ES2582465T3

ES2582465T3 - Inhibidor Quinasa Janus 2 (JAK2) para el tratamiento del lupus

Info

Publication number: ES2582465T3
Application number: ES11846725.7T
Authority: ES
Inventors: Pawel T. Dobrzanski; Matthew M. Seavey
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 2010-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2016-09-13
Anticipated expiration: 2031-12-06
Also published as: US20140024655A1; JP2013544292A; EP2648728A2; WO2012078574A2; WO2012078574A9; JP6033230B2; EP2648728B1; CA2818941A1; MX2013006066A; HK1189822A1; EP2648728A4; US9023853B2; MX338595B

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula**Fórmula** o una sal del mismo en el uso del tratamiento de lupus en un sujeto en necesidad del mismo.

Description

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Inhibidor Quinasa Janus 2 (JAK2) para el tratamiento del lupus

Descripcion

CAMPO TECNICO

La terapia del lupus.

ANTECEDENTES

El lupus (lupus eritematoso sistemico, LES) es una enfermedad cronica autoinmune que se caracteriza por la presencia de las celulas activadas T y B, autoanticuerpos y la inflamacion cronica que ataca a varias partes del cuerpo, incluyendo la articulaciones, piel, rinones, sistema nervioso central, el tejido cardlaco y los vasos sangulneos. En los casos graves, los anticuerpos se depositan en las celulas (glomerulos) de los rinones, lo que puede llevar a una inflamacion y un posible fallo del rinon, conocido como la nefritis lupica.

Aunque la causa de lupus sigue siendo desconocida, se han relacionado manifestaciones de la enfermedad con polimorfismos geneticos, toxinas y patogenos ambientales ( Morel Fairhurst, Wandstrat et al 2006.). Ademas, el genero, las influencias hormonales y disregulacion de citoquinas han sido estrechamente relacionado con el desarrollo de lupus (Aringer y Smolen 2004; Smith- Bouvier, Divekar et al 2008.). El lupus afecta nueve veces mas a las mujeres que a los hombres. Puede ocurrir a cualquier edad, pero aparece con mayor frecuencia en personas entre edades de 10 y 50 anos. Los afroamericanos y los asiaticos se ven afectados con mayor frecuencia que personas de otras razas.

No hay cura para el lupus. Los tratamientos actuales para el lupus estan dirigidos para controlar los slntomas y se limitan a agentes toxicos e inmunosupresores con graves efectos secundarios tales como glucocorticoides de dosis altas y / o hydroxchloro-quine. Una enfermedad grave (por ejemplo, los pacientes que tienen slntomas de afectacion renal) requiere medicamentos mas agresivos, incluyendo el micofenolato mofetil (MMF), azatioprina (AZA) y/o ciclofosfamida (CTX) (Bertsias y Boumpas 2008). El CTX, AZA y MMF son muy toxicos e inmunosupresores, y solo el 50 % de los pacientes tratados entran en remision completa, con unas tasas de recalda de hasta un 30 % en un perlodo de 2 anos.

Las celulas de memoria B, y mas importante, celulas plasmaticas de larga vida (LL-PCs) las cuales se diferencian de las celulas B, son tipos de celulas claves implicadas en el lupus (Neubert, Meister et al. 2008; Sanz y Lee 2010). Las celulas plasmaticas de larga vida sintetizan y ocultan grandes cantidades de isotipo de alta afinidad cambiando anticuerpos (Meister, Schubert et al. 2007; Muller, Dieker et al. 2008). Los anticuerpos antinucleares circulantes (ANAs) aumentan las posibilidades de que los anticuerpos se depositen sobre los propios tejidos, formando complejos inmunes y con el tiempo conduce a la destruccion del tejido, la difusion del epltopo y la participacion de otros sistemas de organos. Las LL-PCs comunmente basadas en ser quimio- y radio- resistentes , sobreexpresando diversas protelnas de choque termico y las bombas de infusion (Obeng, Carlson et al. 2006; Neubert, Meister et al. 2008). Ademas, las LL -PCs residen principalmente en la medula osea, donde estan protegidas de las terapias de lupus actuales, tales como ciclofosfamida y glucocorticoides.

Existe una necesidad de nuevos tratamientos para el lupus, incluyendo el lupus nefritis. En particular existe una necesidad para los tratamientos de lupus que puedan dirigirse y reducir las LL -PCs.

WO2009 / 155551 A1 describe compuestos de triazolopiridina como inhibidores de la quinasa JAK, utiles en metodos para tratar o disminuir la gravedad de una enfermedad o afeccion sensible a la inhibicion de la actividad de la quinasa JAK.

RESUMEN

El COMPUESTO A es proporcionado para usar en metodos en el tratamiento del lupus. En una realizacion, el sujeto es un humano. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra por via oral. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra una vez al dla. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra dos veces al dla. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra como un profarmaco.

En una realizacion, el COMPUESTO A se administra a una dosis en un intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg.

En una realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en suero de IL- 12 durante el tratamiento. En una

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realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en el rinon del pSTAT3 durante el tratamiento. En una realization, el sujeto experimenta una disminucion en el bazo de las celulas plasmaticas durante el tratamiento. En una realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de los anticuerpos antinucleares sericos durante el tratamiento. En una realizacion, el sujeto experimenta una disminucion del suero IFNa durante el tratamiento. En una realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de la proteinuria durante el tratamiento.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Fig. 1. La Fig. 1 muestra una vision general de como el COMPUESTO A se probo en el modelo murino MRL/lpr de lupus agudo.

Fig. 2. La Fig. 2 representa los niveles de COMPUESTO A en diversos tejidos 4 horas despues de la administration de diversas dosis en el raton MRL/lpr.

Fig. 3. La Fig. 3 muestra la reduction de la incidencia de lympomegaly en COMPUESTO A tratada en ratones MRL/lpr.

Fig. 4. La Fig. 4 representa la reduccion en el tamano del bazo y el numero total de celulas de leucocitos del bazo en los ratones MRL/lpr tratados con varias dosis de COMPUESTO A.

Fig. 5. La Fig. 5 representa el cambio en la masa corporal de ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 6. La Fig. 6 representa los niveles circulantes de IL-12 de citoquinas con y sin tratamiento con el COMPUESTO A a diversas dosis en ratones MRL/lpr.

Fig. 7. La Fig. 7 representa niveles de complemento C3 en ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A.

Fig8. La Fig. 8 representa secciones renales manchadas por la infiltration de leucocitos en el glomerulo en ratones MRL/lpr. Se observa mas numero de glomerulonephritis en los animales tratados con vehlculo que en los animales tratados con tres COMPUESTOS A a EOS. Las flechas negras muestran un aumento de glomerulos e infiltraciones leucocitarias, en los animales tratados con dex y vehlculo, pero ausente en los animales tratados con COMPUESTO A.

Fig. 9. La Fig. 9 representa los niveles reducidos de JAK2, pSTAT3 en los rinones enfermos de los ratones MRL/lpr.

Fig. 10. La Fig. 10 representa la reduccion en el porcentaje de celulas plasmaticas despues del tratamiento con 100 mg/kg del COMPUESTO A en los ratones MRL/lpr.

Fig. 11. La Fig. 11 representa niveles reducidos de ASC en el bazo en ratones tratados por COMPUESTO A. La reduccion en ASC que secretan anticuerpos anti-cromatina en una dosis de 100 mg/kg se correlaciona bien con la reduccion de las proporciones de PC en el bazo como en la medicion por citometrla de flujo en la misma dosis. (Fig 10)

Fig. 12. La Fig. 12 representa una vision general de como el COMPUESTO A se probo en el modelo espontaneo lento de raton NZM para el lupus humano.

Fig. 13. La Fig. 13 representa el aumento de la supervivencia de los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A sobre el de vehlculo o Dex.

Fig. 14. La Fig. 14 representa en el tiempo los niveles de suero anti-dsDNA ANA a lo largo del tiempo con el COMPUESTO A en el tratamiento en ratones NZM.

Fig. 15. La Fig. 15 representa los niveles de suero anti-smith ANA a lo largo del tiempo con el COMPUESTO A en el tratamiento en ratones NZM.

Fig. 16. La Fig. 16 representa los niveles de IFNalpha de citoquinas en el suero en EOS para los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 17. La Fig. 17 representa las protelnas totales en la orina medidas a lo largo del tiempo con el tratamiento con el COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 18. Las Fig.s 18A a E representan los niveles de protelnas totales de la orina medidos a lo largo del tiempo por los ratones individuales NZM con el tratamiento con el COMPUESTO A.

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Fig. 19. La Fig. 19 representa la histopatologla renal de secciones manchadas de los ratones NZM tratados con diversos controles y el COMPUESTO A. Las flechas negras senalan los glomerulos agrandados e leucocitarios infiltrados, que estan ausentes en los ratones tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 20. La Fig. 20 representa la histopatologla pulmonar de las secciones manchadas de los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 21. La Fig. 21 representa los niveles reducidos del JAK2 enfocado en el pSTAT3 en el tejido de la enfermedad del lupus, el rinon, la dosificacion posterior oral del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 22. La Fig. 22 representa los niveles de IL-12 de citoquinas medidos a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 23. La Fig. 23 representa los niveles de IL-17A de citoquinas medidos a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig.24. La Fig. 24 representa los niveles de IL-6 de citoquinas medidos a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 25. La Fig. 25 representa los niveles de MIP-1 alfa quimiocinas medidos a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 26. La Fig. 26 representa los niveles de quimiocina CXCL10/IP-10 medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 27. La Fig. 27 representa los niveles de quimiocina CXCL9/MIG medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 28. Fig. 28 representa los niveles de citocina IL-4 medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 29. La Fig. 29 representa los niveles de citocina IL-13 medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig. 30. La Fig. 30 representa los niveles de TNFalfa medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig.31. La Fig.31 representa los niveles de quimiocina KC/IL-8 medidos en el suero a lo largo del tiempo con el tratamiento del COMPUESTO A en ratones NZM.

Fig.32. La Fig. 32 representa la masa del bazo de los ratones NZM tratados con el COMPUESTOA en EOS.

Fig. 33. La Fig. 33 representa el promedio de la masa corporal medido a traves del tiempo en los ratones NZM tratados con el COMpUeSTO A.

Fig. 34. La Fig. 34 representa los niveles medios de la resorcion osea biomarcador CTx medidos a lo largo del tiempo en el suero de los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 35. La Fig. 35 representa la proporcion de celulas plasmaticas del bazo CD19/B220- CD38+ CD138+ en los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A, la parte superior muestra el porcentaje de los datos representados graficamente, la parte de abajo proporciona una imagen de grafico de puntos prima representante de la citometrla de flujo.

Fig. 36. La Fig. 36 representa la frecuencia de celulas secretoras de anticuerpo anti- cromatina ASC ANA de bazos de ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 37. La Fig. 37 representa la expresion media del marcador CD38 en los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 38. La Fig. 38 representa el porcentaje de celulas plasmaticas de vida corta en el bazo en los ratones NZM tratados con el COMpUeSTO A.

Fig. 39. La Fig. 39 representa el porcentaje de celulas plasmaticas de vida corta en la medula osea en ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

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Fig. 40. La Fig. 40 representa el porcentaje de celulas plasmaticas de larga vida en el bazo en los ratones NZM tratados con el COMpUeSTO A.

Fig. 41. Fig. 41 representa el porcentaje de celulas plasmaticas de larga vida en la medula osea en ratones NZM tratados con el COMPUESTO A.

Fig. 42. La Fig. 42 representa un resultado representativo de citometrla de graficos de puntos de puerta en vivo, CD19-negativas, CD38-positivo, el bazo y las celulas plasmaticas de la medula osea de ratones NZM tratados con el COMPUESTO A y cerradas de acuerdo con los marcadores en los ejes X e Y.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Tal como se utiliza en el presente documento el termino "aproximadamente" cuando se hace referencia a un valor medible tal como una cantidad, una duracion temporal, y similares, pretende abarcar variaciones razonables del valor, tales como, por ejemplo, 610 % del valor especificado. Por ejemplo, la frase "aproximadamente 50%" puede incluir el 610% de 50, o de 45% a 55%.

Tal como se utiliza aqul, el termino "sujeto" incluye animales de sangre caliente, preferiblemente mamlferos, incluidos los humanos. En una realizacion preferida, el sujeto es un primate. En una realizacion aun mas preferida, el sujeto es un humano.

Proporcionado es el COMPUESTO A para uso en metodos para el tratamiento del lupus en un sujeto. El COMPUESTO A es un inhibidor de JAK2 con el nombre qulmico [8-(4 - metanosulfonilfenil)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]piridin-2-il]-[3-(4-metil- piperazin-1-10il)-fenil]-amina. El COMPUESTO A tiene la siguiente estructura:

imagen1

El COMPUESTO A utilizado en la presente invencion se puede administrar en cualquier forma qulmica adecuada, incluyendo formas de sal farmaceuticamente aceptables del compuesto original que preferiblemente se convierten en el compuesto original (es decir, COMPUESTO A) despues de la administracion. En la presente memoria, "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a un derivado del compuesto original en el que el compuesto se modifica preparando un acido o base se sal de los mismos. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales de acidos minerales o organicos de residuos basicos de amina.

Por lo tanto, en una realizacion, el COMPUESTO A se administra como un derivado de sal del compuesto original. En una realizacion, el compuesto A se administra como una sal de acido del compuesto A.

Cualquier metodo apropiado de administracion puede ser utilizado. Los ejemplos incluyen la inyeccion (subcutanea, intravenosa, parenteral, intraperitoneal, intratecal, etc.), oral, rectal, transmucoso, inhalacion, y transdermico. Cuando se administra por inyeccion, la inyeccion puede ser embolada o infusion continua.

El COMPUESTO A se administra preferiblemente por inyeccion IV o por una forma de dosificacion oral, tal como en un comprimido o capsula. Por ejemplo, el COMPUESTO A se puede proporcionar como un polvo esteril liofilizado, que puede reconstituirse con, por ejemplo, agua esteril para la inyeccion, solucion salina acuosa (NaCl), o manitol acuoso antes de la inyeccion. Por lo tanto, en una realizacion, el COMPUESTO A se administra por inyeccion intravenosa (IV). En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra por via oral. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra por via oral en un comprimido. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro por via oral en una capsula.

Para la administracion oral, el COMPUESTO A se puede formular facilmente combinando COMPUESTO A con vehlculos farmaceuticamente aceptables bien conocidos por aquellos en la tecnica. Tales vehlculos permiten que el COMPUESTO A sea formulado en comprimidos, plldoras, grageas, capsulas, llquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, emulsiones, y similares, para la ingestion oral en un sujeto a tratar. Las preparaciones farmaceuticas para su uso oral pueden obtenerse combinando el COMPUESTO A con un excipiente solido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, despues de anadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o nucleos de grageas. Los excipientes adecuados incluyen cargas o diluyentes, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, antiadherentes, deslizantes, humectantes y agentes activos de superficie,

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colores y pigmentos, agentes aromatizantes, edulcorantes, adsorbentes, y enmascadores de sabor.

Los diluyentes se anaden tlpicamente en una pequena cantidad del farmaco activo para incrementar el tamano del comprimido. El diluyente mas comun es la lactosa, que existe en dos formas isomericas, alfa-lactosa o beta-lactosa, y puede ser cristalino o amorfo. Varios tipos de lactosa incluyen secado por pulverizacion de monohidrato de lactosa (tal como Super-Tab™), monohidrato de alfa- lactosa (tal como Fast Flo®), anhidro alfa- lactosa, anhidro beta-lactosa, y la lactosa aglomerada. Otros diluyentes incluyen azucares, tales como azucar NF compresible, excipiente de dextrosa NF, y dextratos NF. Un diluyente preferido es el monohidrato de lactosa (tal como Fast Flo®). Otros diluyentes preferentes incluyen la celulosa microcristalina (tal como Avicel® PH, y CEOLUS™) y la celulosa microfina (tal como Elcema®).

Los diluyentes pueden incluir almidon y derivados de almidon. Los almidones incluyen almidones naturales obtenidos a partir de trigo, malz, arroz y patatas. Otros almidones incluyen almidon pregelatinizado NF y glicolato de almidon de sodio NF. Los almidones y derivados de almidon funcionan tambien como desintegrantes. Otros diluyentes incluyen sales inorganicas, tales como fosfato de calcio dibasico USP (tal como Di-Tab® y Emcompress®), fosfato de calcio tribasico NF (tal como Tri-Tab® y Tri-Cafos®) y sulfato de calcio NF (tal como Compactrol ®). Tales polioles como manitol USP, sorbitol NF y xilitol NF tambien pueden servir como diluyentes. Muchos diluyentes funcionan tambien como desintegrantes y aglutinantes, y estas propiedades adicionales deben ser tenidas en cuenta al desarrollar una formulacion.

Los desintegrantes se incluyen en formulaciones de comprimidos para romper los comprimidos en partlculas del ingrediente farmaceutico activo y excipientes que facilitaran la disolucion del ingrediente activo y mejorar la biodisponibilidad del ingrediente activo. El almidon y derivados del almidon, incluyendo sal sodica de enlace cruzado de un carboximetil eter de almidon (tal como almidon glicolato de sodio NF, Explotab® y Primogel®) son desintegrantes utiles. Un desintegrante preferente es el almidon pregelatinizado tal como almidon 1500®. Otro desintegrante preferente es carboximetilcelulosa sodica de enlace cruzado (tal como croscarmelosa de sodio NF , Ac -Di - Sol®). Otros desintegrantes incluyen polivinilpirrolidona de enlace cruzado (tal como Crospovidona NF), celulosa microcristalina (tal como Avicel® PH).

Los aglutinantes son usados como un excipiente de granulacion humeda para aglomerar el ingrediente farmaceutico activo y los otros excipientes. Un aglutinante es seleccionado para mejorar el flujo de polvo y para mejorar la compactabilidad. Los aglutinantes incluyen derivados de celulosa tales como celulosa microcristalina NF, metilcelulosa USP, carboximetilcelulosa sodica uSp, hidroxi-propil-metilcelulosa USP, NF hidroxietil celulosa, y NF hidroxipropil celulosa. Otros aglutinantes incluyen polividona, polivinilpirrolidona, gelatina NF , gomas naturales (tales como acacia , tragacanto, guar y pectina), pasta de almidon, pregelatinizado almidon NF, sacarosa NF, jarabe de malz , polietilenglicoles y alginato de sodio , alginato de calcio y amonio, silicato de magnesio y aluminio, polietilenglicoles. Un aglutinante preferido es polivinilpirrolidona, en particular, Povidona USP y preferentemente, povidona K-29/32.

Los lubricantes se utilizan en formulacion de comprimido para evitar que el comprimido se pegue a las caras de los troqueles y para reducir la friccion durante las etapas de compresion. Los lubricantes incluyen tlpicamente aceites vegetales (tales como aceite de malz), aceites minerales, polietilenglicoles (tales como pEG- 4000 y PEG- 6000), sales de acido estearico (tal como estearato de calcio y estearil fumarato de sodio), sales minerales (tales como talco), sales inorganicas (tales como cloruro de sodio), sales organicas (tales como benzoato de sodio, acetato de sodio y oleato de sodio) y alcoholes de polivinilo. Un lubricante preferido es estearato de magnesio.

Los nucleos de grageas pueden proporcionarse con recubrimientos adecuados. Para este proposito, se pueden usar soluciones de azucar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arabe, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dioxido de titanio, soluciones de laca y disolventes organicos adecuados o mezcla de disolventes. Se pueden anadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificar o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de los compuestos activos.

Las preparaciones farmaceuticas que pueden usarse por via oral incluyen capsulas de ajuste suave hechas de gelatina, as! como capsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas duras pueden contener el COMPUESTO A en mezcla con relleno tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las capsulas blandas, el COMPUESTO A puede disolverse o suspenderse en llquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina llquida, o polietilenglicoles llquidos. Ademas, se pueden anadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administracion oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administracion.

Para la administracion bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administracion por inhalacion, el COMPUESTO A se entrega convenientemente en la forma de una presentacion de pulverizacion de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor

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adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Las capsulas y cartuchos de, por ejemplo , gelatina para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base adecuada de polvo tal como lactosa o almidon.

El COMPUESTO A se puede formular para administracion parenteral por inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion de bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis multiples, con un conservante anadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehlculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacion tales como de suspension, estabilizantes y/o dispersantes.

Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas del COMPUESTO A en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones del COMPUESTO A se pueden preparar como suspensiones apropiadas de inyeccion oleosas. Adecuados disolventes lipofilos o vehlculos incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones de inyeccion acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad del COMPUESTO A para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas.

El COMPUESTO A puede ser de una forma de polvo para su constitucion con un vehlculo adecuado, por ejemplo, agua esteril libre de pirogenos, antes de su uso.

El COMPUESTO A tambien se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retencion, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros gliceridos.

Ademas de las formulaciones descritas previamente, el COMPUESTO A tambien se puede formular como una preparacion de deposito. Tales formulaciones de accion prolongada pueden administrarse por implantacion (por ejemplo subcutanea o intramuscular) o por inyeccion intramuscular. Asl, por ejemplo, el COMPUESTO A se puede formular con adecuados materiales polimericos o hidrofobos (por ejemplo como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehlculos de suministro o portadores para farmacos hidrofobos. Tambien pueden emplearse ciertos disolventes organicos tales como dimetilsulfoxido, aunque normalmente a coste de una mayor toxicidad. Ademas, el COMPUESTO A se puede administrar utilizando un sistema de liberacion sostenida, tal como matrices semipermeables de pollmeros hidrofobos solidos que contienen el agente terapeutico. Varias formas de materiales de liberacion sostenida se han establecido y son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Las capsulas de liberacion sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza qulmica, liberar el COMPUESTO A durante unas pocas horas hasta mas de 100 dlas.

Las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender adecuados vehlculos o excipientes en fase solida o gel. Ejemplos de tales vehlculos o excipientes incluyen pero no se limitan a carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y pollmeros tales como polietilenglicoles.

El COMPUESTO A se administra en una cantidad eficaz para tratar el lupus, es decir, una cantidad eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los slntomas de la enfermedad, prolongar la supervivencia del sujeto a tratar, y/o un impacto favorable en los biomarcadores relacionados con el lupus en el sujeto. La determinacion de la cantidad efictiva del COMPUESTO A esta bien dentro de la capacidad de los expertos en la tecnica a la luz de la descripcion detallada y los ejemplos proporcionados en el presente documento. La cantidad efectiva puede variar dependiendo de factores tales como el tamano del sujeto, la gravedad de la enfermedad lupus, la frecuencia de administracion (por ejemplo, una vez al dla vs. varias veces al dla), la manera de administracion del compuesto, de la salud y condiciones co-morbidos del sujeto, el juicio y experiencia del medico que prescribe (por ejemplo, con los mismos o similares drogas), el modo de administracion, las caracterlsticas de biodisponibilidad de la forma de dosificacion administrada, el regimen de dosis seleccionado, y el tipo de tratamiento concurrente (por ejemplo, glucocorticoides). Por ejemplo , la cantidad efectiva del COMPUESTO A para la monoterapia puede ser una dosis superior a la cantidad del COMPUESTO A que es efectiva cuando se utiliza junto al COMPUESTO A en combinacion con otras terapias con lupus. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba modelo in vitro o animal, y se pueden basar en el area de superficie o el peso del sujeto.

El tratamiento puede iniciarse con dosificaciones mas pequenas que son menores que la dosis optima del compuesto. Posteriormente, la dosis se puede aumentar mediante pequenos incrementos hasta que se alcanza un efecto optimo bajo las circunstancias. La dosis diaria total puede dividirse y administrarse en porciones durante el dla si se desea. Para optimizar el regimen de la dosificacion, la eficacia del COMPUESTO A se puede supervisar

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mediante la supervision del efecto del tratamiento en varios biomarcadores en un tratamiento de un sujeto sometido a estudio. Se incluyen biomarcadores utiles enumerados en la seccion de Ejemplos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos antinucleares, citoquinas tales como IFN e IL- 12, proteinuria, la inhibicion JAK2, etc.). Dos biomarcadores especialmente convenientes para supervisar la eficacia del tratamiento del lupus son la proteinuria y los anticuerpos antinucleares. Una dosis efectiva del COMPUESTO A alterara el biomarcador(s) en la forma deseada, en comparacion con el nivel de biomarcadores antes del tratamiento (por ejemplo, disminuir la proteinuria, disminuir los anticuerpos antinucleares, disminuir pSTAT3, etc.) Por lo tanto, una dosis efectiva del COMpUESTO A puede optimizarse a partir de una dosis baja y, a continuacion aumentarla gradualmente durante el seguimiento de uno o mas de estos biomarcadores. En general, es preferible obtener la evaluation inicial del biomarcador(s) (por ejemplo, proteinuria o anticuerpos antinucleares) del paciente antes de comenzar la terapia y una o mas evaluaciones adicionales en diferentes puntos de tiempo durante el tratamiento. En este uso, se determina una determination de la llnea de base antes de la terapia y entonces los cambios en biomarcador(s) (por ejemplo, proteinuria o anticuerpos antinucleares) se determinan durante el curso de la terapia. Alternativamente, se pueden realizar dos o mas determinaciones sucesivas durante el tratamiento sin la necesidad de una medicion de llnea de base pre- tratamiento. En este uso, la primera evaluacion de biomarcadores(s) (por ejemplo, la proteinuria o anticuerpos antinucleares) debe hacerse a partir del sujeto como un nivel de llnea de base para determinar si el nivel esta aumentando o disminuyendo.

En realizaciones preferidas, el sujeto sometido a tratamiento con el COMPUESTO A experimenta un cambio deseable en uno o mas biomarcadores asociados con la enfermedad lupus. Adecuados biomarcadores asociados a lupus incluyen lymphomegaly, esplenomegalia, bazo recuentos de leucocitos, IL-12 en suero,C3 en suero, celularidad glomerular del rinon, la infiltration intersticial renal, pSTAT3 del rinon, celulas plasmaticas del bazo, los anticuerpos antinucleares sericos, los anticuerpos antinucleares anti-dsDNA en suero, IFNa en suero, proteinuria, infiltrados pulmonares, IL-17A en suero, IL-6 en suero, CCL3/MIP-1a en suero, CXCL10/IP-10 en suero, CXCL9/MIG en suero, IL-4 en suero, IL-13 en suero, TNFa en suero, KC/IL-8 en suero, y CTx en suero. Por lo tanto, en una realization, el sujeto experimenta una disminucion de lymphomegaly durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de la esplenomegalia durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en los recuentos de leucocitos del bazo durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IL-12 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta un aumento del C3 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en la celularidad glomerular del rinon durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de la infiltracion intersticial renal durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de pSTAT3 en el rinon durante el tratamiento con COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en las celulas plasmaticas del bazo durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de anticuerpos antinucleares en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion en los anticuerpos antinucleares anti-dsDNA del suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IFNa en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de la proteinuria durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de infiltrados pulmonares durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IL-17A en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IL-6 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de CCL3/MIP-1a en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de CXCL 10/IP-10 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de CXCL9/MIG en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IL-4 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de IL-13 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de TNFa en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de KC/IL-8 en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A. En otra realizacion, el sujeto experimenta una disminucion de CTx en suero durante el tratamiento con el COMPUESTO A.

El regimen de administracion del COMPUESTO A puede variar dependiendo de factores tales como los pharmacoki-netics de la forma de dosificacion, el tipo de slntomas del lupus siendo tratado o inhibido, el tamano del sujeto, la gravedad de la enfermedad del lupus y el eficaz dosificacion. El momento de la administration del COMPUESTO A se puede variar facilmente por el medico que lo trata para optimizar la eficacia y minimizar los efectos secundarios teniendo en cuenta las consideraciones anteriores y la presente description detallada.

Existe una amplia flexibilidad en los programas de dosificacion para el COMPUESTO A de acuerdo con la presente invention. En ciertas realizaciones, los programas de dosificacion pueden ser adaptados a partir de esquemas de dosificacion conocidos por ser adecuados para otros inhibidores JAK. Por ejemplo, los inhibidores tasocitinib JAK (CP- 690550) y INCB028050 mostraron ser efectivos en la artritis reumatoide en dosis de 5-30 mg dos veces al dla, o 4-10 mg una vez al dla, respectivamente (Coombs, JH et al. 2010;
www.medpagetoday.com/MeetingCoverage/ACR/23308). A pesar de que la tecnica anterior de inhibidores JAK se

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utilizo para tratar la artritis reumatoide y no el lupus, la comparacion es posible debido a una efectiva inhibicion JAK es responsable en el tratamiento de ambas enfermedades.

El COMPUESTO A se puede administrar en cualquier dosis adecuada. En una realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion , el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 55 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis

de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis

de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis

de aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra en una dosis

de aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 g. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg.

En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 30 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 1 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 5 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 10 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 20 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 30 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 40 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 50 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 100 mg. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administro a una dosis de aproximadamente 200 mg. Las dosis anteriores son adecuados para cualquier metodo de administration del COMPUESTO A, y son especialmente adecuadas para la dosificacion oral.

El COMPUESTO A se puede administrar a las dosis descritas anteriormente de acuerdo con cualquier programa adecuado. Las cantidades de dosis del COMPUESTO A puede ser constantes o variar dentro del programa de dosis. Las dosis del COMPUESTO A pueden mantenerse a un nivel constante durante el programa a menos que (a) los cambios de un biomarcador(s) no son observados, en cuyo caso las dosis posteriores pueden aumentar, o (b) se observa significativa toxicidad relacionada con la droga, en cuyo caso las dosis posteriores se pueden reducir, por ejemplo en aproximadamente del 20-30% en cada caso. Un programa adecuado del COMPUESTO A tlpicamente estara en el intervalo de dosificacion de una vez al mes para administracion de dosis multiples al dla. En una realizacion preferida, se administra el COMPUESTO A una vez al dla. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra una vez por semana. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra dos veces al dla. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra tres veces por dla. En otra realizacion, el COMPUESTO A se administra cuatro veces por dla.

Uno o mas tratamientos de lupus se pueden utilizar en combination con la administracion del COMPUESTO A. Tales tratamientos incluyen agentes lupus, incluyendo, pero no limitado a los glucocorticoides, hydroxchloroquine, micofenolato mofetil (MMF), azatioprina (AZA) y ciclofosfamida (CTX). Las dosis apropiadas de estos agentes son bien conocidos en la tecnica.

MATERIALES Y METODOS

Animates

Se obtuvieron ratones femeninos MRL/lpr de seis semanas de edad propensos al lupus (Jackson Labs, #000485) y no propensos al lupus Jackson Labs, #000486) de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME). Se obtuvieron espontaneos ratones hembra SLE-propensos NZBWF1/J(NZM) (catalogo n°. 100008) y ratones no propensos al lupus (con tiempo antes del experimento) NZW/LacJ (n° de catalogo. 001058) de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME) de 15-semanas de edad. Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de 24 horas luz/oscuridad, con comida y agua disponible ad libitum. Todos los procedimientos experimentales de animales

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fueron aprobados por y de acuerdo a las regulaciones del Comite de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Cephalon, Inc; aprobado IACUC protocolo #03-040 y #03-03-041.

Los ratones MRL/lpr desarrollan una rapida enfermedad linfoproliferativa debido una molecula inactiva Fas previniendo las adecuadas apoptosis de las celulas autorreactivas T y B en los tejidos linfoides primarios y secundarios (deficiencia en tanto mecanismo central y periferico tolerancia). Debido a esta alteracion del mecanismo de tolerancia, un porcentaje de todas las celulas T y B que entran en la periferia tienen una alta probabilidad de responder al auto protelna/tejidos y as! iniciar la autoinmunidad temprana en la vida. Los ratones modelo MRL/lpr desarrollan varios slntomas similares a la enfermedad inflamatoria cronica que son caracterlsticas del temprano y tardlo lupus incluyendo la generacion de anticuerpos anti-nucleares, artritis, manifestaciones dermatologicas, glomerulonefritis mediada por inmunocomplejos, que conduce a la proteinuria y finalmente la muerte. Menores fenomenos caracterizados son el CNS y manifestaciones cardlacas, ambas de los cuales son mas comunes en los seres humanos. Previos estudios de optimizacion y validacion mostraron claramente que la enfermedad se manifiesta solamente en animales MRL/lpr enfermos y no en los ratones de control MRL/Mp, y que los anticuerpos antinucleares (ANAs) conducen una forman rapida de entre 4-12 semanas a la aparicion de la nefritis lupica alrededor de las semanas 18-25 con la presencia de proteinuria. La mortalidad es mayor en las hembras y se produce alrededor de las 25 semanas de edad, la enfermedad renal incluye glomerulonefritis, infiltrados glomerulares, esclerosis y vasculitis. Se puede observar que tanto la esplenomegalia y lymphomegalia se asocia con la dermatitis.

La cepa NZM actua como un modelo de raton de impulsado geneticamente, progresivo, lupus eritematoso sistemico (SLE). La evolucion de la enfermedad en ratones NZM se caracteriza por una activacion anormal de celulas policlonales B con una alta production de diversos autoanticuerpos, incluyendo los dirigidos contra el ADN y otros antlgenos nucleares, y en contra de las protelnas del citoesqueleto. Elevados complejos inmunes circulantes pueden conducir a una glomerulonefritis fatal en ratones mas viejos.

COMPUESTO A

El COMPUESTO A se preparo de una manera analoga al procedimiento de cinco pasos que se describe a continuation (vease el Ejemplo 35 de la Solicitud Internacional No. PCT/US10 /37363):

Paso 1: A una solution de una piperazina 1-(3-bromo-fenil) (aproximadamente 1 g) y acido acetico (aproximadamente 0,4 ml) en metanol (aproximadamente 25 ml) se anade 37 % de formaldehldo en agua/metanol (alrededor de 56,7:37:6,3, agua:formaldehldo:metanol; aproximadamente 5 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La suspension se enfria a aproximadamente 5°C en un bano de hielo/agua y cianoborohidruro de sodio (aproximadamente 5 g) que se anade en pequenas porciones. La mezcla se agita y se calienta a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. Se vierte en la mezcla lentamente cloruro de amonio acuoso saturado (aproximadamente 200 ml) y se agita durante aproximadamente 1 hora. La mezcla se extrae con diclorometano (3 x 75 sobre 50 ml). Las capas organicas combinadas se secan sobre sulfato de magnesio, se filtran y se evaporan. El material se coloca bajo un vaclo alto durante aproximadamente 18 horas para proporcionar 1-(3- bromo-fenil)-4-metil-piperazina como un aceite amarillo palido (aproximadamente 1 g). 1H NMR (400 MHz, CDCla, 5, ppm): 7.10 (dd, J=8.2, 8.2 Hz, 1H), 7.04 (dd, J=2.1, 2.1 Hz, 1H), 6.95 (ddd, J=7.8, 1.7, 0.7 Hz, 1H), 6.83 (ddd, J=8.3, 2.4, 0.6 Hz, 1H), 3.23-3.18 (m, 4H), 2.58-2.54 (m, 4H), 2.35 (s, 3H). MS = 255, 257 (MH)+.

Paso 2: A una solucion de 3-bromo-piridin-2-ilamina (aproximadamente 10 g) en 1,4-dioxano (aproximadamente 100 ml) se anade gota a gota isotiocianato de etoxicarbonilo (aproximadamente 7 ml). La mezcla se agita bajo una atmosfera de nitrogeno durante aproximadamente 18 horas. Los componentes volatiles se evaporan para dar un solido ceroso. El material recuperado se tritura con hexano (aproximadamente 250 ml). N-(3-bromo-2-piridinil)-N'- carboetoxi-tiourea se aisla y se usa sin purification 1

adicional. H NMR400 MHz, (D3C)2SO, 5, ppm): 11.46 (s, 1H), 11.43 (s, 1H), 8.49 (dd, J=4.6, 1.5 Hz, 1H), 8.18 (dd, J=8.0, 1.5 Hz, 1H), 7.33 (dd, J=8.0, 4.7 Hz, 1H), 4.23 (q, J=7.1 Hz, 2H), 1.27 (t,J=7.2 Hz, 3H). MS = 215 (MH)+.

Paso 3: A una suspension agitada de hidrocloruro de hidroxilamina (aproximadamente 17 g) y N, N- diisopropiletilamina (aproximadamente 26 ml) en una mezcla de metanol (aproximadamente 70 ml) se anade N- etanol (aproximadamente 70 ml) (3-bromo-2-piridinil) -N'-carboetoxi-tiourea. La mezcla se agita durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente y despues se calienta a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 18 horas. La suspension se enfria a temperatura ambiente, se filtra y se aclara con metanol, agua y luego metanol. 8-bromo[1,2,4]triazolo[1,5 - a]piridin-2-ilamina se aisla como un solido (alrededor de 8 g) de color blanquecino. 1H NMR (400 MHz, (D3C)2SO, 5, ppm): 8.58 (d, J=6.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J=7.6 Hz, 1H), 6.80 (t, J=7.0 Hz, 1H), 6.25 (s, 2H). MS = 213, 215 (MH)+.

Paso 4: Se carga con acetato de paladio (aproximadamente 0,2 g) y trifenilfosfina (aproximadamente 0,6 g) un tubo de horno secado. El tubo se evacua a alto vaclo y toma una retroactiva bajo una corriente de nitrogeno durante aproximadamente 5 minutos. Se anade un disolvente adecuado tal como 1,4-dioxano (alrededor de 10 ml) y la

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mezcla se agita en atmosfera de nitrogeno durante un tiempo adecuado (por ejemplo, durante unos 10 minutos). Se anaden 8-bromo [1,2,4]triazolo[1,5-a] piridin-2-ilamina (0,75 g), (4-methylsulfonylphe-nyl) boronico

(aproximadamente 1 g), un disolvente adecuado, tal como N, N- dimetilformamida (aproximadamente 10 ml) y una base adecuada, tal como aproximadamente 1,5 M de carbonato sodico en agua (aproximadamente 10 ml). La mezcla se agita durante aproximadamente 2 minutos a temperatura ambiente en atmosfera de nitrogeno a continuacion, el tubo se sella y se calienta a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 18 horas. La mezcla se transfiere a una matraz de fondo redondo, y los volatiles se evaporan a presion reducida. El producto se alsla de una manera adecuada. Por ejemplo, puede ser anadida agua (aproximadamente 100 ml) y se agita la mezcla. El solido puede entonces recogerse por filtracion, y opcionalmente se enjuaga con agua, se seca al aire, se tritura con eter/diclorometano (alrededor de 4:1; aproximadamente 10 ml), se filtra y se aclara con eter. Se aisla como un solido de color canela (aproximadamente 0,6g), 8-(4-metanosulfonil-fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a] piridin-2-ilamina. MP = 236239 °C. 1H NMR (400 MHz, (D3C)2SO, 5, ppm): 8.63 (d, J=6.3 Hz, 1H), 8.38 (d, J=7.9 Hz, 2H), 8.03 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.84 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.03 (t, J=7.0 Hz, 1H), 6.21 (br s, 2H), 3.28 (s, 3H). MS = 289 (MH)+.

Paso 5: a un tubo de horno secado se anade acetato de paladio (aproximadamente 10 mg) y 2,2'-bis- diciclohexilfosfanil-bifenil (aproximadamente 30 mg) , 8-(4-metanosulfonil-fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]piridin-2-ilamina (aproximadamente 75 mg), 1-(3-bromo-fenil)-4-metilpiperazina (aproximadamente 80 mg), una base adecuada, tal como carbonato de cesio (aproximadamente 270 mg) y un disolvente adecuado, tal como 1,4-dioxano (aproximadamente 5 ml). El tubo se evacua y se toma tres veces una retroactiva con nitrogeno. El tubo se sello y se calienta a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 72 horas. La mezcla se enfrla a temperatura ambiente y el producto se alsla de una manera adecuada. Por ejemplo, la mezcla enfriada se puede diluir con diclorometano (aproximadamente 10 ml), se filtra a traves de un tapon de tierra de diatomeas, se enjuaga con diclorometano y se evaporo. El material se puede purificar, por ejemplo, mediante cromatografla, por ejemplo, la utilization de un aparato de purification automatizada de iSCO (por ejemplo, columna de gel de sllice modificada de amina 5 % ^ 100 % de acetato de etilo en hexanos). [8-(4-metanosulfonil-fenil)-[1,2,4] triazolo [1,5-a]piridin-2-il]-[3-(4-metil- piperazin-1-il)-fenil]-amina (es decir, el compuesto a) se alsla como un amarillo solido (aproximadamente 0,07 g). MP = 232-234 °C. 1H NMR (400 MHz, CDCla, 5, ppm): 8.49 (d, J=7.2 Hz, 1H), 8.25 (d, J=7.5 Hz, 2H), 8.08 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.65 (d, J=7.7 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.27-7.20 (m, 1H), 7.04-6.95 (m, 2H), 6.84 (s, 1H), 6.60 (d, J=8.0 Hz, 1H), 3.30-3.25 (m, 4H), 3.10 (s, 3H), 2.63-2.58 (m, 4H), 2.38 (s, 3H). MS = 463 (MH)+.

Citometria de Flujo

Los anticuerpos utilizados para la citometria de flujo consistieron en anti-raton de CD138-APC (eBioscience, San Diego, CA), anti-raton CD19-FITC (eBioscience, San Diego, CA), anti-raton CD38-PE (eBioscience, San Diego, CA) y anti- raton CD45R/B220-Cyc (eBioscience, San Diego, CA), control de isotipo de rata IgG1-APC (eBioscience, San Diego, CA), control de isotipo de rata IgG2a PE (eBioscience, San Diego, CA). Todas las muestras se analizaron usando un citometro de flujo Accuri C6. Se utilizo un medio completo para todos los experimentos que implican el cultivo ex vivo de esplenocitos para todos los experimentos ELISPOTEl medio completo consistia en RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA) , mas 1% de Pen-Strep (Cellgro, Manassas, VA), 1 % de L-Gln (Cellgro, Manassas, VA) , 1 % NEAA (Cellgro, Manassas, VA) , 13 -ME (Cellgro, Manassas, vA), mas un 10 % de SFB (Cellgro, Manassas, VA ).

Lavado, esplenocitos RBC-lisados se tineron para los marcadores de celulas plasmaticas que se utilizo anteriormente en los informes publicados (Neubert, Meister et al., 2008). Tal como se utiliza aqui, el termino "celula de plasma " se referira a la siguiente definition inmunofenotipo : se definieron como celulas plasmaticas como eventos en vivo CD19-negativas, CD45R/B220-negativas, CD138-positivas , CD138-positivas para el modelo MRL/lpr. Se recogieron un total de 200,000-500,000 eventos por tubo/muestra. Insuficientes determination de muestras limitadas de celulas plasmaticas en la medula osea. La tincion de flujo de protocolo fue como sigue, brevemente, las celulas se suspendieron en medio completo (definido anteriormente) y 2,5 mg de anti-CD16/CD32 (FcBlock) con anti-CD19-FITC, anti-CD38-PE, anti-CD45R/B220-Cyc anticuerpos y anti-CD138-APC. Despues de 20 minutos de tincion en hielo, las muestras se lavaron despues se fijaron. Todas las muestras fueron replicadas con apropiados, isotipos coincidentes como se describe a continuacion.

Analisis Luminex de muestras de suero de citoquinas

Para el procesamiento de las muestras de suero para el analisis de citoquinas, se descongelo en hielo un plasma congelado a -80°C, vortex, y se centrifugo durante 10 minutos para eliminar los residuos y agregados. Se utilizo un total de 25 a 50 ml de suero para los ensayos de Luminex® siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midieron diez diferentes citoquinas de raton utilizando la citoquina raton 10-plex kit de cuentas (Invitrogen, Carlsba , CA, no. LMC0001). Brevemente, las placas de filtro (Millipore, Billerica, MA, no. MAIPSWU10), fueron pre-mojadas con 200 ml de solution de lavado (componente del kit) y 25 ml de perlas se anadieron por pocillo. Se diluyeron las muestras de suero y se anadio un volumen total de 50 ml por pocillo (es decir, 25 ml de muestra de suero, mas 25 ml de diluyente de ensayo proporcionado por el fabricante). Se incubaron placas con perlas durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) en un agitador orbital en la oscuridad. Al final de la incubation, la placa(s) se lavaron dos veces en un buffer kit, se anadio anticuerpos secundarios biotinilados a una dilution 1:10 (100 ml) en diluyente de biotina proporcionado en el kit. Se anadio estreptavidina en diluyente de ensayo a 100 ml por pocillo, luego se incubaron durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Las placas se lavaron 3 veces y luego se anadio 100 ml de

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solucion del kit de lavado y se agito durante 2-3 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se ejecutaron las placas inmediatamente despues de este periodo de incubacion en una unidad de Luminex xMAP 200 con la adquisicion de datos y el software de analisis (Invitrogen, San Diego, CA, no. MAP0200). Todos los lavados de grano se realizaron utilizando una unidad de colector de vaclo (Pall, Ann Arbor, MI no. 5017). Para todos los ensayos de citoquinas Luminex, los valores por debajo del llmite de deteccion establecidos por el punto mas bajo a lo largo de la norma o fijados por el fabricante fueron considerados fuera de rango, no se estimaron, pero supone el punto mas bajo a lo largo de la curva estandar para ese ensayo particular.

Analisis de Orina

Las muestras de orina fueron acidas precipitadas para la recuperacion total de protelnas y analisis. Las muestras para las que se emitio suficiente orina se utilizaron para el analisis leukouria Uristix® (estudio MRL/lpr solamente). Brevemente, se preparo una solucion de protelna estandar a partir de sueros de raton normal y fue utilizado como un estandar para el ensayo de protelnas en orina de raton por la turbidez. La preparacion estandar fue la siguiente: 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, y 50 ml de 4 mg/mL del suero de raton del estandar de la solucion de la protelna como se proporciona en el kit anadiendo por duplicado en dos columnas. Se anadio PBS a pocillos individuales para ajustar el volumen final a 50 ml. Para la preparacion de muestras de orina, se centrifugaron muestras de orina a 9880 x g durante 3 minutos utilizando una mesa de micro- centrlfuga. Se anadio sobrenadante de la orina (1-50 ml) por duplicado. Se anadio PBS para ajustar el volumen a 50 ml en total. Para el ensayo de turbidez: se anadio 25 ml de 0,1 N HCl en columnas blancas y 250 ml de acido sulfosalicllico 3% en las columnas de prueba. La microplaca se incubo durante 10 minutos a RT y se leyeron las placas usando un lector de ELISA con un solo haz a 450 nm. Para el ensayo de tira Uristix®, se disenaron y etiquetaron tiras. Se colocaron veinte microlitros de orina en cada cuadrado de tira de ensayo y se incubaron durante al menos 30 segundos antes de que el resultado se registrara. Para todos los ensayos basados en el total de la placa de analisis de orina, los valores por debajo del llmite de deteccion establecido por el punto mas bajo a lo largo de la norma o establecido por el fabricante

fueron considerados fuera de rango, no se estimaron, pero supone el punto mas bajo a lo largo de la curva estandar para ese ensayo particular.

Histologia

Para los analisis histologicos, el rinon y el pulmon (solo modelo NZM) se retiraron a la izquierda de cada animal y se fijaron en 10% tamponada neutra al 10% de formalina (EMD) durante 48 horas en un eje de balancln orbital a 25°C, despues se lavaron durante la noche con corriendo dH2O y se almacenaron en etanol al 70% a 4°C hasta el momento de ser procesados. Manchas de rinon utilizadas para los analisis histologicos incluyen hematoxilina y eosina (H&E), acido periodico de Schiff (PAS) y tricromico (Wistar Institute, Filadelfia, PA). Todas las 3 secciones tenidas fueron utilizadas por el patologo con fines de puntuacion. Todo puntuacion histologica se realizo cegada y por una junta independiente certificada por un patologo medico veterinario (Julie Engiles, VMD, DACVP; Universidad de Pennsylvania). Se utilizaron multiples manchas para determinar los valores de puntuacion. Imagenes en las figuras 8, 19 y 20 muestran el area mas afectada de la seccion seleccionada ciegamente por el patologo.

Metodo de calificacion del rinon IC- GN (Smith, Dong et al., 2007):

1. Celularidad glomerular - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

2. Necrosis glomerular - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

3. La glomeruloesclerosis - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

4. Infiltracion intersticial - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

5. La atrofia tubular - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

6. La fibrosis intersticial - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

7. La vasculitis - Marcador 1-5: nulo, bajo, moderado, alto, grave

Definiciones patologo especlficas:

• La necrosis se definio por la presencia de restos/picnosis nucleares dentro del penacho glomerular indicativo de " necro-sis". En muchas muestras, este fue un hallazgo muy leve y raro dentro de solo unos pocos segmentos del mechon glomerular. Tambien se considerado un borramiento del mechon glomerular por PAS positivo, tricromico de necrosis de material negativo.

• La esclerosis glomerular se define por un aumento de fibroplasia o fibrosis dentro del mechon glomerular o de capsula. A veces, la esclerosis glomerular se considera una "fase terminal" del cambio glomerular, pero aqul se clasifica como aquellos que demuestran una progresiva fibrosis "activa" como glomerular "esclerosis".

• atrofia tubular se clasifico por el aumento de diametro de la luz y/o aplanamiento del epitelio tubular renal, o la desercion de los tubulos.

• La infiltracion intersticial se considero como infiltrados inflamatorios.

• La vasculitis - Una definicion mas floja de la vasculitis a tener en cuenta como una patologla vascular no inflamatoria (degenerativa/proliferativa). La mayorla de los cambios vasculares fueron leves y podrlan ser considerados "arteriosclerosis", caracterizados por la proliferacion de las

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celulas del musculo liso, y la hialinizacion de la matriz extracelular. Este cambio puede reflejar la hipertension secundaria a la patologia glomerular. En muy pocos animales se manifiesto "vasculitis". La mayoria de los cambios inflamatorios estaban dentro de las paredes de los vasos sanguineos, con poco o ningun dano al endotelio, y no manifestaban fugas hemorragias/fibrinas. Muchos tambien tienen bordes perivasculares de los fibroblastos.

Analisis Farmacodinamica (PD)

Se recogieron el bazo y el rinon en el dia 118 (modelo NZM) o el dia 98 (modelo MRL/lpr) tres horas despues de la administracion de la dosis final y se congelaron rapidamente en hielo seco, se enfrio con isopenteno y se almacenaron a -80°C. Lisados del bazo y los rinones fueron procesados mediante el siguiente protocolo. Setecientos microlitros "tampon de extraction de tejido" generado por la combination de coctel inhibidor de la proteasa (Calbiochem, no. 539136) y la fosfatasa coctel inhibidor de la fosfatasa (Thermo Scientific, no. 78420) o un coctel Roche inhibidor de la fosfatasa (Roche, no. 04906837001) en el reactivo de extraccion de tejido I (Invitrogen, no. FNN0071) se anadieron a cada muestra. Las muestras se congelaron homogeneizadas utilizando un homogeneizador Polytron PT 1035 (VWR,. No 97036-082). Despues de la homogeneizacion, la muestra se centrifugo a 4°C durante 2000 x g durante 10 minutos, el sobrenadante se volvio a centrifugar a 4°C a la velocidad maxima, 14000 x g, durante 15 minutos. Los sobrenadantes se retiraron cuidadosamente para evitar captation de la capa superior de escombros lipidos/adiposos. La concentration de proteina se ajusto a 3 mg/ml utilizando un ensayo de proteina BCA (Pierce,. no 83228). Se analizo la actividad del bazo JAK/STAT (pSTAT1/3/5a/b), usando el kit de talon Luminex® 3-plex (Invitrogen). Ambos ensayos se realizaron segun las instrucciones del fabricante.

Analisis Farmacocinetico (PK)

Muestras del plasma, rinon y bazo se sometieron a un analisis cuantitativo para determinar las concentraciones de compuestos. Las muestras de sangre se recogieron en tubos heparinizados y se colocaron en hielo hasta que se centrifugaron (16.000 x g, 5 minutos) para separar el plasma. Se recogio el sobrenadante y se almaceno en un analisis en espera de -20°C. En el momento del analisis, se anadieron dos volumenes de acetonitrilo frio que contenian un patron interno (alprenolol) a cada muestra, las cuales fueron agitadas y centrifugadas. Se elimino el sobrenadante, se colocaron en un vial auto-muestreador y la cantidad de compuesto presente en las muestras se analizo por cromatografia de liquidos/espectrometria de masas (LC- MS- MS). La concentracion de compuesto en las muestras se cuantifico contra un vehiculo solamente (es decir, el grupo del control del vehiculo bien del bazo o de los rinones contra el grupo de vehiculo de la cepa ensayada) curva estandar (especifico del tejido) realizado a traves de dilucion en serie en un intervalo de concentracion desde 5 hasta 20000 ng/mL. Las muestras que contienen concentraciones mayores del 10% por encima de la parte superior de la curva estandar se diluyeron a 1:10 con acetonitrilo. El Kmite de detection del plasma, rinon y bazo era <10 ng/mL.

Los ensayos de ELISA de anticuerpos antinucleares (ANA)

La determination de los anticuerpos antigeno anti-dsDNA y anti-Smith se llevaron a cabo mediante un ensayo ELISA generado a medida internamente. Se adquirieron placas recubiertas de cromatina de Inova Diagnostics, Inc. Se utilizo bovino purificado de timo dsDNA (Sigma, St. Louis, MI) o bovina purificada Smith antigeno (Genway, San Diego, CA) como recubrimiento de antigeno para la deteccion de anticuerpos anti-dsDNA y anti-Smith Ag respectivamente. Las placas recubiertas se lavaron con bBorato de Sulfato de Saline (BSS) y se bloquearon con BSS que contenia 1% de Albumina Serica Bovina (BSA) y 0,1% de detergente de Tween- 20. Las curvas de calibration se generaron utilizando los anticuerpos anti-cromatina del raton (Sigma, 2B1) o de suero de MRL/lpr de 25 semanas de edad. Los anticuerpos anti-dsDNA de raton (Abcam, Cambridge, MA), o los anticuerpos antigeno anti-Smith del raton (Abcam) fueron utilizados como estandares para cada ensayo. El anticuerpo secundario fue adquirido de Abcam (anti-raton pAb-HRP de cabra), el sustrato se adquirio de Rockland ( Gilbertsville, PA) (tMb), y detuvo el tampon de reaction que se genero usando 1 ml de acido sulfurico concentrado en 20 ml de dH2O. Se leyeron placas desarrolladas usando un espectrofotometro Victor-X4 a una lectura de 450 nM con una longitud de referencia de onda de 570 nM. Para todos los ensayos ANA ELISA, los valores por debajo del Kmite de deteccion establecido por el punto mas bajo a lo largo de la norma o fijado por el fabricante se consideraron fuera de cobertura y no se estimaron, pero se asume que el punto mas bajo a lo largo de la curva estandar para este ensayo en particular.

Ensayos Elispot de Anticuerpos Secretores de Celulas B

Se encargaron componentes Elispot de celulas B a Mabtech (Nacka Strand, Suecia) y las placas de filtro de nitrocelulosa IP fueron ordenadas a Millipore (Billerica, MA). Se recubrieron pocillos Elispot con ADN de doble cadena de timo bovino purificado (Sigma), bovino purificado antigeno Smith (Genway) o cromatina de pollo purificado filtrado hervido de las celulas rojas de la sangre de pollo lisado (Rockland, Gilbertsville, PA) a 10 mg/mL. Los bazos se procesaron utilizando la homogeneizacion de vidrio, se filtro a traves de un filtro de celulas esteril de 60 mm y los globulos rojos (GR) zadas utilizando BioLegend (San Diego, CA) tampon de lisis. Se anadieron esplenocitos procesados a cada pocillo en medio del cultivo. Para evitar el sesgo de verdaderos ex vivo de frecuencias de anticuerpos secretores de tipos de celulas (ASC), las celulas no se estimularon con un mitogeno

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policlonal como LPS, sino mas bien se incubaron en medio solo para permitir el control de la liberation genuina ex vivo de anticuerpos. El anti-raton pan-IgG se utilizo como control positivo para el total de IgG productoras de ASCs y se utilizo para normalizar los resultados. En una fase de prueba inicial las frecuencias para cada antlgeno fueron identificadas en cada modelo. Para la cromatina y el total de IgG solamente, se anadieron 30,000 esplenocitos a cada pocillo; para el antlgeno de Smith y dsDNA, se anadieron 500,000 celulas a cada pocillo. Se anadieron diferentes cantidades de esplenocitos para diferentes antlgenos, debido a los llmites de saturation de frecuencias unicas por pocillo. Estos llmites fueron establecidos previamente. Eliospot de celulas B se incubaron durante la noche a 37°C. Para desarrollar cada ensayo, se anadieron anticuerpos secundarios a cada pocillo, incubaron, se lavaron y se utilizo estreptavidina fosfatasa alcalina como el conjugado; el sustrato utilizado fue BCIP-NBT. Las placas se desarrollaron hasta que las manchas fueran visibles. Todos los analisis Elispot se realizaron utilizando un inmunoensayo escaner de C.T.L. y el software Biospot (celular Technology Ltd., Shaker Heights, OH). Los resultados se muestran como valores en los que los materiales y las celulas solo los pocillos se substrajeron.

Analisis estadistico

Todas las estadlsticas se realizaron utilizando el software Graph Pad Prism 5.0. El final del estudio de los analisis se analizo utilizando dos colas de Mann-Whitney o pruebas t de estudiantes emparejados (datos de supervivencia) en las que se indica en la leyenda de Figura. Para graficos que muestran cambios en el tiempo, de 1 via ANOVA se utilizaron en la comparacion entre grupos. Para cambios porcentuales entre los grupos en las comparaciones del area bajo la curva (AUC) se determino para cada parametro en comparacion con el vehlculo en la diferencia porcentual a menos que se indique lo contrario en las mediciones de EOS.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. El COMPUESTO A trata con eficacia el lupus en ratones MRL/lpr Protocolo

Los ratones MRL/lpr primero fueron aleatorizados, hemorragias iniciales recogidas, y los pesos corporales registrados para las mediciones de la llnea de base (Fig. 1). Todos los ratones eran marcados individualmente en la oreja y se controlaron durante todo el experimento (por ejemplo, " Grupo # -Cage carta-Raton #", por lo que "3B5" = Grupo 3 (G3), jaula B, raton 5 #). Los ratones fueron emparejados por edad y el tratamiento comenzo a las 6-8 semanas de edad. Se realizaron muestras de sangre de mejilla y de orina semanalmente durante todo el experimento. Los ratones fueron individualmente rastreados para varios parametros que incluyen citoquinas y niveles de anticuerpos antinucleares, la proteinuria, la masa corporal, lymphomegaly, la salud general y la mortalidad. Todos los parametros fueron evaluados cada dos meses, excepto la mortalidad que se controlo diariamente. Todos los grupos estaban formados por un mlnimo de al menos 10 a 12 ratones por grupo. Experimentos ex vivo incluyen el analisis de citometrla de flujo de celulas plasmaticas, el complemento del suero C3 y niveles de anticuerpos antinucleares; protelna en la orina y leucocitos, perfiles de citoquinas en suero, patologla histo renal, y la determination de los niveles de compuestos (farmacocinetica (PK)) en el bazo, el rinon y plasma. Los ratones fueron rastreados en una base individual. Para todos los datos, los ratones se agruparon en poblaciones y los datos graficados como mean6SEM. Se registraron observaciones bimensuales y los datos recogidos por cada grupo, excepto la mortalidad que se realizo a diario. Se analizaron las lecturas de etapa final como se describe en la section Materiales y metodos (arriba) y en la Fig. 1. Para el tratamiento con el COMPUESTO A, los ratones fueron tratados con el COMPUESTO A en suspension en PEG400 mas 1% de DMSO proporcionado por via oral (po) dos veces al dla (bid) de 8 a 11 semanas de edad (es decir, para la dosis de 100 mg/kg, se administraron a los animales 100 mg/kg en AM y 100 mg/kg en PM), a continuation, se descansa sin tratamiento de 11 a 18 semanas de edad, despues se vuelven a iniciar tratamientos farmacologicos p.o. del COMPUESTO A con dosificador b.i.d. en las tres semanas restantes hasta las 21 semanas de edad. El estandar de atencion incluye dexametasona (DEX) previsto en 1,5 mg/kg, tres veces por semana, i.p. Vehlculo fue PEG400 + 1% de DMSO administrado por via oral dos veces al dla, al mismo tiempo que el tratamiento de drogas del COMPUESTO A. El analisis farmacocinetico de la retention de tejido para este modelo se puede encontrar en la Fig. 2. Es de destacar que con respecto a la Fig . 2 es que el nivel de COMPUESTO A en el rinon fue similar al nivel de exposition del plasma. Esto es importante debido a que el rinon es un sitio importante en la patologla de la enfermedad de lupus.

Lymphomegalfa, esplenomegalia, y el recuento de leucocitos

Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A presentaron menor lymphomegalla en 55 mg/kg y 100 mg/kg, pero no en 30 mg/kg, dosis (100% sin lymphomegalla de 100 y 55 mg/kg, 0% para el vehlculo; p< 0,05) (Fig. 3). Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A mostraron esplenomegalia (es decir, la masa bazo) en dosis de 100 mg/kg y 55 mg/kg (p< 0,001 y p< 0,05, respectivamente) en comparacion con el vehlculo (49,4% de disminucion de 55 mg/kg y 74,1% de disminucion de 100 mg/kg frente a el vehlculo) (Fig. 4, panel superior). A 100 mg/kg, el COMPUESTO A disminuye la masa del bazo hasta el nivel de un animal de control de no lupus (MRL/Mp; 98 mg) (Fig. 4, panel superior). Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A presentaron un menor recuento de leucocitos totales en comparacion con el vehlculo tanto en dosis de 55 mg/kg como en 100 mg/kg (p< 0,05), pero no tan bajo como en animales MRL/Mp de no lupus (Fig. 4, panel inferior).

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Estos resultados son importantes porque la esplenomegalia (hinchazon del bazo), la lymphomegalla (hinchazon de ganglios linfaticos), y la hiperproliferacion de las celulas T y B son indicativos de la enfermedad de lupus en ratones MRL/lpr. Por lo tanto, la reduccion en el numero de linfocitos en general, y por lo tanto el tamano del bazo y de los ganglios linfaticos, indican que el COMPUESTO A controla parcialmente las respuestas autoinmunes sistemicas durante el tratamiento. Por otra parte, el hecho de que la masa del bazo y el numero total de celulas no caen por debajo de los controles historicos de no lupus sugiere que el COMPUESTO A no causo una inmunosupresion abierta, lo que podrla esperarse de un bloqueo completo de quinasa JAK. Por lo tanto, el COMPUESTO A es ventajoso ya que proporciona un efecto terapeutico deseable sin efectos secundarios desfavorables.

Tolerabilidad

Los ratones MRL/ pr tratados con el COMPUESTO A no exhibieron cambios significativos en la masa corporal (Fig. 5). Para cada dosis testeada no se observo una manifestation de toxicidad, y de hecho la masa corporal aumento, lo que sugiere una mejora en la salud general en comparacion con el vehlculo.

IL-12

Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A exhibieron una calda de los niveles de citoquinas IL- 12 durante las fases de tratamiento de 8-11 semanas de edad y de 18-21 semanas de edad, pero el aumento del nivel de tratamiento durante los dlas festivos, de 12-20 semanas de edad (Fig. 6; * p< 0,05, ** p< 0,01; 56,1% de disminucion de 100 mg/kg y 50,7% de disminucion de 55 mg/kg en comparacion con el vehlculo).

Estos datos son importantes, ya que apoya la conclusion de que las cascadas inflamatorias de citoquinas en bloques del COMPUESTO A implicadas en el lupus, tales como IL-12.

C3

Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A muestran un significativo aumento de la concentration de C3 en suero relativa al vehlculo en la dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg (aumento del 52,5% para 100 mg/kg y el aumento del 51,4% para 55 mg/kg a lo largo del vehlculo; p< 0,05) (Fig. 7 ). Estos datos son importantes porque el nivel de C3 en el suero se correlaciona indirectamente con la magnitud o extension de la inflamacion.

Pacientes con LES muestran niveles reducidos de C3 y C4 en el tiempo, lo que es indicativo de un aumento de la inflamacion sistemica, lo que resultan danos en los tejidos de los organos. Pero con el tratamiento estos factores de rebote, indican que el tratamiento esta reduciendo la inflamacion sistemica y por lo tanto el tratamiento efectivo de la enfermedad. Por lo tanto, un aumento de C3 en suero es indicativo de la resolution de la enfermedad lupus y el tratamiento (Boumpas, Furie et al. 2003).

Nefritis lupica

La etapa terminal de nefritis lupica fue evaluada por la histopatologla y anotada por un patologo certificado por el consejo para la evaluation de los danos renales totales en los animales afectados (Figura 8; . Tabla 1). Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A mostraron disminuciones en tanto infiltraciones/glomerulonefritis celulares y el tamano glomerular en hematoxilina y eosina (H&E) secciones renales manchadas en comparacion con ambos grupos de dexametasona y el vehlculo de tratamiento (Fig. 8). Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A mostraron reducciones significativas en la celularidad glomerular (33,3 % de disminucion; p< 0,01), la infiltration intersticial (40 % de reduccion ; p< 0,01) y vasculitis ( 46,1 % de disminucion ; p < 0,01 ) en comparacion con los vehlculos a la dosis 100 mg/kg, similar a la dexametasona (Tabla 1). A la dosis de 55 mg/kg, el COMPUESTO A redujo la infiltracion intersticial (33,3% de disminucion, p< 0,05) en comparacion con vehlculo (Tabla 1).

7Estos resultados son importantes porque muestran que el tratamiento de ratones MRL/lpr con el COMPUESTO A pueden ralentizar y/o prevenir el desarrollo de la nefritis lupica en ratones propensos al lupus.

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Tabla 1.MRL/lpr Puntuacion rinon (grado puntuacion: 0-5; media6SD)

Grupo: Celularidad Glomerular Necrosis Glomerular Glomerulosclerosis Infiltracion Intersticial Atrofia Tubular Fibrosis Intersticial Vasculitis

Vehlculo: 3.60 +/- 0.55 2.60 +/- 0.55 2.40 +/- 0.89 3.00 +/- 0.71 2.00 +/- 0.00 2.00 +/- 0.00 2.60 +/- 0.55

COMPONENTE A 30 mg/kg: 2.60 +/- 0.55’ 1.80 +/- 0.45 1.60 +/- 0.55 2.20 +/- 0.45 1.20 +/- 0.45 1.60 +/- 0.55 1.80 +/- 0.45

COMPONENTE A 55 mg/kg: 3.20 +/- 0.45 1.80 +/- 0.45 2.00 +/- 0.00 2.00 +/- 0.711 2.20 +/- 0.45 1.20 +/- 0.45 2.00 +/- 0.00

COMPONENTE A 100 mg/kg: 2.40 +/- 0.552 1.8 +/- 0.45 2.20 +/- 0.84 1.80 +/- 0.842 1.40 +/- 0.55 1.40 +/- 0.55 1.40 +/- 0.552

Dex 1.5 mg/kg: 3.00 +/- 0.71 2.00 +/- 0.00 2.00 +/- 0.00 1.60 +/- 0.553 1.20 +/- 0.45 1.20 +/- 0.45 1.40 +/- 0.552

Comparado a Vehlculo: 1p<0.05 2p<0.01 3p<0.001 1-forma ANOVA

Pharmacodynamics

La inhibicion de fosforilada STAT-3 (pSTAT3) se utilizo como un marcador de derivadas farmacodinamico (PD) de la inhibition de JAK2. Se observaron reducciones significativas renales pSTAT3 tanto en dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg del COMPUESTO A en ratones MRL/lpr cuatro horas despues de la dosis final del farmaco en el fin de estudio (EOS) el dla 147 de edad (dla 91 de estudio) (Fig. 9).

Este dato es importante porque muestra que el COMPUESTO A inhibla eficazmente JAK2 en un lugar de particular importancia para el lupus - el rinon.

Celulas plasmaticas

Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A mostraron una disminucion de las celulas plasmaticas del bazo en dosis de 100 mg/kg en comparacion con el vehlculo (65,5% de disminucion, p< 0,01) (Fig. 10). Los ratones MRL/lpr tratados con el COMPUESTO A exhibieron reducidas frecuencias de celulas secretoras de anticuerpos anti- cromatina (ASC) en el bazo a la dosis de 100 mg/kg en comparacion con el vehlculo (89,1% de disminucion , p< 0,001 ) (Fig. 11).

Este dato es importante porque las celulas plasmaticas son responsables de la generation de autoanticuerpos, y se cree que las celulas plasmaticas de larga vida son una de las ralces de los propagadores de la continuation de la patogenesis del lupus en seres humanos (Espeli, Bokers et al.; Neubert, Meister et al. 2008). Las celulas de plasma de larga vida (LL-PC) pueblan principalmente la medula osea (BM), pero tambien se pueden encontrar en el bazo en sitios de inflamacion, y son conocidas por ser resistentes a la ciclofosfamida, uno terapia aceptada para el tratamiento de la nefritis lupica (Chevrier, Genton et al., 2009).

Ejemplo 2. El COMPUESTO A trata con eficacia el lupus en ratones NZM

Protocolo

Los ratones de una edad acoplada, femeninos, NZM o NZW/LacJ, fueron madurados para el estudio de la nefritis lupica en un total de 7 meses o 210 dlas en la que la orina fue recogida el tiempo para una detection de la proteinuria. Los ratones con 0.5-1.0 mg/ml de protelna en la orina segun lo determinado por un ensayo de precipitation de protelna total basada en la densidad optica y comprobado a 30-300 mg/dl de protelna como se determina mediante un ensayo de palo se consideraron proteinuria positiva y seleccionado para un estudio entrada. Se normalizaron grupos para contener una distribution de Gauss de la proteinuria en animales positivos (es decir, 1/3 bajo la proteinuria, 1/3 medio, 1/3 de altura) y luego distribuidos al azar entre los grupos antes de la marca de lado y tomando las medidas de referencia, incluyendo las colecciones de orina y suero. Un total de cinco ratones de la poblacion total fueron seleccionados al azar para la evaluation de la histologla renal basal. Tratamientos y ensayos para cada grupo se describen en la Fig. 12. En resumen, con un mlnimo de 10 ratones por grupo, se administro el COMPUESTO A a 100 mg/kg o 55 mg/kg, ambas dos veces al dla y por via oral. Para los estandares de cuidado, se proporciono ciclofosfamida (CTX) a 50 mg/kg, una vez por semana, proporcionado ip y dexametasona a 1,5 mg/kg, tres veces a la semana, ip. El vehlculo incluyo DMSO al 3%, 10 % y 87% Solutol PBS. Los tratamientos se iniciaron en el dla de edad, 212, algunos ratones murieron poco despues del tratamiento, pero todos los animales, independientemente del estado de salud se contaronen contra del tamano total del grupo del

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momento de la dosificacion. Nefritis lupica en etapa terminal fue evaluada por histopatologla y anotada por un patologo certificado por el consejo para la evaluacion del total del dano renal en los animales afectados utilizando el metodo de puntuacion descrito por Smith et al (Smith, Dong et al., 2007). Es importante senalar, que todas las graficas mostradas en las figuras relevantes muestran dla 0 como el "inicio del tratamiento" y por lo tanto representa 212 dlas de edad. El dla-98 o "final del tratamiento/estudio" representa 310 dlas de edad para los animales NZM. Todos los graficos muestran el tiempo como "dla de estudio" con el dla de estudio empezando en 212 dlas de edad y terminando a 310 dlas de edad.

Supervivencia

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A exhibieron significativamente un aumento de la supervivencia relativo al vehlculo en dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg (70% de supervivencia de 100 mg/kg y 90% de supervivencia de 55 mg/kg en EOS; p<0,01). La supervivencia fue comparada al estandar del agente de cuidado CTX (70% de supervivencia a EOS; p< 0,001) (Fig. 13). Junto con el MMF y la azatioprina, la ciclofosfamida es una opcion de tratamiento actual para los pacientes que sufren de nefritis lupica, ya que actua como un potente agente inmunosupresor, sin embargo, debido a sus graves efectos secundarios solo se utiliza en los casos mas graves.

Anticuerpos antinucleares (ANA)

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A exhibieron niveles totales reducidos de suero anti-dsDNA ANAs durante todo el curso de la enfermedad (73,9% de disminucion de 100 mg/kg, 67,0% de disminucion de 55 mg/kg en comparacion con el vehlculo; p<0,01). Reduccion en anti-dsDNA ANAs por el COMPUESTO A fue a la par con el estanadr del agente de cuidado CTX (65,3% de disminucion en comparacion con el vehiculo; p<0,001) (Fig. 14). El tratamiento con el COMPUESTO A (y CTX) tambien redujo significativamente el antlgeno anti- Smith ANA (p< 0,05) (Fig. 15).

Este dato es importante porque la presencia de anticuerpos anti-dsDNA se asocia con un pobre pronostico del lupus y esta fuertemente asociado con el desarrollo, y a menudo fatal, la nefritis lupica (Egner 2000; Kiss, Lakos et al., 2009).

IFNa

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A presentaron una modesta pero significativa reduccion de IFNa en suero en comparacion con el vehlculo (73,2% de disminucion de 100 mg/kg y 70,2% de disminucion de 55 mg/kg; p<0,05) (Fig. 16). Ni el nivel de agente de cuidado (es decir, CTX o DEX) mostro una reduccion significativa.

Estos datos son importantes porque el tipo de citoquinas I IFN, IFNa, han sido fuertemente ligadas a la patogenesis del lupus y es una de las primeras rupturas de citoquinas que conducen a manifestaciones de lupus en seres humanos (Niewold, Hua et al. 2007). De hecho, actualmente las terapias de lupus se estan desarrollando para que especlficamente el IFNa se enfoquen en neutralizar IFNa circulante en pacientes con lupus (por ejemplo, Medlmmune, MEDI -545). Una disminucion de esta 'firma IFNa' en pacientes con lupus es un biomarcador utilizado para determinar la eficacia de un medicamento experimental probado (Sozzani, Bosisio et al.).

La Proteinura

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron significativamente la protelna en la orina total reducida durante el curso de la enfermedad para ambos grupos de tratamiento, 55 mg/kg y 100 mg/kg, con respecto al vehlculo (76,25 disminucion y 81,8 % de disminucion en comparacion con el vehlculo respectivamente; p<0,001). (Fig. 17). La reduccion fue comparable al nivel de agente de cuidado CTX (67,1% de disminucion; p<0,001). Los datos para cada raton en cada grupo de tratamiento se muestra en las figuras 18A a 18E . Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A presentaron una menor proteinuria en comparacion con el DEX o el vehlculo (magnitud por ejemplo, menos variable y duracion de la respuesta), comparable a CTX. El tratamiento con el COMPUESTO A llevo los niveles de protelna por debajo de los niveles de protelna de ratones de control sin lupus, de la misma edad (Fig. 17;. Llnea de puntos).

Estos resultados son importantes porque un aumento de protelnas en la orina (proteinuria) es el resultado directo del dano renal asociado con nefritis lupica. Por otra parte, el hecho de que el COMPUESTO A redujiera los niveles de protelna en la orina por debajo de los niveles historicos de los animales de control sin lupus indica que el COMPUESTO A no se limitara simplemente a la proteccion de los animales del avance de la enfermedad, sino que en realidad fuera la reversion de la enfermedad del lupus.

Glomerulonefritis, Danos del Pulmon

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una disminucion de la celularidad glomerular en las dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg en comparacion con el vehlculo (59,3 % de disminucion y 56,2 % de disminucion, respectivamente; p<0,001) (Tabla 2). Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A en las dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg mostraron una disminucion de fibrosis intersticial y vasculitis en comparacion con el vehlculo (58,3% y 8,3% de disminucion, respectivamente; p<0,05) (Tabla 2). Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una disminucion de las patologlas renales, comparables a los de un control parental emparejados por edad de no-enfermedad NZW/LacJ (Fig. 19). Los ratones nZm tratados con el COMPUESTO A en la dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg (y CTX) previno de infiltraciones pulmonares en comparacion con la dexametasona y el vehlculo

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en los animales tratados (Fig. 20).

Tabla 2. Puntuaciones Renales NZM (grado puntuacion: 0-5; mean6SD)

Vehlculo: 3.22 +/- 0.83 2.11+/-0.60 2.55+/-1.33 2.44+/-1.33 2.66+/-1.22 2.44+/-1.33 1.20+/-0.44

COMPONENTE A 55 mg/kg: 1.33+/-0.503 1.22+/-0.44 1.00+/-0.01 1.11+/-0.33 1.22+/-0.44 1.0+/-0.01 1.11+/-0.331

COMPONENTE A 100 mg/kg: 1.44+/-0.523 1.44+/-0.72 1.22+/-0.66 1.22+/-0.44 1.33+/-0.50 1.22+/-0.44 1.44+/-0.52

CTX 50 mg/kg: 2.0+/-0.701 1.77+/-0.83 2.11+/-1.16 1.55+/-1.01 2.00+/-1.32 1.55 +/-1.01 1.33+/-0.50

Dex 1.5 mg/kg: 3.0+/-0.81 3.0+/-0.81 3.42+/-1.27 2.71+/-0.47 3.14+/-1.46 2.71+/-1.25 2.42+/-1.13

Referencia NZM 8mos: 2.50+/-1.00 1.50+/-0.57 2.00+/-0.81 1.50+/-1.00 2.00+/-1.41 2.00+/-1.41 1.75+/-0.50

Control sin lupus: 1.40+/-0.892 1.20+/-0.44 1.20+/-0.44 1.20+/-0.44 1.40+/-0.89 1.20+/-0.44 1.20+/-0.44

Comparado a Vehlculo: 1p<0.05 1p<0.01 3p<0.001 2-forma ANOVA

Estos datos son importantes porque la celularidad glomerular, la fibrosis intersticial y la vasculitis son indicadores de la glomerulonefritis asociada con el lupus. El hecho de que el COMPUESTO A no fuera solo capaz de prevenir un aumento de estos factores, sino de reducirlos en comparacion con los ratones estandares NZM de 7 meses, indica que el COMPUESTO A se va mas alia de la mera proteccion en los animales de la progresion de la enfermedad y de hecho de la inversion del curso de la enfermedad. Ademas, el edema pulmonar o la vasculitis pulmonar y los derrames de la pleura pueden conducir a complicaciones respiratorias superiores tales como pneumonia. La capacidad del COMPUESTO A para la prevencion de vasculitis pulmonar y la inflamacion es una ventaja de la presente invencion, ya que estos son complicaciones comunes de la enfermedad del lupus.

Farmacodinamica

Usando el marcador farmacodinamico de fosforo-STAT3 para la inhibicion de JAK2, los niveles de pSTAT3 en los rinones de ratones tratados fueron significativamente mas bajos que los de cualquiera de los vehlculos o CTX (cambio %; p<0,01) (Fig. 21).

Este dato es importante porque muestra que el COMPUESTO A inhibla eficazmente JAK2 en un lugar de particular importancia en el lupus - el rinon.

Citoquinas

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una significativa reduccion de los niveles sericos de varias citocinas asociadas con la progresion del lupus en comparacion con el vehlculo (Figuras 22-31). Por ejemplo, las dosis de 55 mg/kg y 100 mg/kg del COMPUESTO A redujo significativamente la IL-12 (99,4% y 99,9% de disminucion, p<0,001) (Fig. 22), IL-17A (79,1% y 86,2% de disminucion; p<0,001) (Fig 23), IL-6 (98,2% y 97,0% de disminucion; p<0,001) (Fig 24), CCL3/MIP-1a (94,5% de disminucion para ambas dosis; p<0,01) (Fig. 25), CXCL10/IP-10 (47,3% y 80,0% de disminucion, p<0,01) (Fig 26), CXCL9/MIG (83,7% y 85,7% de disminucion; p<0,001) (Fig 27), IL-4 (98,7% y 91,8% de disminucion, p<0,01) (Fig. 28), IL-13 (86,2% y 79,5% de disminucion, p<0,001) (Fig. 29), TNFa (92,3% y 88,3% de disminucion; p<0,001) (Fig 30), y KC/IL-8 (78,0% y 72,9% de disminucion, p<0,001) (Fig 31) en comparacion con el vehlculo.

Estos resultados son importantes porque estas citoquinas son elevadas en pacientes con lupus, y estan involucradas en el aumento de los brotes de lupus y la respuesta inmune en curso para que los antlgenos propios perpetuen la enfermedad (Chun, Chung et al. 2007; Tucci, Lombardi et al. 2008). La reduccion o la modulacion en estos perfiles de citoquinas puede proporcionar un beneficio favorable en los pacientes y proporciona un indicador indirecto de la resolution de la enfermedad. (Morimoto, Tokano et al. 2001; Aringer y Smolen 2004; Chun, Chung et al. 2007; Niewold, Hua et al. 2007; Fu, Chen et al. 2008 ; Tucci, Lombardi et al. 2008).

Esplenom egalia

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Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una significativa reduccion total del estudio final de la masa del bazo (EOS) en comparacion con los vehlculos (73,5% de disminucion en 100 mg/kg y 71,8% de disminucion en 55 mg/kg; p<0,001). (Fig. 32). La disminucion en las masas del bazo observada en el COMPUESTO A era comparable a CTX.

Estos datos son importantes porque la esplenomegalia (hinchazon del bazo) es un indicativo de la enfermedad del lupus en ratones NZM.

Tolerabilidad

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A no exhibieron ningun cambio en la masa corporal en cualquiera de las dosis (Fig. 33).

Actividad de los Osteoclastos

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una significativa reduccion en la resorcion osea como se mide usando un biomarcador de actividad de los osteoclastos (es decir, c-telopeptido de colageno tipo I reticulante; CTx) (Bouzid, Bahlous et al.). El COMPUESTO A reduce los niveles de CTx en suero en los ratones NZM tratados (46,7% de disminucion en 100 mg/kg y 37,8% de disminucion en 55 mg/kg de vs. vehlculo; p<0,01) (Fig 34).

Este dato es importante porque sugiere que el COMPUESTO A puede afectar a la actividad de los osteoclastos y/o afectar las citoquinas implicadas en la remodelacion osea durante enfermedades inflamatorias cronicas tales como SLE. La capacidad del COMPUESTO A para reducir la actividad de los osteoclastos es importante porque la actividad de los osteoclastos es mayor durante el lupus, lo que provoca la desmineralizacion osea y la perdida general de masa osea, lo que lleva a un aumento de las fracturas, lesiones y la necesidad de reemplazo de articulaciones. ( Kamen y Alele) El estandar de cuidado para el tratamiento del lupus, glucocorticoides tales como dexametasona, metilprednisolona y prednisona, puede exacerbar este problema y, ademas, llevar a la perdida osea mediante el desequilibrio de los osteoclastos sobre la actividad celular de osteoblastos (Cunningham 2007). Consecuentemente, los pacientes de lupus con la desmineralizacion osea son a menudo tratados con bisfosfonatos para restaurar la perdida del hueso; pero este tratamiento es toxico para el sistema renal y por lo tanto son contraproducentes en el tratamiento de pacientes de lupus con el desarrollo de la nefritis lupica (Body, Diel et al. 2004). Asl, la capacidad del COMPUESTO A para tratar el lupus y tambien reducir la actividad de los osteoclastos podrla revertir la perdida osea asociada a lupus y de hecho puede ayudar a la reparacion de danos en las articulaciones causados por la enfermedad.

Celulas de Plasma

Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una reduccion en las celulas plasmaticas del bazo, en ambas dosis de 100 mg/kg y 55 mg/kg en comparacion con el vehlculo (52,9% y 57,6% de disminucion, p<0,05), y la reduccion proporcionada por el COMPUESTO A fue similar a los animales de control sin lupus (58,4% de disminucion; p<0,05) (Fig. 35). Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una disminucion en la expresion del clclico hidrolasa ribosa ADP, CD38 , en ambas dosis de 100 mg/kg y 55 mg/kg al nivel de los ratones de control sin lupus (74,2% y 66,6% de disminucion; p<0,05) (Fig. 37). Aunque tanto la dexametasona y la ciclofosfamida tambien redujeron los niveles de las celulas plasmaticas del bazo, la disminucion no fue significativa (Fig. 35). Los ratones NZM tratados con el COMPUESTO A mostraron una reduccion de niveles de ASC especlficos de la cromatina, a la par con la ciclofosfamida (97,4% de disminucion de 55 mg/kg y 100% de disminucion de 100 mg/kg frente a 100 % de disminucion de CTX; p<0,05) (Fig. 36).

Estos datos son importantes porque las celulas de plasma son responsables de la generacion de autoanticuerpos, y se cree que las celulas plasmaticas longevas son una de las ralces de propagacion de la continuacion de la patogenesis del lupus en seres humanos (Neubert, Meister et al. 2008). Las celulas de plasma longevas (LL-PC) se encuentran principalmente en la medula osea (BM), pero tambien se pueden encontrar en el bazo en sitios de inflamacion, y son conocidas por ser resistentes a la ciclofosfamida, una terapia aceptada para el tratamiento de la nefritis lupica (Alperovich, Rama et al. 2007; Houssiau y Ginzler 2008; Lacotte, Dumortier et al. 2010). La capacidad del COMPUESTO A para reducir los niveles de celulas de plasma longevas es importante porque estas celulas son diflciles de matar, son por lo general quimio- y radio- resistentes, pueden sobrevivir durante muchas decadas dentro de la arquitectura de la medula osea, y producir la mayorla de autoanticuerpos durante el lupus. Tambien es importante tener en cuenta que las proporciones de celulas plasmaticas del bazo no descienden por debajo de la de los ratones de control sin lupus, sino mas bien a un nivel comparable, lo que sugiere que el bloqueo de JAK2 con el COMPUESTO A restaura las proporciones normales de las frecuencias de celulas plasmaticas a la de un raton de control emparejado de edad normal.

Resumen

El raton en cambios de raton individual y el resumen de todos los resultados histopatologicos se puede encontrar en la Tabla 3. Como muestra la Tabla 3, la supervivencia se correlaciona bien con los cambios marcados en la puntuacion renal, los niveles de anti-ADN ANA de doble cadena, y la proteinuria. Estos resultados demuestran claramente la capacidad del COMPUESTO A para tratar el lupus mediante la proteccion de los animales de la

progresion de la enfermedad, e incluso revertir el curso de la enfermedad lupus.

Tabla 3. Resultados NZM integrales

A: Anti-dsDNA IgG, D: Esclerosis Glomerular, G: Fibrosis Intersticial,: B: Celularidad Glomerular, E: Infiltracion Intersticial H: Vasculitis, C: Necrosis Glomerular, F: Atrofia Tubular, I: Proteinuria

Grupo: Raton Edad (d) A B C D E F G H I

Control Parental: NZW/ LacJ-1 310 54.1 1.51

: NZW/ LacJ-2 310 125.0 1.61

5

Grupo: Raton Edad (d) A B C D E F G H

: NZW/ LacJ-3 310 27.8 - - 1.76

: NZW/ LacJ-4 310 55.9 - - 1.00

MEAN 6SD: 310 50.0 58.2 541.0 - 1.47 50.32

Vehiculo: 9A1 212 ND ND ND ND ND ND ND ND 3.58

: 9A2 240 51.4 + + + - + 8.64

: 9A3 310 32.0 + + + + + + + + + ++ + + + + + 1.64

: 9A4 268 ND + + + + + + + + - 13.44

: 9A5 310 16.7 + ■ - - + 0.85

: 9B1 310 95.2 ND ND ND ND ND ND ND 2.04

: 9B2 240 27.0 + + + + + + + + + + ++ 8.63

: 9B3 310 253.2 1.17

: 9B4 227 ND + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12.67

: 9B5 227 57.0 +++ + + + + + + + 7.48

: 9C1 310 214.8 ++ + + + + + + + + + + + + + + + + 1.30

MEAN 6SD: 269.5 641.0 93.4 690.5 5.58 64.7

Grupo: Raton Edad (d) A B C D E F G H

CMPD A 100

mpk bid: 3A1 310 13.4 - - - - - - - 0.48

: 3A2 310 18.2 - + - + + - 0.55

: 3A3 310 9.6 - - - - - - - 0.70

: 3A4 268 13.8 - - - - - - - 0.53

: 3A5 268 11.5 - - - - - - - 0.44

: 3B1 310 6.6 + + - - + - 0.11

: 3B2 310 20.5 + + + + + - + 0.00

: 3B3 310 5.1 + - - - - - 0.00

: 3B4 310 26.5 + - - + - - + 0.00

: 3B5 212 19.2 ND ND ND ND ND ND ND 10.39

MEAN 6SD: 291.8 633.0 14.4 66.6** 1.32 63.1**

CMPD A 55 mpk bid: 4A1 310 20.6 + - - - + - - 0.41

: 4A2 212 39.4 ND ND ND ND ND ND ND 0.41

: 4A3 310 9.4 + + - 0.50

: 4A4 310 12.6 + + - 0.74

: 4A5 310 12.7 - 0.48

: 4B1 310 7.5 - 0.52

: 4B2 310 15.2 1.11

: 4B3 310 16.7 - - - 0.37

: 4B4 310 19.3 - - - + 0.61

: 4B5 310 10.8 - - - 0.48


: 300.2 16.4 0.56

MEAN 6SD: 630.9 69.0** 60.22***

CTX 50 mpk

1x wk: 7A1 227 13.4 + + + + + + + + + + + + + + + 11.09

: 7A2 310 6.9 + - - 0.86

: 7A3 310 22.2 + + + + 1.44

Grupo: Raton Edad (d) A B C D E F G H

: 7A4 310 13.2 + + + + + + + + + + + - 0.76

: 7A5 310 40.3 + - + + - - - 1.30

: 7B1 310 9.6 + + + + - - - + 0.71

: 7B2 212 65.1 ND ND ND ND ND ND ND 8.84

: 7B3 310 52.4 + + - - + - - 0.96

: 7B4 240 24.3 - - - + + - - 0.58

: 7B5 310 61.9 - - - - - - 1.50

MEAN 6SD: 284.9 640.9 30.9 622.2 2.8 63.8

Dex 1.5 mpk 3x wk: 8A1 291 27.2 + + + + + + + + + +++ + + + 8.43

: 8A2 212 18.9 10.19

: 8A3 291 20.0 + + + + + + + + + +++ ++ + 11.02

: 8A4 240 79.5 ND ND ND ND ND ND ND 8.47

: 8A5 268 167.5 + + - - - - - 0.35

: 8B1 240 ND ND ND ND ND ND ND ND 10.19

: 8B2 212 27.8 + + + + + + + + + +++ ++ + 7.16

: 8B3 310 16.2 + + + + - - - 0.55

: 8B4 310 10.9 +++ + + + + + + + + +++ ++ ++ + 12.36

: 8B5 240 17.1 +++ + + + + + + + + + + +++ + + + + + + 9.89


: 261.4 42.7 7.86

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MEAN 6SD: 637.6 651.0 64.1

*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Vehiculo, dos-colas Mann-Whitney t- test Proteinura "0.00" = BQL, x>1mg/mL en negrita

Calificacion = '-' sin enfermedad (1),'+' leve (2),'++' moderado (3), '+++' alto (4), '++++' enfermedad grave (5)

Ejemplo 3. El COMPUESTO A reduce la frecuencia patogena en la medula osea de celulas plasmaticas de larga vida, resistentes a radio/quimioterapia, que promueven el lupus.

Los ratones NZM propensos al lupus de quince semanas de edad fueron administrados de 100, 55, o 30 mg/kg del COMPUESTO A por via oral, b.i.d., estandar de referencia de cuidado del agente de ciclofosfamida a 50 mg/kg, una vez a la semana, i.p. en solucion salina, o vehiculo (PEG400), por via oral, b.i.d., por un total de dos semanas. Veinticuatro horas antes del final del estudio se inyecto i.p. a cada raton con 2 mg de analogo de timidina, bromodesoxiuridina (BrdU). BrdU (Cat # 550891) y un kit de tincion de anti- BrdU-FITC (Cat # 559619) se obtuvieron de BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Veinticuatro horas despues de la inyeccion BrdU en el bazo y la medula osea se procesaron individualmente para aislar los leucocitos en la tincion del flujo. Las celulas se tineron con superficie anti-CD19-Cyc, anti-CD38PE y anti-CD138-APC (todos obtenidos de eBioscience en San Diego, CA), as! como anti-BrdU-FITC (del kit de BrdU). El analisis incluyo la compuerta en poblaciones vivas SSC/FSC, CD19- negativas, CD38-positivo y la compuerta de CD138-positivo, BrdU-negativos (no el ciclismo, las celulas plasmaticas de larga vida, region R2) o BrdU-positivas (ciclismo, a corto celulas plasmaticas vivido, region R1) como se muestra en la Fig. 42. Todas las muestras se analizaron usando un citometro de flujo Accuri C6. Se utilizo un medio completo (R10) para todos los experimentos que implicaron el cultivo de ex vivo de esplenocitos para todos los experimentos ELISPOT. Una tecnica completo consistla en RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA), mas 1% de Pen-Strep (Cellgro, Manassas, VA), 1% de L-Gln (Cellgro, Manassas, VA), 1 % NEAA (Cellgro , Manassas, VA), 13-mE (Cellgro, Manassas, VA), mas un 10% de SFB (Cellgro, Manassas, VA).

Las figuras representan las celulas plasmaticas de vida corta del bazo (Fig. 38), aisladas de la medula osea celulas de plasma de corta duracion (Fig. 39), celulas plasmaticas de larga vida del bazo (Fig. 40), y celulas plasmaticas aisladas de larga vida de la medula osea (Fig. 41). Ademas se muestran graficos de puntos representativos que proporcionan ejemplos de compuertas y celulas plasmaticas de vida corta, R1 y celulas plasmaticas de larga vida, R2, puertas (Fig. 42). Los graficos muestran mean+/-SEM, una prueba estadlstica que incluyo dos colas, el Mann-Whitney test-t, *p<0,05 fue considerado significativo. Todos los eventos que se muestran fueron originalmente regulados por el tamano de las celulas vivas, las graficas muestran CD19-negativas, CD38/CD138-doble de poblaciones positivas que hablan incorporado BrdU, ya sea (ciclismo, por lo tanto celulas plasmaticas de corta duracion, vease region R1) o no se incorporo BrdU (no ciclismo, por lo tanto celulas plasmaticas de larga vida, vease region R2).

El COMPUESTO A redujo las celulas plasmaticas de larga vida, por lo general radio y quimio-resistentes, en ratones NZM propensos al lupus. Como se muestra en las Figs. 38-42 tanto en ciclo (de corta duracion, la region R1) y no en el ciclo (R2, region de larga vida) de las celulas CD138+ en el plasma disminuyen despues del tratamiento con el cOmPUESTO A. La dosis de 100 mg/kg del COMPUEsTo A impactado en las celulas plasmaticas tanto de corta como de larga vida en la medula osea (Figs. 39 y 41). Las tres dosis impactadas en el tiempo en que vivlan las celulas plasmaticas en el bazo (Fig. 40). Una seleccion de celulas plasmaticas de larga vida es importante porque estas celulas son diflciles de matar, son por lo general quimio y radio-resistentes, pueden sobrevivir durante muchas decadas dentro de la arquitectura de la medula osea y producen la mayorla de los autoanticuerpos en el LES.

REALIZACIONES PREFERIDAS

Las realizaciones preferidas de la presente invencion incluyen:

Realizacion 1: El COMPUESTO A para uso en el tratamiento del lupus en un sujeto.

Realizacion 2: El compuesto para uso de la realizacion 1, en el que el COMPUESTO A fue administrado por

via oral.

Realizacion 3: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 1000

mg/kg.

Realizacion 4: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

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COMPUESTO A se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg.

Realizacion 5: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg.

Realizacion 6: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTP A se administro en una dosis de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg.

Realizacion 7: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

Realizacion 8: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 55 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.

Realizacion 9: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el Compuesto A se administro en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg.

Realizacion 10: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 5 mg/kg.

Realizacion 11: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg.

Realizacion 12: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg.

Realizacion 13: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 100 mg/kg.

Realizacion 14: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1 g

Realizacion 15: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 500 mg.

Realizacion 16: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 1mg a aproximadamente 100 mg.

Realizacion 17: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg.

Realizacion 18: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 30 mg.

Realizacion 19: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 20 mg.

Realizacion 20: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 1 mg.

Realizacion 21: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 5 mg.

Realizacion 22: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 10 mg.

Realizacion 23: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 20 mg.

Realizacion 24: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 30 mg.

Realizacion 25: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

COMPUESTO A se: administro en una dosis de aproximadamente 40 mg.

Realizacion 26: El: compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el

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COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 50 mg.

Realizacion 27: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 100 mg.

Realizacion 28: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 2, en el que el COMPUESTO A se administro en una dosis de aproximadamente 200 mg.

Realizacion 29: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 28, en el que el sujeto experimenta una disminucion en linfomegalla durante el tratamiento.

Realizacion 30: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 29, en el que el sujeto experimenta una disminucion de la esplenomegalia durante el tratamiento.

Realizacion 31: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 30, en el que el sujeto experimenta una disminucion en los recuentos de leucocitos del bazo durante el tratamiento.

Realizacion 32: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 31, en el que el sujeto experimenta una disminucion en el suero IL-12 durante el tratamiento.

Realizacion 33: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 32, en el que el sujeto experimenta un aumento en suero C3 durante el tratamiento.

Realizacion 34: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 33, en el que el sujeto experimenta una disminucion en la celularidad glomerular del rinon durante el tratamiento.

Realizacion 35: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 34, en el que el sujeto experimenta una disminucion de la infiltracion intersticial renal durante el tratamiento.

Realizacion 36: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 35, en el que el sujeto experimenta una disminucion de pSTAT3 en el rinon durante el tratamiento.

Realizacion 37: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 36, en el que el sujeto experimenta una disminucion de las celulas plasmaticas del bazo durante el tratamiento.

Realizacion 38: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 37, en el que el sujeto experimenta una disminucion de los anticuerpos antinucleares sericos durante el tratamiento.

Realizacion 39: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 38, en el que el sujeto experimenta una disminucion de anticuerpos antinucleares anti-dsDNA sericos durante el tratamiento.

Realizacion 40: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 39 experimenta una disminucion de IFNa en suero durante el tratamiento.

Realizacion 41: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 40 experimenta una disminucion de la proteinuria durante el tratamiento.

Realizacion 42: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 41 experimenta una disminucion de infiltraciones pulmonares durante el tratamiento.

Realizacion 43: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 42 experimenta una disminucion de IL-17A en suero durante el tratamiento.

Realizacion 44: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 43 experimenta una disminucion de IL-6 en suero durante el tratamiento.

Realizacion 45: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 44 experimenta una disminucion en suero CCL3/MIP-1a durante el tratamiento.

Realizacion 46: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 45 experimenta una disminucion en suero CXCL10/IP-10 durante el tratamiento.

Realizacion 47: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 46 experimenta una disminucion de CXCL9/MIG en suero durante el tratamiento.

Realizacion 48: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 47

en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto en el que el sujeto

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experimenta una disminucion de IL-4 en suero durante el tratamiento.

Realizacion 49: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 48, en el que el sujeto experimenta una disminucion de IL-13 en suero durante el tratamiento.

Realizacion 50: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 49, en el que el sujeto experimenta una disminucion de TNFa en suero durante el tratamiento.

Realizacion 51: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 50, en el que el sujeto experimenta una disminucion de KC/IL-8 en suero durante el tratamiento.

Realizacion 52: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 51, en el que el sujeto experimenta una disminucion de CTx en suero durante el tratamiento.

Realizacion 53: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 52, en el que el sujeto es un humano.

Realizacion 54:: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 53, en el que el

COMPUESTO A: se administro una vez al dla.

Realizacion 55:: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 53, en el que el

COMPUESTO A: se administro dos veces al dla.

Realizacion 56:: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 53, en el que el

COMPUESTO A: se administro tres veces al dla.

Realizacion 57:: El compuesto para el uso de cualquiera de las realizaciones 1 a 53, en el que el

COMPUESTO A se administro cuatro veces al dla.

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Claims

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Reivindicaciones

1. Un compuesto que tiene la formula

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o una sal del mismo en el uso del tratamiento de lupus en un sujeto en necesidad del mismo.
2. El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el sujeto es un humano.
3.
4.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra por via oral.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra una vez al dla.
5.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra dos veces al dla.
6.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis en un intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.
7. El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg.
8. El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis de aproximadamente 50 mg/kg.
9. El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g.
10.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg.
11.

El compuesto en el uso del tratamiento de lupus segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto se administra en una dosis de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 30 mg.
12. El compuesto en el uso del tratamiento de lupus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que el sujeto experimenta una disminucion de la IL-12 en suero, rinon pSTAT3, celulas plasmaticas del bazo, los anticuerpos antinucleares sericos, IFNa en suero o proteinuria durante su tratamiento.