ES2549702B1 - Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis - Google Patents

Abstract

Proteína recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicación para la producción de una composición inmunogénica frente a la pasteurelosis. La invención describe el uso de la proteína recombinante rFrpA como antígeno capaz de servir como vacuna eficaz frente a Ptiotobacterium damselae subespecie piscicida, agente causal de la pasteurelosis en peces. La vacuna es capaz de inducir una potente respuesta inmunitaria y confiere una elevada protección frente a la patología, cuando es suministrada vía parenteral.

Description

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DESCRIPCION

Protefna recombinante del receptor de la ferri-piscibactina y su aplicacion para la produccion de una composicion inmunogenica frente a la pasteurelosis

SECTOR TECNICO DE LA INVENCION

La presente invencion se encuentra dentro de la biologfa y de la biologfa molecular, y se refiere a la elaboracion de composiciones inmunogenicas que comprenden la protefna del receptor de la ferri- piscibactina (FrpA) de Photobacterium damselae subsp. piscicida para el desarrollo de una vacuna frente a la pasteurelosis que afecta a especies de peces de interes comercial de la industria acufcola.

ESTADO DE LA TECNICA

Photobacterium damselae subsp. piscicida (PhDP) es una bacteria gram-negativa conocida previamente como Pasteurella piscicida. PhDP es el agente causal de la pasteurelosis, fotobacteriosis o pseudotuberculosis, una enfermedad devastadora en la acuicultura marina que provoca elevadas mortalidades, posee un amplio rango de hospedadores, afectando a mas de 20 especies de peces de interes acufcola, y tiene una amplia distribucion global (Romalde, 2002., Int. Microbiol. 5 (1): 3-9; Thyssen et al.,1998. Int. J. Syst. Bacteriol. 48: 1145-1151; Toranzo et al, 2005. Aquaculture. 246 (1-4): 37-61; Barnes et al. 2005., Dev. Biol. (Basel).121: 75-84).

PhDP es un patogeno facultativo intracelular capaz de promover su internalizacion en las celulas del hospedador (Acosta et al. 2009., J. Fish Dis. 32(6): 535-541). El hecho de que PhDP sea un parasito intracelular capaz de resistir a la fagocitosis hace que sea un patogeno diffcil de detectar por el sistema inmune del hospedador a la vez que dificulta los tratamientos quimioterapicos (Do Vale et al., 2005. Mol. Microbiol. 58(4): 1025-1038).

La pasteurelosis puede cursar de forma aguda, provocando grandes mortalidades, o de modo cronico asintomatico. Las infecciones asintomaticas afectan tanto a peces cultivados como a animales salvajes, siendo las poblaciones naturales de peces y moluscos el reservorio natural del patogeno (Serraca et al., 2011. Can. J. Microbiol. 57(5): 437-40). Los peces enfermos suelen perder peso, presentar un oscurecimiento de la piel, necrosis en las branquias y en las vfsceras suelen apreciarse granulomas blancos. Los brotes de pasteurelosis se producen en los meses de primavera y verano y se asocian a condiciones de estres de los peces y a la baja calidad del agua: temperatura alta (> 18°C) y baja salinidad (Magarinos et al., 1996. Annu. Rev. Fish Dis. 6(0): 41-64). La enfermedad aparece mayoritariamente durante el estado larvario, provocando mortalidades de hasta el 90%, pero tambien afecta a peces juveniles en los que ocasiona perdidas del 50%. Tras los brotes agudos, los animales asintomaticos se convierten en portadores y pueden desarrollar la enfermedad cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables para el patogeno. Ademas, se ha detectado la presencia de PhDP en fluidos ovaricos y huevos provenientes de reproductores sanos, lo que indica una probable transmision vertical (Romalde et al., 1999. J. Microbiol. Methods. 38 (1-2): 147-154) Todo ello hace que los brotes de pasteurelosis sean un problema recurrente en las plantas de acuicultura debido a su diffcil erradicacion y control.

Inicialmente, los brotes de pasteurelosis aparecieron mayoritariamente en Japon; sin embargo, en la decada de 1990 empezaron a detectarse los primeros brotes en Europa. Aunque las cepas de PhDP muestran caracterfsticas bioqufmicas y serologicas muy homogeneas, se sabe que pueden agruparse en dos lfneas clonales: una formada por los aislados de origen japones y la otra formada por los aislados de origen europeo y americano (Magarinos et al., 2000. Epidemiol. Infect. 125 (1): 213-219). Las bacterias patogenas tienen una serie de herramientas, denominadas factores de virulencia, que les permiten colonizar y persistir dentro de un hospedador. Los principales factores de virulencia descritos en PhDP son la presencia de una capsula de polisacaridos y actividades enzimaticas como proteasas, fosfolipasas, lipasas y hemolisinas (Thyssen et al., 2000. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50 (3): 1013-1019; Magarinos et al., 1996. Microb. Pathog. 21 (4): 289-297). De todos los factores de virulencia descritos en esta bacteria los mas importantes son la produccion de la toxina apoptotica AIP56, que le permite resistir la fagocitosis, y la produccion y utilizacion de piscibactina, un potente sideroforo que le permite captar hierro del hospedador (Souto et al., 2012. Eur. J. Org. Chem. 29: 5693-5700; Osorio et al., 2006. Microbiology. 152 (11): 3327-3341). El sistema de la piscibactina esta codificado en el plasmido pPHDP70 cuya presencia es una caracterfstica comun a todos los aislados europeos y ademas se sabe que constituye un factor de virulencia clave (Osorio et al., 2015. Appl. Environ. Microbiol. Jun19, 19. pii: AeM.01580-15). Dentro de este plasmido el gen mas importante a la hora de captar la piscibactina es frpA, ya que codifica el receptor de membrana externa FrpA que permite la internalizacion del complejo hierro-piscibactina.

La primera estrategia utilizada para combatir la enfermedad se baso en el uso de antibioticos, pero la aparicion de cepas resistentes y multiresistentes provoco que esta estrategia fuese rapidamente

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ineficiente. Ademas, la persistencia de estas sustancias en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilizacion sea cada vez mas restrictiva. En las ultimas decadas los esfuerzos para controlar la enfermedad se han centrado en el desarrollo de vacunas efectivas. Son numerosas las vacunas desarrolladas frente a PhDP y entre ellas podemos encontrar de diversos tipos y formulaciones. Sin embargo, los niveles de proteccion en el pez no suelen ser satisfactorios. Las vacunas convencionales, llamadas bacterinas, estan compuestas por cultivos de la bacteria inactivados por calor, formol u otros metodos. Ademas este tipo de vacunas pueden ser enriquecidas con antfgenos solubles como lipopolisacaridos (LPS), protefnas de membrana externa (OMP), componentes de la capsula (CPS) o productos extracelulares (ECPs). De las numerosas vacunas disponibles la ICTHIOVAC-PD (vacuna DI21) comercializada por Hipra (Espana), es la que ha mostrado mayores grados de proteccion (proteccion en lubina > 60%) (Magarinos et al., 1994. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 14 (4): 120-122). Se trata de una bacterina enriquecida con ECPs que se viene utilizando desde mediados de los anos noventa.

El desarrollo de las tecnicas de biologfa molecular ha permitido utilizar nuevas estrategias para la formulacion de vacunas. En los ultimos anos se han publicado trabajos en los que se opta por la utilizacion como antfgeno de protefnas recombinantes purificadas a partir de cultivos de E. coli que, formuladas junto a otros componentes como sustancias adyuvantes o nano y microsistemas de vectorizacion, estan obteniendo resultados prometedores, postulandose como candidatos potenciales para desarrollar nuevas vacunas para distintas especies de peces (Andreoni et al., 2013. Vaccine. 31 (5): 820-826; Ho L-P et al., 2011. Fish Shellfish Immunol. 30 (1): 412-419; Ho L-P et al., 2014. J. Fish Dis. 37 (1): 51-56; Zhao et al. 2014. Vaccine 32: 327-337).

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La estrategia basada en el uso de antibioticos a gran escala para el tratamiento de la pasteurelosis ha dado lugar a la aparicion de cepas resistentes y multiresistentes que han hecho que su uso sea ineficiente. Ademas, la persistencia de los quimioterapicos en el pez y el impacto que provocan al medioambiente hace que su utilizacion sea cada vez mas restrictiva. El desarrollo de la biologfa molecular ha permitido, en los ultimos anos, la formulacion de vacunas basadas en el uso de protefnas recombinantes en el papel de antfgeno. En la presente invencion se describe por primera vez el uso de la protefna recombinante rFrpA de PhDP para el control de la pasteurelosis en peces.

Dado que las protefnas mas inmunogenicas son las que forman parte de su superficie celular (Scarselli et al., 2005. Trends Biotechnol. 23(2): 84-91), creemos que la utilizacion del receptor de membrana externa FrpA, necesario para la internalizacion de piscibactina, actuara como un antfgeno eficaz capaz de activar el sistema inmune especffico del pez. Para ello, en la presente invencion se ha clonado el gen frpA de PhDP en E. coli permitiendo la produccion y purificacion de la protefna recombinante FrpA (rFrpA). La presente invencion muestra la formulacion de un preparado inmunogenico a base de rFrpA y un adyuvante oleoso como el de Freund para obtener una vacuna frente a la pasteurelosis. La optimizacion de un protocolo de vacunacion y los experimentos de infeccion experimental en lenguado (Solea senegalensis y Solea solea) indican que la inmunizacion con la protefna recombinante rFrpA induce la produccion de anticuerpos especfficos frente al receptor de la piscibactina, FrpA, confiriendo ademas una proteccion satisfactoria frente a PhDP.

Asf, un primer aspecto de la invencion se refiere a una protefna de PhDP, la FrpA, caracterizada por la secuencia aminoacfdica SEQ ID NO: 2, a la protefna recombinante rFrpA, a polipeptidos con, al menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 2 y a fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas de FrpA. Cualquiera de estas protefnas o polipeptidos puede incluirse en una composicion inmunogenica que permite la produccion de una vacuna frente a PhDP. El uso de la vacuna asf elaborada logra tasas de proteccion en peces iguales o superiores al 80% frente a peces no vacunados.

En esta memoria descriptiva se entiende como propiedades antigenicas la capacidad de una sustancia de ser reconocida por el sistema inmune de un organismo como un elemento extrano y generar una respuesta inmune especffica que desemboca en la produccion de anticuerpos contra dicha sustancia.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia aminoacfdica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoacidos entre las dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias. Ademas, los polipeptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID nO:2 asf como, los fragmentos inmunogenicos a los que se refiere la presente memoria son aquellos que mantienen las caracterfsticas antigenicas de la protefna FrpA.

En esta memoria descriptiva se entiende como fragmento inmunogenico un peptido capaz de activar el sistema inmune especffico del pez generando anticuerpos frente a pasteurelosis.

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La invencion tambien se refiere al gen que codifica la protefna FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotfdica SEQ ID NO: 1 y a secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70% o aquellas que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas.

En esta memoria descriptiva se entiende por porcentaje de identidad de la secuencia nucleotfdica el porcentaje de coincidencias de los mismos nucleotidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de toda la longitud de ambas secuencias.

Otro aspecto de la invencion se refiere a la secuencia nucleotfdica del gen frpA, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia, o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas, clonadas en un vector recombinante que, asimismo, es susceptible de incluirse en celulas o microorganismos hospedadores en los que se expresan las secuencias nucleotfdicas descritas.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un organismo transgenico no humano que contiene, insertado en su genoma, una secuencia nucleotfdica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias.

La invencion tambien se refiere a una composicion inmunogenica que incluye: la protefna FrpA, la protefna recombinante rFrpA, polipeptidos con, al menos, un 80% de identidad con la protefna FrpA o fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas; la molecula nucleotfdica del gen de FrpA, secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas; vectores recombinantes que comprenden cualquiera de estas secuencias nucleotfdicas o celulas, microorganismos u organismos transgenicos no humanos portadores de vectores que incluyen la molecula nucleotfdica del gen de FrpA, secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia nucleotfdica o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas.

Esta composicion inmunogenica se puede utilizar en la elaboracion de una vacuna o preparacion farmaceutica con actividad inmunizadora para su administracion a peces con el fin de conferirles proteccion frente a la pasteurelosis, enfermedad causada por la infeccion por PhDP. Ademas, la composicion inmunogenica comprende un adyuvante, el adyuvante de Freund, para mejorar la respuesta inmune y puede comprender tambien un micro o nanosistema como sistema de vectorizacion.

En esta memoria descriptiva se entiende como microsistema de vectorizacion a un sistema constituido por partfculas que presentan unas dimensiones microescalares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribucion de la composicion inmunogenica a nivel tisular, celular o subcelular.

En esta memoria descriptiva se entiende como nanosistema de vectorizacion a un sistema constituido por partfculas que presentan unas dimensiones nanoescalares y que puede ser utilizado para modificar y/o controlar la distribucion de la composicion inmunogenica a nivel tisular, celular o subcelular.

La vacuna elaborada con la composicion inmunogenica que incluye la protefna recombinante rFrpA y adyuvante de Freund alcanza valores de proteccion satisfactorios, igualando la proteccion alcanzada por la vacuna comercializada por la casa comercial Hipra, a lo que suma ademas otros beneficios como el hecho de evitar problemas asociados a la bioseguridad ya que, no es necesario el cultivo a gran escala del patogeno del que proviene la protefna y el uso de una protefna recombinante que no supone ningun riesgo para la salud animal ni para el medio ambiente.

La invencion tambien se refiere a un procedimiento para la produccion de protefna recombinante (rFrpA) o polipeptidos con, al menos, un 80% de porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 2 o fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas de la protefna, que comprende el cultivo de una celula o microorganismo hospedador transfectado o transformado con la secuencia nucleotfdica del gen frpA, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos que mantienen las propiedades antigenicas de la protefna clonadas en un vector, cultivado en condiciones que promueven la expresion para la posterior recuperacion del polipeptido.

En esta memoria descriptiva se entiende como condiciones que promueven la expresion de un gen como aquellas condiciones de medio de cultivo, temperatura, pH y tiempo de incubacion necesarias para que se

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pueda obtener la correcta expresion de dicho gen obteniendose la protefna madura correctamente plegada.

La invencion tambien se refiere a un procedimiento para la replicacion del gen que codifica la protefna FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotfdica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 80%, o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas de la protefna FrpA que comprende el cultivo de una celula o microorganismo hospedador transfectado o transformado con un vector recombinante que a su vez comprende el gen que codifica la protefna FrpA de PhDP, caracterizado por la secuencia nucleotfdica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 80% o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas de la protefna FrpA cultivado en condiciones que promueven la replicacion para la posterior recuperacion del gen.

Se entiende como condiciones que promueven la replicacion aquellas condiciones de temperatura, pH, medio de cultivo y tiempo necesarias para que se pueda obtener la replicacion del vector utilizado para clonar la protefna recombinante.

Por otro lado, la invencion tambien se refiere al procedimiento para elaborar una composicion inmunogenica o preparacion farmaceutica con actividad inmunizadora en peces que comprende la formulacion de, al menos, uno de los siguientes productos: la protefna FrpA, caracterizada por SEQ ID NO:2, la protefna recombinante rFrpA, polipeptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2 o fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas; el gen que codifica la protefna FrpA de PhDP, caracterizado por SEQ ID NO:1 , secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO:1 de, al menos, el 70% o secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas; un vector recombinante que incluye una de estas secuencias nucleotfdicas; una celula o microorganismo transfectado o transformado con un vector recombinante como el descrito aquf; un organismo transgenico no humano que comprende insertado en su genoma una secuencia nucleotfdica SEQ ID NO: 1, secuencias con un porcentaje de identidad con SEQ ID NO: 1 de, al menos, el 70%, secuencias que codifican fragmentos inmunogenicos de la protefna FrpA que mantienen las propiedades antigenicas o vectores que comprenden cualquiera de las anteriores secuencias; un adyuvante; un microsistema o nanosistema de vectorizacion.

La composicion inmunogenica de la invencion permite la obtencion de un grado de proteccion elevado en peces, evitando el cultivo y manipulacion del patogeno y evitando los problemas asociados a la utilizacion de vacunas poco caracterizadas procedentes de extractos brutos de la bacteria que puedan contener otros componentes no deseados como endotoxinas, exotoxinas, enzimas hidrolfticos, etc.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Gel agarosa 1%. A. Amplificacion del gen frpA a partir de DNA genomico de Photobacterium damselae subsp. piscicida DI21. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificacion sin DNA genomico. 3) amplificacion con DNA genomico. B. Amplificacion del gen frpA tras ser clonado en pBAD. 1) marcador de peso molecular. 2) amplificacion sin DNA plasmfdico. 3) amplificacion con el vector original derivado de pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacteriol. 177 (14): 4121-4130) (Notese que este vector contenfa la secuencia codificadora de otra protefna en el lugar a ocupar por FrpA; Vila Sanjurjo et al, sin publicar). 4) amplificacion de pBAD-10His-FrpA. C. Amplificacion del gen frpA que contiene pelB y 10 His tras ser clonado en pBAD 1) Amplificacion sin DNA plasmfdico. 2) Amplificacion de pBAD-10His-FrpA.

Figura 2. Analisis de la expresion de rFrpA. M corresponde al marcador de peso molecular. Las fracciones celulares insolubles (pellet) obtenidas despues de la lisis por sonicado y posterior centrifugacion fueron separadas en un gel de poliacrilamida 8%-SDS. 1) Protefnas presentes sin induccion. 2) protefnas despues de la induccion con arabinosa 0.2%. La flecha indica la protefna recombinante.

Figura 3. Las fracciones obtenidas en el proceso de purificacion de rFrpA usando una resina de afinidad de nfquel fueron analizadas en un gel de poliacrilamida 10%-SDS. M corresponde al marcador de peso molecular. 1) Fraccion membranas totales de las celulas despues de la solubilizacion con sarkosyl 1.5%. 2) Fraccion membranas externas de las celulas despues de la solubilizacion con elugent 5%. 3) Fraccion no retenida en la columna de afinidad de nfquel. 4-6) Fracciones de lavado de la columna con tampon Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM. 9-12) Fracciones de elucion de la protefna con tampon Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 500 mM. 13) FrpA concentrada obtenida despues de combinar las fracciones de la columna.

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Figura 4. A Digestion de rFrpA con tripsina. La reaccion se llevo a cabo con 4 pg/mL de tripsina durante 15 min a temperature ambiente. Los fragmentos obtenidos fueron analizados en un gel de poliacrilamida 10%-SDS. M corresponde al marcador de peso molecular. 1) Fragmentos de rFrpA nativa 2) Fragmentos de rFrpA desnaturalizada por calentamiento a 100°C durante 10 min en presencia de SDS. B. Espectro de dicrofsmo circular de rFrpA.

Figura 5. Protocolo experimental de vacunacion e infeccion experimental realizado para determinar el nivel de proteccion. Tambien se muestran los dfas en los que se obtuvieron muestras de suero para cuantificar la produccion de anticuerpos.

Figura 6. Nivel de anticuerpos en sangre frente a PhDP presente en el suero de los grupos de peces inmunizados con 100 pl de: PBS, PBS con adyuvante de Freund (en proporcion 1:1), bacterina o vacuna rFrpA.

Figura 7. Supervivencia acumulada en los cuatro grupos de peces inmunizados con vacuna rFrpA, bacterina, PBS y Freund o PBS. Los resultados se muestran como el porcentaje de supervivencia acumulada en cada grupo de peces.

MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION

La presente invencion se ilustra adecuadamente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Expresion de la protefna recombinante de FrpA (rFrpA) en E. coli

En este ejemplo se ilustra la metodologfa utilizada para la produccion de la protefna recombinante rFrpA en E. coli BL1 CodonPlus. Para ello se construyo un plasmido recombinante al clonar el gen frpA, que codifica para la protefna FrpA, en el plasmido pBAD (Guzman et al., 1995. J. Bacteriol. 177 (14): 41214130). La utilizacion del pBAD como vector de clonacion permite que la expresion de frpA se active al anadir arabinosa al medio de cultivo. La construccion se realizo mediante “overlap extension PCR cloning" (Bryksin et al., 2010, 48: 463-465). El gen frpA se amplifico mediante PCR a partir del ADN de PhDP usando polimerasa Phusion (Thermo Scientific) y los cebadores mencionados en la tabla No. 1. Para asegurar la correcta localizacion de rFrpA en la membrana externa de E. coli, se sustituyo el peptido senal nativo de FrpA, correspondiente a los primeros 26 aminoacidos del extremo N-terminal, por PelB de Erwinia carotovora caracterizado por SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Adicionalmente se incluyo una secuencia que codifica la sfntesis de 10 histidinas util durante la purificacion de rFrpA mediante resina de afinidad de nfquel (de aquf en adelante nos referiremos al constructo como: pelB-10His-FrpA). La construccion fue transformada en E. coli BL21 CodonPlus.

Tabla 1. Cebadores usados para la amplificacion del gen frpA y para su insercion en el plasmido pBAD.

Cebador (oligonucleotido)

Secuencia 5'^3'

Fwd-frpA-pBAD Caracterizado por SEQ ID NO:5

CCCGTTTTTTTGGGCT AACAGGAGGAATT AACCAT GTACAGGAACAGTTTC TCGCTCTCTCC

Rev-frpA-pBAD Caracterizado por SEQ ID NO:6

CGAATTCCAATGACAACTCCGT CTT CCTTACCACT CT AGCTT CATATT CACA CCC

F-pBAD-pelB Caracterizado por SEQ ID NO:7

GGGCTAACAGGAGGAATTAACCAUGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTG CTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC

pelB-His-FrpA-R Caracterizado por SEQ ID NO:8

CCGT AACTT CT GGATT ATGTT CAT CAT GAT GAT GAT GGT GGT GGT GAT GGT GATGGG CCATCGCCGGCTGGGCAGC

Tras clonar la secuencia pelB-10His-FrpA en E. coli, se optimizaron las condiciones de expresion de rFrpA, para ello se probaron diferentes condiciones de cultivo variando la concentracion de arabinosa,

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temperatura y el tiempo de incubacion. Finalmente, las mayores cantidades de rFrpA se obtuvieron con cultivos de E. coli BL21 CodonPlus incubados a 28°C durante 38 h suplementando el medio de cultivo con un 0.2% de arabinosa.

Para comprobar la correcta expresion de rFrpA se prepararon dos cultivos de E. coli BL21 CodonPlus con el plasmido pelB-10His-frpA, uno de los cultivos se dejo crecer sin inducir y el otro cultivo se indujo con arabinosa 0.2% durante 3 h. A continuacion se centrifugaron los cultivos y las celulas se resuspendieron en tampon Tris-HCl 20 mM, NaCl 0.5 M, KCl 0.1 M yse lisaron por sonicacion, obteniendose dos fracciones, el sobrenadante y el pellet, este ultimo se resuspendio en tampon Tris-HCl 50 mM, Urea 6 M. Estas fracciones se cargaron en geles de poliacrilamida al 8%. En la figura 2 se puede observar como al adicionar el inductor, aparece una banda alrededor de 75 KDa. Dicha banda fue analizada empleando la tecnica de huella peptfdica y fragmentacion (MS y MS/MS) mediante MALDI-TOF/TOF. Los peptidos obtenidos permitieron comprobar la presencia de rFrpA.

Ejemplo 2. Purificacion de la protefna rFrpA y estudio de su estructura terciaria

Para la preparacion de la vacuna se opto por trabajar con la protefna purificada a partir de las membranas externas de E. coli que expresasen la protefna rFrpA. En el ejemplo anterior hemos visto que rFrpA puede ser sobreexpresada correctamente en E. coli BL21 CodonPlus. En este ejemplo se ilustra la produccion y purificacion de rFrpA a media escala utilizando para ello cromatograffa de afinidad, y se demuestra que rFrpA conserva la estructura tridimensional nativa de la protefna FrpA de PhDP.

De una placa de E. coli BL21 CodonPlus que porta la construccion pelB-10His-FrpA se inicio un cultivo bacteriano de 100 mL de LB suplementado con 200 pg/mL de ampicilina y 50 pg/mL de cloranfenicol que se incubo durante una noche a 28°C en agitacion a 180 rpm. A la manana siguiente se usaron 60 mL de preinoculo para iniciar un cultivo de 6 L del mismo medio. Este cultivo se incubo a 28°C con agitacion durante aproximadamente 90 min, momento en el que se indujo la expresion de rFrpA al anadir al medio de cultivo 0.2% de arabinosa. El cultivo se dejo crecer a 28°C con agitacion durante 38 h. Posteriormente, se obtuvo el pellet celular mediante centrifugacion a 5000 rpm durante 10 min. Siguiendo esta metodologfa se obtuvo un pellet de 24.7 g que se conservo a -80° C hasta su procesamiento.

El pellet obtenido de la induccion con arabinosa se resuspendio en tampon Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, conteniendo lisozima (Alfa Aesar), DNasa RQ1 RNase-Free (PROMEGA) e inhibidor de proteasas (SIGMA ALDRICH). Las celulas bacterianas se lisaron por sonicacion y el lisado se centrifugo a 4500 rpm durante 10 min a 4°C para retirar los restos celulares. El sobrenadante se centrifugo a 33000 g durante 1 h a 4°C, para obtener las membranas totales. Posteriormente, las membranas totales se resuspendieron en agua y se adiciono sarkosyl (lauroil-sarcosinato sodico, SIGMA ALDRICH) al 3%. Estas membranas se solubilizaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitacion. Una vez disueltas las membranas internas se obtuvieron las membranas externas por centrifugacion a 30000 g durante 1 h a 4°C.

Las membranas externas obtenidas por centrifugacion como se menciono previamente, se resuspendieron en elugent 5% (CALBIOCHEM) y se dejaron una noche a 4°C con agitacion. Para retirar las impurezas no solubles se centrifugo a 33.000 g durante 1 h a 4°C. La fraccion soluble de las membranas se combino con tampon de equilibrio (Tris-Hcl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% y imidazol 10 mM). La purificacion de rFrpA se hizo usando columnas de afinidad de nfquel de 1 mL (Thermo Scientific™ HisPur™ Ni-NTA). La separacion en la columna se realizo siguiendo las recomendaciones del fabricante, utilizando como tampon de lavado Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 30 mM, y como tampon de elucion Tris-HCl 10 mM pH 8.0, NaCl 0.05 M, elugent 0.25% e imidazol 500 mM. Las fracciones obtenidas se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones que contenfan la protefna fueron combinadas, concentradas y cambiadas a tampon PBS con elugent 0.25% usando celulas con agitacion Amicon.

Por otra parte, para que rFrpA genere una respuesta inmune efectiva frente a PhDP es indispensable el correcto plegamiento de rFrpA en la membrana externa de E. coli. Para estudiar la estructura tridimensional de rFrpA se realizaron dos pruebas: digestion con tripsina y analisis de dicrofsmo circular. Reaccion con tripsina: 10 pL de disolucion de protefna (2.55 mg/mL) se trataron con 4 pg/mL de tripsina (Sigma Aldrich) durante 15 min a temperatura ambiente. Los resultados de la digestion se visualizaron en un gel de poliacrilamida al 10%, una muestra de rFrpA obtenida de las membranas externas y una fraccion de la muestra anterior sometida a desnaturalizacion con SDS 0.1% a 100°C. A diferencia de la rFrpA desnaturalizada, para la que se observan una gran cantidad de bandas debido a la presencia de sitios de corte expuestos durante la desnaturalizacion, los productos de digestion de la rFrpA nativa presentan menos bandas, debido a la proteccion de gran parte de estos sitios en la protefna intacta. (Figura 4A).

Para terminar de comprobar que rFrpA estaba en su forma nativa se hizo el espectro de dicrofsmo circular. El espectro obtenido para rFrpA coincide con los espectros de protefnas de la familia de receptores de sideroforos que han sido estudiados previamente. El espectro de rFrpA presenta un mfnimo

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en 219 nm que confirma la presencia de laminas p en su estructura secundaria (Figura 4b). [Microbes and Infection 2006, 8: 2145-2153].

Ejemplo 3. Experimento de inmunizacion con rFrpA y produccion de anticuerpos frente a PhDP

En este ejemplo se ilustra el experimento llevado a cabo para comprobar la capacidad inmunogenica de rFrpA en peces cultivados. Para ello se realizo una experiencia de inmunizacion de lenguados a los que se les monitorizo la produccion de anticuerpos frente a PhDP.

El protocolo de inmunizacion utilizado se ilustra en la figura 5. Se utilizaron un total de 250 lenguados de 10 g de peso que fueron distribuidos al azar en 5 grupos de 50 peces. Un grupo de 50 peces actuo como testigo del experimento, los restantes 4 grupos fueron sometidos a diferentes tratamientos al ser inmunizados con 100 pL de: (1) una solucion inmunogenica que contenfa la protefna rFrpA. A cada pez se le suministro 30 pg de rFrpA resuspendida en una solucion de PBS con 0.25% de elugent y adyuvante de Freund en una proporcion 1:1 (2) una bacterina (vacuna tradicional) obtenida al inactivar un cultivo de PhDP con un 0.1% de formol, este cultivo inactivado se ajusto con PBS a una DO600 = 1, (3) adyuvante de Freund. A este grupo de peces se les suministro una solucion de PBS y adyuvante de Freund en una proporcion 1:1 y por ultimo, (4) el grupo control sin vacunar tratado con solucion salina. El metodo elegido para suministrar los tratamientos fueron dos inmunizaciones por inyeccion intraperitoneal que se suministraron los dfas 0 y 30 siguiendo el protocolo expuesto en la Figura 4.

Para cuantificar la respuesta inmune generada en el pez, los dfas 0, 30 y 60 se obtuvieron muestras de suero. Con los sueros se realizo un inmunoenzimoensayo ELISA tipo sandwich, o de captura de antfgeno, utilizando como antfgeno celulas inactivadas de PhDP y como anticuerpo una IgM anti-Gurami capaz de reconocer especfficamente los anticuerpos del lenguado. En la figura 6 se muestran los niveles de anticuerpos frente a PhDP presentes en los sueros de los peces de cada tratamiento. Los resultados se expresan como un porcentaje siendo el 100% el nivel de anticuerpos de los peces inmunizados con bacterina el dfa 60 ya que este fue el valor maximo. En los peces control, tratados con PBS, la presencia de anticuerpos frente a PhDP es testimonial y apenas alcanza el 5%. En el grupo de peces inmunizados con adyuvante de Freund se observa una produccion significativa de anticuerpos. El adyuvante de Freund consiste en una suspension oleosa de Mycobacterium tuberculosis por lo que creemos que se esta produciendo un reconocimiento cruzado entre los anticuerpos frente a Mycobacterium y PhDP. En los peces inmunizados con bacterina se observa una produccion de anticuerpos intensa y rapida, como se muestra en la figura 6 la produccion ya es maxima desde la primera inmunizacion. En el grupo de peces inmunizados con rFrpA vemos que la produccion de anticuerpos es gradual, de apenas el 7%, tras la primera inmunizacion, que sin embargo aumenta al 20% tras la segunda inmunizacion. Aunque los niveles de anticuerpos son estadfsticamente superiores en el grupo de peces inoculados con bacterina, la presencia de anticuerpos frente a PhDP en el suero de los lenguados inmunizados con rFrpA demuestra que rFrpA es una protefna inmunogenica capaz de inducir una respuesta inmune especffica en el lenguado. Tal y como se refleja en la bibliograffa, cuando se realizan inmunizaciones con vacunas recombinantes, es necesario realizar una segunda inmunizacion o dosis de refuerzo, esta necesidad se refleja en el grupo de peces tratados con rFrpA, en el que solo se detecta una produccion significativa de anticuerpos tras la segunda inmunizacion.

Ejemplo 4. Determinacion de la proteccion conferida frente a PhDP por la rFrpA

Para determinar el nivel de proteccion conferida por la vacuna recombinante rFrpA frente a PhDP se realizo una infeccion experimental inoculando a los lenguados una dosis de PhDP capaz de producir un 100% mortalidad en un plazo de 7 a 10 dfas. En este experimento tambien se comparo el nivel de proteccion de la vacuna rFrpA con el conferido por una bacterina clasica utilizada en la industria acufcola.

Tras haber suministrado los diferentes tratamientos por medio de dos inmunizaciones, el dfa 60, se les

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inoculo a los lenguados 100 pL de una suspension de PBS con 10 celulas mL de PhDP. A partir de este momento se registro la mortalidad acumulada en cada grupo de peces (tratamiento). Tras la infeccion se retiraron peces muertos entre los dfas 64 y 71, momento a partir del cual se estabilizaron las curvas de supervivencia. La figura 7 muestra la dinamica de supervivencia registrada entre los dfas 61 y 75. Como se puede ver en la Figura 7, existen diferencias significativas entre los grupos de animales vacunados (grupo 1 y 2) y los grupos control (grupo 3 y 4) (p < 0.001). En los peces inoculados con PBS, o grupo control, se observa una rapida mortalidad que alcanza el dfa 68 al 100% de los peces. En el grupo de peces tratados con adyuvante se observa una reduccion significativa de la mortalidad respecto al grupo control, consiguiendo contener la mortalidad en un 55%. Los grupos donde se observa un mayor nivel de supervivencia, y por tanto de proteccion frente a la pasteurelosis, son los grupos tratados con la vacuna recombinante rFrpA y con la bacterina. El fndice de supervivencia se situo en el 74% y 80% respectivamente. Las diferencias no son significativas por lo que se puede considerar que la proteccion conseguida con la vacuna recombinante es equivalente a la conseguida con la bacterina, pero con las ventajas comentadas anteriormente que aporta el uso de una protefna purificada.

Los resultados obtenidos en el experimento de inmunizacion indican que la inmunizacion de los lenguados de 10 g de peso con 30 pg de protefna recombinante rFrpA es suficiente para conferir un nivel de proteccion satisfactorio, lo que hace que la utilizacion de la protefna de membrana externa FrpA se postule como una opcion prometedora a la hora de combatir la pasteurelosis.

5

Ejemplo 5. Formulacion de la vacuna recombinante rFrpA y protocolo de inmunizacion.

En este ejemplo se realiza una descripcion detallada de la composicion de la solucion inmunogenica a base de la protefna recombinante FrpA (rFrpA). La vacuna recombinante rFrpA consiste en una solucion de 600 pg/ml de rFrpA en tampon fosfato salino (PBS; pH 7.4) con un 0.25 % de elugent que se mezcla 10 en una proporcion 1:1 con adyuvante de Freund. Para la correcta inmunizacion de los peces la vacuna recombinante debe ser suministrada por medio de dos inmunizaciones. La inmunizacion consistira en la inyeccion intraperitoneal de un volumen de 100 pl de la solucion inmunogenica, por tanto cada pez sera inmunizado con 30 pg de rFrpA. En la primera inmunizacion el adyuvante utilizado sera el completo de Freund (SIGMA-ALDRICH), mientras que en la segunda inmunizacion (dosis de refuerzo) se utilizara el 15 adyuvante incompleto de Freund (SIGMA-ALDRICH). Las dos inmunizaciones deben estar espaciadas por un periodo de 30 dfas. Dado que la respuesta protectora en el pez es dependiente de la edad y la especie, podrfa ser conveniente ajustar la cantidad de protefna recombinante inyectada a las circunstancias especfficas de cada vacunacion. La presente invencion no pretende limitar la cantidad de protefna suministrada, y aunque en los ejemplos 3 y 4 se ha acreditado que la inmunizacion de lenguados 20 de 10 g de peso con 30 pg de protefna recombinante es suficiente para generar un grado de proteccion satisfactorio, la composicion inmunogenica podrfa contener hasta 300 pg de protefna recombinante sin provocar efectos nocivos en los animales.

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Claims (25)

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   REIVINDICACIONES

   1. Molecula aislada de acidos nucleicos, caracterizada por una secuencia nucleotfdica SEC ID NO:1

   o con, al menos, un 70% de identidad con SEQ ID NO:1, que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna FrpA de Photobacterium damselae subsp. piscicida caracterizada por SEQ ID NO:2, o un polipeptido con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2 que mantiene las propiedades antigenicas de FrpA o un fragmento inmunogenico que mantiene las propiedades antigenicas de FrpA.
2. 2. Molecula aminoacfdica aislada que comprende la secuencia aminoacfdica de FrpA de

   Photobacterium damselae subsp. piscicida, caracterizada por la SEC ID NO:2, o la protefna recombinante rFrpA, o una secuencia con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO:2 que mantiene las propiedades antigenicas de FrpA o un fragmento inmunogenico que mantiene las propiedades antigenicas de FrpA.
3. 3. Vector recombinante caracterizado porque comprende la secuencia de nucleotidos segun la

   reivindicacion 1.
4. 4. Celula o microorganismo que comprende un vector recombinante segun reivindicacion 3.
5. 5. Organismo transgenico no humano que comprende, insertado en su genoma, una secuencia

   nucleotfdica segun reivindicacion 1 o un vector segun reivindicacion 3.
6. 6. Composicion inmunogenica caracterizada porque comprende un elemento seleccionado de la

   lista que consiste en:

   a. Molecula aislada de acidos nucleicos segun reivindicacion 1

   b. Molecula aminoacfdica aislada segun reivindicacion 2;

   c. Vector recombinante segun reivindicacion 3 ;

   d. Celula o microorganismo hospedador segun reivindicacion 4;

   e. Organismo transgenico no humano segun reivindicacion 5;

   o cualquiera de sus combinaciones y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
7. 7. Composicion inmunogenica segun la reivindicacion 6 donde el vehfculo farmaceuticamente

   aceptable es un adyuvante.
8. 8. Composicion inmunogenica segun la reivindicacion 7 en donde el adyuvante se selecciona de la

   lista que consiste en: aceite mineral, adyuvante de Freund completo (FCA), adyuvante de Freund incompleto (FIA), alginatos, beta-glucanos, CpG, flagelina, fosfito de aluminio y potasio, hidroxido de aluminio, interleuquinas, levamisol, liposomas, microesferas biodegradables, Montanide ISA, Mycobacterium bovis, Mycobacterium butyricum, Mycobacterium chenolae, nanopartfculas PLGa, paredes celulares de micobacteria, polisacaridos bacterianos (LPS), quimiocinas, quitosano, saponinas, sorbitan sesquioleato, vitamina C, vitamina E, o cualquier combinacion de los mismos.
9. 9. Composicion inmunogenica segun reivindicacion 8 en la que el adyuvante es el adyuvante de

   Freund.
10. 10. Composicion inmunogenica segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende un

    nanosistema como sistema de vectorizacion.
11. 11. Composicion inmunogenica segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende un

    microsistema como sistema de vectorizacion
12. 12. Anticuerpo obtenible tras la inmunizacion de un animal con la composicion inmunogenica segun

    reivindicaciones 6 a 11.
13. 13. Anticuerpos segun la reivindicacion 14, donde el animal empleado para la inmunizacion es un

    pez.
14. 14. Uso como medicamento de los anticuerpos segun cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15.
15. 15. Uso de la composicion inmunogenica, segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en la

    elaboracion de un medicamento.
16. 16. Uso segun la reivindicacion 15, donde le medicamento es una vacuna

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17. 17. Uso segun la reivindicacion 16, donde la vacuna es para peces.
18. 18. Uso de la composicion inmunogenica, segun reivindicacion 17, donde los peces se seleccionan

    de la lista que consiste en: Dicentrarchus labrax, Epinephelus akaara, Macropodus opercularis, Morone americanus, Morone saxatilis, Mullus spp., Pagrus pagrus, Pictiblennius yatabei, Rachycentron canadum, Seriola quinqueradiata, Solea senegalensi, Solea solea, Sparus aurata.
19. 19. Uso de la composicion inmunogenica, segun reivindicacion 18, donde los peces son Solea

    senegalensis y Solea solea.
20. 
    20. Procedimiento para la produccion de una molecula aminoacfdica, segun reivindicacion 2,

    caracterizado porque comprende el cultivo de una celula o microorganismo hospedador, segun reivindicacion 4, y la recuperacion de la molecula aminoacfdica del extracto celular o del sobrenadante.
21. 
    21. Procedimiento para la produccion de una molecula aminoacfdica, segun reivindicacion 2,

    caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo transgenico no humano, segun reivindicacion 5, y la recuperacion de la molecula aminoacfdica.
22. 
    22. Procedimiento para la produccion de una molecula nucleotfdica, segun reivindicacion 1,

    caracterizado porque comprende el cultivo de una celula o microorganismo hospedador, segun reivindicacion 4, y la recuperacion de la molecula nucleotfdica a partir del extracto celular o del sobrenadante.
23. 
    23. Procedimiento para la produccion de una molecula nucleotfdica, segun reivindicacion 1,

    caracterizado porque comprende el cultivo de un organismo transgenico no humano, segun reivindicacion 5, y la recuperacion de la molecula nucleotfdica.
24. 24. Procedimiento para la elaboracion de una composicion inmunogenica segun reivindicaciones 6 a

    11, que comprende un procedimiento segun reivindicaciones 20 o 23, y la adicion de un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
25. 25. Un kit para uso en la induccion de una respuesta inmune en peces, que comprende una

    composicion inmunogenica o vacunal segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 y opcionalmente instrucciones relacionadas con la administracion.