ES2582288B1 - Método de detección de predisposición a padecer cardiopatía dilatada - Google Patents

Método de detección de predisposición a padecer cardiopatía dilatada Download PDF

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Abstract

Método de detección de predisposición a padecer cardiopatía dilatada.#La presente invención se refiere a un método para detectar la susceptibilidad a padecer miocardiopatía dilatada en un sujeto o en sus familiares que comprende la detección de la mutación c.77T>C del gen EMD. Además también se refiere a un kit para detectar dicha mutación y al uso del mismo para dicho fin.

Description

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Metodo de deteccion de predisposicion a padecer cardiopatia dilatada
DESCRIPCION
La presente invencion se refiere a un metodo para detectar la susceptibilidad a padecer cardiopatia dilatada en un sujeto. Por lo tanto, la presente invencion se podria encuadrar en el campo de la biomedicina.
ESTADO DE LA TECNICA
La miocardiopatia dilatada (MCD) es la causa mas frecuente de insuficiencia cardiaca en jovenes y la causa mas frecuente de trasplante cardiaco (TxC) en el mundo. Diversos estudios mediante despistaje clmico y ecocardiografico de familiares de pacientes con MCD han mostrado que hasta un 50% de los casos de MCD son de origen familiar y, por tanto, tienen una base genetica.
Hasta la fecha, mas de 40 genes distintos se han relacionado con la MCD (Garda- Pavia P et al. 2013 Biomarkers Med 7(4):517-533). Sin embargo, cada uno de los genes descritos hasta la fecha solo es responsable de un pequeno porcentaje de los casos de MCD. Por tanto, existen otros genes por descubrir relacionados con esta patologia.El alto numero de genes relacionados con esta enfermedad ha hecho muy dificil el estudio genetico de pacientes con MCD asi como la busqueda de nuevos genes implicados. Asimismo, el gran numero de genes a analizar ha limitado hasta la fecha la aplicacion de estrategias de screening genetico a nivel clmico.
Uno de los genes relacionados con la MCD es el gen que codifica para la protema emerina, el gen EMD. Las mutaciones en el gen EMD son una causa muy infrecuente de MCD (<1% de los casos) (Arbustini E, Narula N, Dec GW, et al. The MOGE(S) Classification for a Phenotype-Genotype Nomenclature of Cardiomyopathy: Endorsed by the World Heart Federation. J Am Coll Cardiol 2013;62:2046-72). Las mutaciones en EMD tambien se asocian a defectos en el sistema de conduccion cardiaco que pueden dar lugar a muerte subita y a patologia muscular. La emerina es una protema de la membrana interna del nucleo. El gen EMD esta compuesto por seis exones y se localiza en el cromosoma Xq28 (Koch AJ, Holaska JM. Emerin in health and disease. Semin Cell Dev Biol. 2014 May;29:95-106).
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Se han descrito mutaciones en este gen asociadas a la MCD pero el screening de este gen no se hace de manera rutinaria para la detection de la predisposition genetica de la MCD (Zhang M et al. 2014 BMC Medical Genetics 15:77; Meinke P et al. 2014 Neuromuscul Disord doi: 10.1016/j.nmd.2014.09.012).
Actualmente existen metodos de diagnostico que detectan si un individuo es portador de una determinada enfermedad o si presenta predisposicion genetica a padecerla, como por ejemplo para la fibrosis quistica o la hemocromatosis. Sin embargo, hace falta un metodo de deteccion de la predisposicion genetica a padecer la MCD, util tanto para la deteccion en el propio individuo posiblemente afectado como para predecir si sus descendientes o familiares tambien van a ser susceptibles de padecer dicha enfermedad.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
En la presente invention se demuestra que la mutation en el gen EMD c.77T>C produce MCD. La deteccion de esta mutacion es util tanto en hombres como en mujeres. Se demuestra la utilidad de la deteccion de la mutacion c.77T>C en el gen EMD para establecer el estado de portador en un sujeto y, por lo tanto, determinar la susceptibilidad genetica a padecer MCD.
En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para proporcionar datos (datos utiles) para detectar la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares que comprende la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD en una muestra biologica aislada. En adelante nos referiremos a el como al "metodo primero de la invencion”.
El termino "susceptibilidad genetica” se refiere a la predisposicion genetica a desarrollar un determinado fenotipo debido a su dotation genetica, es decir, a la presencia de una alteration (cambio o mutacion) genetica. En la presente invencion, se refiere a la predisposicion a padecer miocardiopatia dilatada. Los individuos con dicha susceptibilidad tienen mayor probabilidad de desarrollar esta enfermedad.
En la presente invencion se entiende por miocardiopatia dilatada (MCD) a la dilatation y disfuncion sistolica del ventriculo izquierdo o de ambos ventriculos del corazon en ausencia de cardiopatia isquemica o condiciones hemodinamicas que provoquen
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sobrecarga del corazon. (Elliott P, et al. Classification of the cardiomyopathies: a position statement from the European Society Of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. Eur Heart J
La mutacion c.77T>C del gen EMD (en la posicion 77 del ADN codificante, contando a partir del ATG) (localization cromosomica g.153607921T>C; NC_000023.10;
NM_000117.2), produce la mutacion p.Val26Ala en la protema (NP_000108.1). En la presente invention se demuestra que la mutacion c.77T>C del gen EMD es prevalente entre pacientes aquejados de MCD. En adelante, nos referiremos a la mutacion c.77T>C del gen EMD como a la "mutacion de la invencion”.
El termino "muestra biologica” en la presente invencion se refiere a cualquier muestra que permita analizar el gen EMD del individuo del que se ha obtenido dicha muestra, e incluye, pero sin limitarnos, fluidos biologicos o tejidos de un individuo, obtenidos mediante cualquier metodo conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biologica comprende acido desoxirribonucleico (ADN), ADN genomico, ADN codificante, acido ribonucleico (ARN) y/o protema. La muestra biologica podria ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, saliva, orina, liquido sinovial o linfa. Tambien puede ser una muestra de tejido.
La muestra biologica en la presente invencion puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. La muestra biologica ademas se puede provenir de extracciones realizadas de forma rutinaria en analisis que se pueden realizar periodicamente a los pacientes.
En la presente invencion los terminos "sujeto”, "individuo” y "paciente” se usan indistintamente.
Un segundo aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro para detectar la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares que comprende la detection de la mutacion c.77T>C del gen EMD y donde la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD es indicativa de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en dicho sujeto o en sus familiares. En adelante nos referiremos a el como al "metodo segundo de la invencion”.
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El termino “in vitro” se refiere a que el metodo de la invention se realiza fuera del cuerpo del sujeto. La detection se hace por lo tanto en una muestra biologica aislada del sujeto.
Se entiende por “familiares” en la presente invencion a los individuos que presenten cualquier grado de consanguinidad con el sujeto analizado, por ejemplo, descendientes (hijos, nietos, bisnietos, tataranietos), hermanos, padres, etc. Tanto hombres como mujeres. En el caso de los descendientes estos pueden ser nacidos o no nacidos.
Los metodos de la invencion permiten disponer de information util para la toma de decisiones terapeuticas, permitiendo seleccionar a los pacientes con mayor probabilidad de necesitar seguimiento y tratamiento de la MCD. El tratamiento de la MCD incluye diversos farmacos como son los inhibidores del enzima convertidor de angiotensina, los antagonistas de los receptores de la angiotensina, los inhibidores de la aldosterona o los beta-bloqueantes. Asimismo en los casos mas graves de MCD puede ser necesario realizar un trasplante cardiaco.
Conocer quien dentro de una familia es portador de la mutation deriva en un abaratamiento de los costes directos e indirectos de la enfermedad (ya que no es necesario seguir a los sujetos no portadores) y permite tomar decisiones en relacion a la actividad laboral, planificacion de vida y actitud reproductiva.
La presente invencion tambien permite realizar un diagnostico prenatal e preimplantacional con el fin de evitar la trasmision de la mutacion a descendientes en el caso en el que al menos uno de los padres sea portador de la mutacion de la invencion.
Por este motivo la presente invencion tambien se refiere a un metodo in vitro para realizar un seguimiento o disenar un tratamiento individualizado para un sujeto que comprende detectar si la mutacion c.77T>C esta presente en una muestra biologica de dicho sujeto; en el que la presencia de la mutacion es indicativa de que el sujeto precisa seguimiento y/o tratamiento (en funcion de si ya ha desarrollado la MCD). El tratamiento de la MCD comprende al menos uno de los tratamientos seleccionados de la lista que consiste en: inhibidor del enzima convertidor de angiotensina, un antagonista de los receptores de la angiotensina, un inhibidor de la aldosterona o los
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beta-bloqueantes o cualquiera de sus combinaciones. Asimismo en los casos mas graves de MCD puede ser necesario realizar un trasplante cardiaco. En adelante nos referiremos a este como al “metodo tercero de la invention”.
Se entiende por “tratamiento” al conjunto de medios que se emplean para curar o aliviar una enfermedad. En la presente invencion el tratamiento a administrar son farmacos o realization de intervenciones (trasplante cardiaco) como se ha indicado anteriormente.
Tanto en el metodo primero, como en el segundo, como en el tercero de la invencion el sujeto preferiblemente es un humano. Mas preferiblemente, el sujeto es un hombre o una mujer.
La mutation c.77T>C del gen EMD puede ser detectada mediante tecnicas generales de biologia molecular, como pueden ser la tecnica de amplification de ADN por reaction en cadena de la polimerasa (PCR); o PCR seguida de una reaction de extension de primer; o por una tecnica de secuenciacion del fragmento de ADN amplificado por PCR; o por hibridacion. Tambien podria detectarse por tecnicas de secuenciacion masiva de nueva generacion.
Por este motivo, una realizacion preferida del primer y segundo aspecto de la invencion se refiere al metodo donde la detection de la mutacion c.77T>C del gen EMD se realiza mediante PCR, secuenciacion, hibridacion o cualquiera de sus combinaciones.
La deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD puede ser realizada en el ADN codificante, el ADN genomico, en el ARN mensajero o en la protema emerina (donde se detecta la mutacion p.Val26Ala).
La deteccion puede realizarse mediante el empleo de cebadores (preferiblemente los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2), sondas o anticuerpos.
El termino “cebador” (tambien denominado “primer”u “oligo”), como se utiliza aqui, se refiere a un oligonucleotido capaz de actuar como punto de inicio de la smtesis de ADN cuando hibrida con el acido nucleico molde. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleotido de desoxirribosa. Los cebadores pueden prepararse mediante
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cualquier metodo adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la donation y restriction de secuencias apropiadas y la smtesis qtimica directa. Los cebadores pueden disenarse para hibridar con secuencias espedficas de nucleotidos en el acido nucleico molde (cebadores espetificos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
De acuerdo con la presente invention un “cebador” puede ser marcado o etiquetado mediante tecnicas bien conocidas en el estado de la tecnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isotopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimaticas.
El termino “secuenciacion”, tal y como se utiliza en la presente description, se refiere a la determination de los nucleotidos de un acido nucleico molde y de su orden.
Las condiciones en las cuales se realiza la secuenciacion generalmente incluyen (a) poner en contacto un acido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que ademas comprende un cebador, un cation bivalente (por ejemplo, Mg2+), y nucleotidos, generalmente, dNTPs y al menos, un ddNTP (dideoxinucleotido trifostato), y (b) someter dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporation de los nucleotidos al cebador mediante complementariedad de bases con el acido nucleico molde, y de lugar a una poblacion de moleculas de ADN complementario de diferente tamano. La separation de dicha poblacion de moleculas de ADN complementario, generalmente, mediante electroforesis, permite determinar la secuencia de nucleotidos.
El termino “amplification”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere al aumento del numero de copias de un acido nucleico molde.
El termino “acido nucleico molde” o “molde”, tal y como se utiliza en la presente descripcion, se refiere a una molecula de acido nucleico de cadena simple o de doble cadena que va a ser amplificada o secuenciada.
Las condiciones en las cuales se realiza la amplification generalmente incluyen (a) poner en contacto un acido nucleico molde con una polimerasa en una mezcla que ademas comprende al menos un cebador (siendo normalmente dos cebadores), un cation bivalente (por ejemplo, Mg2+), y nucleotidos, generalmente, dNTPs (b) someter
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dicha mezcla a una temperatura suficiente para que la polimerasa inicie la incorporation de los nucleotidos al cebador mediante complementariedad de bases con el acido nucleico molde, y de lugar a una poblacion de moleculas de ADN complementary generalmente del mismo tamano.
El termino "hibridacion”, tal y como es conocido por el experto en la materia, se refiere a la union de dos cadenas de acidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una unica molecula de doble cadena.
Un tercer aspecto de la invention se refiere al uso in vitro de la mutation c.77T>C del gen EMD como biomarcador para la detection de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares.
En la presente invencion se entiende como "biomarcador” (marcador genetico) a una secuencia de ADN (en este caso la mutacion de la invencion) que puede ser utilizada para identificar la predisposition a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares.
Un cuarto aspecto de la invencion se refiere a un kit que comprende cebadores, sondas o anticuerpos espedficos para la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD.
Una realization mas preferida del cuarto aspecto de la invencion se refiere al kit que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Preferiblemente el kit consiste en los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
El kit tambien puede incluir al menos uno de los reactivos seleccionado de la lista que consiste en: una transcriptasa, una ARN polimerasa o un fluoroforo, una mezcla de desoxinucleotidos trifosfato (dNTPs), una mezcla de nucleotidos trifosfato (NTP), desoxirribonucleasa inversa (DNasa), inhibidores de la ribonucleasa (RNasa), ditiotreitol (DTT), pirofosfatasa inorganica (PPI) y tampones.
Ademas, en la presente invencion las sondas, cebadores o los anticuerpos se pueden encontrar sobre un soporte solido, por ejemplo, pero no limitado a: vidrio, plastico, tubos, de multiples pocillos placas, membranas, soportes de silicio, soportes de
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plastico, discos compactos, filtros, capas de gel, soportes metalicos, un dispositivo, cualquier otro soporte conocido, o una mezcla de ellos.
La presente invencion tambien se refiere al dispositivo que comprenda las sondas, cebadores, preferiblemente los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o los anticuerpos espedficos para la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD, asi como su uso para dicho fin.
La sonda o cebador espedfico (ADN de origen no natural) utilizado en la presente invencion se pueden modificar, por ejemplo, con marcadores adecuados para su deteccion o modificados qdmicamente. Tales etiquetas pueden ser todo lo conocido por el experto en el campo, por ejemplo, fluoroforos, isotopos radiactivos, moleculas para la identificacion inmunologica o quenchers. Los ejemplos no limitantes de marcadores fluorescentes que se pueden utilizar en el contexto de la presente invencion incluyen: FAM ™, VIC®, HEX ™, TET ™, Cy3, CY5.5, JOE ™, ROX ™, Cascade Blue®, fluorescema, ficoeritrina, Texas Red®, rodamina, rodamina verde, rodamina roja, rodamina 6G, 6-TAMRA, 5-TMRIA, Alexa Fluor® (por ejemplo, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 594), BODIPY® , etc. Ejemplos de quenchers son, sin limitarse a los mismos, rojo de metilo, ElleQuencher, Dabcilo, DABSYL, TAMRA, etc. En la presente invencion, "quencher" se entiende que significa una molecula que acepta energia de un fluoroforo y lo disipa en forma de calor o de fluorescencia. Los isotopos radiactivos pueden ser por ejemplo de fosforo-32 o tritio. Como moleculas para la identificacion inmunologica, se puede utilizar cualquier molecula conocida por el experto en el campo, por ejemplo digoxigenina.
La longitud de las sondas o cebadores espedficos puede ser de cualquier longitud, preferiblemente la longitud es de entre 10 y 50 nucleotidos, preferiblemente entre 15 a 25 nucleotidos, mas preferiblemente entre 18 o 22 nucleotidos.
Un quinto aspecto de la invencion se refiere al uso del kit del cuarto aspecto de la invencion para la deteccion de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares.
Una realizacion preferida del quinto aspecto de la invencion se refiere al uso donde el sujeto es un humano. Mas preferiblemente, el sujeto es un hombre o una mujer.
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A lo largo de la description y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invention se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invention. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1 Gel de agarosa al 1% tenido con bromuro de etidio al 6% tras la amplification por PCR de tres pacientes portadores de la mutation en el nucleotido 77 del EMD (lmeas 2 a 4) y un sujeto control no portador de la mutacion (lmea 5). En la lmea 1 se muestra el marcador de peso molecular y en la lmea 6 el control negativo de PCR (agua en lugar de ADN genomico).
FIG. 2 Secuenciacion de la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el nucleotido 77 del gen EMD en los sujetos afectos (17342, 17363 y 17365) o no (P1) por la mutacion. El recuadro negro indica el triplete mutado en los pacientes afectos.
EJEMPLOS
A continuation se ilustrara la invencion mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invencion.
Describimos aqu el metodo diagnostico basico que puede ser realizado por medio de una pareja de primers (cebadores) y las condiciones de PCR que permiten la amplificacion del fragmento de DNA en el que se localiza la mutacion c.77T>C del gen EMD.
Se analizo la presencia de la mutacion c.77T>C del gen EMD en 13 pacientes con MCD y en 40 familiares de estos (tanto hombres como mujeres).
La extraction de ADN de la muestra biologica del sujeto se realizo mediante un kit comercial de extraccion de ADN (Wizard® Genomic DNA Purification de Promega). La muestra biologica fue sangre periferica.
Posteriormente, se amplified la region del ADN que contiene el nucleotido 77 del gen EMD mediante el empleo de los siguientes cebadores:
Fw CTGCGCCGGTACAACAT (SEQ ID NO: 1)
Rv TCTGGGTCTCGTACTCGAAGA (SEQ ID NO: 2)
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Para ello se preparo la mezcla de reactivos de la PCR en cantidad suficiente para (c.s.p.) todas las muestras que se iban a analizar, sin incluir el ADN del paciente en la mezcla, de la siguiente manera:
10 Tabla 1:
Reactivo
Concentration madre Concentracion final Volumen por muestra
MasterMix (contiene la
2,5x 1x 9,8jl
polimerasa Taq)
Primer Fw + Rv
150jM (para 7,5|jM 0,5jl de cada
cada uno) cebador
dH2O
c.s.p. 20jl
(dH2O: agua destilada)Finalmente se anadieron80-100ng de ADN genomico del paciente a testar.
En presencia de estos cebadores se sometioal ADN del paciente a un proceso de 15 amplification usando un termociclador estandar.
Las condiciones de amplificacion del fragmento fueron las siguientes:
Tabla 2:
Fase
Temperatura Tiempo
Activation polimerasa
950C 10min
Desnaturalizacion ADN
950C 30s
Hibridacion cebadores
600C 30s 37 ciclos
Extension fragmento ADN
720C 30s .
Elongacion final
720C 10miri25
Mantenimiento
40C 00
El producto amplificado de ADN incluia el fragmento de ADN que contiene el nucleotido 77 del gen EMD, contando a partir del codon de initiation de la traduction
(ATG) (figura 1) en el 100% de las muestras testadas. El fragmento de ADN amplificado tenia un peso de 242pb (pares de bases).Como control positivo utilizamos un paciente no portador de la mutacion en el gen EMD (P1) y como control negativo, agua. Este fragmento se analizo mediante secuenciacion directa (figura 2). La 5 secuencia de nucleotidos de las muestras de ADN amplificado por PCR se realizo utilizando la tecnica de BigDye ® Terminator v3.1.
La mutacion c.77T>C fue testada en 40 sujetos procedentes de 9 familias de sujetos con MCD y se comprobo que todos los sujetos que padedan MCD eran portadores de 10 la mutacion mientras que ningun sujeto no portador padeda MCD. En base a estos hallazgos y la ausencia de otra mutacion causal en otros genes relacionados con MCD en los sujetos mdice de cada familia, se considera que la mutacion c.77T>C cosegrega con la enfermedad en estas familias y es causal de la cardiopatia en ellas.
15

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para proporcionar datos para detectar la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares que comprende la detection de la mutation c.77T>C del gen EMD en una muestra aislada.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1 donde el sujeto es un humano.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 2 donde el sujeto es un hombre o una mujer.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la muestra biologica
    se selecciona de la lista que consiste en: tejido, sangre, plasma, suero, saliva, orina o linfa.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4 donde la muestra es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.
  6. 6. Metodo in vitro para detectar la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares que comprende la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD y donde la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD es indicativa de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en dicho sujeto o en sus familiares.
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 6 donde el sujeto es un humano.
  8. 8. Metodo segun la reivindicacion 7 donde el sujeto es un hombre o una mujer.
  9. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD se realiza mediante PCR, secuenciacion, hibridacion o cualquiera de sus combinaciones.
  10. 10. Uso in vitro de la mutacion c.77T>C del gen EMD como biomarcador para la deteccion de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares.
  11. 11. Kit o dispositivo que comprende los cebadores, sondas o anticuerpos espedficos para la deteccion de la mutacion c.77T>C del gen EMD.
  12. 12. Kit o dispositivo segun la reivindicacion 11 que comprende los cebadores de secuencia SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
    10
  13. 13. Uso del kit segun cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 para la deteccion de la susceptibilidad genetica a padecer miocardiopatia dilatada en un sujeto o en sus familiares.
  14. 14. Uso segun la reivindicacion 13 donde el sujeto es un humano.
    15
  15. 15. Uso segun la reivindicacion 14 donde el sujeto es un hombre o una mujer.
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