo el sensor HCB-LD-25/25. Se diluyeron con tampon los concentrados de contenido de partmulas superior a 120.000/ml para ajustarse a la capacidad especificada del sensor utilizado. Se analizaron tres mediciones de un volumen de 0,5 ml de cada muestra tras un lavado equilibrador de 0,3 ml. Se calcularon los resultados como valores medios de tres mediciones y se refirieron a un volumen de muestra de 1,0 ml. Antes de diluir los concentrados se filtro el tampon utilizando dispositivos de filtracion de 0,1 |jm Stericup Express plus (Millipore, Billerica, EUA) y se determino la carga de partmulas tal como se ha indicado anteriormente.

Ejemplo 13

Medicion del potencial zeta

Para determinar la carga de la protema a diferentes valores del pH, se determino la movilidad electroforetica de la protema mediante velocimetria por laser Doppler utilizando el aparato Malvern Zetasizer Nano S (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Se calculo el potencial zeta Z a partir de la ecuacion de Henry bajo la premisa de distribucion uniforme de cargas mediante la utilizacion del software Malvern DTS (version 5.0, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido):

imagen6

en la que me es la movilidad electroforetica, £ es la constante dielectrica de la solucion, ks es la constante basada en el modelo con un valor de 1,5 para concentraciones salinas superiores a 1 mM, n es la viscosidad de la solucion y Z es el potencial zeta. Para la preparacion de muestras, las soluciones de mAb 5 mg/ml se dializaron en un tampon acetato 50 mM, pH 5,0, y se titularon a un pH de 2,0 posteriormente mediante la utilizacion de acido clorhfdrico 0,2 M. Las muestras se titularon con una solucion de hidroxido sodico 0,2 M de pH 2 a pH 12 mediante la aplicacion del titulador MPT2 (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido). Se determino el potencial zeta en 15 etapas entre pH 2 y 12 en una celda capilar plegada de temperatura controlada (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) a 25°C. Se repitio cada medicion tres veces y se proporcionan los valores medios ± SD. Ver la figura 9 para una determinacion ejemplar del potencial zeta de un anticuerpo anti-IL-1R.

Ejemplo 14

Determinacion de la densidad de la solucion de protemas

Se determino la densidad p de las soluciones de proteinas en cada etapa de concentracion de protema. Un picnometro (Schott, Mainz, Alemania) con un volumen de 2,076 ml se relleno con una solucion para muestras templada previamente a 20°C. Se determino la masa del picnometro sin llenar y lleno mediante la utilizacion de una balanza analitica (MC 210 S, Sartorius, Gottingen, Alemania). Se calculo la densidad de acuerdo con la ecuacion comun CJ=mN.

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   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para concentrar una solucion de inmunoglobulinas que comprende las etapas siguientes:

   a) proporcionar una solucion de inmunoglobulinas con un valor de pH, con una primera concentration de protema inmunoglobulina, y una primera concentracion S+ o S- de una sustancia tampon,

   b) ajustar la primera concentracion de la sustancia tampon a una segunda concentracion S' y mantener el valor del pH, de manera que la segunda concentracion S' se calcula con la ecuacion 2 en el caso de que la sustancia tampon sea una pareja de cation/neutro o con la ecuacion 3 en el caso de que la sustancia tampon sea una pareja de neutro/anion,

   c) concentrar la solucion de b) con una filtration de flujo tangencial a una segunda concentracion de protema inmunoglobulina,

   en el que la ecuacion 2 es:

   imagen1

   y la ecuacion 3 es:

   imagen2

   la concentracion molar en el retenido de solutos cargados positivamente/negativamente (S+/S-), la carga de la protema (z), la concentracion molar (P) y el peso molecular (Pm) de la protema, la densidad de la solucion en el retenido (p) y el filtrado (p’), y la concentracion molar teorica del soluto difundible (S'), en donde la concentracion teorica de soluto difundible S' se corrige con un factor de correction en el que el incremento relativo de cada valor del pH se utilizo como el factor de correccion respectivo, en el que la proportion entre el anion del tampon/el cation del tampon y acido del tampon se calcula para cada valor de pH determinado en el retenido mediante la utilization de la ecuacion de Henderson-Hasselbach y se utiliza el incremento relativo a cada valor del pH como el factor de correccion respectivo.
2. 2.Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la sustancia tampon es histidina y por que la segunda concentracion se calcula con la ecuacion 2.
3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que la primera concentracion es 20 mM.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, caracterizado por que la segunda concentracion es de entre 24 mM y 37 mM.
5. 5. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que la primera concentracion es 46 mM.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, caracterizado por que la segunda concentracion es de entre 52 mM y 72 mM.
7. 7. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la sustancia tampon es acetato y por que la concentracion se calcula con la ecuacion 3.
8. 8. Metodo segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la primera concentracion es 20 mM.
9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, caracterizado por que la segunda concentracion es de entre 8 mM y 19 mM.
10. 10. Metodo segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la primera concentracion es 45 mM.
11. 11. Metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado por que la segunda concentracion es de entre 41 mM y 48 mM.
12. 12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la inmunoglobulina es un anticuerpo anti-selectina P o un anticuerpo anti-Ap.
13. 13.Metodo para producir una inmunoglobulina in vitro, que comprende:

    a) cultivar una celula que comprende un acido nucleico codificante de la inmunoglobulina,

    b) recuperar la inmunoglobulina a partir del medio de cultivo o la celula de la etapa a),

    5 c) purificar la inmunoglobulina,

    d) concentrar la inmunoglobulina con un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y de esta manera producir una inmunoglobulina.