ES2564087T3 - Método para medir la actividad de calcineurina - Google Patents

Método para medir la actividad de calcineurina Download PDF

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ES2564087T3
ES2564087T3 ES13703836.0T ES13703836T ES2564087T3 ES 2564087 T3 ES2564087 T3 ES 2564087T3 ES 13703836 T ES13703836 T ES 13703836T ES 2564087 T3 ES2564087 T3 ES 2564087T3
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calcineurin
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Sylvia Sanquer
Robert Barouki
Laurence Herry
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Universite Paris 5 Rene Descartes
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Universite Paris 5 Rene Descartes
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Abstract

Un método para medir la actividad de calcineurina en una muestra biológica que comprende las etapas de: - proporcionar una mezcla de reacción que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa; - incubar dicha muestra biológica con la mezcla de reacción en condiciones adecuadas para la actividad de calcineurina; - medir la cantidad de sustrato desfosforilado.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para medir la actividad de calcineurina Sector de la tecnica
La presente invencion se refiere a un metodo para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica. Estado de la tecnica
El patron para la prevencion de rechazo en pacientes de trasplante consiste en regfmenes inmunosupresores que incluyen un inhibidor de la calcineurina tal como ciclosporina (CsA) o tacrolimus (TAC). Sin embargo, despues del trasplante es diffcil conseguir el equilibrio optimo entre una inmunosupresion demasiado fuerte o una demasiado debil. Una inmunosupresion inadecuada puede provocar un rechazo al trasplante y, por otro lado, una inmunosupresion excesiva facilita el desarrollo de complicaciones graves tales como infecciones o trastornos linfoproliferativos. La practica habitual consiste, para los medicos, en establecer el tratamiento con dosis fijas, a continuacion en el ajuste de las dosis de farmaco de acuerdo con sus niveles en sangre o, incluso de forma mas frecuente, de acuerdo con la aparicion bien de un rechazo agudo o bien de un suceso de farmaco adverso. Desafortunadamente, esta estrategia se asocia con un fallo frecuente como se ilustra con el hecho de que de un 30 a un 50 % de los pacientes desarrollan rechazo agudo despues del trasplante.
Un enfoque farmacodinamico, basado en la medida del efecto de los farmacos en sus dianas celulares, se ha desarrollado con el objetivo de reducir la incidencia y gravedad de rechazo agudo. Este enfoque farmacodinamico se basa en la medida de la actividad de la calcineurina (CN), una fosfatasa dependiente de calcio y calmodulina. La CN es parte de la familia de la enzima serina/treonina fosfatasa que incluye PP1, PP2A, PP2B o calcineurina y PP2C (Ingebritsen y Cohen, 1983). Los ensayos actuales sobre calcineurina se realizan generalmente en extractos celulares obtenidos a partir de celulas mononucleares sangufneas (PBMC, celulas mononucleares de sangre periferica) de pacientes de trasplante (Fruman et al., 1996; Sanquer et al., 2004; Fukudo et al., 2005). Estos ensayos se basan en la desfosforilacion de un sustrato de calcineurina fosforilado en presencia de calcio y calmodulina que
son esenciales para la actividad de la enzima (Pallen y Wang, 1983). La adicion de acido okadaico a una
concentracion de 500 nM (que inhibe todas las fosfatasas excepto CN) evitar la reactividad cruzada potencial para el sustrato fosforilado.
Un sustrato especialmente preferente es el peptido fosforilado RII (P-RII), derivado de la subunidad reguladora de la protefna quinasa A (PKA, Donella-Deana et al., 1994). Este peptido se caracteriza por la siguiente secuencia: DLDVPIPGRFDRRVpSVAAE (SEC ID N°: 1).
En los diferentes ensayos descritos hasta ahora, el peptido P-RII se puede etiquetar o no, y el etiquetado se realiza bien con un radioelemento (32P) o un fluoroforo.
La mayorfa de los metodos usados para medir la actividad de la CN fosfatasa se basan en la deteccion del fosfato libre liberado durante la reaccion enzimatica. Estos metodos usan medidas de radiometrfa en el caso del peptido P- RII etiquetado con 32P (Fruman et al., 1996; Koefoed-Nielsen et al., 2004). Ellos usan medidas de
espectrofotometrfa en el caso del peptido R-RII sin etiquetar. Este ultimo requiere la puesta en practica de una
segunda reaccion con verde de malaquita para colorear el fosfato inorganico libre (Sellar et al., 2006).
Se han desarrollado muchos metodos especfficos basados en la medida directa de la formacion del peptido RII desfosforilado (DP-RII) con CN. Estos metodos se basaban originalmente en cromatograffa lfquida acoplada a deteccion de UV (Enz et al., 1994; Sanquer et al., 2004). Estos metodos se desarrollaron para el peptido P-RII sin etiquetar. Mas recientemente, se describio un metodo de fluorimetrfa para medir la actividad de CN mediante el uso del peptido P-RII etiquetado con un fluoroforo y separacion del producto de peptido desfosforilado con oxido de titanio (Roberts et al., 2008).
El documento WO2011/085176 describe un metodo basado en FRET para determinar la actividad de fosfatasa actividad de la calcineurina.
Objeto de la invencion
La invencion surge de la observacion de que algunas muestras biologicas, tales como extractos de celulas mononucleares de sangre periferica, contienen una actividad de quinasa que puede competir con la actividad de fosfatasa de la calcineurina. Esta actividad de quinasa, que nunca antes se informo en los metodos para medir la actividad de calcineurina de la tecnica anterior, se deberfa inhibir para obtener resultados mas especfficos.
De hecho, los inventores han observado que la especificidad del ensayo de actividad de calcineurina puede aumentar de forma significativa mediante la adicion de al menos un inhibidor de quinasa a la mezcla de reaccion.
Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende las etapas de:
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- proporcionar una mezcla de reaccion que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa;
- incubar dicha muestra biologica con la mezcla de reaccion en condiciones adecuadas para la actividad de calcineurina;
- medir la cantidad de sustrato desfosforilado.
La presente invencion tambien se refiere a un kit para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa.
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de inhibidor de quinasa en un metodo para medir la actividad de calcineurina.
En otro aspecto mas, la invencion se refiere a un metodo para predecir el resultado terapeutico de un paciente de trasplante que comprende medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica obtenida de dicho paciente como se ha descrito anteriormente.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende las etapas de:
- proporcionar una mezcla de reaccion que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa;
- incubar dicha muestra biologica con la mezcla de reaccion en condiciones adecuadas para la actividad de calcineurina;
- medir la cantidad de sustrato desfosforilado.
Como se usa en el presente documento el termino "calcineurina", se usa indistintamente con "CaN", "fosfatasa 2B" o "PP-2B", y se refiere a la protefna fosfatasa de Serina /Treonina dependiente de Ca2+/calmodulina. Esta protefna cataliza la retirada de un grupo fosfato de su sustrato por hidrolisis de monoesteres de acido fosforico en un ion fosfato y una molecula con un grupo hidroxilo libre. De forma mas especffica, la calcineurina retira un grupo fosfato de un resto de serina fosforilada (fosfo-serina, o "pS") o un resto de treonina fosforilada (fosfo-treonina, o "pT").
La calcineurina es un heterodfmero que consiste en una subunidad A catalftica (57-61 kDa) y una subunidad B reguladora (19 kDa). La subunidad A catalftica esta formada por cuatro dominios funcionales: el nucleo catalftico con homologfa de secuencias para PP-1 y PP-2A; sitios de union tanto para calmodulina como para la subunidad reguladora de CaN, y dominio autoinhibidor C-terminal.
Como se usa en el presente documento, el termino "sustrato" o "sustrato de calcineurina" se refiere a una fosfoprotefna o fosfopeptido que se puede hidrolizar por calcineurina. Por lo tanto, se refiere a una fosfoprotefna o fosfopeptido que tiene al menos un resto de fosfoserina y/o fosfotreonina.
Se prefiere que los restos de aminoacido que se describen en el presente documento esten en la forma isomerica "L". Sin embargo, algunos restos en la forma isomerica "D" se pueden sustituir para cualquier resto de L-aminoacido, siempre y cuando se mantenga la capacidad del sustrato para ser hidrolizado por la calcineurina. NH3 se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipeptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en extremo carboxi de un polipeptido.
De acuerdo con la nomenclatura convencional de polipeptidos, J. Biol. Chem., 243: 3552-59 (1969), en la siguiente Tabla de Correspondencias se muestran algunas abreviaturas para restos de aminoacido:
Codigo de una letra
Codigo de tres letras Aminoacido
Y
Tyr tirosina
G
Gly glicina
F
Phe fenilalanina
M
Met metionina
A
Ala alanina
S
Ser serina
I
Ile isoleucina
L
Leu leucina
T
Thr treonina
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Codigo de una letra
Codigo de tres letras Aminoacido
V
Val valina
P
Pro prolina
K
Lys lisina
H
His histidina
Q
Gln glutamina
E
Glu acido glutamico
W
Trp triptofano
R
Arg arginina
D
Asp acido aspartico
N
Asn asparagina
C
Cys cistefna
En el presente documento, todas las secuencias de restos de aminoacido ase representan con formulas cuya orientacion a la izquierda y la derecha esta en la direccion convencional del extremo amino-terminal con respecto al extremo carboxi-terminal.
El termino "pX", o "fosfoX", como se usa en el presente documento, se refiere a un resto de aminoacido X fosforilado. Por lo general, el sustrato de acuerdo con la invencion comprende al menos un resto de fosfoserina o fosfotreonina.
Algunos estratos preferentes de acuerdo con la invencion son sustratos especfficos de calcineurina. En otros terminos, el sustrato de acuerdo con la invencion por lo general se reconoce y se hidroliza con calcineurina de forma mas eficaz que con otros tipos de fosfatasas.
Por lo general, el sustrato de acuerdo con la invencion se puede seleccionar entre el grupo que consiste en los fosfopeptidos que se describen en la Tabla I de Donella-Deana et al. (Donella-Deana et al., 1994, Eur J Biochem 219, 109-117).
Por lo general, un sustrato preferente es un fragmento de la subunidad reguladora de la protefna quinasa de tipo II dependiente de cAMP (RII). En una realizacion mas preferente, el sustrato es DLDVPIPGRFDRRVpSVAAE (SEC ID N°:1).
El sustrato de la invencion se puede obtener con cualquier metodo adecuado en la tecnica: puede ser una fosfoprotefna recombinante o fragmento de la misma, una fosfoprotefna purificada o fragmento de la misma, o un fosfopeptido sintetico.
En una realizacion de la intervencion, el sustrato es un fosfopeptido sintetico.
El sustrato de acuerdo con la invencion puede estar etiquetado, o sin etiquetar.
La deteccion del producto de reaccion de desfosforilacion se realizara a continuacion con diferentes medios, de acuerdo con el tipo de sustrato que se use (vease a continuacion).
Como se usa en el presente documento, la expresion "condiciones adecuadas para la actividad de calcineurina" tiene un significado general en la tecnica y se refiere a las condiciones fisicoqufmicas globales en que se produce la reaccion de desfosforilacion catalizada por calcineurina.
De acuerdo con una realizacion, la reaccion se realiza a una temperatura comprendida entre 20 °C y 40 °C, preferentemente entre 25 °C y 38 °C, incluso mas preferentemente a aproximadamente 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C o 37 °C.
De acuerdo con una realizacion, la reaccion se realiza durante un periodo de tiempo comprendido entre 5 minutos y 60 minutos, preferentemente entre 10 y 45 minutos, entre 15 y 40 minutos, incluso mas preferentemente aproximadamente 30 minutos.
En una realizacion de la invencion, la reaccion se realiza por incubacion de la muestra biologica y la mezcla de reaccion a 37 °C durante 30 minutos.
Por lo general, la reaccion se puede detener despues de un periodo tiempo determinado previamente mediante colocacion del tubo de reaccion a +4 °C y adicion de acido tricloroacetico (TCA).
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De acuerdo con la invencion, la desfosforilacion del sustrato con calcineurina se realiza en una mezcla de reaccion. Como se usa en el presente documento, la expresion "mezcla de reaccion" o "mezcla de reaccion de ensayo" tiene su significado general en la tecnica. Y se refiere a la solucion en que se realiza la reaccion enzimatica a cuantificar. Por lo general, la mezcla de reaccion de ensayo de acuerdo con la invencion es una solucion acuosa que comprende todos los reactivos necesarios para que se produzca la reaccion enzimatica. Por lo general, la mezcla de reaccion comprende agua, un tampon de pH y sales.
Algunos tampones de pH adecuados de acuerdo con la invencion son tampones sin fosfato, tales como Tris-HCl.
Por lo general, el pH de la mezcla de reaccion esta comprendido entre 6,0 y 8,0, preferentemente alrededor de 7,0.
En una realizacion, el tampon de reaccion comprende Ca2+ y calmodulina. De hecho, la actividad de fosfatasa de la calcineurina nativa depende de la presencia de Ca2+ y calmodulina.
Por lo general, la mezcla de reaccion de ensayo puede comprender una concentracion final de calmodulina comprendida entre 0,01 y 0,06 unidades, de forma preferente aproximadamente 0,03 unidades.
Por lo general, la mezcla de reaccion de ensayo comprende una concentracion final de Ca2+ comprendida entre 30 pM y 90 pM, de forma preferente aproximadamente 50 pM.
En una realizacion de la invencion, se anaden inhibidores de proteasa a la muestra biologica y/o a la mezcla de reaccion. De hecho, la presencia de tales inhibidores evita la degradacion de la calcineurina presente en la muestra biologica mediante proteasas endogenas. Algunos inhibidores de proteasa adecuados incluyen, pero no se limitan a PMSF, EDTA, EGTA, aprotinina, leupeptina, pepstatina y mezclas de los mismos.
La reaccion de acuerdo con la invencion se realiza en presencia de al menos un inhibidor de fosfatasa. Como se usa en el presente documento, la expresion "inhibidor de fosfatasa" tiene su significado general en la tecnica. Se refiere a un compuesto que inhibe al menos una fosfatasa. Por lo general, el inhibidor de fosfatasa de acuerdo con la invencion no es un inhibidor de calcineurina a la concentracion seleccionada.
Algunos inhibidores de fosfatasa adecuados de acuerdo con la invencion incluyen inhibidores especfficos de fosfatasa e inhibidores de amplio espectro.
Por lo general, el inhibidor de fosfatasa de acuerdo con la invencion es acido okadaico. El acido okadaico (9,10- Desepitio-9,10-dideshidroacantifolicina) es un potente inhibidor de la protefna fosfatasa 1 (PP-1; CI50 = 20-100 nM), protefna fosfatasa 2A (PP-2A; CI50 = 0,1-1 nM) y protefna fosfatasa 2B (PP-2B; CI50 > 5000 nM).
Por lo general, el acido okadaico se usa a una concentracion final quedarfa de 100 a 1000 nM, de forma preferente aproximadamente 500 nM.
Otro inhibidor de fosfatasa adecuado es la microcistina-LR.
La reaccion de acuerdo con la presente invencion se realiza en presencia de al menos un inhibidor de quinasa. De hecho, los inventores han demostrado, por primera vez, que algunas muestras biologicas contenfan una actividad de quinasa que compite con la actividad de la calcineurina fosfatasa, lo que conducfa perdida de especificidad de los ensayos descritos anteriormente.
Por lo tanto, la realizacion del ensayo de actividad de calcineurina en presencia de al menos un inhibidor de quinasa conduce a un aumento de la especificidad del metodo.
Como se usa en el presente documento, la expresion "inhibidor de quinasa" se refiere a un compuesto que inhibe la actividad de al menos una quinasa.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, el inhibidor de quinasa es un inhibidor selectivo de la Protefna Quinasa A (PKA).
La seleccion de inhibidores de PKA apropiados entra dentro de la capacidad de la persona experta en la materia.
Algunos inhibidores de PKA selectivos adecuados de acuerdo con la invencion pueden ser 1) analogos estructurales de cAMP, la familia de los Rp-cAMP, que son inhibidores competitivos del sitio de union a cAMP, 2) inhibidores endogenos de la actividad de PKA: el peptido inhibidor de la protefna quinasa (Murray, 2008) y 3) ARN de silenciamiento dirigido a al menos las dos isoformas (a y p) de la subunidad catalftica de PKA (Murray, 2008; Dumaz et al., 2003; Rudolph et al., 2007; Monagham et al., 2008). Estos compuestos incluyen, pero no se limitan a Rp- adenosin 3',5'-monofosforotioato cfclico (Wang et al., 1991); Rp-8-Bromoadenosin 3',5'-Monofosforotioato cfclico (Gjertsen et al., 1995); Rp-8-bromo-2'-O-monobutiriladenosin-3',5'-monofosforotioato cfclico (Ruiz-Velasco et al.,
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1998); Rp-8-cloroadenosin-3’,5’-monofosforotioato cfclico (Yokozaki et al., 1992); Rp-8-(4-clorofeniltio)adenosin-3’,5’- monofosforotioato cfclico (Weisskupf et al., 1994); Rp-8-hexilaminoadenosin-3’,5’-monofosforotioato cfclico (Gjertsen et al., 1995); Rp-8-hidroxiadenosin-3’,5’-monofosforotioato cfclico (Gjertsen et al., 1995); los Rp-8-PIP-cAMP (Ogreid et al., 1994); fragmento 14-22 miristoilado inhibidor de PKA (Zhang et al., 2004); fragmento 6-22 de amida inhibidor PKA (Glass et al., 1989); fragmento de amida 5-22 inhibidor de PKA (Cheng et al., 1986); fragmento 5-24 inhibidor de protefna quinasa dependiente de cAMP (Cheng et al., 1986).
Dentro de la capacidad de la persona experta entra la determinacion de la concentracion optima del inhibidor de PKA en la mezcla de reaccion final.
En una realizacion con el inhibidor de PKA es el Rp-adenosin 3’-5’ monofosforotioato cfclico, que se puede adquirir en Sigma-Aldrich con la referencia A165.
Por lo general, el Rp-adenosin 3’-5’ monofosforotioato cfclico se puede usar a una concentracion final de 10 pM.
De acuerdo con otra realizacion de la invencion, el inhibidor de quinasa es un inhibidor de quinasa no selectivo. Algunos inhibidores de quinasa no selectivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, H89 (Murray, 2008); KT5720 (Murray, 2008); queleritrina (Freemerman et al., 1996); H7 (Qiu et al., 2010); H8 (Hidaka et al., 1984); inhibidor de protefna quinasa de corazon porcino.
Por lo general, el inhibidor de quinasa no selectivo puede ser H89, que se puede adquirir en Sigma-Aldrich con la referencia B1427.
H89 se puede usar a una concentracion final de 20 pM.
Ademas, en otra realizacion, la mezcla de reaccion de ensayo comprende varios inhibidores de quinasa.
Despues de realizar la desfosforilacion del sustrato por la calcineurina presente en la muestra biologica, la cantidad de sustrato desfosforilado se cuantifica, ya sea de forma directa o indirecta. Los resultados se pueden expresar como una medida absoluta (tal como pmol/mg de protefna/min), o en unidades arbitrarias.
Esta etapa de "medir la cantidad de sustrato desfosforilado" se puede realizar ya sea de forma indirecta (por medida de la cantidad de fosfato libre liberado por la reaccion) o de forma directa (por medida del sustrato desfosforilado en sf mismo).
Se puede usar cualquier metodo para medir la cantidad de sustrato desfosforilado.
Algunos metodos adecuados incluyen, pero no se limitan a:
- medidas de radiometrfa en el caso de un sustrato etiquetado con 32P (Fruman et al., 1996; Koefoed-Nielsen et al., 2004);
- medidas de fluorescencia en el caso de un sustrato etiquetado con un fluoroforo (Roberts et al., 2008);
- medidas de espectrofotometrfa en el caso de sustrato sin etiquetar (Sellar et al., 2006).
En una realizacion, la cantidad de fosfato libre se mide usando un ensayo de colorimetrfa y espectrofotometrfa (Sellar et al., 2006). Por ejemplo, el kit de ensayo de actividad celular de calcineurina comercializado por Calbiochem con el numero de catalogo 207007 depende de la deteccion de fosfato libre basandose en el ensayo de verde de malaquita.
En las tecnicas de deteccion descritas anteriormente, es necesario separar de forma ffsica:
- el fosfato libre del sustrato fosforilado sin metabolizar, por ejemplo, con columnas de cromatograffa con resina de intercambio cationico Dowex (vease Fruman et al., 1996);
- o el peptido desfosforilado del sustrato fosforilado sin metabolizar, por ejemplo usando resinas de oxido de
titanio (vease Roberts et al., 2008) o usando cromatograffa lfquida (vease Enz et al., 1994) antes de la etapa de
medida en sf misma.
En otra realizacion, la cantidad de sustrato desfosforilado se mide mediante cromatograffa lfquida. Algunos metodos de cromatograffa adecuados se describen por ejemplo en Enz et al. (1994).
El presente documento describe un metodo para cuantificar de forma simultanea peptidos fosforilados y no fosforilados mediante HPLC acoplada a deteccion de UV. Los experimentos desvelados en el presente documento se realizaron usando calcineurina purificada. Sanquer et al., (2004) tambien describen un metodo de deteccion basado en HPLC acoplada a deteccion de UV para medir la actividad de calcineurina en muestras de PBMC obtenidas de pacientes de trasplante.
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Ademas, en otra realizacion, la cantidad de sustrato desfosforilado se mide mediante cromatograffa liquida acoplada con espectrometrfa de masas en tandem (LC-MS/MS). De forma ventajosa, este metodo de deteccion aumenta adicionalmente la sensibilidad y la especificidad del ensayo.
En una realizacion preferente, la etapa de medir la cantidad de sustrato desfosforilado se realiza mediante cromatograffa liquida acoplada con espectrometrfa de masas en tandem (LC-MS/MS) como se describe en los Ejemplos que siguen a continuacion.
Como se usa en el presente documento, la expresion "muestra biologica" se refiere a cualquier muestra biologica de la que se sospecha que contiene actividad de calcineurina.
Por lo general, la muestra biologica puede ser una muestra de sangre, una muestra de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), una muestra de fluido cerebroespinal o extractos celulares preparados a partir de cultivos celulares.
En una realizacion preferente, la muestra biologica es una muestra de PBMC.
La muestra biologica de acuerdo con la invencion se puede obtener en el momento o se puede mantener a +4 °C o +20 °C antes del analisis.
En una realizacion preferente, la muestra biologica se usa en un maximo de 7 dfas desde su recogida, preferentemente en 4, 3, 2 o 1 dfas desde la recogida cuando se mantiene a +4 °C o en el dfa de la recogida cuando se mantiene a +20 °C.
Por lo general, un "paciente" se refiere a un mamffero, tal como un roedor, un felino, un canino, y un primate. Preferentemente, un paciente de acuerdo con la invencion es un ser humano.
Por lo general, un paciente de acuerdo con la invencion es un paciente inmunosuprimido, tal como un paciente que ha recibido un trasplante de organos o celulas madre.
La presente invencion tambien se refiere a un kit para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa.
En el kit de acuerdo con la invencion, el sustrato, el inhibidor de fosfatasa y el inhibidor de quinasa son como se han descrito anteriormente.
El kit de acuerdo con la invencion puede comprender adicionalmente:
- calcineurina recombinante, a usar como control positivo;
- controles de calidad
- calibradores
- tampon de ensayo
- un folleto que explica que la reaccion se deberfa realizar en presencia de al menos un inhibidor de quinasa para resultados optimos;
- y/o medios para detectar la cantidad de fosfato libre liberado por la reaccion, tal como verde de malaquita (para deteccion mediante espectrofotometrfa).
- y/o un patron interno (para deteccion mediante cromatograffa liquida acoplada a espectrometrfa de masas).
Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de inhibidor de quinasa en un metodo para medir la actividad de calcineurina.
El metodo para cuantificar la actividad de calcineurina en una muestra biologica tiene muchas aplicaciones.
Por ejemplo, el metodo se puede usar para controlar la actividad de calcineurina en una muestra biologica obtenida de un paciente al que se le ha administrado un tratamiento inmunosupresor.
Por lo general, a los pacientes que reciben un trasplante de organos se les proporcionan tratamientos inmunosupresores tales como tacrolimus o ciclosporina.
Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un metodo para predecir el resultado terapeutico de un paciente de trasplante que comprende medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica obtenida de dicho paciente como se ha descrito anteriormente.
Como se usa en el presente documento, la expresion "predecir el resultado terapeutico" incluye tanto controlar el nivel de actividad de calcineurina en una muestra biologica de un paciente dado en el tiempo (en una primera y segunda muestras biologicas obtenidas en dos puntos temporales distintos) como comparar el nivel de actividad de
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calcineurina en una muestra biologica obtenida de dicho paciente con un valor de referencia. En una realizacion, el valor de referencia puede ser un valor obtenido a partir de una poblacion que presenta una enfermedad similar para dicho paciente. Como alternativa, el valor de referencia puede ser un valor obtenido a partir de una poblacion sana.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Se realizaron experimented cineticos de calcineurina en presencia o ausencia de dos inhibidores de quinasa diferentes. La produccion del peptido DP-RII se cuantifico usando analisis de LC-MS/MS.
Figura 2: Seguimiento longitudinal de actividades de calcineurina y quinasa en 2 pacientes de trasplante. A, B: Paciente 1; C, D: Paciente 2; A, C: Influencia de H89 en la actividad de calcineurina; B, D: la actividad de quinasa se cuantifico por medio de LC-MS/MS.
Figura 3: Perfiles cromatograficos de peptido P-RII, peptido DP-RII y peptido RII de isotopo estable en extracto de protefna de PBMC. A, B, C: 1 mg/l de peptido RII en extracted de protefna de PBMC; D, E, F: 1 mg/l de P-RII en extracted de protefna de PBMC; G, H, I: 1 mg/l de peptido RII de isotopo estable en extractos de protefna de PBMC; J, K, L: blanco de extractos de protefna de PBmC; A, D, G, J: transicion 732,4 > 70,1 (peptido P-RII); B, E, H, K: transicion 705,8 > 70,1 (peptido DP-RII); C, F, I, L: transicion 708,3 > 70,1 (peptido RII de isotopo estable).
Figura 4: Perfiles de supresion de iones para fusion postcolumna de extractos de protefna de PBMC.
Figura 5: Reproducibilidad para calibraciones durante un periodo de 12 dfas.
Ejemplos
Materiales y metodos
Preparacion de extractos celulares
Las PBMC obtenidas de voluntarios sanos o de pacientes de trasplante se resuspendieron en un tampon que contenfa Tris 50 mM, pH = 7,0, EGTA 0,1 mM, ditiotreitol 0,05 mM, Tween 20 al 0,1 %, 0,3 mg/ml de albumina, MnCl2 1 mM, CaCh 1 mM e inhibidores de proteasa. Estos extractos celulares se sonicaron en hielo, y se centrifugaron durante 30 minutos a 10.000 g a 4 °C. Los sobrenadantes que corresponden principalmente a las fracciones citosolicas se recuperaron y su contenido de protefna se determino. Estos extractos celulares se pueden almacenar a -80 °C para medida posterior de actividad de CN.
Preparacion de peptidos
Se prepararon soluciones de reserva del peptido RII, su forma fosforilada y patron interno (peptido RII de isotopo estable) a una concentracion de 0,5 g/l en tampon Hepes y se almacenaron a -40 °C. Se prepararon calibradores por dilucion de las soluciones de reserva en Tris-HCl para proporcionar un intervalo de calibracion final de 0,16, 0,32, 0,63, 0,95, 1,58, 4,74 y 7,9 pM.
Ensayo enzimatico
De uno a 5 pg de protefnas obtenidas a partir de PBMC, preparadas como se ha descrito anteriormente, se usaron para medir la actividad de calcineurina en una mezcla de reaccion que contenfa acido okadaico 500 nM, 1 mg/l de patron interno, H89 20 pM, 8 mg/l de peptido RII fosforilado y 0,03 unidades de calmodulina en 15 pl de Tris-HCl 50 mM, pH = 7,0. La reaccion enzimatica se realizo a 37 °C durante 30 min y a continuacion, los tubos de reaccion se enfriaron en hielo y la reaccion enzimatica se detuvo mediante la adicion de 15 pl de una solucion de acido tricloroacetico al 5 %. Despues de centrifugacion durante 5 minutos a 12.000 g a 4 °C, los sobrenadantes se transfirieron a inserted de vidrio de 200 pl en viales para autoinyector de vidrio de 1,5 ml y se mantuvieron a 4 °C en automuestreador antes de inyeccion.
Condiciones cromatograficas
La LC-MS/MS se realizo usando un sistema de HPLC de la serie 1100 de Agilent conectado a un espectrometro de masas cuadrupolo en tandem API3000 de Applied Biosystems, manejado en el modo de ion positivo con electronebulizacion con control de reaccion seleccionado (sRm). De forma rutinaria se uso una inyeccion de 24 pl, y la cromatograffa se consiguio con una columna Zorbax 300 Extend-C18 de 4,6 x 100 mm y un tamano de partfcula de 3,5 pm, columna analftica protectora de 4,6 x 12,5 mm de Agilent. El caudal era de 0,2 ml/min. La fase movil A era acetato amonico 5 mM y acido formico al 0,1 % en agua y la fase movil B, acetato amonico 5 mM y acido formico al 0,1 % en acetonitrilo. Un gradiente de fase movil programado se uso durante la realizacion de 20 min: 0 min, 2 % de B; 10 min, 100 % de B, 15 min, 100 % de B; 15,5 min 2 % de B, 20 min, 2 % de B. Se seleccionaron peptidos ionicos di-cargados tanto para P-RII, DP-RII como patron interno como los peptidos ionizados de forma mas intensa
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despues de modo de ionizacion positiva con electronebulizacion. El instrumento de MS/MS y los parametros de recogida de datos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1a: Parametros del instrumento de MS/MS
Tension de pulverizacion de iones (V)
5500
Potencial de entrada
10
Temperatura ( °C)
50
Cortina de gas
10
Gas nebulizador
8
Gas de colision
4
Resolucion de Q1
unidad
Resolucion de Q3
unidad
Tiempo de residencia (ms)
300
Tipo de barrido
SRM
Tension de pulverizacion de iones (V)
5500
Potencial de entrada
10
Temperatura ( °C)
50
Cortina de gas
10
Gas nebulizador
8
Gas de colision
4
Resolucion de Q1
unidad
Resolucion de Q3
unidad
Tiempo de residencia (ms)
300
Tipo de barrido
SRM
Tabla 1.b: Parametros de transiciones
compuesto
m/z Q1 m/z Q3 CE CXP DP FP tiempo de retencion
peptido P-RII
732,4 201,2 70 10 100 400 14,5
(sustrato)
732,4 70,1 90 10 46 320
peptido DP-RII
705,8 70,1 95 8 51 370 14,6
(producto)
705,8 201,2 59 20 51 370
patron interno
708,5 70,1 89 8 96 370 14,6
708,5 201,2 55 18 96 370
CE: energfa de colision (eV) CXP: potencial de salida de colision celular (eV); DP: potencial de desagregacion (eV) FP: potencial de enfoque (eV).
Ensayo de validacion
Los perfiles cromatograficos para blanco de extractos de protefna de PBMC y extractos de protefna de PBMC que contenfan cualquiera de peptido P-RII, peptido DP-RII o patron interno se muestran en la Figura 3. Como se puede observar en la Figura 3, las transiciones seleccionadas para cada peptido de interes son especfficas de un peptido dado, y ninguna de ellas se encuentra en el blanco de extractos de protefna de PBMC. El peptido RII fosforilado presentaba un tiempo de retencion de 14,5 min y tanto el peptido DP-RII como el patron interno presentaban tiempos de retencion similares de 14,6 min.
En la Figura 4 se muestran algunos perfiles representativos de supresion de iones para un extracto de protefna de PBMC analizado por LC-MS/MS 4. Los efectos de supresion se produjeron principalmente entre 6 y 11 minutos de la cromatograffa, a continuacion la senal se estabilizo de forma gradual. El pequeno efecto de supresion de iones observado en los tiempos de elucion de los peptidos de interes se puede ignorar debido a la coelucion del patron interno.
La reproducibilidad del ensayo se verifico en 7 calibraciones separadas realizadas durante un periodo de 12 dfas como se muestra en la Figura 5. Cada calibracion individual presentada un R2 de 0,9966 o superior. La ecuacion de regresion media para las 7 calibraciones, en las que el coeficiente de regresion se expresa como media (DT), era
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como sigue a continuacion: y = [0,1863 (0,055)]x-[0,0007 (0,00421)].
La precision del ensayo se examino en extractos de protema de PBMC con actividades de calcineurina conocidas que variaban de 90 a 500 pmol/mg/min. La variabilidad maxima intraensayo e interensayo era de un 11,5 % y un 16 %, respectivamente (Tabla 2).
Tabla 2: Datos de imprecision para actividad de calcineurina medidos en extractos de protefna de PBMC
Intraensayo
Interensayo
nombre
media medida nombre media medida
de la muestra
pmol/mg/min CV, % de la muestra pmol/mg/min CV, %
1
92 6,6 7 337 10,5
2
232 4,6 8 91 8,7
3
333 10,6 9 160 11,5
4
132 8,6 10 375 8,0
5
221 11,5 11 362 5,6
6
116 4,3 12 454 13,5
13 452 11,7
14 356 12,8
15 140 12,3
16 179 16,0
Resultados
Ninguno de los metodos descritos anteriormente analizaba la posibilidad de refosforilacion del peptido DP-RII durante el proceso de reaccion enzimatica de CN con quinasas presentes en los extractos celulares.
Los inventores evaluaron la cinetica de la calcineurina en presencia o no de 2 inhibidores de quinasa diferentes: H89, un inhibidor inespedfico y Rp-adenosin 3',5'-monofosforotioato dclico, un inhibidor espedfico de PKA.
Un primer conjunto de experimentos se realizo usando 5 pg de protemas citosolicas de PBMC obtenidas a partir de voluntarios sanos. Las celulas se resuspendieron en un tampon que contema Tris 50 mM, pH = 7,0, EGTA 0,1 mM, ditiotreitol 0,05 mM, Tween 20 al 0,1 %, 0,3 mg/ml de albumina, MnCh 1 mM, CaCl2 1 mM e inhibidores de proteasa. Las reacciones enzimaticas se procesaron a 37 °C en el tampon Tris 50 mM, pH = 7,0, complementado con 8 mg/l detective RII-P, 0,03 unidades de calmodulina, acido okadaico 500 nM y 1 mg/l peptido RII de isotopo estable como un patron interno. Las reacciones enzimaticas se detuvieron en los puntos temporales indicados (hasta 120 min) y las cantidades de peptido se cuantificaron por LC-MS/MS.
Como se muestra en la Figura 1, la produccion de peptido DP-RII era significativamente mas elevada en presencia de los inhibidores de quinasa (inhibidor espedfico de PKA con respecto a control, p = 0,0008; H89 con respecto a control, p = 0,0007, ensayo de ANOVA). Ademas, la inhibicion obtenida con H89 era significativamente mas elevada que la obtenida con el inhibidor espedfico de PKA (p = 0,0163).
Para examinar la importancia de tal influencia en la estrategia farmacodinamica para controlar el alcance de la inmunosupresion despues del trasplante, los inventores evaluaron las PBMC de pacientes de trasplante en presencia o ausencia del inhibidor de quinasa H89, en un segundo conjunto de experimentos. Como se muestra en la Figura 2, una fuerte variacion en la actividad de quinasa se observo entre pacientes y en el tiempo. Ademas, la actividad de quinasa era capaz de alterar la medida de la actividad de CN, lo que refleja la importancia del enfoque de los inventores.
Este hallazgo demuestra que la medida de la actividad de CN se puede realizar en presencia de un inhibidor de quinasa, para obtener una medida mas espedfica.
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Claims (10)

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    25
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    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende las etapas de:
    - proporcionar una mezcla de reaccion que comprende un sustrato, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa;
    - incubar dicha muestra biologica con la mezcla de reaccion en condiciones adecuadas para la actividad de calcineurina;
    - medir la cantidad de sustrato desfosforilado.
  2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el sustrato es el peptido fosforilado DLDVPIPGRFDRRVpSVAAE (SEC ID N°: 1).
  3. 3. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de fosfatasa es acido okadaico.
  4. 4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de quinasa es H89.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra biologica es una muestra de celulas sangufneas mononucleares de sangre periferica (PBMC).
  6. 6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de medir la cantidad de sustrato desfosforilado se realiza mediante cromatograffa.
  7. 7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la etapa de medir la cantidad de sustrato desfosforilado se realiza mediante cromatograffa lfquida acoplada con espectrometrfa de masas en tandem (LC-MS/MS).
  8. 8. Un kit para medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica que comprende un sustrato de calcineurina, al menos un inhibidor de fosfatasa y al menos un inhibidor de quinasa.
  9. 9. Uso de inhibidor de quinasa en un metodo para medir la actividad de calcineurina.
  10. 10. Un metodo para predecir el resultado terapeutico de un paciente de trasplante que comprende medir la actividad de calcineurina en una muestra biologica obtenida de dicho paciente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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