ES2566781T3 - Procedimiento mejorado para la producción de hormona del crecimiento humana recombinante - Google Patents

Procedimiento mejorado para la producción de hormona del crecimiento humana recombinante Download PDF

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ES2566781T3 ES11773541.5T ES11773541T ES2566781T3 ES 2566781 T3 ES2566781 T3 ES 2566781T3 ES 11773541 T ES11773541 T ES 11773541T ES 2566781 T3 ES2566781 T3 ES 2566781T3
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Abstract

Un procedimiento para la producción de hormona del crecimiento humana (hGH) que comprende: (i) hacer que realicen fermentación células de E. coli que producen hormona del crecimiento humana; (ii) recuperar los cuerpos de inclusión a partir de las células de E. coli y disolver los cuerpos de inclusión recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta; (iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta; caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento mejorado para la produccion de hormona del crecimiento humana recombinante CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere al campo de la produccion de hormona del crecimiento humana recombinante (hGH).
ANTECEDENTES
La hormona del crecimiento humana (hGH), tambien conocida como somatropina (INN) o somatotropina, es una hormona proteica producida y segregada por las celulas somatotropicas de la pituitaria anterior. La hormona del crecimiento humana juega un papel clave en crecimiento somatico en la infancia y en el metabolismo en la edad adulta por sus efectos en el metabolismo de protemas, carbohidratos y lfpidos. La hormona del crecimiento humana es una cadena de polipeptidos unica de 191 aminoacidos que presenta dos enlaces disulfuro, uno entre Cys-53 y Cys-165, que forma un gran bucle en la molecula y el otro entre Cys-182 y Cys-189, que forma un bucle pequeno cerca del extremo C-terminal.
La tecnologfa de ADN recombinante ha permitido la produccion de un suministro ilimitado de hGH en un numero de diferentes sistemas. Uno de estos sistemas es bacterias, por ejemplo, E. coli. Si bien tal procedimiento esta bien establecido y se usa ampliamente, como cualquier procedimiento de la tecnica en cualquier momento, tambien este ultimo se puede aun mejorar.
Cuando la hGH recombinante es expresada en celulas de E. coli como cuerpos de inclusion, los cuerpos de inclusion se disuelven de forma tfpica en presencia de agentes de reduccion y/o agentes caotropicos con lo que se renaturaliza completamente la hGH y se facilita el plegado apropiado de la hGH en su forma bioactiva y se mitiga la formacion agregada.
SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona ahora una reduccion significativa en la formacion de agregados durante la produccion de hGH sin la necesidad de agentes de reduccion y/o agentes caotropicos.
A este respecto la presente invencion proporciona un procedimiento para la produccion de la hormona del crecimiento humana que comprende:
(i) hacer que realicen fermentacion celulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana (hGH);
(ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
(iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta;
caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
La presente invencion proporciona ademas un procedimiento para la reduccion de la cantidad de formas polimericas de hormona del crecimiento humana formadas durante un procedimiento para la produccion de la hormona del crecimiento humana, que comprende:
(i) hacer que realicen fermentacioncelulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana (hGH);
(ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
(iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta;
caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
El procedimiento para la produccion de hormona del crecimiento humana de la presente invencion comprende las etapas de:
(i) hacer que realicen fermentacioncelulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana (hGH);
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(ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
(iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta;
caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
El procedimiento para la reduccion de la cantidad de formas polimericas de la hormona del crecimiento humana formadas durante un procedimiento para la produccion de la hormona del crecimiento humana de la presente invencion comprende las etapas de:
(i) hacer que realicen fermentacion celulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana (hGH);
(ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
(iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta;
caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
“Hormona del crecimiento humana" y “hGH" tal como se usan este documento de forma intercambiable, debena entenderse que engloban hormona del crecimiento humana que presenta 191 aminoacidos o Met-hGH que presenta 192 aminoacidos (es decir, hGH con una metionina adicional en el extremo N-terminal).
Una “forma polimerica hGH" tal como se usa en esta invencion debena entenderse que engloba cualquier forma de hGH que no sea hGH que presente 191 aminoacidos o 192 aminoacidos (hGH con una metionina adicional en el extremo N-terminal) tal como, pero sin limitarse a, dfmeros y oligomeros de hGH.
“Medio de cultivo" tal como se usa en esta invencion debena entenderse que comprende medio fermentador y/o medio de produccion.
Los elementos traza en el medio de cultivo se pueden proporcionar de forma convencional, por ejemplo haciendo uso de sales comercialmente disponibles de los elementos traza, incluyendo acidos y bases e hidratos de los mismos. Estos se pueden introducir en el medio de cultivo en forma de sales solidas o en forma de soluciones acuosas que comprenden una o mas de las sales. En una realizacion estos se pueden anadir en forma de una solucion de elementos traza que comprende cada uno de los elementos traza a una concentracion predeterminada. La solucion de elementos traza puede contener adicionalmente un acido o base para ajustar el pH y por ejemplo, mantener los elementos traza en solucion.
Se puede proporcionar manganeso como un elemento traza usando, por ejemplo, sulfato de manganeso monohidratado (MnSO4'H2O). Se puede proporcionar cinc como un elemento traza usando, por ejemplo, sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4'7H2O). Se puede proporcionar cobalto como un elemento traza usando, por ejemplo, cloruro de cobalto hexahidratado (CoCl2-6H2O). Se puede proporcionar molibdeno como un elemento traza usando, por ejemplo, molibdato de sodio dihidratado (NaMoO4'2H2O). Se puede proporcionar calcio como un elemento traza usando, por ejemplo, cloruro de calcio dihidratado (CaCl2'2H2O). Se puede proporcionar cobre como un elemento traza usando, por ejemplo, sulfato de cobre pentahidratado (CoSO4-5H2O). Se puede proporcionar boro como un elemento traza usando, por ejemplo, acido borico (H3BO3). Se puede proporcionar tambien hierro como elemento traza.
Los elementos traza estan presentes en el medio de cultivo en los siguientes intervalos de concentracion (en base al volumen total del medio de cultivo) (“intervalo”) y en una realizacion estan presentes a las concentraciones particulares indicadas (“realizacion”):
Elemento traza
Intervalo (^M) Realizacion (^M)
Manganeso
4,4-5,4 4,9
Cinc
7,2-8,8 8,0
Cobalto
6,3-7,7 7,0
Molibdeno
6,2-7,6 6,9
5
10
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25
30
35
40
45
Calcio
15,2-18,6 16,9
Cobre
5,5-6,7 6,1
Boro
6,0-7,4 6,7
En una realizacion, los elementos traza se usan en una solucion de elementos traza que se anade al medio de cultivo. En esta realizacion, la solucion de elementos traza es preferiblemente una solucion acuosa concentrada que contiene los elementos traza a una concentracion que, cuando se usa en el medio de cultivo, alcance los intervalos de concentracion anteriormente citados.
En una realizacion, la solucion de elementos traza se anade al medio de cultivo en una proporcion de 0,1 a 10 ml/l, en base al volumen total del medio de cultivo, o de 0,2 a 5 ml/l o de 0,5 a 1 ml/l o a aproximadamente 0,8 ml/l.
Cuando se anade la solucion de elementos traza al medio de cultivo a aproximadamente 0,8 ml/l, puede comprender 1 g/l de sulfato de manganeso monohidratado. Esta puede comprender tambien 2,8 g/l de sulfato de cinc heptahidratado. Puede comprender tambien 2 g/l de cloruro de cobalto hexahidratado. Puede comprender tambien 2 g/l de molibdato de sodio dihidratado. Puede comprender tambien 3 g/l de cloruro de calcio dihidratado. Puede comprender tambien 1,85 g/l de sulfato de cobre pentahidratado. Puede comprender tambien 0,5 g/l de acido borico. En una realizacion la solucion de elementos traza comprende cada una de las concentraciones anteriormente citadas de los elementos traza.
Cuando se lleva a cabo la fase de fermentacion en mas de una etapa, por ejemplo, cuando se prepara un cultivo de siembra en un fermentador de siembra y se hace avanzar ese cultivo de siembra a un fermentador de produccion, se usan los elementos traza de acuerdo con a presente invencion en al menos una etapa, o en mas de una etapa, o en todas las etapas de fermentacion.
“pH alcalino" tal como se usa en esta invencion debena entenderse que comprende un pH que vana de 10 a 12,5. En un aspecto el pH alcalino es aproximadamente 12.
Se concibe ademas que la etapa (ii), es decir, recuperacion de los cuerpos de inclusion y disolucion de los cuerpos de inclusion recuperados a pH alcalino, no implica el uso de agentes reductores y agentes caotropicos.
“Agente de reduccion" tal como se usa en esta invencion debena entenderse que comprende un agente capaz de reducir los enlaces Cys-Cys proteicos. Ejemplos no limitantes de agentes reductores son ditiotreitol (DTT), beta- mercaptoetanol, cistema y glutation.
“Agente caotropico" tal como se usa en esta invencion debena entenderse que comprende un agente que altera la estructura tridimensional en macromoleculas tales como protemas y las desnaturaliza. Ejemplos no limitantes de agentes caotropicos son urea, guanidina, tiourea y perclorato de litio.
La etapa (iii) del procedimiento de la presente invencion es una etapa opcional que se puede llevar a cabo en el caso que se desee producir la hGH en forma solida. En una realizacion la etapa (iii) comprende una subetapa de purificacion de la hGH disuelta antes de la liofilizacion. Igualmente la subetapa de purificacion se puede anadir a la etapa (ii) en caso de que no se lleve a cabo ninguna liofilizacion.
Ejemplos
La invencion se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no se pretende en modo alguno que limiten el alcance de la invencion segun se reivindica.
EJEMPLO 1 - Procedimiento para la produccion de hGH
La preparacion de hGH consiste en procedimientos bien conocidos en la tecnica incluyendo la fermentacion y la cosecha de celulas de E. coli que producen hGH, la recuperacion y la disolucion de cuerpos de inclusion y la purificacion y la liofilizacion de hGH.
Procedimiento de fermentacion
El procedimiento de fermentacion de hGH consiste en tres etapas llevadas a cabo sucesivamente en un matraz agitador, un fermentador de siembra y un fermentador de produccion. Los parametros de fermentacion, temperatura, agitacion, aireacion, presion, pH y oxfgeno se controlan por completo mediante un sistema de control que tambien controla el consumo de glucosa y amoniaco.
Inoculo
Se inoculo ~1 ml de E. coli que expresa hGH (n.° de ATCC: 39384) en un matraz que contiene 200 ml de medio de cultivo (20 g/l de hidrolizado de casema, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 100 mg/l de sal sodica de
ampicilina). Se incubo el matraz durante ~6 horas en un agitador rotatorio a ~30° C a ~250 rpm. Al final de este periodo el cultivo presentaba una densidad optica a 660 nm (D.O.) de ~4. Se inoculo una cantidad calculada de cultivo de siembra en el fermentador de siembra.
Fermentador de siembra.
5 El medio fermentador de siembra contema:
Hidrolizado de casema 20 g/l
Extracto de levadura 10 g/l
K2HPO4 2,5 g/l
NaCl 5 g/l
MgSO4-7H2O 1 g/l
Antiespumante (PPG) 0,4 ml/l
Glucosa ~50 g/l
y de forma opcional:
Solucion de elementos 0,83 ml/l traza
1 l de solucion de elementos traza consistfa en:

MnSO4H2O 1 g/l
ZnSO4 7H2O 2,78 g/l

CoCl2 6H2O 2 g/l

Na2MoO4 2H2O 2 g/l

CaCl2 2H2O 3 g/l
CuSO4 5H2O 1,85 g/l
H3BO3 0,5 g/l
HCl al 32% 100 ml
Se inoculo el fermentador de siembra (150 ml) con cultivo de siembra y tuvo lugar la fermentacion a aproximadamente 30° C, pH 7. Se mantuvieron los niveles de oxfgeno disuelto usando procedimientos bien 10 conocidos por el especialista en la tecnica y cuando la D.O. del cultivo estaba por encima de 12, se transfirieron los contenidos del fermentador de siembra, ~120 l, al fermentador de produccion de 1500 l.
Fermentador de produccion
El medio de produccion contema:
Hidrolizado de casema 20 g/l
Extracto de levadura 10 g/l
K2HPO4 2,5 g/l
NaCl 5 g/l
MgSO4-7H2O 1 g/l
Antiespumante (PPG) 0,4 ml/l
Glucosa ~13 g/l
y de forma opcional:
Solucion de elementos 0,83 ml/l
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traza
Se anadio solucion de glucosa al 50% durante la fase de produccion. La temperatura del fermentador era de aproximadamente 30° C, el pH se mantuvo a aproximadamente 7 con amoniaco y los niveles de oxfgeno disuelto se mantuvieron usando procedimientos bien conocidos por los especialistas en la tecnica. A OD 13-16, se indujo la produccion de hGH mediante aumento de la temperatura de fermentacion de aproximadamente 30° C a aproximadamente 42° C y la fermentacion tuvo lugar durante las siguientes ~2 horas.
Cosecha
Se cosecharon celulas bacterianas conteniendo hGH mediante microfiltracion con fibra hueca. El caldo de fermentacion, ~1200 l, se concentro y dializo frente a agua purificada (PuW). Se almaceno la suspension de -10° C a -30° C.
Recuperacion y purificacion de hGH
Se rompe la suspension de celulas cosechadas y se lava en PuW dando lugar a cuerpos de inclusion que comprenden hGH. Se disolvieron los cuerpos de inclusion mediante aumento del pH hasta 12,0 ± 0,1 mediante adicion de NaOH 1 N con agitacion. Se replego hGH reduciendo el pH hasta 10,5 ± 0,1 y anadiendo borato 0,5 M a pH 9,0 hasta una concentracion final de borato de 10 mM. No se usaron ni agentes de reduccion ni agentes caotropicos en la disolucion de los cuerpos de inclusion.
Se purifico luego hGH mediante procedimientos conocidos en la tecnica incluyendo una serie de etapas de ultrafiltracion y de cromatograffa. Se uso aminopeptidasa, la enzima de eliminacion de metionina N-terminal durante el procedimiento para eliminar la metionina N-terminal de Met-hGH. La hGH purificada se liofilizo finalmente.
EJEMPLO 2 - Analisis comparativo de hGH producido con y sin elementos traza
Se produjeron once (11) preparaciones de hGH de acuerdo con el ejemplo 1 con la excepcion de que los elementos traza (TE) no se anadieron al medio fermentador de siembra ni al medio de produccion.
Se produjeron veintitres (23) preparaciones de hGH de acuerdo con el ejemplo 1 donde se anadieron TE al medio fermentador de siembra y al medio de produccion.
La tabla 1 demuestra que preparaciones liofilizadas que resultan de la fermentacion que contiene elementos traza teman una cantidad mucho menor de formas polimericas de hGH. La cantidad de formas polimericas de hGH se presenta como el porcentaje relativo del area de pico total que corresponde a todos los picos en la cromatograffa de exclusion por tamanos (SEC) analftica usada en el analisis. Se llevo a cabo el procedimiento de SEC de acuerdo con la monograffa de somatropina en la Farmacopea Europea 6a edicion 2010.
Tabla 1
Preparacion
Solucion de elementos traza Formas polimericas de hGH
I
- 1,4
II
- 1,9
III
- 1,3
IV
- 1,7
V
- 2,0
VI
- 1,8
VII
- 1,9
VIII
- 3,0
IX
- 1,6
X
- 1,3
Preparacion
Solucion de elementos traza Formas polimericas de hGH
XI
- 1,3
XII
+ 0,7
XIII
+ 0,6
XIV
+ 0,8
XV
+ 0,7
XVI
+ 0,6
XVII
+ 0,9
XVIII
+ 0,8
XIX
+ 0,5
XX
+ 1,0
XXI
+ 0,7
XXII
+ 0,9
XXIII
+ 0,8
XXIV
+ 0,7
XXV
+ 0,8
XXVI
+ 0,9
XXVII
+ 0,8
XXVIII
+ 0,9
XXIX
+ 0,9
XXX
+ 0,7
XXXI
+ 0,7
XXXII
+ 0,8
XXXIII
+ 0,8
XXXIV
+ 0,8

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para la produccion de hormona del crecimiento humana (hGH) que comprende:
    (i) hacer que realicen fermentacion celulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana;
    (ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
    (iii) de forma opcional liofilizar la hGh disuelta;
    caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el medio de cultivo comprende los elementos traza en las siguientes concentraciones:

    Manganeso 4,9 |iM

    Cinc 8,0 |iM

    Cobalto 7,0 |iM

    Molibdeno 6,9 |iM
    Calcio 16,9 |iM

    Cobre 6,1 |iM

    Boro 6,7 |iM
    en base al volumen total del medio de cultivo.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los elementos traza se anaden al medio de cultivo en forma de una solucion de elementos traza.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la solucion de elementos traza comprende
    1 g/l de sulfato de manganeso monohidratado y/o en el que la solucion de elementos traza comprende aproximadamente 2,8 g/l de sulfato de cinc heptahidratado y/o en el que la solucion de elementos traza comprende 2 g/l de cloruro de cobalto hexahidratado y/o en el que la solucion de elementos traza
    comprende 2 g/l de molibdato de sodio deshidratado y/o en el que la solucion de elementos traza
    comprende 3 g/l de cloruro de calcio deshidratado y/o en el que la solucion de elementos traza
    comprende 1,85 g/l de sulfato de cobre pentahidratado y/o en el que la solucion de elementos traza
    comprende 0,5 g/l de acido borico.
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que la solucion de elementos traza comprende 1 g/l de sulfato de manganeso monohidratado, 2,78 g/l de sulfato de cinc heptahidratado, 2 g/l de cloruro de cobalto hexahidratado, 2 g/l de molibdato de sodio dihidratado, 3 g/l de cloruro de calcio dihidratado, 1,85 g/l de sulfato de cobre pentahidratado y 0,5 g/l de acido borico.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el pH alcalino es de aproximadamente 10 a aproximadamente 12,5.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 6 en el que el pH alcalino es aproximadamente 12.
  8. 8. El procedimiento de acuerdo a la reivindicacion 1 en el que la etapa (ii) no implica el uso de agentes reductores y agentes caotropicos.
  9. 9. Un procedimiento para la reduccion de la cantidad de formas polimericas de hormona del crecimiento humana formadas durante un procedimiento para la produccion de hormona del crecimiento humana (hGH) que comprende:
    (i) hacer que realicen fermentacioncelulas de E. coli que producen hormona del crecimiento humana;
    (ii) recuperar los cuerpos de inclusion a partir de las celulas de E. coli y disolver los cuerpos de inclusion recuperados a un pH alcalino para proporcionar hGH disuelta;
    (iii) de forma opcional liofilizar la hGH disuelta;
    caracterizado porque la fermentacion se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende
    5
    10
    15
    20
    manganeso, cinc, cobalto, molibdeno, calcio, cobre y boro como elementos traza.
  10. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el medio de cultivo comprende los elementos traza en las siguientes concentraciones:

    Manganeso 4,9 |iM

    Cinc 8,0 |iM

    Cobalto 7,0 |iM

    Molibdeno 6,9 |iM
    Calcio 16,9 |iM

    Cobre 6,1 |iM

    Boro 6,7 |iM
    en base al volumen total del medio de cultivo.
  11. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que los elementos traza se anaden al medio de cultivo en forma de una solucion de elementos traza.
  12. 12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la solucion de elementos traza

    comprende 1 g/l de sulfato de manganeso monohidratado y/o en el que la solucion de elementos traza comprende aproximadamente 2,8 g/l de sulfato de cinc heptahidratado y/o en el que la solucion de

    elementos traza comprende 2 g/l de cloruro de cobalto hexahidratado y/o en el que la solucion de

    elementos traza comprende 2 g/l de molibdato de sodio deshidratado y/o en el que la solucion de

    elementos traza comprende 3 g/l de cloruro de calcio deshidratado y/o en el que la solucion de
    elementos traza comprende 1,85 g/l de sulfato de cobre pentahidratado y/o en el que la solucion de elementos traza comprende 0,5 g/l de acido borico.
  13. 13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la solucion de elementos traza comprende 1 g/l de sulfato de manganeso monohidratado, 2,78 g/l de sulfato de cinc heptahidratado, 2 g/l de cloruro de cobalto hexahidratado, 2 g/l de molibdato de sodio dihidratado, 3 g/l de cloruro de calcio dihidratado, 1,85 g/l de sulfato de cobre pentahidratado y 0,5 g/l de acido borico.
  14. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 en el que el pH alcalino es de aproximadamente 10 a aproximadamente 12,5, por ejemplo en el que el pH alcalino es aproximadamente 12.
  15. 15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 en el que la etapa (ii) no implica el uso de agentes reductores y agentes caotropicos.
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