ES2577109T3 - Compuestos heterocíclicos y sus usos - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado entre**Fórmula** o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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DESCRIPCIÓN

Compuestos heterocíclicos y sus usos

5 La presente invención se refiere generalmente a enzimas de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y, más particularmente, a inhibidores selectivos de la actividad de PI3K y a métodos de uso de tales materiales.

Antecedentes de la invención

La señalización celular a través de fosfoinosítidos 3'-fosforilados se ha visto implicada en una diversidad de procesos celulares, por ejemplo, transformación maligna, señalización del factor de crecimiento, inflamación e inmunidad (véase Rameh et al., J. Biol Chem, 274: 8347-8350 (1999) para una revisión). La enzima responsable de la generación de estos productos de señalización fosforilados, la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI 3-quinasa; PI3K), se identificó originalmente como una actividad asociada con oncoproteínas virales y tirosina quinasas del receptor del

15 factor de crecimiento que fosforila el fosfatidilinositol (PI) y sus derivados fosforilados el 3'-hidroxilo del anillo de inositol (Panayotou et al., Trends Cell Biol 2: 358-60 (1992)).

Los niveles de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3), el producto primario de activación de la PI 3-quinasa, aumentan tras el tratamiento de las células con una diversidad de estímulos. Esto incluye la señalización a través de receptores para la mayoría de los factores de crecimiento y muchos estímulos inflamatorios, hormonas, neurotransmisores y antígenos, y por lo tanto la activación de las PI3K representa uno, si no el más frecuente, de los sucesos de transducción de señales asociados con la activación del receptor de la superficie celular de mamíferos (Cantley, Science 296: 1655-1657 (2002); Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem, 70: 535-602 (2001)). Por lo tanto, la activación de la PI 3-quinasa está implicada en una amplia gama de respuestas celulares que incluyen 25 crecimiento celular, migración, diferenciación y apoptosis (Parker et al., Current Biology, 5: 577-99 (1995); Yao et al., Science, 267: 2003-05 (1995)). Aunque las dianas cadena abajo de los lípidos fosforilados generados después de la activación de la PI 3-quinasa no se han caracterizado completamente, se sabe que las proteínas que contienen dominios de homología de pleckstrina y dominios de dedos de FYVE (PH) se activan cuando se unen a varios lípidos de fosfatidilinositol (Sternmark et al., J Cell Sci, 112: 4175-83 (1999); Lemmon et al., Trends Cell Biol, 7: 237-42 (1997)). Dos grupos de dominio PH que contienen efectores de PI3K se han estudiado en el contexto de la señalización de células inmunes, los miembros de la familia TEC de tirosina quinasa y las serina/treonina quinasas de la familia AGC. Los miembros de la familia Tec contienen dominios PH con selectividad aparente para Ptdlns (3,4,5)P3 incluyen Tec, Btk, Itk y Etk. La unión de PH a PIP3 es fundamental para la actividad de tirosina quinasa de los miembros de la familia Tec (Schaeffer y Schwartzberg, Curr. Opin. Immunol. 12: 282-288 (2000)). Los miembros

35 de la familia AGC que están regulados por la PI3K incluyen la quinasa dependiente de fosfoinosítido (PDK1), AKT (también denominado PKB) y ciertas isoformas de la proteína quinasa C (PKC) y S6 quinasa. Hay tres isoformas de AKT y la activación de AKT se asocia fuertemente con la proliferación dependiente de PI3K y señales de supervivencia. La activación de AKT depende de la fosforilación de PDK1, que también tiene un dominio PH selectivo de 3 fosfoinosítido para reclutarla a la membrana en la que interactúa con AKT. Otros sustratos de PDK1 importantes son PKC y S6 quinasa (Deane y Fruman, Annu. Rev. Immunol. 22563-598 (2004)). In vitro, algunas isoformas de la proteína quinasa C (PKC) están activadas directamente por PIP3, (Burgering et al., Nature, 376: 599602 (1995)).

En la actualidad, la familia de la enzima PI 3-quinasa se ha dividido en tres clases basándose en sus especificidades

45 de sustrato. Las PI3K de Clase I pueden fosforilar fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol-4-fosfato, y fosfatidilinositol4,5-bifosfato (PIP2) para producir fosfatidilinositol-3-fosfato (PIP), fosfatidilinositol-3,4-bifosfato, y fosfatidilinositol3,4,5-trifosfato, respectivamente. Las PI3K de Clase II fosforilan PI y fosfatidilinositol-4-fosfato, mientras que las PI3K de Clase III solamente pueden fosforilar PI.

La purificación inicial y la clonación molecular de la PI 3-quinasa reveló que era un heterodímero que consiste en subunidades p85 y P110 (Otsu et al., Cell, 65: 91-104 (1991); Hiles et al., Cell, 70: 419-29 (1992)). Desde entonces, se han identificado cuatro PI3K de Clase I distinta, denominadas PI3Kα, β, γ, y δ, cada una de las cuales consiste en una subunidad catalítica distinta de 110 kDa y una subunidad reguladora. De forma más específica, tres de las subunidades catalíticas, es decir, p110α, p110β y p110δ, cada una interactúa con la misma subunidad reguladora,

55 p85; mientras que p110γ interactúa con una subunidad reguladora distinta, p101. Como se describe a continuación, los patrones de expresión de cada uno de estas PI3K en células y tejidos humanos también son distintos. A pesar de una gran cantidad de información que se ha acumulado en el pasado reciente sobre las funciones celulares de las PI 3-quinasas en general, las funciones desempeñadas por las isoformas individuales no se entienden completamente.

La clonación de p110α bovino se ha descrito. Esta proteína se identificó como relacionada con la proteína de Saccharomyces cerevisiae: Vps34p, una proteína implicada en el procesamiento de la proteína vacuolar. También se demostró que el producto de p110α recombinante se asocia con p85α, para producir una actividad de PI3K en células COS-1 transfectadas. Véase Hiles et al., Cell, 70, 419-29 (1992).

65 La clonación de una segunda isoforma p110 humana, denominada p110β, se describe en Hu et al., Mol Biol Cell, 13: 7677-88 (1993). Se dice que esta isoforma está asociada con p85 en células, y que se expresa de forma ubicua, como ARNm de p110β se ha encontrado en numerosos tejidos humanos y de ratón, así como en células endoteliales de la vena umbilical humana, leucemia de linfocitos T humanos de Jurkat, células 293 de riñón embrionario humano, fibroblastos 3T3 de ratón, células HeLa, y células de carcinoma de vejiga de rata NBT2. Tal expresión amplia sugiere que esta isoforma es muy importante en las rutas de señalización.

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5 La identificación de la isoforma p110δ de la PI 3-quinasa se describe en Chantry et al., J Biol Chem, 272: 19236-41 (1997). Se observó que la isoforma p110δ humana se expresa de una manera limitada al tejido. Se expresa a niveles elevados en linfocitos y tejidos linfoides y se ha mostrado que desempeña un papel fundamental en la señalización de PI 3-quinasa mediada en el sistema inmune (Al-Alwan et al. JI, 178: 2328-2335 (2007); Okkenhaug et al. JI, 177: 5122-5128 (2006); Lee et al., PNAS, 103: 1289-1294 (2006)). También se ha mostrado que p110δ se expresa a niveles más bajos en células de mama, melanocitos y células endoteliales (Vogt et al. Virology, 344: 131138 (2006) y desde entonces se ha visto implicada en conferir propiedades migratorias selectivas a las células de cáncer de mama (Sawyer et al,. Cancer Res. 63: 1667-1675 (2003)). Algunos detalles con respecto a la isoforma p110δ también se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos n.ºs 5.858.753; 5.822.910; y 5.985.589,

15 Véase también, Vanhaesebroeck et al., Proc Nat. Acad Sci USA, 94: 4330-5 (1997), y la publicación internacional WO 97/46688.

En cada uno de los subtipos PI3Kα, β, y δ, la subunidad p85 actúa para localizar la PI 3-quinasa en la membrana plasmática mediante la interacción de su dominio SH2 restos de de tirosina fosforilados (presentes en un contexto de secuencia apropiado) en proteínas diana (Rameh et al., Cell, 83: 821-30 (1995)). Se han identificado cinco isoformas de p85 (p85α, p85β, p55γ, p55α y p50α) codificadas por tres genes. Algunas transcripciones alternativas de Pik3rl codifican las proteínas p85α, p55α y p50α (Deane y Fruman, Annu. Rev. Immunol. 22: 563-598 (2004)). p85α se expresa de forma ubicua mientras que p85β, se encuentra principalmente en el cerebro y tejidos linfoides (Volinia et al., Oncogene, 7: 789-93 (1992)). La asociación de la subunidad p85 con las subunidades catalíticas de p110α, β, o

25 δ PI 3-quinasa parece ser necesaria para la actividad catalítica y la estabilidad de estas enzimas. Además, la unión de proteínas Ras también regula de forma positiva la actividad de la PI 3-quinasa.

La clonación de p110γ reveló una complejidad más adicional dentro de la familia PI3K de enzimas (Stoyanov et al., Science, 269: 690-93 (1995)). La isoforma p110γ está muy relacionada con p110α y p110β (identidad de un 45-48 % en el dominio catalítico), pero como se ha señalado no hace uso de p85 como una subunidad de orientación. En su lugar, p110γ se une a una subunidad reguladora p101 que también se une a las subunidades βγ de las proteínas G heterotriméricas. La subunidad reguladora P101 para PI3Kgamma se clonó originalmente en cerdos, y el ortólogo humano identificado posteriormente (Krugmann et al., J Biol Chem, 274: 17152-8 (1999)). Se sabe que la interacción entre la región N-terminal de p101 con la región N-terminal de p110γ activa PI3Kγ a través de Gβγ. Recientemente,

35 se ha identificado un homólogo de p101, p84 o P87PIKAP (proteína adaptadora de PI3Kγ de 87 kDa) que se une p110γ (Voigt et al. JBC, 281: 9977-9986 (2006), Suire et al. Curr. Biol. 15: 566-570 (2005)). p87PIKAP es homóloga con p101 en zonas que se unen p110γ y Gβγ y también media la activación de p110γ cadena debajo de los receptores acoplados a la proteína G. A diferencia de p101, p87PIKAP se expresa altamente en el corazón y puede ser fundamental para la función cardiaca de PI3Kγ.

Un polipéptido de PI3K constitutivamente activo se describe en la publicación internacional WO 96/25488. Esta publicación desvela la preparación de una proteína de fusión quimérica en la que un fragmento de 102 restos de p85 conocida como la región inter-SH2 (iSH2) se fusiona a través de una región conectora al extremo N-terminal de p110 murino. El dominio iSH2 de p85 es capaz aparentemente de activar la actividad de PI3K de una manera comparable

45 a p85 intacto (Klippel et al., Mol Cell Biol, 14: 2675-85 (1994)).

Por lo tanto, las PI 3-quinasas se pueden definir por su identidad de aminoácidos o por su actividad. Algunos miembros adicionales de esta familia genética creciente incluyen lípidos relacionados más alejados y proteína quinasas que incluyen Vps34 TORI, y TOR2 de Saccharomyces cerevisiae (y sus homólogos de mamífero tales como FRAP y mTOR), el producto genético de ataxia telangiectasia (ATR) y la subunidad catalítica de proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK). Véase, en general, Hunter, Cell, 83: 1-4 (1995).

La PI 3-quinasa también está implicada en una serie de aspectos de activación de leucocitos. Se ha demostrado que una actividad de PI 3-quinasa asociada a p85 está asociada físicamente con el dominio citoplásmico de CD28, que

55 es una molécula coestimuladora importante para la activación de los linfocitos T como respuesta al antígeno (Pages et al., Nature, 369: 327-29 (1994); Rudd, Immunity, 4: 527-34 (1996)). La activación de los linfocitos T a través de CD28 reduce el umbral de activación por antígeno y aumenta la magnitud y duración de la respuesta proliferativa. Estos efectos están relacionados con aumentos en la transcripción de un número de genes incluyendo la interleuquina-2 (IL2), un importante factor de crecimiento de linfocitos T (Fraser et al., Science, 251: 313-16 (1991)). La mutación de CD28 de modo que ya no pueda interactuar con PI 3-quinasa conduce a un fallo para iniciar la producción de IL2, lo que sugiere un papel crítico para la PI 3-quinasa en la activación de linfocitos T.

Algunos inhibidores específicos (WO 2012/003271) contra miembros individuales de una familia de enzimas proporcionan herramientas muy valiosas para descifrar las funciones de cada enzima. Dos compuestos, LY294002 y 65 wortmanina, se han usado ampliamente como inhibidores de PI 3-quinasa. Estos compuestos, sin embargo, son inhibidores de PI3K no específicos, ya que no distinguen entre los cuatro miembros de las PI 3-quinasas de Clase I.

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Por ejemplo, los valores de CI50 de wortmanina contra cada uno de las diversas PI 3-quinasas de Clase I están en el intervalo de 1-10 nM. De forma análoga, los valores de CI50 para LY294002 contra cada una de estas PI 3-quinasas es de aproximadamente 1 µM (Fruman et al., Ann Rev Biochem, 67: 481-507 (1998)). Por lo tanto, la utilidad de estos compuestos en el estudio de las funciones de las PI 3-quinasas de Clase I individuales es limitada.

5 Basándose en estudios que usan wortmanina, existen evidencias de que la función de la PI 3-quinasa también es necesaria para algunos aspectos de la señalización de leucocitos a través receptores acoplados a la proteína G (Thelen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 91: 4960-64 (1994)). Además, se ha mostrado que wortmanina y LY294002 bloquean la migración de neutrófilos y la liberación de superóxido. Sin embargo, puesto que estos compuestos no distinguen entre las diversas isoformas de PI3K, a partir de estos estudios no queda claro qué isoforma o isoformas de PI3K en particular están implicadas en estos fenómenos y qué funciones realizan las diferentes enzimas PI3K de Clase I tanto en tejidos normales como enfermos en general. La coexpresión de varias isoformas de PI3K en la mayoría de los tejidos ha frustrado los esfuerzos para separar las actividades de cada enzima hasta hace poco.

15 La separación de las actividades de las diversas isozimas PI3K ha avanzado recientemente con el desarrollo de ratones manipulados genéticamente que permitieron el estudio de ratones con desactivación genética y con activación genética de quinasa muerta específicas de isoforma y el desarrollo de inhibidores más selectivos para algunas de las diferentes isoformas. Se han generado ratones con desactivación genética p110α y p110β y ambos son letales embrionarios y se puede obtener poca información a partir de estos ratones en cuanto a la expresión y función de p110 alfa y beta (Bi et al. Mamm. Genome, 13: 169-172 (2002); Bi et al. J. Biol. Chem. 274: 10963-10968 (1999)). Más recientemente, se generaron ratones con activación genética de quinasa muerta p110α con una sola mutación puntual en el motivo DFG del bolsillo de unión de ATP (p110αD933) que deteriora la actividad de quinasa, pero conserva la expresión de quinasa p110α mutante. Al contrario que los ratones con desactivación genética, el enfoque de activación genética conserva la estequiometría compleja de la señalización, funciones de andamios e

25 imita a los enfoques de molécula pequeña de manera más realista que los ratones con desactivación genética. Del mismo modo que los ratones p110α KO, los ratones homocigotos p110αD933A son letales embrionarios. Sin embargo, los ratones heterocigotos son viables y fértiles pero presentan señalización severamente debilitada a través de proteínas de sustrato receptor de insulina (IRS), mediadores fundamentales de insulina, factor 1 de crecimiento similar a la insulina y acción de la leptina. La respuesta defectuosa a estas hormonas conduce a hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, hiperpagia, aumento de la adiposidad y reducción del crecimiento general en heterocigotos (Foukas, et al., Nature, 441: 366-370 (2006)). Estos estudios revelaron un papel no redundante, definido para p110α como un intermedio en la señalización de IGF-1, insulina y leptina que no está sustituido por otras isoformas. Los inventores tendrán que esperar a la descripción de la activación genética de la quinasa muerta p110α para comprender mejor la función de esta isoforma (los ratones se han preparado pero aún no se ha

35 publicado; Vanhaesebroeck).

Se han generado ratones con desactivación genética de p110γ y activación genética de quinasa muerta y en general muestran fenotipos similares y ligeros con defectos primarios en la migración de células del sistema inmune innato y un defecto en el desarrollo tímico de los linfocitos T (Li et al., Science, 287: 1046-1049 (2000), Sasaki et al., Science,

287: 1040-1046 (2000), Patrucco et al., Cell, 118: 375-387 (2004)).

Al igual que p110γ, se han preparado ratones con desactivación genética de PI3K delta y activación genética de quinasa muerta y son viables con fenotipos viables y ligeros. Los ratones con activación genética mutantes p110δD910A demostraron un papel importante para delta en el desarrollo y la función de linfocitos B, con linfocitos B y 45 células CD5 + Bl de la zona marginal casi indetectables, y señalización del receptor de antígeno de linfocitos B y T (Clayton et al., J. Exp. Med. 196: 753-763 (2002); Okkenhaug et al., Science, 297: 1031-1034 (2002)). Los ratones p110δD910A se han estudiado ampliamente y han dilucidado el papel diverso que desempeña delta en el sistema inmune. Las respuestas inmunes dependientes de linfocitos T e independientes de linfocitos T están seriamente atenuadas en p110δD910A y la secreción de TH1 (INF-γ) y citoquina TH2 (IL-4, IL-5) están afectadas (Okkenhaug et al., J. Immunol 177: 5122 -5128 (2006)). Un paciente humano con una mutación en p110δ también se ha descrito recientemente. Un niño taiwanés con una inmunodeficiencia de linfocitos B primarios y una gamma-hipoglobulinemia de etiología previamente desconocida presentaba una única sustitución de pares de bases, m.3256G para A en el codón 1021 en el exón 24 del p110δ. Esta mutación dio como resultado una sustitución de aminoácido en sentido erróneo (E a K) en el codón 1021, que se encuentra en el dominio catalítico altamente conservado de la proteína

55 p110δ. El paciente no tiene otras mutaciones identificadas y su fenotipo es coherente con la deficiencia de p110δ en ratones de acuerdo con lo que se ha estudiado. (Jou et al., Int. J. Immunogenet 33: 361-369 (2006)).

Algunos compuestos de molécula pequeña selectivos de isoforma variable se han desarrollado con éxito variable para todas las isoformas de PI3 quinasa de Clase I (Ito et al, J. Pharm Exp Therapeut, 321: 1-8 (2007)). Algunos inhibidores para alfa son deseables porque se han identificado mutaciones en p110α en varios tumores sólidos; por ejemplo, una mutación de amplificación de alfa se asocia con un 50 % de cáncer de ovario, cuello uterino, pulmón y mama y una mutación de activación se ha descrito en más de 50 % de cánceres de intestino y un 25 % de cánceres de mama (Hennessy et al., Nature Reviews , 4: 988-1004 (2005)). Yamanouchi ha desarrollado un compuesto, YM024, que inhibe alfa y delta de forma equipotente y es de 8 y 28 veces más selectivo con respecto a beta y gamma

65 respectivamente (Ito et al., J. Pharm. Exp. Therapeut, 321: 1-8 (2007)).

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P110β está implicada en la formación de trombos (Jackson et al., Nature Med 11: 507-514 (2005)) y se cree que algunos inhibidores de molécula pequeña específicos para esta isoforma se han concebido para indicación que implica trastornos de coagulación (TGX-221: 0,007 uM en beta; selectiva 14 veces con respecto a delta, y más de 500 veces más selectivo con respecto a gamma y alfa) (Ito et al., J. Pharm. Exp. Therapeut, 321: 1-8 (2007)).

5 Varios grupos están desarrollando algunos compuestos selectivos para p110γ como agentes inmunosupresores para enfermedad autoinmune (Rueckle et al., Nature Reviews, 5: 903-918 (2006)). Es de destacar que se ha demostrado que AS 605240 es eficaz en un modelo de ratón de artritis reumatoide (Camps et al., Nature Medicine, 11: 936-943 (2005)) y que retrasa el inicio de la enfermedad en un modelo de lupus sistémico eritematoso (Barber et al,. Nature

10 Medicine, 11: 933-935 (205)).

Recientemente también se han descrito algunos inhibidores selectivos de delta. Los compuestos más selectivos incluyen los inhibidores de purina quinazolinona (PIK39 e IC87114). IC87114 inhibe p110δ en el rango nanomolar elevado (tres dígitos) y tiene una selectividad superior a 100 veces frente a p110α, es 52 veces más selectivo frente

15 a p110β pero carece de selectividad frente a p110γ (aprox. 8 veces). No muestra ninguna actividad frente a ninguna proteína quinasa sometida a ensayo (Knight et al,. Cell, 125: 733-747 (2006)). Usando compuestos selectivos para delta o ratones manipulados genéticamente (p110δD910A) se demostró además de desempeñar un papel fundamental en la activación de los linfocitos B y T, delta también está parcialmente implicado en la migración de neutrófilos y en el estallido respiratorio de neutrófilos estimulado y conduce a un bloqueo parcial de la desgranulación de mastocitos

20 mediada por antígeno-IgE (Condliffe et al,. Blood, 106: 1432-1440 (2005); Ali et al,. Nature, 431: 1007-1011 (2002)). Por lo tanto p110δ está emergiendo como un importante mediador de muchas respuestas inflamatorias fundamentales que también se sabe que participan en afecciones inflamatorias anómalas, que incluyen, pero no se limitan a enfermedad autoinmune y alergia. Para apoyar esta idea, existe un creciente cuerpo de datos de validación de diana de p110δ a partir de estudios que usan tanto herramientas genéticas como agentes farmacológicos. Por lo

25 tanto, usando el compuesto IC 87114 selectivo de delta y ratones p110δD910A, Ali et al,. (Nature, 431: 1007-1011 (2002)) han demostrado que delta desempeña un papel fundamental en un modelo murino de enfermedad alérgica. En ausencia de delta funcional, la anafilaxis cutánea pasiva (PCA) se reduce de forma significativa y se puede atribuir a una reducción de la activación de mastocitos inducida por alergeno-IgE y desgranulación. Además, se ha demostrado que la inhibición de delta con IC 87114 mejora de forma significativa la inflamación y la enfermedad en

30 un modelo murino de asma usando inflamación de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina (Lee et al,. FASEB, 20: 455-465 (2006). Estos datos que utilizan el compuesto se corroboraron en ratones mutantes para p110δD910A usando el mismo modelo de inflamación de las vías respiratorias alérgica con un grupo diferente (Nashed et al,. Eur. J. Immunol. 37: 416-424 (2007)).

35 Existe una necesidad de caracterización adicional de la función de PI3Kδ en configuraciones inflamatorias y autoinmunes. Por otra parte, la comprensión de los inventores de PI3Kδ requiere una elaboración adicional de las interacciones estructurales de p110δ, tanto con su subunidad reguladora como con otras proteínas en la célula. También sigue habiendo una necesidad de inhibidores más potentes y selectivos o específicos de PI3K delta, para evitar una toxicología potencial asociada con la actividad de en isoenzimas p110 alfa (señalización de insulina) y

40 beta (activación de plaquetas). En particular, algunos inhibidores selectivos o específicos de PI3Kδ son deseables para explorar el papel de esta isoenzima adicionalmente y para el desarrollo de productos farmacéuticos superiores para modular la actividad de la isoenzima.

Sumario

45 La presente invención comprende nuevos compuestos que tienen propiedades y actividad biológica mejoradas en PI3Kδ humana.

Descripción detallada

50 Un aspecto de la invención se refiere a compuestos que tienen las estructuras

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15

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o cualquier sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar afecciones o trastornos mediados por PI3K.

En ciertas realizaciones, la afección o trastorno mediados por PI3K se selecciona entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias, y que enfermedades autoinmunes. En otras realizaciones, la afección o trastorno mediados por PI3K se selecciona entre enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis, hipertensión, trombosis venosa profunda, apoplejía, infarto de miocardio, angina inestable, tromboembolia, embolia pulmonar, enfermedades trombolíticas, isquemia arterial aguda, oclusiones trombóticas periféricas, y enfermedad arterial coronaria. En otras realizaciones más, la afección o trastornos mediados por PI3K se selecciona entre cáncer, cáncer de colon, glioblastoma, carcinoma endometrial, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, melanoma, carcinoma de células renales, carcinoma de tiroides, linfoma celular, trastornos linfoproliferativas, cáncer de pulmón microcítico, carcinoma de pulmón de células escamosas, glioma, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, y leucemia. En otra realización más, la afección o trastorno mediados por PI3K se selecciona entre diabetes del tipo II diabetes. En otras realizaciones más, la afección o trastornos mediados por PI3K se seleccionan entre enfermedades respiratorias, bronquitis, asma, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias o enfermedades autoinmunes que comprenden la etapa de administrar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad, que comprende la etapa de administrar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de cánceres que están mediados, dependen de un están asociados con la actividad de con p110δ, que comprende la etapa de administrar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere al tratamiento de cánceres seleccionados entre leucemia mieloide aguda, síndrome mielodisplásico, enfermedades mieloproliferativas, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B, linfoma no Hodgkins, linfoma de linfocitos B, tumores sólidos y cáncer de mama, que comprende la etapa de administrar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores o posteriores.

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Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo 5 con cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente y un diluyente vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente como un medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias, y enfermedades autoinmunes.

15 Los compuestos de la presente invención pueden tener en general varios centros asimétricos y por lo general se representan en forma de mezclas racémicas. La presente invención pretende incluir mezclas racémicas, mezclas parcialmente racémicas y enantiómeros y diastereómeros separados.

"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sal preparada con medios convencionales, y son bien conocidas por los expertos en la materia. Las "sales farmacológicamente aceptables" incluyen sales básicas de ácidos inorgánicos y orgánicos, que incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido málico, ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido fenilacético,

25 ácido mandélico y similares. Cuando los compuestos de la invención incluyen una función ácida tal como un grupo carboxi, entonces los expertos en la materia conocen bien algunos pares de cationes farmacéuticamente aceptables adecuados para el grupo carboxi incluyen cationes alcalinos, alcalinotérreos, amonio, amonio cuaternario y similares. Para ejemplos adicionales de "sales farmacológicamente aceptables", véase infra y Berge et al., J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977).

Por lo general "grupo saliente" se refiere a grupos que se pueden desplazar fácilmente por nucleófilo, tal como un nucleófilo de amina, un tiol o un alcohol. Tales grupos salientes se conocen bien en la técnica. Algunos ejemplos de tales grupos salientes incluyen, pero no se limitan a, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxibenzotriazol, haluros, triflatos, tosilatos y similares. Algunos grupos salientes preferentes se indican en el presente documento cuando sea 35 apropiado. Por lo general "grupo protector" se refiere a grupos bien conocidos en la técnica que se usan para evitar que algunos grupos reactivos seleccionados, tales como carboxi, amino, hidroxi, mercapto y similares, experimenten reacciones indeseadas, tales como nucleófilas, electrófilas, oxidación, reducción y similares. Algunos grupos protectores preferentes se indican en el presente documento cuando sea apropiado. Algunos ejemplos de grupos protectores de amino incluyen, pero no se limitan a, aralquilo, aralquilo sustituido, cicloalquenilalquilo y cicloalquenil alquilo sustituido, alilo, alilo sustituido, acilo, alcoxicarbonilo, aralcoxicarbonilo, sililo y similares. Algunos ejemplos de aralquilo incluyen, pero no se limitan a, bencilo, orto-metilbencilo, tritilo y benzhidrilo, que puede estar opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo, alcoxi, hidroxi, nitro, acilamino, acilo y similares, y sales, tales como sales de fosfonio y amonio. Algunos ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, indanilo, antracenilo, 9-(9-fenilfluorenilo), fenantrenilo, durenilo y similares. Algunos ejemplos de radicales cicloalquenilalquilo o cicloalquilenilalquilo sustituido, 45 que tienen preferentemente 6-10 átomos de carbono, incluyen, pero no se limitan a, ciclohexenil metilo y similares. Algunos grupos acilo, alcoxicarbonilo y aralcoxicarbonilo adecuados incluyen benciloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, isobutoxicarbonilo, benzoílo, benzoílo sustituido, butirilo, acetilo, trifluoroacetilo, tricloro acetilo, ftaloílo y similares. Una mezcla de grupos protectores se pueden usar para proteger el mismo grupo amino, tal como un grupo amino primario se puede proteger tanto con un grupo aralquilo como con un grupo aralcoxicarbonilo. Algunos grupos protectores de amino también pueden formar un anillo heterocíclico con el nitrógeno al que están unidos, por ejemplo, 1,2-bis(metilen)benceno, ftalimidilo, succinimidilo, maleimidilo y similares y en el que estos grupos heterocíclicos pueden incluir adicionalmente la unión a anillos de arilo y cicloalquilo. Además, los grupos heterocíclicos pueden estar mono-, di-o tri-sustituidos, tal como nitroftalimidilo. Algunos grupos amino también se pueden proteger frente a reacciones indeseadas, tales como oxidación, a través de la formación de una sal de 55 adición, tal como clorhidrato, ácido toluenosulfónico, ácido trifluoroacético y similares. muchos de los grupos protectores de amino también son adecuados para protección de grupos carboxi, hidroxi y mercapto. Por ejemplo, grupos aralquilo. Algunos grupos alquilo también son grupos adecuados para proteger grupos hidroxi y mercapto, tal como terc-butilo. Algunos grupos protectores de sililo son átomos de silicio opcionalmente sustituido con uno o más grupos alquilo, arilo y aralquilo. Algunos grupos protectores de sililo adecuados incluyen, pero no se limitan a, trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, terc-butildimetilsililo, dimetilfenilsililo, 1,2-bis(dimetilsilil)benceno, 1,2bis(dimetilsilil)etano y difenilmetilsililo. La sililación de un grupo amino proporciona grupos mono-o di-sililamino. La sililación de compuestos de aminoalcohol puede conducir a un derivado de N,N,O-trisililo. La retirada de la función sililo de una función silil éter se consigue fácilmente por tratamiento con, por ejemplo, un reactivo de hidróxido metálico o fluoruro de amonio, ya sea como una etapa de reacción separada o in situ durante una reacción con el 65 grupo alcohol. Algunos agentes de sililación adecuados son, por ejemplo, cloruro de trimetilsililo, cloruro de terc-butildimetilsililo, cloruro de fenildimetilsililo, cloruro de difenilmetil sililo o sus productos de combinación con imidazol o

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DMF. Los expertos en la materia conocen bien algunos métodos para sililación de aminas y retirada de grupos protectores de sililo. Los expertos en la técnica de la química orgánica también conocen bien algunos métodos de preparación de estos derivados de amina de los correspondientes aminoácidos, amidas de aminoácido o ésteres de aminoácido incluyendo química de aminoácido/éster de aminoácido o aminoalcohol.

Algunos grupos protectores se retiran en condiciones que no afectan a la parte restante de la molécula. Estos métodos se conocen bien en la técnica e incluyen hidrólisis ácida, hidrogenólisis y similares. Un método preferente implica la retirada de un grupo protector, tal como retirada de un grupo benciloxicarbonilo mediante hidrogenólisis utilizando paladio sobre carbono en un sistema disolvente adecuado tal como un alcohol, ácido acético, y similares o mezclas de los mismos. Un grupo protector de t-butoxicarbonilo se puede retirar utilizando un ácido inorgánico orgánico, tal como HCl o ácido trifluoroacético, en un sistema disolvente adecuado, tal como dioxano o cloruro de metileno. La sal de amino resultante se puede neutralizar fácilmente para producir la amina libre. El grupo protector de carboxi, tal como metilo, etilo, bencilo, terc-butilo, 4-metoxifenilmetilo y similares, se puede retirar en condiciones de hidrólisis e hidrogenólisis bien conocidas por los expertos en la materia.

Se debería indicar que los compuestos de la invención pueden contener grupos que pueden existir en formas tautoméricas, tales como grupos amidina y guanidina cíclicas y acíclicas, grupos heteroarilo sustituido con heteroátomo (Y' = O, S, NR), y similares, que se ilustran en los siguientes ejemplos:

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y aunque una forma se nombre, describa, presente y/o reivindique en el presente documento, se pretende que todas las formas tautoméricas estén incluidas de forma inherente bajo tal nombre, descripción, presentación y/o reivindicación.

Los profármacos de los compuestos de la presente invención donde se contemplan en esta invención. Un profármaco es un compuesto activo o inactivo que se modifica químicamente a través de acción fisiológica in vivo, tal como hidrólisis, metabolismo y similares, en un compuesto de la presente invención después de administración del profármaco a un paciente. La idoneidad y técnicas implicadas en la preparación y uso de profármaco s son bien conocidas por los expertos en la materia. Para un discusión general de profármacos que implican ésteres véase Svensson y Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) y Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985). Algunos ejemplos de un anión carboxilato enmascarado incluyen una diversidad de ésteres, tales como alquilo (por ejemplo, metilo, etilo), cicloalquilo (por ejemplo, ciclohexilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo, p-metoxibencilo), y alquilcarboniloxialquilo (por ejemplo, pivaloiloximetilo). Algunas aminas se han enmascarado como derivados sustituidos con arilcarboniloximetilo que se extinguen con esterasas in vivo liderando el fármaco libre y formaldehído (Bungaard J. Med. Chem. 2503 (1989)). Además, algunos fármacos que contienen un grupo NH ácido, tal como imidazol, imida, indol y similares, se han enmascarado con grupos N-aciloximetilo (Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)).

Algunos grupos hidroxi se han enmascarado como ésteres y éteres. El documento EP 039,051 (Sloan y Little, 4/11/81) desvela profármacos de base de Mannich y ácido hidroxámico, su preparación y uso.

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La memoria descriptiva y las reivindicaciones contienen listados de especies en los que se usa la expresión "seleccionado entre . . . y . . ." y "es . . . o . . ." (en ocasiones denominados grupos de Markush). Cuando estas expresiones se usan en la presente solicitud, a menos que se indique de otro modo, se hace referencia a que incluyen el grupo como un conjunto, o cualquier miembro individual del mismo, o cualquier subgrupo del mismo. El

5 uso de esta expresión es simplemente para fines simbólicos y en ningún modo pretende ser limitante de la retirada de elementos individuales o subgrupos si fuera necesario.

Experimental

10 Se usan las siguientes abreviaturas:

ac. -acuoso BINAP -2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo cond -concentrado

15 DCM diclorometano DMF -N,N-dimetilformamida Et2O -éter dietílico EtOAc -acetato de etilo EtOH -alcohol etílico

20 h -hora(s) min -minutos MeOH -alcohol metílico ta temperatura ambiente satd -saturado

25 THF -tetrahidrofurano

General

Los reactivos y disolventes usados a continuación se pueden obtener a partir de fuentes comerciales. Los espectros

30 de RMN 1H se registraron en un espectrómetro RMN Bruker a 400 MHz y 500 MHz. Los picos significativos se tabulan en el orden: multiplicidad (s, singlete; d, duplete; t, triplete; c, cuadruplete; m, multiplete; s a, singlete ancho) , constante(s) de acoplamiento en Hercios (Hz) y número de protones. Los resultados de espectrometría de masas se informan como la proporción de masa con respecto a la carga, seguido de la abundancia relativa de cada ión (entre paréntesis el análisis de espectrometría de masas de ionización con Electronebulización (ESI) se realizó en un

35 espectrómetro de masas con electronebulización LC/MSD de la serie Agilent 1100, Todos los compuestos se pudieron analizar en el modo ESI positivo usando acetonitrilo:agua con ácido fórmico al 0,1 % como el disolvente de administración. La HPLC analítica en fase inversa se realizó usando una serie Agilent 1200 en una columna de 5 µm (4,6 x 150 mm) Agilent Eclipse XDB-C18 como la fase estacionaria y eluyendo con acetonitrilo:H2O con TFA al 0,1 %. La HPLC semi-prep en fase inversa se realizó usando una columna Agilent 1100 Series en una columna

40 Phenomenex Gemini™ C18 de 10 µm (250 x 21,20 mm) como la fase estacionaria y que eluyendo con acetonitrilo:H2O con TFA al 0,1 %. Los compuestos quirales se purifican usando gradiente de Isopropanol/Hexano, columna AD. La asignación de la quiralidad se basa en los datos bioquímicos.

Ejemplo 1: Preparación de 4-amino-6-(((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metil-sulfonil)fenil)-3-quinolinil)etil)amino)-545 pirimidincarbonitrilo

N-(2-fluorofenil)cinamamida

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50 A una solución de 2-fluoroanilina (25,0 g, 225 mmol) y carbonato potásico (47 g, 337 mmol) en agua (112 ml) y acetona (45 ml) a 0 ºC se añadió cloruro de cinamoílo (37,0 g, 225 mmol, 1 equiv.) en acetona (45 ml) durante 2 h. La reacción se agitó durante 1 h a 0 ºC, y se inactivó en 200 ml de agua con hielo. El sólido cristalino de color blanco se filtró y se lavó con agua. El sólido se seco al aire durante 2 h, a continuación se lavó con 400 ml de hexanos. El

55 sólido se secó al vacío durante una noche para proporcionar N-(2-fluorofenil)cinamamida (56 g, rendimiento de un 103 %). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,49 (t a, J= 7,8 Hz, 1 H), 7,80 (d, J= 15,3 Hz, 1 H), 7,57 (m, 3H), 7,41 (m, 3 H), 7,17 (m, 3 H), 6,61 (d, J= 15,6 Hz, 1 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 242,1 (M + 1).

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8-fluoroquinolin-2(1H)-ona

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5 N-(2-Fluorofenil)cinamamida (10,5 g, 44 mmol) se disolvió en clorobenceno (60 ml) y se añadió tricloruro de aluminio (29,0 g, 218 mmol, 5 equiv.). La reacción se calentó a 125 ºC durante 3 h y que a continuación se enfrió a ta durante 45 min. La reacción se vertió en 300 g de hielo con agitación, produciendo un sólido de color castaño. El sólido se filtró y se lavó con 100 ml de agua y 3 x 100 ml de hexanos y se secó a alto vacío. El sólido se extrajo con 1 l de DCM y se filtró para retirar los productos secundarios insolubles. El disolvente se retiró al vacío para proporcionar 8

10 fluoroquinolin-2(1H)-ona. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 10,95 (s a, 1H), 7,77 (dd, J= 9,8, 1,6 Hz, 1 H), 7,35 (d, J= 7,8 Hz, 1 H), 7,27 (ddd, J= 10,2, 7,8, 1,2 Hz, 1 H), 7,14 (td, J= 8,0, 5,1 Hz, 1 H), 6,76 (d, J= 9,4 Hz, 1 H).

2-cloro-8-fluoroquinolina

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8-Fluoroquinolin-2(1H)-ona (26,0 g, 159 mmol) se suspendió con tricloruro de fosforilo (163 ml, 1,73 mol, 11 equiv.) y se calentó a 125 ºC durante 2 h. La reacción se enfrió a ta y se vertió en 1,2 l de agua con hielo con agitación vigorosa. Cuando la mezcla se había enfriado a ta, el sólido de color naranja se filtró y se lavó con agua y se secó al

20 vacío durante una noche para proporcionar 27 g de material en bruto. El material en bruto se recristalizó en hexanos por disolución en ~700 ml de hexanos a reflujo y retirando por decantación del alquitrán residual. La solución de hexano se enfrió a 0 ºC y la 2-cloro-8-fluoroquinolina precipitada se filtró. Las aguas madre se concentraron al vacío y se cristalizaron en hexanos para obtener una segunda cosecha de 2-cloro-8-fluoroquinolina (21,3 g, rendimiento total de un 74 %).

25 RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,14 (dd, J= 8,6, 1,2 Hz, 1 H), 7,62 (d a, 1H), 7,52 (td, J= 7,8, 4,7 Hz, 1 H), 7,45 (m, 2 H).

1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol

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2-Cloro-8-fluoroquinolina (5,00 g, 27,5 mmol) se disolvió en THF (60 ml) y se enfrió a -78 ºC. A esta solución se añadió diisopropilamida de litio recién preparada y valorada (solución 1 M en THF, 30 ml, 30 mmol, 1,1 equiv.) durante 5 min. La reacción se dejó en agitación a -78 ºC durante 20 min, tiempo tras el que se añadió acetaldehído 35 (2,3 ml, 41,3 mmol, 1,5 equiv.) mediante una jeringa durante 30 segundos (exotérmico). Después de 30 min a 78 ºC, la reacción se interrumpió con solución saturada de NH4CI al 50 % y se diluyó con EtOAc. Las fases se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, y se filtraron. La mezcla de reacción en bruto se depositó en 30 g de gel de sílice y se pasó a través de un lecho de 60 g de gel de sílice, eluyendo con hexanos:EtOAc a 8:2. Las fracciones que contenían el producto y un regioisómero de elución próxima (segundo) se

40 recogieron. Las fracciones se concentraron y el sólido en bruto se suspendió en 140 ml de 9:1 de hexanos:EtOAc a reflujo durante 30 min. Después de enfriar a ta, el sólido se filtró y se lavó con una pequeña cantidad de de hexanos:EtOAc a 9:1 en frío para proporcionar el 1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol puro (3,1 g, 13,7 mmol, rendimiento de un 50 %). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,43 (s a, 1 H), 7,64 (td, J= 7,8, 5,1 Hz, 1 H), 7,41 (ddd, J= 10,2, 7,4, 1,2 Hz, 1 H), 5,39 (cdd, J= 6,3, 3,9, 0,8 Hz, 1 H), 2,22 (d, J= 3,9 Hz, 1 H), 1,62 (d, J= 6,3 Hz, 3 H).

45

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1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanona

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5 A un matraz de fondo redondo que contenía tolueno (183 ml) se añadió 1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol (6,20 g, 27,5 mmol) y dióxido de manganeso (19,1 g, 220 mmol, 8 equiv.). La reacción se calentó a reflujo durante 2 h, se enfrió a ta, se filtró y se concentró. El producto se diluyó con hexanos y se filtró para dar 1-(2-cloro-8-fluoroquinolin3-il)etanona (4,43 g, rendimiento de un 72 %)en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,40 (d, J= 1,6 Hz, 1 H), 7,71 (d a, J= 8,2 Hz, 1 H), 7,56 (td, J= 7,8, 5,1 Hz, 1 H), 7,54 (ddd, J= 9,8, 7,8,

10 1,6 Hz, 1 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 223,9 (M + 1).

(R)-1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol

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15 En un matraz de fondo redondo se disolvió (+)-dip-cloruro(tm) (17,5 g, 540 mmol, 2,2 equiv.) en THF anhidro (200 ml) y la solución se enfrió a -55 ºC (usando un baño de hielo seco/MeCN). A esta solución se añadió 1-(2-cloro8-fluoroquinolin-3-il)etanona (5,50 g, 24,5 mmol) como una solución en THF (50 ml). La reacción se dejó calentar a ta lentamente durante una noche. Después de este tiempo, la reacción se interrumpió con 10 ml de acetona y 100 ml

20 de Na2CO3 al 10 % y se permitió la agitación durante 2 h a ta. Se añadió acetato de etilo (750 ml) y las fases se separaron. La fase orgánica se lavó 3x con una solución saturada de bicarbonato sódico al 50 % y una vez con salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgSO4, se filtra y se concentró. El material en bruto se concentró a alto vacío a 75 ºC para retirar el pineno. El residuo se suspendió en 150 ml de hexanos y 150 ml de agua durante 3 h a ta. Se formó un precipitado de color blanco y se filtró y se secó para proporcionar 4,9 g de producto ee al 98 %. El

25 sólido se disolvió en 25 ml de EtOAc en ebullición y se añadieron 25 ml de hexanos en caliente se añadió para formar un precipitado a reflujo. La mezcla se enfrió a -15 ºC, se filtró, y se lavó con hexanos:EtOAc a 9:1 en frío para proporcionar (R)-1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol (4,07 g, rendimiento de un 73 %). La HPLC quiral (IPA al 10 % en hexanos, chiralcel AD-H muestra que el producto tiene un ee > 99,9 %. El enantiómero deseado se eluye a los 9,6 min, el enantiómero no deseado se eluye a los 8,1 min. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,43 (s a), 7,64 (d a,

30 J= 8,2 Hz, 1 H), 7,50 (td, J= 7,8, 4,7 Hz, 1 H), 7,41 (ddd, J= 10,2, 7,8, 1,2 Hz, 1 H), 5,40 (cd, J= 5,9, 0,8 Hz, 1 H), 2,22 (s a, 1 H), 1,62 (d, J= 6,3 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 226,0 (M + 1).

(S)-2-(1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona

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En un matraz de fondo redondo se combinó ftalimida (6,38 g, 43,3 mmol), trifenilfosfina (1,14 g, 43,3 mmol) y (R)-1(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etanol (8,15 g, 36,2 mmol) en THF (240 ml). La solución se enfrió a 0 ºC y se añadió diisopropilazodicarboxilato (DIAD, 8,5 ml, 43,3 mmol) gota a gota. La reacción se dejó calentar a ta durante una 40 noche. La reacción se concentró hasta un volumen de ~100 ml y se diluyó con 1 l de Et2O y 200 ml de agua. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo de nuevo con 200 ml de Et2O, Las fases orgánicas combinadas se lavaron con 160 ml de salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. La cromatografía en

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columna usando DCM al 100 % proporcionó (S)-2-(1-(2-cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etil)-isoindolin-1,3-diona (10,5 g, rendimiento de un 82 %). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,60 (s a, 1 H), 7,74 (m, 2 H), 7,64 (m, 3 H), 7,45 (td, J= 7,8, 4,9 Hz, 1 H), 7,35 (ddd, J= 10,2, 7,8, 1,2 Hz, 1 H), 5,89 (c, J= 7,2 Hz, 1 H), 1,90 (d, J= 7,0 Hz, 3 H).

2-((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metiltio)fenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona

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(S)-2-(1-(2-Cloro-8-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (14,0 g, 39,5 mmol), ácido 2-(metiltio)fenilborónico

10 (9,95 g, 59,2 mmol) y carbonato potásico (16,4 g, 118 mmol) se combinaron en 300 ml de DMF anhidra en una atmósfera de N2. La solución se roció con N2 durante ~5 min antes de añadir PdCl2(dppf)CH2Cl2 (3,22 g, 3,95 mmol). La solución se calentó a 100 ºC durante 3 h, y a continuación se enfrió a 50 ºC. La solución se concentró al vacío para dar un residuo de color pardusco, que se diluyó con EtOAc (600 ml). Las fases orgánicas se lavaron a continuación con H2O (3 x 80 ml), seguido de salmuera (1 x 100 ml). Las fases acuosas combinadas se extrajeron

15 con DCM (3 x 200 ml). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4 y a continuación se concentraron al vacío. El residuo obtenido se purificó por gel de sílice cromatografía ultrarrápida eluyendo con un gradiente de hexano al 20 % a EtOAc al 40 %/hexano. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se concentraron al vacío para dar 2-((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metiltio)fenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (14,6 g, 33,0 mmol, rendimiento de un 84 %) en forma de una espuma de color amarillo claro. La RMN del protón refleja una

20 proporción de 53/47 de atropisómeros a 25 ºC. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8,71 (s a, 0,53 H), 8,65 (s a, 0,47 H), 7,79 (m, 1H), 7,66 (s, 4 H), 7,55 (m, 1 H), 7,45-7,27 (serie de m, 3,6 H), 6,87 (m, 1,4 H), 5,70 (c, J= 6,4 Hz, 0,47 H), 5,63 (c, J= 6,8 Hz, 0,53 H), 2,47 (s a, 1,4 H), 1,91 (m, 3 H), 1,52 (s a, 1,6 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 443,2 (M + 1).

25 2-((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)-3-quinolinil)etil)-1H-isoindolo-1,3(2H)-diona

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A 70 ml de DCM se añadieron 13,56 g (1,2 g/1 mmol de sustrato) de Montmorillonita húmeda (~0,2 g de H2O/1 g de

30 arcilla), y oxone (17,37 g, 28,2 mmol)1. A esta suspensión se añadió una solución de 2-((1S)-1-(8-fluoro-2-(2(metiltio)-fenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (5,0 g, 11,3 mmol) disuelta en DCM (10 ml). La suspensión se agitó a ta durante 72 h y a continuación se filtró a través de un embudo con frita. Los sólidos se lavaron con DCM (~600 ml) y los filtrados se concentraron al vacío para dar 2-((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)-3-quinolinil)etil)1H-isoindolo-1,3-(2H)-diona 7,11 g (97 %) en forma de un sólido de color amarillo claro. La RMN del protón refleja

35 una proporción a 59/41 de atropisómeros a 25 ºC. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8,86 (s, 0,59 H), 8,79 (s, 0,41 H), 8,26 (d, J= 7,8 Hz, 0,41 H), 8,04 (d, J= 7,8 Hz, 0,59 H), 7,89-7,36 (series of m, 9,6 H), 7,20 (d, J= 7,6 Hz, 0,41 H), 5,70 (c, J= 7,1 Hz, 0,59 H), 5,54 (c, J= 7,3 Hz, 0,41 H), 3,19 (s, 1,75 H), 3,15 (s, 1,25 H), 1,98 (d, J= 7,3 Hz, 1,75 H), 1,85 (d, J= 7,1 Hz, 1,25 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 475,0 (M + 1).

1. Hirano, M.; Tomaru, J.; Morimoto, T. Bull. Chem. Soc. Jpn., 1991, 64, 3752-54. 40

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(1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)-3-quinolinil)etanamina

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5 2-((1S)-1-(8-Fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (9,10 g, 19,2 mmol) e hidrato de hidrazina (9,32 ml, 192 mmol) se añadieron a EtOH (190 ml). Después de calentamiento a 65 ºC durante 3 h, la suspensión resultante se enfrió a ta, se diluyó con 900 ml de EtOAc, y se filtró a través de un embudo con frita. El filtrado se lavó con H2O (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml) y a continuación se secó sobre MgSO4 antes de su concentración al vacío para dar (1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etanamina (6,06 g, 17,6 mmol,

10 rendimiento de un 92 %) en forma de un sólido de color naranja claro. La RMN del protón refleja una proporción a 73/27 de atropisómeros a 25 ºC. RMN 1H (500 MHz, CDCl3) δ ppm 8,55 (d, J= 1,5 Hz, 0,73 H), 8,50 (d, J= 1,5 Hz, 0,27 H), 8,26 (dd, J= 8,1, 1,2 Hz, 0,27 H), 8,23 (dc, J= 7,8 1,2 Hz, 0,73 H), 7,73 (m, 3 H), 7,52 (m, 1,27 H), 7,40 (m, 1,73 H), 4,16 (c, J= 6,6 Hz, 0,27 H), 4,03 (c, J= 6,4 Hz, 0,73 H), 3,36 (s, 0,79 H), 3,17 (s, 2,21 H), 1,36 (m, 3H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 345,2 (M + 1).

15

4-amino-6-(((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)-3-quinolinil)-etil)amino)-5-pirimidincarbonitrilo

imagen24

20 (1S)-1-(8-Fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etanamina (9,16 g, 26,6 mmol), N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (13,7 ml, 80 mmol) y 4-amino-6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (4,32 g, 27,9 mmol) se combinaron en n-butanol (67 ml) y a continuación se calentó a 110 ºC en una atmósfera de N2. Después de 3 h a 110 ºC, la temperatura de la reacción aumentó a 120 ºC durante 2 h. Después de enfriamiento en un baño de hielo, la mezcla se filtró dejando 14 g de un sólido de color pardusco. El filtrado se calentó a 120 ºC durante 3 h, se enfrió a 40 ºC y se concentró al

25 vacío dejando un aceite de color marrón. El aceite y los sólidos se combinaron y se purificaron en una columna ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 2 %/DCM. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se concentraron al vacío para dar un sólido amarillento claro. Las fracciones que contenían el producto impuro se combinaron y se purificaron en una columna ultrarrápida sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de MeOH al 1,5 %/DCM a MeOH al 2 %/DCM. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se

30 concentraron al vacío para dar un sólido de color amarillento claro. Los sonidos puros combinados se disolvieron en EtOH con calentamiento (~60 ºC), y a continuación se concentraron al vacío, la disolución se repitió en EtOH seguido de concentración al vacío. Los sólidos obtenidos se secaron a continuación en la línea de vacío a 120 ºC hasta que la concentración residual de etanol era inferior a un 0,5 % en peso. El sólido obtenido era 4-amino-6(((1S)-1-(8-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)-3-quinolinil)etil)-amino)-5-pirimidincarbonitrilo, 10,3 g (rendimiento de un

35 84 %). La RMN del protón refleja una proporción a 87/13 de atropisómeros a 25 ºC. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,80 (s a, 0,13 H), 8,58 (s a, 0,87 H), 8,13 (dd, J= 7,7, 1,2 Hz, 0,87 H), 7,95-7,52 (serie de m, 8H), 7,30-6,99 (m a, 2 H), 6,82 (d, J= 8,3 Hz, 1 H), 5,62 (quintuplete, J= 6,9 Hz, 0,13 H), 5,22 (quintuplete, J= 6,9 Hz, 0,87 H), 3,37 (s, 2,57 H), 3,31 9s, 0,43 H), 1,60 (d, J= 6,9 Hz, 0,4 H), 1,35 (d, J= 6,9 Hz, 2,6 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 463,1 (M + 1).

40

imagen25

Ejemplo 2: Preparación de (S)-4-amino-6-((1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)-fenil)quinolin-3il)etil)amino)pirimidin-5-carbonitrilo

2-cloro-7-fluoroquinolina-3-carbaldehído

imagen26

POCl3 (0,837 l, 9,17 mmol) se añadió gota a gota a DMF (253 ml, 3,28 mmol) en un matraz de tres bocas equipado con agitador mecánico a 0 ºC. La mezcla semisólida se agitó a ta durante 30 min y se añadió N-(3

10 fluorofenil)acetamida (200 g, 1,31 mol) en una porción. La mezcla resultante se calentó a 75 ºC durante una noche. Después de enfriar a ta, la mezcla de reacción se vertió con cuidado en agua con hielo (9 kg). El sólido resultante se filtró, se lavó con agua, NaHCO3, y se secó al aire. La mezcla en bruto (200 g, 73 %) se recristalizó en EtOAc (5 l) para dar 2-cloro-7-fluoroquinolin-3-carbaldehído en forma de agujas de color blanquecino (150 g). Espectro de Masas (ESI) m/e = 210 (M + 1).

15

1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanol

imagen27

20 Una suspensión de 2-cloro-7-fluoroquinolin-3-carbaldehído (44,7 g, 213 mmol) en THF (600 ml) se trató con MeMgBr (78,0 ml, 234 mmol 1,1 equiv.) a -20 ºC. Después de agitar durante una noche, la reacción se interrumpió con una solución de NH4Cl y se extrajo con Et2O (300 ml y 100 ml). Las fases orgánicas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se concentraron y se recristalizaron en EtOAc (100 ml) y hexano (1 l). se obtuvo un sólido de color amarillo pálido de 1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)-etanol (41 g, 85%). Espectro de Masas (ESI) m/e = 226

25 (M+1).

1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanona

imagen28

30 1-(2-Cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanol (7,7 g, 34 mmol), MnO2 (30 g, 10 equiv.) y Tolueno (200 ml) se calentaron a reflujo durante 2 h. La LC-MS mostraba la finalización de la reacción. La filtración seguida por la retirada de disolvente dio un sólido de color blanquecino de 1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanona (6,2 g, 81 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 224 (M + 1).

35

(R)-1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanol

imagen29

40 Una solución de 1-(2-cloro-7-fiuoroquinolin-3-il)etanona (164 g, 733 mmol) en THF (1,34 l) se añadió a una solución de (+)-DIP-Cl (517,5 g, 2,2 equiv.) en THF (3,5 l) a -45 ºC (hielo seco y acetonitrilo) gota a gota. La reacción se calentó lentamente hasta una ta durante una noche. La reacción se inactivó a continuación con acetona (750 ml) y Na2CO3 al 10 % (750 ml) a 0 ºC y se agitó a ta durante 1 h antes de la adición de EtOAc (3,5 l). La mezcla se calentó hasta ta y se lavó con Na2CO3 al 10 % y agua. La fase orgánica se secó con salmuera, se concentró y se trató con

45 hexano (1,0 l) y agua (1,8 l). La mezcla se agitó a ta durante 40 min y se filtró. El sólido de color blanco se lavó con agua y hexano, se secó al aire durante una noche (143 g). Este material se secó en el rotavapor a 60 ºC durante 4 h a alto vacío (267 Pa) para dar un polvo de color blanco de (R)-1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanol (122 g, 73,7 %). La HPLC quiral en columna de AD (isopropanol en hexano, 10 %) mostraba un ee > 99 %. Espectro de Masas (ESI) m/e=226 (M+ 1).

imagen30

(S)-2-(1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona

imagen31

A una mezcla de (R)-1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etanol (3,03 g, 13,4 mmol), ftalimida (2,37 g, 1,20 equiv.) y PPh3

10 (4,23 g, 1,20 equiv.) en THF (70 ml) se añadió DIAD (3,13 ml, 1,20 equiv.) gota a gota a 0 ºC. A continuación, la mezcla se agitó a ta durante una noche antes de repartir entre EtOAc (200 ml) y agua (200 ml). La fase orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (DCM) para dar una espuma de color blanco de (S)-2-( 1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3il)etil)isoindolin-1,3-diona (3,8 g, 80 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 355 (M + 1).

15

(1-(2-Cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)carbamato de (S)-terc-butilo

imagen32

20 A una solución de (S)-2-(1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (1,0 g, 2,8 mmol) en EtOH (10 ml) se añadió gota a gota NH2NH2 (10 equiv., 0,88 ml) a ta antes de calentar a 90 ºC durante 30 min. Después de enfriar a ta, la mezcla de reacción se concentró, se repartió entre EtOAc (20 ml) y agua (5 ml). La fase orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró para dar un aceite incoloro, que se disolvió en THF (10 ml) y se trató con BOC2O (1,1 equiv., 0,68 g) y TEA (1,0 equiv., 0,39 ml) a reflujo. Después de enfriar a ta, la

25 mezcla de reacción se concentró y se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc/hexano, 1/9) para dar un sólido de color blanco, (1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)carbamato de (S)-terc-butilo (0,70 g, 76 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 325 (M + 1).

(1-(7-fluoro-2-(2-(metiltio)fenil)quinolin-3-il)etil)-carbamato de(S)-terc-butilo

30

imagen33

Una mezcla de (1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)carbamato de (S)-terc-butilo (382 mg, 1,2 mmol), ácido 2(metiltio)fenilborónico (257 mg, 1,3 equiv.), Na2CO3 (623 mg, 5,0 equiv.), Pd(PPh3)4 (93 mg, 5 %), MeCN (9 ml) y

35 agua (3 ml) se calentó a 85 ºC en atmósfera de N2 durante una noche. Después de enfriar a ta, la reacción se repartió entre EtOAc (10 ml) y agua (5 ml). La fase orgánica se separó, se lavó, seco y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice para dar un sólido de color blanco, (l-(7-fluoro-2-(2(metiltio)fenil)quinolin-3-il)etil)carbamato de (S)-terc-butilo (460 mg, 94,8 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 413 (M +1).

imagen34

(1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etil)-carbamato de (S)-terc-butilo

imagen35

5 En una atmósfera de N2, se disolvió (1-(7-fluoro-2-(2-(metiltio)fenil)-quinolin-3-il)etil)carbamato de (S)-terc-butilo (412 mg, 999 µmol) en acetona (3,00 ml, 40,8 mmol) y agua (3 ml), y se añadió NMO (351 mg, 3,00 mmol) seguido de OsO4 (12,7 mg, 0,05 mmol). La reacción se dejó en agitación a ta durante una noche. La LC-MS mostraba que la reacción no era completa. La reacción se trató con OsO4 (12,7 mg, 0,05 mmol) de nuevo y se agitó durante una noche. La LC-MS mostraba solamente una traza del reactivo de partida. La reacción se interrumpió mediante la

10 adición de 5 ml de una solución saturada de tiosulfato sódico. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con Na2CO3 al 5 %, La fase orgánica se lavó a continuación con salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró al vacío. El residuo en bruto se purificó eluyendo con EtOAc de un 30 % a un 60 % en hexanos para proporcionar un sólido de color blanco, (1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)-etil)carbamato de (S)-terc-butilo (440 mg, 99 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 445 (M + 1).

15

(S)-4-amino-6-((1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etil)-amino)pirimidin-5-carbonitrilo

imagen36

20 A (1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etil)-carbamato de (S)-terc-butilo (440 mg, 1,0 mmol) se añadió HCl, 4 M (1 ml). La mezcla resultante se agitó a ta durante 1 h. El disolvente se retiró y la (S)-1-(7-fluoro-2-(2(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etanamina en bruto se usó sin tratamiento adicional. Una solución de (1S)-1-(7-fluoro2-(2-(metilsulfonil)fenil)-quinolin-3-il)etanamina (100 mg, 290 µmol), 4-amino-6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (45 mg, 290 µmol) y DIEA (101 µl, 581 µmol) en DMF (4 ml) se calentó a 100 ºC durante una noche. El disolvente se retiró a

25 presión reducida y se purificó mediante TLC preparativa usando un 3 % de MeOH/DCM para proporcionar un polvo de color blanco de (S)-4-amino-6-((1-(7-fluoro-2-(2-(metilsulfonil)fenil)quinolin-3-il)etil)-amino)pirimidin-5-carbonitrilo (6,9 mg, 5,1 %). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1,51 (d, J= 7,09 Hz, 3 H) 3,17 (s, 3 H) 5,43 (d, J= 6,85 Hz, 1 H) 7,48 (d, J= 2,45 Hz, 1 H) 7,60 -7,63 (m, 1 H) 7,66 -7,69 (m, 2 H) 7,73 (d, J= 1,47 Hz, 1 H) 7,81 (s, 1 H) 8,07 (dd, J= 9,05, 6,11 Hz, 1 H) 8,13 -8,17 (m, 1 H) 8,49 (s, 1 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 463 (M + 1).

30

imagen37

Ejemplo 3: Preparación de 4-amino-6-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)-quinolin-3-il)etilamino)pirimidin-5carbonitrilo.

2-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona

imagen38

A una solución de (S)-2-(1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (150 mg, 423 µmol), ácido 3fluorofenilborónico (65 mg, 465 µmol) y carbonato sódico (90 mg, 846 µmol) en MeCN (8 ml) y agua (2 ml) se purgó con N2 seguido de la adición de Pd(PPh3)4 (24 mg, 21 µmol) y la mezcla resultante se agitó a 90 ºC durante una 10 noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc lavado con agua y salmuera y se secó sobre Na2SO4. La purificación usando TLC preparativa eluyendo con EtOAc al 100 % proporcionó ácido 2-(((S)-1-(7-fluoro-2-(3fluorofenil)quinolin-3-il)etil)carbamoil)benzoico (120 mg, 66 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 433 (M + 1). El ácido 2-(((S)-1-(7-Fluoro-2-(3-fluorofenil)-quinolin-3-il)etil)carbamoil)benzoico se disolvió en EtOH (2 ml) y se añadió HCl cond (0,1 ml). La solución resultante se calentó a 80 ºC durante 4 h. El disolvente se retiró y se añadió NaHCO3 satd

15 a la mezcla de reacción y se extrajo con EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se concéntrese purificó a través de TLC preparativa usando al MeOH 3 %/DCM saturado con gas NH3 para proporcionar un sólido de color blanco de 2-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (85 mg, 49 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 415 (M + 1).

20 4-amino-6-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)quinolin-3-il)etilamino)-pirimidin-5-carbonitrilo

imagen39

A una solución de 2-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)quinolin-3-il)etil)-isoindolin-1,3-diona (60,0 mg, 145 µmol) en

25 EtOH (2 ml) se añadió NH2NH2 (1,0 ml, 1,45 mmol, 10 equiv.) y la solución resultante se calentó a 80 ºC durante 2 h. Un precipitado se retiró por filtración y el filtrado se retiró a presión reducida para proporcionar (1S)-1-(7-fluoro-2-(3fluorofenil)quinolin-3-il)etanamina. Al residuo en bruto de (1S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)quinolin-3-il)-etanamina en DMF (2 ml) se añadió 4-amino-6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (22 mg, 145 µmol) y DIEA (0,06 ml, 319 µmol). La mezcla resultante se calentó a 100 ºC durante una noche. El disolvente se retiró a presión reducida y se purificó a

30 través de HPLC preparativa usando MeCN al 15-60 %/H2O en p/ TFA al 0,01 % para proporcionar un sólido de color blanco de 4-amino-6-((S)-1-(7-fluoro-2-(3-fluorofenil)-quinolin-3-il)etilamino)pirimidin-5-carbonitrilo (9,3 mg, 16 %). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1,63 (d, J= 6,85 Hz, 3 H) 5,70 (c, J= 7,01 Hz, 1 H) 7,25 -7,34 (m, 1 H) 7,44 7,54 (m, 2 H) 7,55 -7,63 (m, 2 H) 7,74 (dd, J= 9,78, 2,45 Hz, 1 H) 8,05 (s, 1 H) 8,18 (dd, J= 9,05, 5,87 Hz, 1 H) 8,72 (s, 1 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 403 (M + 1).

35

imagen40

Ejemplo 4: Preparación de (S)-4-amino-6-((1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)-quinolin-3-il)etil)amino)pirimidin-5carbonitrilo

2-((S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona

imagen41

Una mezcla de (S)-2-(1-(2-cloro-7-fluoroquinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (85,6 g, 241 mmol), Pd(PPh3)4 (14 g, 12 mmol, 0,05 equiv.) y 2-(tributilestannil)-piridina (107 g, 289 mmol, 1,2 equiv.) en dioxano (3,0 l) se calentó a 90 ºC 10 en atmósfera de N2. Después de agitar durante una noche, la LC-MS mostraba una finalización de un 30 %. La mezcla de reacción se calentó a 101 ºC durante un periodo adicional de 2 días. La mezcla de reacción se enfrió a continuación a ta, se decantó y los 200 ml de solución restantes se filtraron para retirar el residuo de Pd. Los disolventes combinados se concentraron a 300 ml y se filtraron para dar un sólido de color castaño, que se lavó con EtOAc/hexano (1/1) y se secó para proporcionar (82,1 g). Las aguas madre se concentraron a 100 ml y se trataron

15 con EtOAc/hexano, 1/1 (200 ml) para dar una segunda cosecha del producto (2,2 g). En general se obtuvo un sólido de color castaño de 2-((S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (84,3 g, 88 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 398 (M + 1).

(S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etanamina

20

imagen42

A una suspensión de 2-((S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etil)isoindolin-1,3-diona (2,1 g, 5,3 mmol) en etanol anhidro (15 ml) se añadió NH2NH2 (0,85 g, 26 mmol) gota a gota durante 5 minutos. La mezcla de reacción se

25 calentó a 90 ºC durante 30 min y se enfrió a ta. La mezcla de reacción se filtró y se lavó con EtOAc. La solución resultante de EtOAc se lavó con agua y salmuera y se secó sobre Na2SO4. La retirada de los disolventes proporcionó un aceite de color castaño de (S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etanamina (1 g, 71 %). Espectro de Masas (ESI) m/e = 468 (M + 1).

30 4-amino-6-((S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etilamino)-pirimidin-5-carbonitrilo

imagen43

imagen44

Una mezcla de (S)-1-(7-fluoro-2-(piridin-2-il)quinolin-3-il)etanamina (85 mg, 0,32 mmol), 4,6-dicloro-5-cianopirimidina (55 mg, 0,32 mmol, 1,0 equiv.) y N,N-diisopropiletilamina (68 µl, 0,38 mmol, 1,2 equiv.) en THF (3 ml) se agitó a ta durante 30 min antes de calentar a 50 ºC. Después de 4 h, la mezcla se concentró y se purificó por cromatografía en columna (EtOAc/1/1) para dar un sólido de color blanco, que se trató con NH3 saturado en dioxano (3 ml) en un tubo 5 cerrado herméticamente a 110 ºC durante una noche. La mezcla de reacción se concentró y se purificó por HPLC de fase inversa (MeCN/H2O/TFA al 0,1 %) y se liofilizó para dar un polvo de color blanco de 4-amino-6-((S)-1-(7-fluoro2-(piridin-2-il)quinolin-3 -il)etilamino)pirimidin-5-carbonitrilo (19 mg, 15 %). RMN 1H (500 MHz, CD3OD) δ ppm 1,78 (d, J= 6,85 Hz, 3 H) 5,82 (c, J= 6,85 Hz, 1 H) 7,71 (td, J= 8,80, 2,45 Hz, 1 H) 7,89 (dd, J= 9,66, 2,32 Hz, 1 H) 8,10 (ddd, J= 7,83, 5,62, 0,98 Hz, 1 H) 8,19 (s, 1 H) 8,27 (dd, J= 9,05, 5,87 Hz, 1 H) 8,45 (d, J= 7,83 Hz, 1 H) 8,63 (td,

10 J= 7,95, 1,47 Hz, 1 H) 8,94 (s, 1 H) 9,03 -9,09 (m, 1 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 386 (M + 1).

Ejemplo 5: Preparación de (S)-4-amino-6-((1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)-fenil)quinoxalin-2il)etil)amino)pirimidin-5-carbonitrilo

15 Ácido 2-((3-cloro-2-nitrofenil)amino)butanoico

imagen45

Una mezcla de 1-cloro-3-fluoro-2-nitrobenceno (2,00 Kg, 11,4 mol), ácido 2-aminobutírico (1,22 kg, 11,8 mol) y

20 K2CO3 (1,58 Kg, 11,4 mol) en DMSO anhidro (4,2 l) se calentó a 80 ºC durante 16 h (después de iniciar la reacción, la temperatura interna aumentó hasta 110 ºC). En este momento, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. Después de enfriar a ta, la mezcla de reacción se vertió con cuidado en agua (10 l) con agitación vigorosa. La fase acuosa se lavó con metil terc-butil éter (2 x 5 l) para retirar las impurezas orgánicas. La fase acuosa se acidificó a continuación a pH ~1,5 con HCl cond para dar un sólido de color naranja. El sólido de color naranja se

25 recogió por filtración, se lavó con agua (2 x 4 l) y se secó al aire para dar ácido 2-((3-cloro-2nitrofenil)amino)butanoico (2,85 Kg), que se usó como tal en la siguiente etapa. RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 7,35 (t, J= 8,3 Hz, 1 H), 6,82 -6,91 (m, 2 H), 6,25 (d, J= 7,6 Hz, 1 H), 4,14 (td, J = 1A, 5,4Hz, 1H), 3,4 (s a, 1H), 1,74 1,92 (m, 2 H), 0,88 (t, J =lA Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 259,2 (M + 1).

30 8-cloro-3-etil-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona

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A una solución de ácido 2-((3-cloro-2-nitrofenil)amino)butanoico (1,5 Kg, 5,8 mol), HCl ac. 4 N (4,35 l, 17,4 mol) y

35 EtOH (5,3 l) se añadió SnCl2.2H2O (3,93 Kg, 17,4 mol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 5 h. En este momento, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. Después de enfriar a ta la mezcla de reacción se evaporó a presión reducida. El residuo resultante se enfrió a 0 ºC usando un baño de hielo-agua y una solución acuosa de KOH 10 N (12 l, 180 mol) se añadió con cuidado con agitación vigorosa. Después de la filtración para retirar los sólidos insolubles, el filtrado se extrajo con DCM (2 x 10 l) lavado con agua y salmuera, se secó sobre

40 Na2SO4 anhidro, y se evaporó a presión reducida para dar 8-cloro-3-etil-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona (1,1 Kg) en forma de un sólido de color amarillo, que se usó sin purificación adicional. RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 9,70 (s, 1 H), 6,65 -6,83 (m, 3 H), 6,31 -6,44 (m, 1 H), 3,66 -3,72 (m, 1 H), 1,53-1,71 (m, 2 H), 0,92 (t, J= 7,4 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 211,2 (M + 1).

45

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8-cloro-3-etilquinoxalin-2(1H)-ona

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A una solución de 8-cloro-3-etil-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona (1,30 Kg, 6,17 mol) en 1,4-dioxano anhidro (15 l) se

5 añadió DDQ (1,47 Kg, 6,48 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 h (la temperatura interna aumentó hasta 45 ºC después de adición de DDQ). Después de este tiempo, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. La mezcla se evaporó a presión reducida para dar un residuo de color marrón. A este residuo se añadió NaOH acuoso 2 M para ajustar el pH a 7 -8. El sólido de color amarillo resultante se recogió por filtración, se suspendió en NaHCO3 ac. saturado, se agitó durante 1 h, y se filtró para dar un sólido de color verde claro. El sólido

10 de color verde claro se suspendió en NaHCO3 acuoso saturado, se agitó, se filtró y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y agua para dar un sólido de color blanquecino. El sólido de color blanquecino se suspendió en agua, se mezcla bien, se filtró, se lavó con agua, se secó al aire durante una noche, y se secó a alto vacío a 50 ºC para dar 8cloro-3-etilquinoxalin-2(1H)-ona (1 Kg). RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 7,69 -7,75 (m, 1 H), 7,59 -7,65 (m, 1 H), 7,29 (t, J= 8,0 Hz, 1 H), 2,84 (c, J=l A Hz, 2 H), 1,23 (t, J= 7,4 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 209,1 (M + 1).

15

3,5-dicloro-2-etilquinoxalina

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20 Una suspensión espesa de 8-cloro-3-etilquinoxalin-2(1H)-ona (1,00 Kg, 4,79 mol) en POCI3 (2,68 l, 28,8 mol) se agitó a 100 ºC durante 2 h. En este momento, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. Después de la retirada de la mayor parte del POCI3 a presión reducida, el residuo se vertió con cuidado en agua con hielo y se neutralizó con una combinación de NaOH ac. 2 M y NaHCO3 ac. saturado. La suspensión resultante se extrajo con DCM (3 x 4 l). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró, y se evaporó a

25 presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida eluyendo con hexano/EtOAc (30/1) para dar 3,5-dicloro-2-etilquinoxalina (840 g) en forma de un sólido de color blanco. RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 8,01-8,08 (m, 2 H), 7,84 (t, J= 8,0 Hz, 1 H), 3,10 -3,17 (d, J= 7,3 Hz, 2 H), 1,36 (t, J= 7,3 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 227,1 (M + 1).

30 2-(1-bromoetil)-3,5-dicloroquinoxalina

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3,5-Dicloro-2-etilquinoxalina (1,10 Kg, 4,84 mol) se disolvió en CCI4 (4,4 l) a ta. A continuación se añadieron 1, 3

35 dibromo-5, 5-dimetilhidantoína (762 g, 2,66 mol) y peróxido de benzoílo (116 g, 0,48 mol). La suspensión resultante se calentó a reflujo durante 2 h. En este momento, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. Después de enfriar a ta, se formaron cristales de color blanco en el recipiente de reacción. Los cristales de color blanco se recogieron por filtración, se lavaron con NaHCO3 acuoso saturado (3 x 5 l), y se secaron a alto vacío para dar 2-(1-bromoetil)-3,5-dicloroquinoxalina en forma de un sólido de color blanco (1,05 Kg). RMN 1H (DMSO-d6)δ

40 ppm 8,04 -8,12 (m, 2 H), 7,78 -7,90 (m, 1 H), 5,76 -5,84 (m, 1 H), 2,09 (d, J= 6,7 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 304,8 [(M + 1) (79Br)], 306,9 [(M + 1) (81Br)].

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2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona

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5 A una solución de 2-(1-bromoetil)-3,5-dicloroquinoxalina (1,00 Kg, 3,27 mol) en DMF (8,2 l) se añadió ftalimida potásica (1,21 Kg, 6,54 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 3 h. En este momento, el análisis de LC-MS mostraba que la reacción era completa. La mezcla se transfirió a un embudo de decantación de 50 l y se añadieron agua (12 l) y EtOAc (6 l) al mismo con agitación. Una gran cantidad de sólido de color blanco se trituró y se recogió por filtración. La fase acuosa se separó y se extrajo de nuevo con EtOAc (2 x 4 l). Las fases orgánicas combinadas

10 se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron ti el volumen se redujo a 5 l a presión reducida. Después de enfriar a ta, el producto se obtuvo en forma de un sólido de color blanco. El sólido de color blanco se filtró, se trituró con hexano y se secó al vacío para dar 2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3diona (1,24 Kg). RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 8,02 -8,21 (2 H, m), 7,83 -8,02 (m, 5 H), 5,89 (c, J= 6,8 Hz, 1 H), 1,87 (d, J= 6,8 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 372,0 (M + 1).

15

(S)-2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona

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20 La 2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona racémica (1 Kg) se purificó en una unidad Novasep para HPLC. Las condiciones de funcionamiento usadas para el proceso de separación fueron:

Columna: CHIRALPAK®AS 20 µM, 11 cm id x 25 cm L Fase Móvil: Hexano-IPA 70-30

25 Caudal: 400 ml/min Temperatura: 25 ºC Detección de UV: 340 nm La solubilidad era de 1 g/l en la fase móvil. Para mantener la muestra solución fueron necesarios agitación y calentamiento. La solución se filtró antes de su uso. El volumen de inyección era de 510 ml cada 8,0 minutos. Las

30 fracciones recogidas del proceso de cromatografía se evaporaron usando evaporadores de película fina Artisan y rotavapores a 45 ºC. Después de retirada de disolvente, el producto se secó hasta peso constante en horno de vacío a 40 ºC para dar: (S)-2-(1-(3,5-dicloro-quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona, 1er enantiómero (425,7 g, rendimiento de un 85,1 %, e.e. de un 98,7 %) y (R)-2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2-il)etil)isoindolina-1,3-diona , 2º enantiómero (432,5 g, rendimiento de un 86,2 %, e.e. de un 97,7 %).

35

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2-((1S)-1-(5-cloro-3-(2-(metiltio)fenil)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona

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5 Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un agitador mecánico, un condensador, una entrada de gas nitrógeno y una sonda de temperatura se cargó con DMF (2,16 l), (S)-2-(1-(3,5-dicloroquinoxalin-2il)etil)isoindolin-1,3-diona (273 g, 733 mmol) y ácido 2-(metiltio)fenilborónico (136 g, 807 mmol). A la mezcla, se añadió carbonato potásico (203 g, 147 mmol) y cloruro de [1,1-bis(di-fenilfosfino)ferroceno]paladio (ii), formando complejo con DCM (29,9 g, 36,7 mmol). La mezcla se purgó al vacío con N2 (2 x), y se calentó a 100 ºC. La reacción

10 se controló por LC-MS, y se consideró completa después de 4 h. La reacción se enfrió a ta (21 ºC), y a continuación se dividió en dos lotes. Cada lote se repartió entre EtOAc (1,08 l) y agua (1,35 l) en un embudo de decantación de número 4 l. Después de separación de fases, la fase orgánica se lavó con salmuera (2 x 500 ml) y se concentró para proporcionar el producto en bruto. Los lotes combinados de material en bruto se cargaron sobre gel de sílice y se purificaron por cromatografía ultrarrápida (ISCO/RediSep™) (hexano:EtOAc = 10:0 a 6:4) para proporcionar el

15 producto en forma de un sólido de color marrón claro de 320 g con una pureza de un 98 % por LC y rendimiento de un 95%. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,15 -8,31 (m, 1 H), 8,07 (m, 1H), 7,93 (m, 1 H), 7,77 (m, 2 H), 7,64 (s. a., 2 H), 7,16 -7,55 (m, 3 H), 6,58 -7,02 (m, 1 H), 5,72 -5,98 (m, 1H), 3,29 (s, 3 H), 1,79 (d, J= 6,9 Hz, 3 H) Espectro de Masas (ESI) m/z = 460,0 (M + 1).

20

2-((1S)-1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)etil)-isoindolin-1,3-diona

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25 Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un embudo de adición, entrada de nitrógeno, agitador superior y termopar se cargó con Montmorillonita K10 (274 g, 274 mmol) y agua (54,2 ml). La mezcla se agitó vigorosamente durante ~10 min, cuando se obtuvo un polvo de flujo libre. En este momento, se añadió DCM (1,26 ml) seguido de Oxone (421 g, 685 mmol). La temperatura de la reacción disminuyó hasta 15 ºC. Una solución de 2-((1S)-1-(5-cloro-3-(2-(metiltio)fenil)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona (126 g, 274 mmol) en DCM (630 ml) se

30 añadió a ta (18-20 ºC) a la suspensión de montmorillonita/oxone a través de un embudo de adición y la temperatura interna se controló para que fue inferior a 21 ºC con un baño de agua/hielo. La reacción se agitó a ta (19-21 ºC) y se controló por LC. Se consideró finalizada después de 96 h. La mezcla de reacción se filtró y los sólidos se lavaron con DCM (2 x 250 ml). La solución orgánica combinada se lavó con una solución acuosa de Na2SO3 al 10 % en peso (2 x 250 ml), se concentró y se secó para proporcionar el producto en forma de un sólido de color amarillo claro de

35 110 g con una pureza de un 97,6 % por LC y un rendimiento de un 82 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,14 -8,29 (m, 1 H), 7,64 -8,14 (m, 8 H), 7,52 (dd, J = 5,5, 3,0 Hz, 1 H), 7,21 -7,38 (m, 1 H), 5,59 -5,94 (m, 1 H), 3,10 -3,27 (m, 3 H), 1,66 -1,91 (m, 3 H) Espectro de Masas (ESI) m/z = 492,0 (M + 1).

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(S)-1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)etanamina

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5 Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un agitador superior, termopar y condensador de reflujo con una entrada de nitrógeno se cargó con (S)-2-(1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2il)etil)isoindolin-1,3-diona (193 g, 392 mmol), agua (1351 ml) e hidrazina, solución al 35 % en peso en agua (711 ml, 785 mmol). La suspensión de color blanco resultante se agitó vigorosamente a 65 ºC en atmósfera de nitrógeno durante 6 h y a continuación se dejó enfriar a ta durante una noche. Después de este tiempo, el análisis de LC-MS

10 mostraba la conversión completa en el producto deseado. El sólido de color blanco se aisló por filtración, se lavó con agua y se secó en el filtro de vidrio en una corriente de nitrógeno durante 4 h para dar (S)-1-(5-cloro-3-(2(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)etanamina (129,7 g). Espectro de Masas (ESI) m/z = 362,0 (M + 1).

(S)-4-amino-6-((1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)-etil)amino)pirimidin-5-carbonitrilo

15

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Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 3 l equipado con un agitador superior, entrada de nitrógeno y termopar se cargó con (1S)-1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)etanamina (130 g, 358 mmol), 4-amino20 6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (55,4 g, 358 mmol), butan-1-ol (920 ml) y N,N-diisopropiletilamina (187 ml, 1,08 mol). La mezcla de reacción se calentó a una temperatura interna de 95-100 ºC durante 6 h y a continuación se dejó enfriar a ta durante una noche. Después de este tiempo, la reacción se calentó a una temperatura interna de 100 ºC y a continuación se enfrió hasta an temperatura interna de 50 ºC. Se añadió acetato de etilo (~1,5 l) a 50 ºC y la reacción se dejó enfriar a ta. La solución resultante se lavó con agua (3 x 1 l), NaHSO4 ac. al 10 % en peso (4 x 1 l) y 25 salmuera (1 x 500 ml). La fase orgánica separada se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío. El residuo resultante se suspendió en tolueno (1 l), se evaporó al vacío y se secó a alto vacío durante 36 h (se obtuvieron 247 g de material en bruto). El material en bruto se suspendió en EtOAc (2 l), se filtró y se lavó con una solución acuosa de NaHSO4 al 10 % en peso (4 x 1 l). En la fase de EtOAc empezó a formarse un sólido de color blanco. Se añadió una barra de agitación magnética y la suspensión se agitó a ta durante una noche y a 0 ºC durante 2 h. El sólido de color 30 blanco se aisló por filtración del EtOAc y se secó en un filtro de vidrio en una corriente de nitrógeno durante dos días, el filtrado de EtOAc (filtrado A) se dejó aparte. El sólido de color blanco (51 g) suspendió a continuación en EtOAc (2 l) y se añadió NaHCO3 acuoso saturado (1 l). La suspensión resultante se agitó durante 15 min dando como resultado una mezcla de dos fases. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró al vacío para dar el producto deseado. A continuación el filtrado A se concentró al vacío, se adsorbió sobre sílice y se 35 purificó por MPLC (DCM/MeOH + NH4OH al 10 %: 100/0 a 90/10) para dar 92 g del producto deseado. Los dos productos aislados se combinaron y se disolvieron en EtOH (500 ml). La solución resultante se concentró al vacío. Este proceso de disolución en EtOH y concentración se repitió tres veces (3 x 500 ml). El sólido resultante se molió (mortero y mano) hasta un polvo y se secó en un horno de vacío (temperatura: 90-100 ºC) sobre P2O5 durante 84 h. Después de este tiempo con el material se molió de nuevo, se transfirió a un recipiente de gran tamaño y se secó a 40 alto vacío a 100-110 ºC durante 24 h para dar (S)-4-amino-6-((1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2il)etil)amino)pirimidin-5-carbonitrilo (127,9 g). RMN 1H (DMSO-d6) δ ppm 8,06 -8,20 (m, 3 H), 7,96 -7,77 (m, 5 H), 7,64-7,65 y 6,79-6,80 (m, 1 H), 7,28 (s. a., 2H), 5,42-5,45 (m, 1 H), 3,32 y 3,22 (s, 3 H), 1,51 y 1,40 (d, J = 6,6 Hz,

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Ejemplo 6: Preparación de 2-((S)-1-(6-amino-5-cianopirimidin-4-ilamino)-etil)-3-(2(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-5-carbonitrilo

2-((S)-1-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)etil)-3-(2-(metilsulfonil)fenil)-quinoxalin-5-carbonitrilo

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10 Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un condensador, entrada de nitrógeno, agitador superior y termopar se cargó con 2-((1S)-1-(5-cloro-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona (400 g, 813 mmol), dicianocinc (143 g, 1,22 mol) y 1,4-dioxano (4,0 l). La solución se agitó vigorosamente y se desgasificó con Ar durante 1 h. A continuación, a la solución se le añadió precatalizador de XPhos (66,1 g, 89 mmol).

15 A continuación, la mezcla se desgasificó con Ar durante 1 h y se calentó a 90 ºC. La reacción se controló por LC, y se consideró completa después de 8 h. La reacción se enfrió a ta (20-21 ºC) y se dividió en dos lotes. Para cada lote, se añadieron EtOAc (2,0 l), NaHCO3 (400 ml) y agua (400 ml). La mezcla se agitó durante 10 min y se formó un precipitado. Los precipitados se filtraron para proporcionar el producto puro en forma de un sólido de color blanco de 201,5 g. Las aguas madre se lavó con salmuera (800 ml) y la fase orgánica se concentró para proporcionar el

20 producto en bruto de ~400 g. El material en bruto se suspendió a continuación en EtOAc (1,2 l) durante 30 min a ta. El sólido se filtró, se lavó con EtOAc (2 x 400 ml) y se secó para proporcionar el producto en forma de un sólido de color castaño de 220 g. Todos los sólidos se combinaron, se secaron en una frita sinterizada ha vacío suave y una corriente de N2 durante 2 días para proporcionar el producto en forma de un sólido de color blanco de 378 g con una pureza de un 99,6 % por LC y un rendimiento de un 96 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,47 -8,68 (m, 2 H),

25 7,66 -8,19 (m, 7 H), 7,52 (dd, J = 5,5, 3,0 Hz, 1 H), 7,22 -7,40 (m, 1 H), 5,61 -5,95 (m, 1H), 3,11 -3,27 (m, 3 H), 1,68 -1,93 (m, 3H) Espectro de Masas (ESI) m/z = 483,0 (M + 1).

2-((S)-1-aminoetil)-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-5-carbonitrilo

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Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con a entrada de nitrógeno, agitador superior y termopar

se cargó con hidrato de hidrazina (381 ml, 783 mmol) y EtOH (3,0 l). A continuación a la solución se le añadió 2-((S)

1-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)etil)-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-5-carbonitrilo (378 g, 783 mmol) en una porción y se 35 calentó a 80 ºC. La reacción se controló por LC, y se consideró completa una vez que la reacción alcanzó de nuevo

80 ºC. La reacción se enfrió a temp ambiente (20-21 ºC), cuando se añadieron DCM (3,0 l) y NaHCO3 satd. (600 ml).

Después de separación de fases, la fase orgánica se lavó con salmuera (2 x 600 ml), se concentró y se secó al vacío

y flujo de N2 durante 24 h para proporcionar el producto en forma de un sólido de color amarillo claro de 257,7 g con

una pureza de un 94,4 % por LC, (no se detectó enantiómero R) y un rendimiento de un 93 %. RMN 1H (400 MHz, 40 DMSO-d6) δ ppm 8,45 -8,54 (m, 2 H), 8,18 (dt, J= 7,7, 1,5 Hz, 1 H), 8,05 (dd, J= 8,5, 7,4 Hz, 1 H), 7,76 -8,00 (m,

3 H), 3,83 -4,03 (m, 1 H), 3,25 -3,32 (m, 3 H), 1,19 -1,39 (m, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/z = 353,0 (M + 1).

imagen63

2-((S)-número-(6-amino-5-cianopirimidin-4-ilamino)etil)-3-(2-(metilsulfonil)-fenil)quinoxalin-5-carbonitrilo

imagen64

5 Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un agitador mecánico, un condensador, una entrada de gas nitrógeno y una sonda de temperatura se cargó con 2-((S)-1-aminoetil)-3-(2-(metilsulfonil)fenil)quinoxalin-5carbonitrilo (257,7 g, 731 mmol), 4-amino-6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (120 g, 775 mmol) y butan-1-ol (2,5 l). La solución se agitó a ta (19-22 ºC) durante 5 min y se añadió N,N-diisopropiletilamina (363 ml, 219 mmol) en una porción. La solución se calentó a 95 ºC, se controló por LC, y se consideró completa después de 4 h. La reacción se

10 enfrió a ta cuando se añadieron EtOAc (2,0 l) y agua (500 ml). Las dos fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera (500 ml), se concentró hasta retirar la mayor parte del EtOAc, y se forma un precipitado. El precipitado se filtró y se lavó con una cantidad mínima de MeOH. El sólido se secó al vacío durante 18 h para proporcionar un sólido de color amarillo claro, 305 g. Las aguas madre se concentraron, hasta que precipitó más producto. El sólido se filtró, se lavó con MeOH (2 x 200 ml), se secó al vacío durante 24 h para proporcionar el producto en forma de un

15 sólido (45 g). Un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l equipado con un agitador mecánico, una entrada de gas nitrógeno y una sonda de temperatura se cargó con el producto bruto combinado de 350 g y MeOH (3,5 l). La mezcla se agito a ta (19-22 ºC) durante 2 días. El sólido se filtró, se lavó con MeOH (2 x 350 ml), se secó al vacío y flujo de N2 durante 24 h para proporcionar un sólido de color crema (276,2 g) con una pureza de un 99,4 % por HPLC, (no se detectó enantiómero R) y un rendimiento de un 80 %. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,43 -8,59

20 (m, 2 H), 8,01 -8,23 (m, 2 H), 7,71-7,99 (m, 4 H), 7,61 (d, J= 7,0 Hz, 1 H), 7,24 (s a, 2 H), 5,33 -5,68 (m, 1 H), 3,19 -3,33 (m, 3 H), 1,34 -1,55 (m, 3 H) Espectro de Masas (ESI) m/z = 471,1 (M + 1).

Ejemplo 7: Preparación de (S)-4-amino-6-((1-(6-fluoro-3-(piridina-2-il)-quinoxalin-2-il)etil)amino)pirimidin-5carbonitrilo

25

Ácido 2-((4-fluoro-2-nitrofenil)amino)butanoico

imagen65

30 Una mezcla de 2,5-difluoronitrobenceno (119 ml, 1,10 mol), ácido 2-aminobutanoico (114 g, 1,10 mol) y carbonato potásico (152,2 g, 1,10 mol) en dimetilsulfóxido (410 ml, 1,10 mol) se agitó a 80 ºC durante 23 h. ([Nota 1]: La mezcla tenía un color rojo anaranjado intenso. La temperatura interna de la mezcla se elevó hasta -110 ºC durante 1 h y a continuación se redujo hasta 80 ºC). Después de 23 h, la reacción se enfrió a ta y se vertió con cuidado en agua (2 l + 1 l). La mezcla acuosa se lavó con éter dietílico (1 l x 2) para retirar las impurezas orgánicas. La fase

35 acuosa se acidificó a continuación a ~ pH 1,5 con HCl concentrado (300 ml) para generar un sólido de color amarillo. El sólido de color amarillo se recogió por filtración, se lavó con agua (3 l), y se secó al aire para dar el producto deseado, un sólido de color naranja húmedo. El sólido de color naranja húmedo se recristalizó en 3 l de tolueno y se dejó en reposo a ta durante una noche para proporcionar el producto deseado en forma de un sólido cristalino de color naranja. El sólido cristalino de color naranja se filtró, se lavó con tolueno (2 l), y se secó a alto vacío a 80 ºC

40 durante 4 h y a continuación en liofilizador durante una noche para proporcionar ácido 2-(4-fluoro-2-nitrofenilamino)butanoico (203,6 g, rendimiento de un 76,4 %) en forma de un sólido cristalino de color naranja. El sólido cristalino de color naranja se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 13,30 (s. a. 1 H), 8,28 (d, J= 7,4 Hz, 1 H), 7,90 (dd, J= 9,4, 2,9 Hz, 1 H), 7,49 7,60 (m, 1 H), 7,09 (dd, J= 9,6, 4,7 Hz, 1 H), 4,49 (dt, J= 7,2, 5,5 Hz, 1 H), 1,79 -2,00 (m, 2 H), 0,85 -0,93 (m, 3 H),

45 Espectro de Masas (ESI) m/e = 243,1 (M + 1).

imagen66

3-Etil-7-fluoro-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona

imagen67

5 La mezcla heterogénea de ácido 2-(4-fluoro-2-nitrofenilamino)butanoico (181,7 g, 750,0 mmol), HCl ac. 3 N (750,0 ml, 2250 mmol) y etanol (1923 ml, 750,0 mmol) en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 5 l se añadió a dihidrato de cloruro de estaño(II) (507,7 g, 2250 mmol) y la mezcla de color naranja se calentó a 78 ºC con agitación usando un agitador superior durante 4 h ([Nota 1]: La mezcla heterogénea de color naranja se convirtió en una mezcla homogénea de color naranja y el color naranja cambió a un color rojo durante ~ 2 horas). Después de

10 4 h, la mezcla se enfrió a ta y se concentró a presión reducida para retirar etanol, y se dejó a ta durante 48 h. El precipitado de color amarillo resultante se recogió por filtración y se lavó con agua (500 ml). El sólido de color amarillo se suspendió en agua enfriada con hielo (1 l) y la mezcla se ajustó ~ pH 13 con KOH (~250 g). La mezcla heterogénea se extrajo con DCM (1 l x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua (1 l x 1) y salmuera (1 l x 1), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 3-etil-7-fluoro-3,4

15 dihidroquinoxalin-2(1H)-ona (60,92 g, rendimiento de un 41,8 %) en forma de un sólido de color amarillo claro. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 10,26 (s, 1 H), 6,68 (dd, J= 8,6, 5,5 Hz, 1 H), 6,47 -6,61 (m, 2 H), 5,95 (d, J= 1,2 Hz, 1 H), 3,62 (ddd, J = 6,7, 5,0, 2,0 Hz, 1 H), 1,50 -1,72 (m, 2 H), 0,92 (t, J= 7,4 Hz, 3 H), Espectro de Masas (ESI) m/e = 195,1 (M + 1).

20 3-Etil-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona

imagen68

A una solución homogénea de 3-etil-7-fluoro-3,4-dihidroquinoxalin-2(1H)-ona (60,61 g, 312,1 mmol) y 1,4-dioxano

25 (1350 ml) se añadió 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (75,91 g, 327,7 mmol) y la mezcla se agitó usando un agitador superior a ta durante 2,5 h. En este momento, la mezcla se concentró a presión reducida para dar un residuo de color marrón. El residuo de color marrón se suspendió en NaHCO3 acuoso saturado (2 l), se agitó durante 30 min, se filtró, se lavó con NaHCO3 acuoso saturado (1 l) para dar un sólido de color verde claro. El sólido de color verde claro se volvió a suspender en NaHCO3 acuoso saturado (500 ml), se mezcló bien, se filtró, y se lavó con

30 NaHCO3 acuoso saturado (500 ml) para dar un sólido de color blanquecino. El sólido de color blanquecino se suspendió en agua (500 ml), se mezcló bien, se filtró, se lavó con agua (1 l), se secó al aire durante una noche, y se secó a alto vacío a 22 ºC durante 2 h para dar 3-etil-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona (56,87 g, rendimiento de un 94,8 %) en forma de un sólido de color blanquecino. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,36 (s. a., 1 H), 7,76 (dd, J= 9,0, 5,9 Hz, 1 H), 7,11 (td, J= 8,8, 2,7 Hz, 1 H), 7,00 (dd, J= 9,6, 2,7 Hz, 1 H), 2,78 (c, J= 7,4 Hz, 2 H), 1,20

35 (t, J= 7,4 Hz, 3 H) Espectro de Masas (ESI) m/e = 193,0 (M + 1).

3-(1-Bromoetil)-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona

imagen69

40 3-Etil-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona (20,61 g, 107,2 mmol) y 1,3-dibromo-5,5-dimetilhidantoína (18,77 g, 64,34 mmol) se suspendieron en tetracloruro de carbono (1072 ml, 107,2 mmol). A la mezcla heterogénea se añadió peróxido de benzoílo (3,463 g, 10,72 mmol) y la mezcla se calentó a reflujo con agitación (temperatura del baño de aceite: 80 ºC) durante 20 h. Después de 20 h, la mezcla se enfrió a ta. Después de un periodo de refrigeración, la mezcla se vertió

45 en una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico (1 l) con agitación. El precipitado se recogió por filtración y se lavó con agua (1 l) para dar 3-(1-bromoetil)-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona (23,19 g, rendimiento de un 79,8 %) en forma de un sólido de color castaño: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12,68 (s. a., 1 H.), 7,85 (dd, J= 9,0, 5,9 Hz, 1 H), 7,19 (td, J= 8,8, 2,7 Hz, 1 H), 7,05 (dd, J= 9,8, 2,7 Hz, 1 H), 5,62 (c, J= 6,7 Hz, 1 H), 1,99 (d, J= 6,7 Hz, 3 H), puro en ~90 % Espectro de Masas (ESI) m/e = 271,0 [M + H (79Br)]+ y 273,0 [M + H (81Br)]+.

imagen70

2-(1-Bromoetil)-3-cloro-6-fluoroquinoxalina3-Cloro-2-(1-cloroetil)-6-fluoroquinoxalina

imagen71

Una mezcla heterogénea de 3-(1-bromoetil)-7-fluoroquinoxalin-2(1H)-ona (58,86 g, 217,1 mmol) y oxicloruro de

10 fósforo (198,8 ml, 2171 mmol) en un matraz de fondo redondo de 1 l se agitó a 100 ºC durante 2 h. La mezcla era heterogénea al comienzo de la reacción y a continuación se convierte en una solución homogénea de color negro durante 1 h. Después de 2 h, la mezcla se enfrió a ta y se concentró a presión reducida. agresivo de color negro se le añadió hielo (~ 400 ml) con cuidado en porciones y a continuación agua (200 ml) con agitación. La mezcla se neutralizó con NH4OH (200 ml) y hielo (~ 200 ml) con agitación. El precipitado resultante se recogió por filtración, se

15 aclaró con agua (1 l), y se secó a alto vacío durante una noche para dar 2-(1-bromoetil)-3-cloro-6-fluoroquinoxalina (58,31 g, rendimiento de un 92,8 %) incluyendo 3-cloro-2-(1-cloroetil)-6-fluoroquinoxalina en forma de un sólido de color /. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6), proporción de análogo de bromoetilo y análogo de cloroetilo = 2,5:1 Espectro de Masas (ESI) m/e = 288,9 [M + H (79Br)]+ y 291,0 [M + H (81Br)]+

20 2-(1-(3-Cloro-6-fluoroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona

imagen72

A una mezcla de 2-(1-bromoetil)-3-cloro-6-fluoroquinoxalina (57,17 g, 197,5 mmol) que contenía 3-cloro-2-(1

25 cloroetil)-6-fluoroquinoxalina (48,39 g, 197,5 mmol) en N,N-dimetilformamida (700,0 ml, 197,5 mmol) se añadió ftalimida potásica (91,43 g, 493,6 mmol) a ta y la mezcla se agitó a ta durante 1 h. Después de 1 h, a la mezcla se le añadió agua (2 l). La mezcla se extrajo con DCM (500 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1 l x 1), se secaron sobre MgSO4, se filtraron, y se concentraron a presión reducida para dar un líquido de color rojo. El líquido de color rojo se filtró a través de un lecho de sílice (14 cm de diámetro x 12,7 cm de altura), y se

30 eluyó con un 20 % de EtOAc en hexano, a continuación con un 30 % de EtOAc en hexano, y a continuación con un 100 % de EtOAc como eluyente para dar dos fracciones. Segunda fracción, producto deseado 2-(1-(3-cloro-6fluoroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona (53,367 g, rendimiento de un 75,97 %) en forma de un sólido de color rosa. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,25 (dd, J= 9,4, 5,9 Hz, 1 H), 7,81 -7,95 (m, 6 H), 5,86 (c, J= 6,8 Hz, 1 H), 1,86 (d, J= 7,0 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 356,0 (M + 1).

35

2-(1-(6-Fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona

imagen73

40 Una solución de 2-(1-(3-cloro-6-fluoroquinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona (50,14 g, 140,9 mmol), 2-tri-nbutilestanilpiridina (pura al 80 %) (76,95 ml, 211,4 mmol), y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (16,29 g, 14,09 mmol)

imagen74

en 1,4-dioxano (1175 ml, 140,9 mmol) se agitó a 110 ºC durante 29 h. Después de 29 h, la mezcla se enfrió a ta y se concentró a presión reducida para dar un sólido con consistencia de jarabe de color verde. Al residuo se añadió DCM (200 ml). La mezcla se calentó a reflujo durante 20 min y a continuación se enfrió a 0 ºC con agitación. El sólido se recogió por filtración y se lavó con EtOAc-hexano (1:5, 500 ml) para dar el producto deseado (52,82 g, 5 rendimiento de un 94,07 %). El sólido de color marrón oscuro se disolvió en CH2Cl2:MeOH (9:1, 400 ml, caliente), se filtró a través de un lecho de gel de sílice (150 g, 8,5 cm de diámetro x 5,5 cm de altura) para retirar el paladio residual y se lavó con CH2Cl2:MeOH (9:1, 600 ml). El filtrado se concentró a presión reducida para dar un sólido de color marrón (49,94 g, rendimiento de un 88,9 %). El sólido de color marrón se suspendió en EtOAc-hexano (1:9, 400 ml) y la mezcla se calentó a reflujo durante 40 min. La mezcla se enfrió a ta, se filtró, se lavó con EtOAc-hexano

10 (1:9, 600 ml), y se secó para dar el producto deseado 2-(1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3diona (47,76 g, rendimiento de un 85,06 %) en forma de un sólido de color castaño. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,47 -8,53 (m, 1 H), 8,20 (dd, J= 9,4, 5,9 Hz, 1 H), 7,94 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1 H), 7,85 (td, J= 8,9, 2,9 Hz, 1 H), 7,64 -7,80 (m, 6 H), 7,30 -7,37 (m, 1 H), 6,42 (c, J= 6,9 Hz, 1 H), 1,76 (d, J= 7,0 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 399,1 (M + 1).

15

1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina

imagen75

20 A una mezcla heterogénea de 2-(1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etil)isoindolin-1,3-diona (47,26 g, 118,6 mmol) en etanol (768,3 ml, 118,6 mmol) se añadió hidrazina, monohidrato (28,77 ml, 593,1 mmol) y la mezcla se agitó a 95 ºC durante 1 h. La mezcla de reacción heterogénea continuaba en solución después de 15 min, pero fue seguido de un precipitado de color blanco voluminoso. Después de 1 h, la mezcla se enfrió a ta. El precipitado se separó con una espátula, se filtró y se lavó con EtOAc (porciones de 3 x 250 ml). El filtrado se concentró a presión

25 reducida. El residuo se disolvió de nuevo en EtOAc (600 ml) y agua (300 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (100 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina (30,95 g, rendimiento de un 97,25 %) en forma de un sólido de color marrón. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,75 (dc, J= 4,7, 0,9 Hz, 1 H), 8,20 (dd, J= 9,0, 5,9 Hz, 1 H), 7,98 -8,11 (m, 2 H), 7,91 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1 H), 7,78 -7,86 (m, 1 H),

30 7,56 -7,61 (m, 1 H), 4,66 (c, J= 6,7 Hz, 1 H), 2,08 (s. a., 2 H), 1,35 (d, J= 6,7 Hz, 3 H). Espectro de Masas (ESI) m/e = 269,0 (M + 1). [HPLC Quiral] (columna Chiralpak AD-H, 0,46 x 250 mm, 5 um) usando un 10 % isocrático de isopropanol en hexano como eluyente: dos picos a 9,350 min y a 10,678 min a 254 nm, (columna Chiralpak OD-H, 0,46 x 250 mm, 5 um) usando un 10 % isocrático de isopropanol en hexano como eluyente: dos picos a 9,69 min y a 11,22 min a 254 nm.

35

(S)-1-(6-Fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina

(R)-1-(6-Fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina

imagen76

40 Separación Quiral: La mezcla racémica (30,95 g) se sometió a separación quiral usando SFC. La muestra se disolvió en 800 ml de MeOH (+ traza de TFA), 1,3 ml de solución de muestra, es decir 50,3 mg cada inyección en el sistema de separación. La cromatografía de fluido supercrítico Semi-Prep (SFC) se realizó usando un Thar 350 SFC (presión de salida: 12 MPa, a 327 nm) con una: columna de AS-H, 250 x 30 mm (5 micrómetros) Fase Móvil:

45 36 g/min de MeOH (DEA al 0,2%) más 54 g/min CO2 (Temp. = 22 ºC) Después de separación quiral, cada fracción se co-evaporó dos veces con tolueno y etanol para retirar dietilamina. Primer Pico en columna de AS-H y segundo pico en columna de AD-H (10,678 min): (R)-1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina (13,5173 g, 50,4 mmol, rendimiento de un 43,7 %) en forma de un sólido de color marrón. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm

imagen77

8,76 (dc, J= 4,7, 0,9 Hz, 1 H), 8,20 (dd, J= 9,0, 5,9 Hz, 1 H), 7,99 -8,10 (m, 2 H), 7,91 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1 H), 7,82 (td, J= 8,9, 2,9 Hz, 1 H), 7,56 -7,61 (m, 1 H), 4,66 (c, J= 6,7 Hz, 1 H), 2,07 (s, 2 H), 1,35 (d, J= 6,7 Hz, 3 H), contenía óxido de trifenilfosfina; Espectro de Masas (ESI) m/e = 269,0 (M + 1). [HPLC] un pico a 4,996 min, puro al 99,56 % a 254 nm; [HPLC Quiral] (columna Chiralpak AD-H, 0,46 x 250 mm, 5 mm) usando un 10 % isocrático de 5 isopropanol en hexano como eluyente: un pico a 11,432 min (segundo enantiómero de elución) a 254 nm; [Análisis de Exceso Enantiomérico]: ee de un 99 %, primer enantiómero de elución en columna AS-H. Segundo pico en columna AS-H y primer pico en columna AD-H (9,350 min): (S)-1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etanamina (12,6738 g, 47,2 mmol, rendimiento de un 40,9 %) en forma de un sólido con consistencia de jarabe de color marrón: RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,73 -8,78 (m, J= 4,8, 1,2, 0,9, 0,9 Hz, 1 H), 8,20 (dd, J= 9,4, 5,9 Hz, 1 H), 10 7,99 -8,10 (m, 2 H), 7,91 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1 H), 7,82 (td, J= 8,9, 2,9 Hz, 1 H), 7,58 (ddd, J= 7,4, 4,9, 1,4 Hz, 1 H), 4,66 (c, J= 6,4 Hz, 1 H), 2,07 (s a, 2 H), 1,35 (d, J= 6,7 Hz, 3 H); Espectro de Masas (ESI) m/e = 269,0 (M + 1). [HPLC Quiral] (columna Chiralpak AD-H, 0,46 x 250 mm, 5 mm) usando 10 % isocrático de isopropanol en hexano como eluyente: un pico 9,135 min (primer enantiómero de elución) a 254 nm; [Análisis de Exceso Enantiomérico]: ee de un 98,86 %, segundo enantiómero de elución en una columna AS-H. La estereoquímica se

15 confirmó como isómero S en la siguiente etapa.

(S)-4-Amino-6-((1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etil)amino)-pirimidin-5-carbonitrilo

imagen78

20 Una mezcla de 4-amino-6-cloropirimidin-5-carbonitrilo (0,060 g, 0,39 mmol), (S)-1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin2-il)etanamina (0,105 g, 0,391 mmol), y N,N-diisopropiletilamina (0,205 ml, 1,17 mmol) en butan-1-ol (3,91 ml) se agitó a 120 ºC durante 3 h. Después de 3 h, la mezcla se retiró del calor y se dejó a ta. La mezcla se concentró a presión reducida para dar un sólido de color amarillo. Al sólido de color amarillo se le añadió agua (30 ml). El sólido

25 resultante se filtró, se lavó con agua (30 ml), seco al aire para dar el producto en forma de un sólido de color marrón. El sólido de color marrón se purificó por cromatografía en columna en 40 g de una columna Redi-Sep usando un gradiente de 0 a 50 % de CH2Cl2:MeOH:NH4OH (89:9:1) en CH2Cl2 durante 14 min y a continuación un 50 % isocrático de CH2Cl2:MeOH:NH4OH (89:9:1) en CH2Cl2 durante 14 min como eluyente para dar un sólido de color amarillo claro (0,1246 g). El sólido de color amarillo claro se suspendió en EtOAc-hexano (1:4), se filtró y se secó

30 para dar (S)-4-amino-6-(1-(6-fluoro-3-(piridin-2-il)quinoxalin-2-il)etilamino)pirimidin-5-carbonitrilo (0,1121 g, 0,290 mmol, rendimiento de un 74,1 %) en forma de un sólido de color marrón. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8,66 -8,74 (m, 1 H), 8,19 (dd, J= 9,4, 5,9 Hz, 1 H), 7,99 -8,09 (m, 2 H), 7,95 (dd, J= 9,4, 2,7 Hz, 1 H), 7,80 -7,89 (m, 2 H), 7,70 (d, J= 7,4 Hz, 1 H), 7,53 (ddd, J= 6,9, 5,0, 1,8 Hz, 1 H), 7,20 (s a, 2 H), 6,09 -6,21 (m, 1 H), 1,54 (d, J= 6,7 Hz, 3 H); Espectro de Masas (ESI) m/e = 387,1 (M + 1). [HPLC Quiral]

35 (columna Chiralpak AD-H, 0,46 x 250 mm, 5 mm) usando 10 % de isocrático de isopropanol en hexano como eluyente: un pico a 16,038 min a 254 nm.

Ensayos Biológicos

40 Expresión recombinantes de las PI3K

Las subunidades de p110 de longitud completa de PI3k α, β y δ, etiquetadas de forma N-terminal con etiqueta de poliHis, se coexpresaron con p85 con vectores de expresión de Baculo virus en células de insecto sf9. Los heterodímeros P110/p85 se purificaron por Ni-NTA secuencial, Q-HP, cromatografía Superdex-100. Las isoenzimas

45 α, β y δ purificadas se almacenaron a -20 ºC en Tris 20 mM, pH 8, NaCl 0,2 M, glicerol al 50 %, DTT 5 mM, colato de Na 2 mM. La PI3Kγ truncada, los restos 114-1102, etiquetados de forma N-terminal con etiqueta de poliHis, se expresaron con Baculo virus en células de insecto Hi5. La isoenzima γ se purificó por Ni-NTA secuencial, Superdex200, cromatografía de Q-HP. La isoenzima γ se almacenó congelada a -80 ºC en NaH2PO4, pH 8, NaCl 0,2 M, etilenglicol al 1 %, β-mercaptoetanol 2 mM.

50

Alfa

Beta Delta Gamma

Tris 50 mM

pH 8 pH 7,5 pH 7,5 pH 8

MgCl2

15 mM 10 mM 10 mM 15 mM

imagen79

Alfa

Beta Delta Gamma

Colato de Na

2 mM 1 mM 0,5 mM 2 mM

DTT

2 mM 1 mM 1 mM 2 mM

ATP

1 uM 0,5 uM 0,5 uM 1 uM

PIP2

ninguno 2,5 uM 2,5 uM ninguno

tiempo

1 h 2 h 2 h 1 h

[Enzima]

15 nM 40 nM 15 nM 50 nM

Ensayos enzimáticos in vitro

Los ensayos se realizaron en 25 µl con las concentraciones finales mencionadas anteriormente de componentes en

5 placas de polipropileno de color blanco (Costar 3355). El fosfoaceptor de fosfatidil inositol, PtdIns(4,5)P2 P4508, era de Echelon Biosciences. La actividad de ATPasa de las isoenzimas alfa y gamma no estaba estimulada en gran medida con PtdIns(4,5)P2 en estas condiciones y por lo tanto se omitió del ensayo de estas isoenzimas. Los compuestos de ensayo se disolvieron en dimetilsulfóxido y se diluyeron con diluciones en serie tres veces. El compuesto en DMSO (1 µl) se añadió por pocillo de ensayo, y la inhibición relativa a reacciones que no contenían

10 compuesto, con y sin enzimas se determinó. Después de incubación de ensayo a ta, la reacción se detuvo y el ATP residual se determinó mediante la adición de un volumen igual de un kit de bioluminiscencia de ATP comercial (Perkin Elmer EasyLite) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se detectó usando un luminómetro AnalystGT.

15 Estimularla proliferación de linfocitos B humanos con anti-IgM

Aislar linfocitos humanos B:

Las PBMC aisladas de Leukopac o de sangre recién extraída humana. Aislar linfocitos B humanos usando el

20 protocolo Miltenyi y el kit II de aislamiento de linfocitos B -los linfocitos B humano se purificaron usando columna de AutoMacs.

Activación de linfocitos B humanos

25 Usar placa de fondo plano de 96 pocillos, linfocitos B purificados en placa 50000/pocillo en medio de proliferación de linfocitos B (DMEM + FCS al 5 %, Hepes 10 mM, 2-mercaptoetanol 50 µM); 150 µl de medio que contiene 250 ng/ml de CD40L -proteína recombinante LZ (Amgen) y 2 µg/ml de anticuerpo IgM anti-Humano (Jackson ImmunoReseach Lab. n.º 109-006-129), mezclado con 50 µl de medio de linfocitos B que contiene inhibidores de PI3K e incubar 72 h a 37 ºC en incubadora. Después de 72 h, pulsar el etiquetado de linfocitos B con 0,5-1 uCi/pocillo de 3H timidina

30 durante una noche ~18 h, y cosechar células usando cosechador TOM.

Estimular la proliferación de linfocitos B humanos con IL-4

Aislar linfocitos B humanos:

35 Aislar las PBMC humanas a partir de Leukopac o de sangre recién extraída humana. Aislar los linfocitos B usando el protocolo Miltenyi -kit de aislamiento de linfocitos B. Los linfocitos B humanos se purificaron con columna AutoMacs.

Activación de linfocitos B humanos

40 Usar placa de fondo plano de 96 pocillos, linfocitos B purificados en placa 50000/pocillo en medio de proliferación de linfocitos B (DMEM + FCS al 5 %, 2-mercaptoetanol 50 µM, Hepes 10 mM). El medio (150 µl) contiene 250 ng/ml de CD40L -proteína recombinante LZ (Amgen) y 10 ng/ml de IL-4 (R&D system n.º 204-IL-025), mezclado con 50 150 µl de medio de linfocitos B que contienen compuestos e incubar 72 h a 37 ºC en incubadora. Después de 72 h,

45 pulsar el etiquetado de linfocitos B con 0,5-1 uCi/pocillo de 3H timidina durante una noche ~18 h, y cosechar células usando cosechador TOM.

Ensayos de proliferación de PBMC humanas inducida por antígeno T (toxoide del tétanos) específico

50 Las PBMC humanas se preparan a partir de reservas congeladas o se purifican a partir de sangre humana recién extraída usando un gradiente Ficoll. Usar placa de fondo redondo de 96 pocillos y placa de 2 x 105 PBMC/pocillo con medio de cultivo (RPMI 1640 + FCS al 10 %, 2-Mercaptoetanol 50 uM, Hepes 10 mM). Para determinaciones de CI50, los inhibidores de PI3K se sometieron a ensayo a partir de 10 µM a 0,001 µM, en incrementos semilogarítmicos y por triplicado. El toxoide del tétanos, antígeno específico de linfocitos T (Universidad de Massachusetts Lab) se añadió a 1 µg/ml y se incubó 6 días a 37 ºC en incubadora. Los sobrenadantes se recogen después de 6 días para ensayo de IL2 ELISA, a continuación las células se pulsan con 3H-timidina durante ~18 h para medir la proliferación.

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Ensayos de GFP para detectar la inhibición de PI3K de Clase la y Clase III

5 AKT1 (PKBa) está regulada por la PI3K de Clase la activada por factores mitogénicos (IGF-1, PDGF, insulina, trombina, NGF, etc.). Como respuesta a los estímulos mitogénicos, AKTT se transloca desde el citosol a la membrana plasmática

Forkhead (FKHRL1) es un sustrato para AKTT. Es citoplasmático cuando se fosforila por AKT (supervivencia/crecimiento). La inhibición de AKT (estasis/apoptosis) -translocación forkhead a los dominios FYVE del núcleo que se unen a PI(3)P. La mayor parte está generada por acción constitutiva de PI3K de Clase III.

Ensayo de alteración de membrana AKT (células CHO-IR-AKT1-EGFP/GE Healthcare)

15 Lavar las células con tampón de ensayo. Tratar con compuestos en tampón de ensayo 1 h. Añadir 10 ng/ml de insulina. Fijar después de 10 min a temperatura ambiente y formar imágenes.

Ensayo de translocación Forkhead (células MDA MB468 Forkhead-Diversa GFP)

Tratar las células con compuesta en medio de crecimiento 1 h. Fijar y formar imágenes.

Ensayo de PI(3)P de Clase III (células U2OS EGFP-2XFYVE /GE Healthcare)

25 Lavar las células con tampón de ensayo. Tratar con compuestos en tampón de ensayo 1 h. Fijar y formar imágenes.

El control para los 3 ensayos es Wortmanina 10 uM:

AKT es citoplasmático Forkhead es nuclear PI(3)P suprimido de endosomas

Ensayo de biomarcador: estimulación del receptor de linfocitos B de expresión de CD69 o B7.2 (CD86)

La sangre completa humana heparinizada se estímulo con 10 µg/ml de anti-IgD (Southern Biotech, n.º 9030-01). A

35 continuación se tomaron alícuotas de 90 µl de la sangre estimulada por pocillo de una placa de 96 pocillos y se trató con 10 µl de diversas concentraciones de compuesto de bloqueo (de 10-0,0003 µM) diluido en IMDM + FBS al 10 % (Gibco). Las muestras se incubaron juntas durante 4 h (para expresión de CD69) durante 6 h (para expresión de B7.2) a 37 ºC. La sangre tratada (50 µl) se transfirió alguna placa de pocillo profundo, de 96 pocillos (Nunc) para tinción de anticuerpo con 10 µl cada uno de CD45-PerCP (BD Biosciences, n.º 347464), CD19-FITC (BD Biosciences, n.º 340719), y CD69-PE (BD Biosciences, n.º 341652). Los segundos 50 µl de la sangre tratada se transfirieron alguna segunda placa de pocillo profundo de 96 pocillos para tinción de anticuerpo con 10 µl cada uno de CD19-FITC (BD Biosciences, n.º 340719) y CD86-PeCy5 (BD Biosciences, n.º 555666). Todas las tinciones se realizaron durante 15-30 min en la oscuridad a ta. A continuación, la sangre se lisó y se fijó usando 450 µl de solución de lisado de FACS (BD Biosciences, n.º 349202) durante 15 min a ta. A continuación, las muestras se

45 lavaron 2X en PBS + FBS al 2 % antes del análisis de FACS. Las muestras se seleccionaron en cualquiera de células doble positivas CD45/CD19 para tinción de CD69, o células positivas CD 19 para tinción de CD86.

Contraidentificación sistemática Gamma: Estimulación de monocitos humanos para expresión de fosfo-AKT

Una línea de células de monocitos humanos, THP-1, se mantuvo en RPMI + FBS al 10 % (Gibco). Un día antes de la estimulación, se hizo recuento de las células usando exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro y se suspendieron a una concentración de 1 x 106 células por ml de medios. A continuación, se tomaron alícuotas de 100 µl de células más medios (1 x 105 células) por pocillo de placas de fondo profundo de 4-96 pocillos (Nunc) para someter a ensayo ocho compuestos diferentes. Las células reposaron durante una noche antes del tratamiento con

55 diversas concentraciones (de 10-0,0003 µM) de compuesto de bloqueo. El compuesto diluido en medios (12 µl) se añadió a las células durante 10 min a 37 ºC. MCP-1 humano(12 µl, R&D Diagnostics, n.º 279-MC) se diluyó en medios y se añadió a cada pocillo hasta una concentración final de 50 ng/ml. La estimulación duró 2 min a ta. Se añadió tampón FACS Phosflow Lyse/Fix calentado previamente (1 ml a 37 ºC) (BD Biosciences, n.º 558049) a cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron a 37 ºC durante un periodo adicional de 10-15 min. Las placas centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min, el sobrenadante se retiró por aspiración, y se añadió 1 ml de MEOH al 90 % enfriado con hielo a cada pocillo con agitación vigorosa. A continuación, las placas se incubaron durante una noche a -70 ºC o en hielo durante 30 min antes de la tinción del anticuerpo. Las patas se centrifugaron y se lavaron 2X en PBS + FBS al 2 % (Gibco). El lavado se aspiró y las células se suspendieron en el tampón restante. Se añadió pAKT de conejo (50 µl, Cell Signaling, n.º 4058L) a 1:100, a cada muestra durante 1 h a ta con agitación. Las células

65 se lavaron y se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min. El sobrenadante se aspiró y las células se suspendieron en el tampón restante. El anticuerpo secundario, Alexa 647 anti-conejo de cabra (50 µl, Invitrogen, n.º A21245) a 1:500, se añadió durante 30 min a ta con agitación. A continuación, las células se lavaron 1X en tampón y se suspendieron en 150 µl de tampón para análisis de FACS. Es necesario dispersar las células muy bien mediante pipeteo antes de la realización en citómetro de flujo. Las células se desarrollaron en un LSRII (Becton Dickinson) y se seleccionaron en dispersión directa y lateral para determinar los niveles de expresión de pAKT en la población de

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5 monocitos.

Contraidentificación sistemática Gamma: Estimulación de monocitos para expresión de fosfo-AKT en médula ósea de ratón

Los fémures de ratón se diseccionaron a partir de cinco ratones BALB/c hembra (Charles River Labs.) y se recogieron en medio de RPMI + FBS al 10 % (Gibco). La médula ósea del ratón se retiró cortando los extremos del fémur y lavando abundantemente con 1 ml de medio usando una aguja de calibre 25. A continuación, la médula ósea se dispersó en medio usando una aguja de calibre 21. El volumen del medio aumentó hasta 20 ml y se hizo el recuento de las células usando exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro. A continuación, la suspensión 15 celular aumentó a 7,5 x 106 células por 1 ml de medio y se tomaron alícuotas de 100 µl (7,5 x 105 células) por pocillo en placas de pocillo profundo, de 4-96 pocillos (Nunc) para someter al ensayo ocho compuestos diferentes. Las células se dejaron en reposo a 37 ºC durante 2 h antes del tratamiento con diversas concentraciones (de 100,0003 µM) de compuesto de bloqueo. El compuesto diluido en medio (12 µl) se añadió a células de médula ósea durante 10 min a 37 ºC. El MCP-1 de ratón (12 µl, R&D Diagnostics, n.º 479-JE) se diluyó en medio y se añadió a cada pocillo hasta una concentración final de 50 ng/ml. La estimulación duró 2 min a ta. A cada pocillo se añadió 1 ml de tampón FACS Phosflow Lyse/Fix calentado previamente a 37 ºC (BD Biosciences, n.º 558049). A continuación, las placas se incubaron a 37 ºC durante un periodo adicional de 10-15 min. Las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min. El sobrenadante se retiró por aspiración y se añadió 1 ml de MEOH al 90 % enfriado con hielo a cada pocillo con agitación vigorosa. A continuación, las placas se incubaron bien durante 25 una noche a -70 ºC o bien en hielo durante 30 min antes de la tinción de anticuerpo. Las placas se centrifugaron y se lavaron 2X en PBS + FBS al 2 % (Gibco). El lavado se aspiro y las células se suspendieron en el tampón restante. El bloqueo de Fc (2 µl, BD Pharmingen, n.º 553140) se añadió a continuación por pocillo durante 10 min a ta. Después del bloqueo, 50 µl de anticuerpos primarios se diluyeron en tampón; CD11b-Alexa488 (BD Biosciences, n.º 557672) a 1:50, CD64-PE (BD Biosciences, n.º 558455) a 1:50, y pAKT de conejo (Cell Signaling, n.º 4058L) a 1:100, se añadieron a cada muestra durante 1 h a TA con agitación. El tampón de lavado se añadió a las células y se centrifugó a 1500 rpm durante 10 min. El sobrenadante se aspiró y las células se suspendieron en el tampón restante. El anticuerpo secundario; Alexa 647 anti-conejo de cabra (50 µl, Invitrogen, n.º A21245) a 1:500, se añadió durante 30 min a ta con agitación. A continuación, las células se lavaron 1X en tampón y suspendieron en 100 µl de tampón para análisis de FACS. Las células se desarrollaron en LSRII (Becton Dickinson) y se sometieron la

35 selección en células CD11b/CD64 doble positivas para determinar los niveles de expresión de pAKT en la población de monocitos.

Ensayo in vivo de pAKT

El vehículo y los compuestos se administran p.o. (0,2 ml) mediante sonda (Oral Gavage Needles Popper & Sons, New Hyde Park, NY) a ratones (Línea 3751 Transgénica, hembra, 10-12 semanas, Amgen Inc, Thousand Oaks, CA) 15 min antes de la inyección i.v (0,2 ml) de FITC anti-IgM (50 ug/ratón) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Después de 45 min, los ratones se sacrifican dentro de una cámara de CO . La sangre se extrae a través de punción cardiaca (0,3 ml) (Jeringas de 1 cc y 25 g, Sherwood, St. Louis, MO) y se transfieren en un vial cónico de 45 15 ml (Nalge/Nunc International, Dinamarca). La sangre se fija inmediatamente con 6,0 ml de Tampón BD Phosflow Lyse/Fix (BD Bioscience, San Jose, CA), se invierte 3X y se coloca en un baño de agua a 37 ºC. La mitad del bazo se retira y se transfiere a un tubo eppendorf que contiene 0,5 ml de PBS (Invitrogen Corp, Grand Island, NY). El bazo se tritura usando un triturador de tejidos (Pellet Pestle, Kimble/Kontes, Vineland, NJ) y se fija inmediatamente con 6,0 ml de tampón BD Phosflow Lyse/Fix, se invierte 3X y se coloca en un baño de agua a 37 ºC. Una vez que los tejidos se han recogido con el ratón se disloca por vía cervical y el esqueleto se descarta. Después de 15 min, los viales cónicos de 15 ml se retiran del baño de agua a 37 ºC y se colocan en hielo hasta que los tejidos se procesan adicionalmente. Los bazos triturados se filtran a través de un filtro celular de 70 µm (BD Bioscience, Bedford, MA) en otro vial cónico de 15 ml y se lavan con 9 ml de PBS. Los esplenocitos y la sangre se centrifugan @ 2.000 rpms durante 10 min (frío) y el tampón se aspira. Las células se mueven a suspender en 2,0 ml de alcohol metílico al 90 %

55 frío (-20 ºC) (Mallinckrodt Chemicals, Phillipsburg, NJ). El MeOH se añade lentamente mientras que el vial cónico se somete a agitación vorticial rápidamente. A continuación, los tejidos se almacenan a -20 ºC hasta que las células se pueden teñir para análisis de FACS.

Inmunización de TNP con múltiples dosis

La sangre se recogió mediante extracciones retro-orbital del ojo de ratones hembra BALB/c de 7-8 semanas de edad (Charles River Labs.) el día 0 antes de la inmunización. Se permitió que la sangre coagulara durante 30 min y se centrifugó a 10.000 rpm en tubos Microtainer consuelo (Becton Dickinson) durante 10 min. Los sueros se recogieron, se tomaron alícuotas en tubos de Matrix (Matrix Tech. Corp.) y se almacenaron a -70 ºC hasta que se realizó el 65 ELISA. A los ratones se les administró compuesto por vía oral antes de inmunización y en periodos de tiempo posteriores basándose en el periodo de duración de la molécula. A continuación, los ratones inmunizaron con cualquiera de 50 µg de TNP-LPS (Biosearch Tech., n.º T-5065), 50 µg de TNP-Ficoll (Biosearch Tech., n.º F-1300), o 100 µg de TNP-KLH (Biosearch Tech., n.º T-5060) más alum al 1 % (Brenntag, n.º 3501) en PBS. Se preparó TNP-KLH más solución de alum invirtiendo suavemente la mezcla 3-5 veces cada 10 min durante 1 h antes de la inmunización. El día 5, después del último tratamiento, los ratones se sacrificaron con CO2 y se hizo una función 5 cardiaca. Se permitió que la sangre coagulada durante 30 min y se centrifugó a 10.000 rpm en tubos Microtainer con suero durante 10 min. Los sueros se recogieron, se tomaron alícuotas en tubos de Matrix, y se almacenaron a -70 ºC hasta que se realizó el análisis adicional. Los niveles de IgGl, IgG2a, IgG3 e IgM específicos para TNP en los sueros se midieron a continuación mediante ELISA. El TNP-BSA (Biosearch Tech., n.º T-5050) se usó para capturar los anticuerpos específicos para TNP. El TNP-BSA (10 µg/ml) se usó para revestir las placas de ELISA de 384 pocillos 10 (Corning Costar) durante una noche. A continuación, las placas se lavaron y se bloquearon durante 1 h usando la solución de Bloqueo para ELISA de BSA al 10 % (KPL). Después del bloqueo, las placas de ELISA se lavaron y las muestras/patrones de sueros se diluyeron en serie se permitió que se unieran a las placas durante 1 h. Las placas se lavaron y los anticuerpos secundarios conjugados con Ig-HRP (IgGl anti-ratón de cabra, Southern Biotech n.º 1070-05, IgG2a anti-ratón de cabra, Southern Biotech n.º 1080-05, IgM anti-ratón de cabra, Southern Biotech n.º

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15 1020-05, IgG3 anti-ratón de cabra, Southern Biotech n.º 1100-05) se diluyeron a 1:5000 y se incubaron en las placas durante 1 h. La solución de TMB peroxidasa (TMB de Reserva SureBlue de KPL) se usó para visualizar los anticuerpos. Las placas se lavaron y se permitió que las muestras se desarrollaran en la solución de TMB aproximadamente 5-20 min dependiendo de la Ig analizada. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico 2 M y las placas se leyeron a una DO de 450 nm.

20

Ej n.º

CI50 de PI3K d (mM) CI50 de PI3K b (mM) CI50 de PI3Ka (mM) CI50 de PI3Kg (mM) PI3K: b/d PI3K: a/d PI3K: g/d

1

0,0030 4,7400 9,9800 1,6100 1580 3327 537

2

0,0078 1,3600 7,0400 0,8040 174 903 103

3

0,0051 0,4340 3,4200 0,0629 85 671 12

4

0,0100 0,5220 12,0600 0,4480 52 1206 45

5

0,0026 0,6520 5,1600 0,6200 251 1985 238

6

0,0070 5,8000 25,0000 2,8000 829 3571 400

7

0,0117 2,4900 12,7000 3,9000 213 1085 333

Ej n.º

en anti-IgM diana pAKT de esplenocitos mu (Hu esplenocitos PAKT) PI3KIII, (uM) PI3KbMDA468 FH PI3KbMBMDA468 (uM) datos de pAKT in vivo, DE50 (uM) WB, esplenocitos

1

0,0022 >1 0 5,97,2,6 0,041, 0,010

2

0,0012 > 10 >10, 0,811 0,36, 0,26

3

0,0015 > 10 3,8000, 0,483 sin datos

4

0,0018 > 10 1,9500, 0,62 sin datos

5

0,0050 > 10 > 10, > 10 0,056, 0,012

6

0,0060 > 10 > 10, 11 0,13 (WB)

7

0,0104 (anti-IgM de Células Hu B) > 10 > 10 sin datos

Para el tratamiento de enfermedades mediadas por PIKδ, tales como artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias, y enfermedades autoinmunes, los compuestos

25 de la presente invención se pueden administrar por vía oral, por vía parenteral, mediante inhalación por pulverización, por vía rectal, o por vía tópica en formulaciones de unidad de dosificación que contienen excipientes, adyuvantes, y vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye, técnicas subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, de infusión o por vía intraperitoneal.

30 El tratamiento de enfermedades y trastornos en el presente documento también pretende incluir la administración profiláctica de un compuesto de la invención, una sal farmacéutica del mismo, o una composición farmacéutica de cualquiera de un sujeto (es decir, un animal, preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un ser humano) de que se cree que está en necesidad de tratamiento preventivo, tal como, por ejemplo, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias, y enfermedades autoinmunes y similares.

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5 El régimen de dosificación para el tratamiento de enfermedades mediadas por PBKS, cáncer, y/o hiperglucemia con los compuestos de la presente invención y/o composiciones de la presente invención se basa en una diversidad de factores, que incluyen el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo, afección médica del paciente, la gravedad de la afección, la vía de administración, y el compuesto en particular empleado. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de forma rutinaria usando métodos convencionales. Algunos

10 niveles de dosificación en el orden de aproximadamente 0,01 mg a 30 mg por kilogramo de peso corporal al día, preferentemente de aproximadamente 0,1 mg a 10 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,25 mg a 1 mg/kg son útiles para todos los métodos de uso desvelados en el presente documento.

Los compuestos farmacéuticamente activos de la presente invención se pueden procesar de acuerdo con métodos

15 convencionales de farmacia para producir agentes medicinales para administración a pacientes, incluyendo seres humanos y otros mamíferos.

Para administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, una cápsula con un comprimido, una suspensión, o líquido. La composición farmacéutica se prepara preferentemente en forma de una

20 unidad de dosificación que contiene una cantidad dada del principio activo. Por ejemplo, éstas pueden contener una cantidad de principio activo de aproximadamente 1 a 2000 mg, preferentemente de aproximadamente 1 a 500 mg, más preferentemente de aproximadamente 5 a 150 mg. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la afección del paciente y otros factores, pero, de nuevo, se puede determinar usando métodos de rutina.

25 El principio activo también se puede administrar mediante inyección con una composición con vehículos adecuados incluyendo solución salina, dextrosa, o agua. El régimen de dosificación parenteral diario será de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal total, preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg, y lo más preferentemente de aproximadamente 0,25 mg a 1 mg/kg.

30 Las preparaciones inyectables, tales como suspensiones ac. u oleaginosas inyectables estériles, se pueden formular de acuerdo con el uso de agentes conocidos adecuados de dispersión o agentes humectantes y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre

35 los vehículos de solventes aceptables que se pueden usar se encuentren agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Además, algunos aceites no volátiles estériles se usan convencionalmente en forma de un medio disolvente o de suspensión. Para este fin, se puede usar cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo mono-o diglicéridos sintéticos. Además, algunos ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de agentes inyectables.

40 Para administración rectal del fármaco se pueden preparar supositorios mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado tal como manteca de cacao y polietilenglicoles que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la temperatura del recto y por lo tanto se fundirán en el recto y liberarán el fármaco.

45 Una dosis tópica adecuada de principio activo de un compuesto de la invención es de 0,1 mg a 150 mg administrada de una a cuatro, preferentemente una o dos veces al día. Para administración tópica, el principio activo puede comprender de un 0,001 % a un 10 % en p/p, por ejemplo, de un 1 % a un 2 % en peso la formulación, aunque puede comprender tanto como un 10 % en p/p, pero preferentemente no más de un 5 % en p/p, y más preferiblemente de un 0,1 % a un 1 % de la formulación.

50 Algunas formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para penetración a través de la piel (por ejemplo, linimentos, lociones, pomadas, cremas o pastas) y gotas adecuadas para administración al ojo, oído, o nariz.

55 Para administración, los compuestos de la presente invención se combinan de forma habitual con uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración indicada. Los compuestos se pueden mezclar con lactosa, sacarosa, almidón en polvo, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, goma arábiga, gelatina, alginato sódico, polivinil-pirrolidina, y/o alcohol de polivinilo, y pueden formar comprimidos o encapsular para administración

60 convencional. Como alternativa, los compuestos de la presente invención se pueden disolver en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, goma de tragacanto, y/o diversos tampones. En la técnica farmacéutica se conocen bien otros adyuvantes y modos de administración. El vehículo o diluyente puede incluir material de retardo de tiempo, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solo o con una cera, o u otros materiales bien conocidos en la

65 técnica.

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Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar en una forma sólida (incluyendo gránulos, polvos o supositorios) o en una forma líquida (por ejemplo, soluciones, suspensiones, o emulsiones). Las composiciones farmacéuticas se pueden someter a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, agentes

5 emulgentes, tampones, etc.

Las formas de dosificación sólida para administración oral pueden incluir cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En formas de dosificación sólida de este tipo con el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa, o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, dado que es una práctica normal, sustancia adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, comprimidos, y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes de tamponamiento. Además, se pueden preparar comprimidos y píldoras con revestimientos entéricos.

15 Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes usados normalmente en la técnica, tales como agua. Tales composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como agentes humectantes, edulcorantes, saborizantes y perfumantes.

Los compuestos de la presente invención pueden poseer uno o más átomos de carbono asimétricos y por lo tanto son capaces de existir en forma de isómeros ópticos así como en forma de mezclas racémicas o no racémicas de los mismos. Los isómeros ópticos se pueden obtener por resolución de las mezclas racémicas de acuerdo con procesos convencionales, por ejemplo, mediante formación de sales diastereoisoméricas, por tratamiento con un ácido o base ópticamente activos. Algunos ejemplos de ácidos apropiados son ácido tartárico, diacetiltartárico,

25 dibenzoiltartárico, ditoluoiltartárico, y canforsulfónico y a continuación separación de la mezcla de diaestereoisómeros mediante cristalización seguido de liberación de las bases ópticamente activas a partir de estas sales. Un proceso diferente para la separación de isómeros ópticos implica el uso de una columna de cromatografía quiral usada de forma óptima para maximizar la separación de los enantiómeros. Además, otro método disponible implica la síntesis de moléculas diastereoisoméricas covalentes por reacción de compuestos de la invención con un ácido ópticamente puro en una forma activada o un isocianato ópticamente puro. Los diaestereoisómeros sintetizados se pueden separar por medios convencionales tales como cromatografía, destilación, cristalización o sublimación, y a continuación se pueden hidrolizar para administrar el compuesto enantioméricamente puro. Los compuestos ópticamente activos de la invención se pueden obtener del mismo modo usando materiales de partida activos. Estos isómero se pueden encontrar en forma de un ácido libre, una base libre, un éster o una sal.

35 De forma análoga, los compuestos de la presente invención pueden existir como isómeros, es decir, compuestos de la misma fórmula molecular pero en los que los átomos, con respecto los unos a los otros, se colocan de forma diferente. En particular, los sustituyentes de alquileno de los compuestos de la presente invención, se colocan normal y preferentemente y se insertan en las moléculas como se indica en las definiciones para cada uno de estos grupos, leyendo ser izquierda a derecha. Sin embargo, en ciertos casos, un experto en la materia observará que es posible preparar compuestos de la presente invención en los que los sustituyentes tienen una orientación invertida con respecto a los otros átomos en una molécula. Es decir, el sustituyente a insertar puede ser el mismo que el que se ha indicado anteriormente excepto en que está insertado en la molécula en la orientación inversa. Un experto en la materia observará que estas formas isoméricas de los compuestos de la presente invención se deben de

45 interpretar como incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Los compuestos de la presente invención pueden usar en forma de sales derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos. Las sales incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, ciclopentanopropionato, dodecilsulfato, etanosulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metansulfonato, nicotinato, 2naftalenosulfonato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 2-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, mesilato, y undecanoato. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de aquilo inferior, tales como cloruros, bromuros e yoduros 55 de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dialquilo tales como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo tales como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De este modo se obtienen productos solubles en agua o en aceite

o dispersables.

Algunos ejemplos de ácidos que se pueden usar para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico y ácido cítrico. Otros ejemplos incluyen sales con metales alcalinos o metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, calcio o magnesio o con bases orgánicas.

65 En el alcance de la presente invención también se incluyen ésteres farmacéuticamente aceptables de un grupo que contiene ácido carboxílico o hidroxilo, incluyendo un éster metabólicamente lábil o una forma de profármaco de un

imagen85

compuesto de la presente invención. Un éster metabólicamente lábil es uno que puede producir, por ejemplo, un aumento en los niveles en sangre y prolongar la eficacia de la forma correspondiente del compuesto no esterificada. Una forma de profármaco es una que no está en una forma activa de la molécula como se administra pero que se convierte en terapéuticamente eficaz después de una cierta actividad o biotransformación in vivo, tal como 5 metabolismo, por ejemplo, escisión enzimática o hidrolítica. Para una discusión general de profármacos que implican ésteres véase Svensson and Tunek Drug Metabolism Reviews 165 (1988) y Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985). Algunos ejemplos de un anión carboxilato enmascarado incluyen una diversidad de ésteres, tales como alquilo (por ejemplo, metilo, etilo), cicloalquilo (por ejemplo, ciclohexilo), aralquilo (por ejemplo, bencilo, pmetoxibencilo), y alquilcarboniloxialquilo (por ejemplo, pivaloiloximetilo). Algunas aminas se han enmascarado como 10 derivados sustituidos con arilcarboniloximetilo que se extienden con esterases in vivo liberando el fármaco libre y formaldehído (Bungaard J. Med. Chem. 2503 (1989)). Además, algunos fármacos que contienen un grupo NH ácido, tal como imidazol, imida, indol y similares, se han enmascarado con grupos N-aciloximetilo (Bundgaard Design of Prodrugs, Elsevier (1985)). Algunos grupos hidroxi se han enmascarado como ésteres y éteres. El documento EP 039.051 (Sloan y Little, 4/11/81) desvela profármacos de base de Mannich y ácido hidroxámico, su preparación y 15 uso. Algunos ésteres de un compuesto de la presente invención, pueden incluir, por ejemplo, los ésteres de metilo, etilo, propilo, y butilo, así como otros ésteres adecuados formados entre un resto ácido y un resto que contiene hidroxilo. Algunos ésteres metabólicamente lábiles, pueden incluir, por ejemplo, metoximetilo, etoximetilo, isopropoximetilo, α-metoxietilo, grupos tales como α-((alquiloxi C1-C4))etilo, por ejemplo, metoxietilo, etoxietilo, propoxietilo, iso-propoxietilo, etc.; grupos 2-oxo-1,3-dioxolen-4-ilmetilo, tales como 5-metil-2-oxo-1,3,dioxolen-4

20 ilmetilo, etc.; grupos alquiltiometilo C1 3, por ejemplo, metiltiometilo, etiltiometilo, isopropiltiometilo, etc.; grupos aciloximetilo, por ejemplo, pivaloiloximetilo, α-acetoximetilo, etc.; etoxicarbonil-1-metilo; o grupos metilo sustituidos con α-aciloxi-α, por ejemplo α-acetoxietilo.

Además, los compuestos de la invención pueden existir como sólidos cristalinos que se pueden cristalizar a partir de

25 disolventes comunes tales como etanol, N,N-dimetilformamida, agua, o similares. Por lo tanto, las formas cristalinas de los compuestos de la invención pueden existir como polimorfos, solvatos y/o hidratos de los compuestos precursores o sus sales farmacéuticamente aceptables. Del mismo modo, se debe interpretar que todas las formas de este tipo entran dentro del alcance de la invención.

30 Aunque los compuestos de la invención se pueden administrar como el único agente farmacéutico activo, también se pueden usar en combinación con uno o más compuestos de la invención u otros agentes. Cuando se administran como una combinación, los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones separadas que se administran al mismo tiempo o en tiempos diferentes, o los agentes terapéuticos se pueden administrar como una sola composición.

35

Claims (19)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto seleccionado entre

   imagen2

   imagen3

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   imagen4

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   imagen5

   imagen6
4. 4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   imagen7

   10 o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
5. 5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   imagen8

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. 6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   imagen9

   imagen10
7. 7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   imagen11

   10 o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
8. 8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene la estructura

   imagen12

   15

   o cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. 9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de

   acuerdo con la reivindicación 2; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. 20
10. 10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
11. 11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de 25 acuerdo con la reivindicación 4; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

    30 13. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

    imagen13
13. 14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. 15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de 5 acuerdo con la reivindicación 8; y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. 16. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios,

    10 trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.

    15 17. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis

    20 reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.
16. 18. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades

    25 inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.

    30
17. 19. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones

    35 inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.
18. 20. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada

    40 entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome

    45 de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.
19. 21. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios,

    50 trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, lupus sistémico eritematoso (SLE), miastenia grave, artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.

    55 22. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, osteoartritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunes, trastornos intestinales inflamatorios, trastornos oculares inflamatorios, trastornos de vejiga inflamatorios o inestables, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, afecciones inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunes, encefalomielitis diseminada aguda (SLE), miastenia grave,

    60 artritis reumatoide, encefalomielitis diseminada aguda, púrpura trombocitopénica idiopática, esclerosis múltiple, síndrome de Sjoegren y anemia hemolítica autoinmune, afecciones alérgicas e hipersensibilidad.