ES2540064T3 - Inhibidor de afecciones inflamatorias - Google Patents

Abstract

Un extracto en etanol de oleorresina de Boswellia frereana que comprende un inhibidor de la metaloproteinasa 9 de la matriz (MMP9) para su uso en el tratamiento o la prevención de la osteoartritis, artritis reumatoide, degradación o artritis del cartílago articular, todas las formas de distrofia muscular especialmente distrofia muscular de Duchenne, asma, diabetes, leucemia mielógena y otras, psoriasis, Enfermedad de Alzheimer, trastornos neurológicos desmielinizantes incluyendo esclerosis múltiple y trastornos de la retina.

Description

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después de la siembra. La concentración de etanol se ajustó en todos los pocillos para que contuvieran 0,77%. Después de 24, 48 y 72 horas más, un análisis MTS. La absorbancia se leyó utilizando FLUOstar OPTIMA.

La Tabla 1 muestra los Cebadores utilizados en los análisis de PCR cuantitativa utilizando la detección SYBR Green®. Se diseñaron cebadores para secuencias de GenBank utilizando el soporte lógico de diseño de cebadores Primer 3 (http://www.frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi);

Tabla 2. Contenido de resina de oleorresina de B. frereana después de la extracción con hexano (disolvente no polar) y etanol (disolvente polar);

La Tabla 3 muestra una comparación del contenido de goma de Boswellia frereana con una especie relacionada;

La Tabla 4 muestra un resumen de los componentes de la oleorresina de B. frereana;

La Tabla 5 muestra el contenido de aceite esencial de la oleorresina de B. frereana extraída por medio de hidrodestilación; y

La Tabla 6 muestra los componentes químicos identificados en diferentes extractos de oleorresina de B. frereana (aceite esencial, hexano y etanol); y

La Tabla 7 muestra los valores de DL50 de células MCF-7 a las 24, 48 y 72 h de incubación.

Materiales y métodos

Todos los reactivos se adquirieron de Sigma (Poole, Reino Unido) a menos que se especifique de otro modo. El medio de cultivo consistió en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (medio DMEM glutamax I™/HAMS F12 (1:1), Invitrogen, Reino Unido) con un suplemento de 100 Unidades/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 50 µg/ml de L-ascorbato-2-fosfato y 1X Insulina-Transferrina-Selenito de sodio (ITS).

Las oleorresinas de incienso somalí, Boswellia frereana (nombre Somalí Maidi) y Boswellia carteri (nombre Somali Beyo) se obtuvieron de Hargeysa en Somalilandia (norte de Somalia). El incienso etíope (Boswellia papyrifera) fue amablemente suministrado por Mr Abdi Farah (Somaliland Frankincense Company, Cardiff). Los disolventes etanol absoluto y hexano (calidad analar) se adquirieron de Fischer Scientific (Loughborough).

Extracción de Boswellia frereana (Para bio-análisis)

Se recogió resina gomosa de Boswellia frereana y los componentes activos se prepararon extrayendo la resina gomosa (20 g) sucesivamente con etanol (100%) durante 7 días en un recipiente impermeable a la luz. La resina gomosa insoluble se retiró por filtración y el disolvente se evaporó a 60°C. Más específicamente, se pesó con exactitud una cantidad conocida de oleorresina de B. frereana (20 g), se colocó en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml y se añadieron 100 ml de etanol. La mezcla se agitó con una espátula, se cubrió con papel aluminio y lámina de cierre Para-film y después se dejó reposar durante siete días. El extracto en etanol se filtró utilizando un filtro Express™ Millipore de 150 ml. El disolvente se evaporó en una corriente suave de nitrógeno a una temperatura de 60°C. El extracto de B. frereana resultante se disolvió en etanol a una concentración de 10 mg/ml para proporcionar la disolución de trabajo de partida y se almacenó a -20°C.

Los constituyentes químicos de los extractos de B. frereana se analizaron mediante cromatografía de gasesespectrometría de masas (GC-MS) utilizando un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 6890N equipado con un detector selectivo de masa Agilent 5973 Network y un aparato de toma de muestras automático de la serie Agilent 7683. (Véase la Figura 6). Se utilizó un intervalo de barrido de 35 a 450 unidades de masa para adquirir los datos del espectro de masas con un tiempo de muestreo de 2 que corresponde a 3,5 barridos por segundo. La adquisición de datos se realizó utilizando el soporte lógico informático MSD Chemstation™. La identificación de los picos individuales se llevó a cabo comparando los espectros de masas de las muestras con los almacenados en la base de datos de la biblioteca del National Institute of Standards and Technology (NIST) que contiene más de

54.000 espectros y mediante comparación de los espectros de masas de las muestras con los valores publicados en la bibliografía.

El National Institute of Standards and Technology es un laboratorio de investigación de ciencias físicas y una agencia del U.S. Department of Commerce. (sitio de la red -www.nist.gov). Se encuentra disponible en el mercado una biblioteca de espec. de masas alternativa en Wiley (sitio de la red www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm#wiley8).

Caracterización Química: Comparación del Contenido de Resina y goma de oleorresinas de B. frereana, B. carteri y B. Papyrifera

Se trituraron por separado gránulos de oleorresina de Boswellia de B. carteri, B. frereana y B. papyrifera, hasta un polvo con un mortero y una mano de mortero. Se colocaron 40 g del polvo de cada oleorresina en vasos de precipitados de vidrio de 500 ml separados y se añadieron 100 ml de etanol absoluto a cada vaso de precipitados. Las mezclas se agitaron con una espátula, se cubrieron con papel aluminio y lámina de cierre Para-film y después

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Todos los análisis MTS se realizaron en placas de 96 pocillos (Costar). Las células se sembraron a 1,2 x 103 -1,5 x 105 células/cm2 con 0,1 -0,2 ml de medio de crecimiento apropiado. Los pocillos de control en todos los casos contenían el mismo volumen de medio, el mismo volumen de reactivo de ensayo y el mismo volumen de disolución MTS pero no contenían células. A continuación las placas se incubaron. Se añadieron suspensión celular y disolución MTS a los pocillos utilizando una pipeta repetitiva (HandyStep) o una pipeta multicanal y artesa (Transferpette). La suspensión celular de la artesa se agitó regularmente con una espátula estéril para evitar que las células se asienten en la superficie. A las 24 -48 horas de la siembra, se añadieron 50 µl del reactivo de ensayo según fuera apropiado. A las 24 -168 horas de la siembra se añadió la disolución MTS a 20 µl de disolución MTS por 100 µl de medio a los pocillos con y sin células. Las placas se devolvieron a continuación a la incubadora durante dos horas. A continuación las placas se retiraron de la incubadora y se sacudieron utilizando un agitador de placa orbital (MS1 Minishaker IKA) durante diez segundos para garantizar que el producto de reacción estaba homogéneamente distribuido en el pocillo. Después se leyó la absorbancia a 492 nm utilizando un lector de placa Anthos Reader 2001 (Labtech) o un lector de placa FLUOstar OPTIMA (Labtech). En el caso de las curvas de crecimiento, el medio se cambió a las 72 horas y cada 24 horas después de eso de modo que el agotamiento del medio no actúe como variable de confusión. Para eliminar el medio de los pocillos se colocó un hisopo estéril sobre la parte superior de la placa que a continuación se invirtió. El medio fue absorbido por el hisopo estéril y cualquier medio restante se eliminó dando golpecitos con otro hisopo estéril. Luego se pipeteó medio de nueva aportación (0,2 ml) a todos los pocillos de ensayo y de control.

Preparación de extracto en etanol de B. frereana (Boswellia frereana)

Se disolvió un extracto en etanol de B. frereana (3,01778 g) en 10 ml de etanol absoluto (Fisher Scientific) para proporcionar una disolución de partida de 266,7 mg/ml. Esto se filtró a continuación utilizando una membrana PTFE Sartorius (Fisher Scientific Reino Unido) para garantizar la esterilidad. La disolución de partida se diluyó en medio para proporcionar 3 veces la concentración final necesaria y se añadieron 50 µl de este producto concentrado a los pocillos que contenían 0,1 ml de medio para proporcionar una concentración final de 88 -2000 µg/ml en el pocillo. Las muestras se sometieron después a vórtice para dispersar el extracto en el medio. La concentración de etanol se ajustó para que fuera constante en todos los pocillos. La concentración se ajustó para que contuviera la misma concentración que el pocillo que contenía la concentración más alta de extracto de B. frereana. Esta osciló de 0,17 a 0,77%.

Se puede producir absorbancia de fondo no específica en el medio de cultivo incubado con disolución MTS. Esta se corrigió para utilizar pocillos de control que fueran idénticos a los pocillos de ensayo pero sin contener células. La absorbancia promedio de estos pocillos de control se restó de todos los demás valores de absorbancia de los pocillos de ensayo para proporcionar la absorbancia corregida. Estos valores de absorbancia corregida se utilizaron para trazar la absorbancia de formazán en los gráficos. Las barras de error expresan el error típico de la diferencia (et(d)) entre los pocillos de control y los pocillos de ensayo y se calcularon utilizando la siguiente ecuación:

et(d) = rc (ete2 + etc2)

et(d) = error típico de la diferencia;

rc = raíz cuadrada;

ete = error típico de los pocillos de ensayo;

etc = error típico de los pocillos de control.

Cálculo de los valores de DL50

Los valores de DL50 se calcularon como la concentración del extracto de B. frereana a la cual había una reducción de 50% en la absorbancia de formazán. Los gráficos se trazaron utilizando la absorbancia media de formazán y se presentaron como el porcentaje de la absorbancia a 0 µg/ml. La DL50 se tomó a 50% de absorbancia de formazán en cada momento de muestreo (24, 48 y 72 horas después de la incubación con extracto de B. frereana) en las curvas. Esto se realizó para cada experimento y la media en cada momento de incubación se registró en los resultados.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó en Minitab 15.

Se realizaron ANOVA de dos vías y ANOVA de tres vías por medio del modelo lineal general. Se utilizó la comparación pareada simultánea de Tukey para comparar las medias. Si las varianzas no eran homogéneas (como se verifica utilizando el ensayo de Bartlett), se utilizaba una regresión ponderada. Los pesos utilizados fueron los recíprocos de la varianza (59).

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Resultados

Sorprendentemente se encontró que la oleorresina de B. frereana era casi completamente soluble tanto en hexano como en etanol dando como resultado rendimientos de extracción muy elevados para la resina (99%), como se indica en la tabla 2.

Las Tablas 2 y 3 indican que las oleorresinas de B. frereana contienen muy poca goma insoluble en etanol (polisacárido). Esto contrasta con otras especies de Boswellia tales como B. carterii y B. papyrifera, en las que la fracción de goma insoluble en etanol comprendía 48% y 51% respectivamente como se muestra en la tabla 2. También se ha informado de que las oleorresinas de Boswellia de India (B. serrata) contienen una cantidad sustancial de fracción de goma insoluble en alcohol, en la región de 24% (55).

A diferencia de las oleorresinas de B. carteri, B. serrata y B. papyrifera se encontró que esta especie concreta de Boswellia (B. frereana) no era susceptible de destilación con vapor de agua debido a su bajo contenido de goma. Al contacto con el vapor de agua la resina se ablandó y pasó completamente a través de la malla perforada y al agua caliente.

El método de aislamiento del aceite esencial fue por lo tanto en la realidad uno de hidro-destilación en lugar de destilación con vapor de agua.

El contenido de aceite esencial de B. frereana, utilizando hidro-destilación fue bastante bajo (0,87%) como se indica en la tabla 5.

Los disolventes no polares tales como hexano se utilizan comúnmente, en fitoquímica, para extraer el componente de aceite volátil de las oleorresinas mientras el etanol se utiliza comúnmente para extraer la fracción de resina más polar de las oleorresinas. Los autores de la presente invención han utilizado previamente hexano para aislar el componente de aceite volátil de oleorresinas aromáticas relacionadas tales como incienso (B. carterii, B. papyrifera), Opopanax (Commiphora guidotti) y mirra (Commiphora molmol) a la vez que deja la resina y el contenido de goma de las oleorresinas intactos. Inesperadamente, en este caso, el hexano no es adecuado para la extracción del componente de aceite volátil de B. frereana ya que el disolvente también extraía el componente de resina. Véase la Figura 7.

B. frereana no afecta a la viabilidad de condrocitos de cartílago.

El tratamiento de explantes de cartílago con 5 ng/ml de IL-1α y 10 ng/ml de OSM o 100 µg/ml de B. frereana, por separado o combinados no afectó significativamente a la viabilidad celular a lo largo del período de cultivo de 28 días (datos no mostrados).

B. frereana no afecta a los niveles de sGAG en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

El tratamiento de explantes con 5 ng/ml de IL-1α y 10 ng/ml de OSM, por separado o combinado con 100 µg/ml de

B. frereana no tuvo efecto sobre los niveles de sGAG en el tejido (Figura 1A). En contraste hubo un incremento significativo en la cantidad de los sGAG detectados en el medio de explantes tratados con IL-1α/OSM con respecto a los que se dejaron sin tratar o se trataron con B. frereana solo (p < 0,01; la transformación log requirió análisis de los datos de los días 3 y 7). B. frereana no rescató la pérdida de sGAG inducida por citoquina de explantes de cartílago a lo largo del período de cultivo (Figura 1B).

B. frereana reduce la liberación de colágeno en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

No hubo diferencias apreciables en la cantidad de colágeno medida en los explantes a través de los tratamientos (Figura 2A). Se liberó significativamente más colágeno al medio desde los explantes de cartílago tratados con IL-1α/OSM después de 28 días en cultivo en comparación con los explantes no tratados o tratados con B. frereana (p = 0,001; transformación log). No obstante, hubo un reducción significativa en el colágeno liberado desde explantes de cartílago tratados con IL-1α/OSM combinado con B. frereana (p = 0,012; transformación log) volviendo los niveles a cantidades basales (Figura 2B).

B. frereana inhibe la expresión y activación de MMP 9 inducidas por citoquina, debido a la reducción de la transcripción de MMP 9, en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

En explantes no tratados, hubo una expresión mínima de pro-MMP 9 después de 7 días, pero se observaron pro-MMP 2 y MMP 2 activa en explantes de cartílago tanto no tratados como tratados con B. frereana (Figura 3A). El cartílago estimulado con IL-1α/OSM sintetizó niveles significativamente más altos de pro-MMP 9 después de 7 días (p < 0,0001; transformación log). La MMP 9 activa no se observó en este momento puntual. Los niveles de pro-MMP 2 y MMP 2 activa no se alteraron apreciablemente después de la estimulación con IL-1α/OSM. Curiosamente, B. frereana inhibió la síntesis de pro-MMP 9 inducida por citoquina (p < 0,0001; transformación log), pero no tuvo efecto sobre la expresión o activación de pro-MMP 2. Después de 28 días en cultivo, ya no se observó pro-MMP 9 en los explantes de cartílago no tratados, pero estuvieron presentes tanto pro-MMP 2 como MMP 2 activa (Figura 3B). Estas observaciones también fueron evidentes en cartílago tratado con B. frereana. En líneas generales, B.

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frereana abolió la expresión y la activación de MMP 9 inducida por citoquina. Hubo una reducción drástica en la cantidad de pro-MMP 9 expresada por los explantes tratados con IL-1α/OSM combinado con B. frereana que fue altamente significativa desde el día 7 en adelante. Como consecuencia de la reducción de la síntesis de MMP 9, se abolieron los niveles de MMP 9 activa volviendo a llevar los niveles de expresión a los de los explantes no tratados. También pareció reducir la expresión de pro-MMP 2 mediada por IL-1α/OSM pero esta no alcanzó significación (p = 0,06; transformación log). No obstante, B. frereana contrarrestó significativamente la activación de pro-MMP 2 por IL-1α/OSM (p = 0,04; transformación log categorizada). Solamente se han incluido los medios retirados de los explantes después de 7 y 28 días en el manuscrito para mantener la brevedad pero son representativos de las tendencias observadas a lo largo de todos los momentos puntuales. Como la expresión de la proteína MMP 9 era sensible al tratamiento, se cuantificaron los niveles de ARNm de MMP 9 en tejido que había sido tratado durante 3 días (Figura 3C). El ARNm de MMP 9 estuvo por debajo del límite de detección en explantes de cartílago tanto no tratados como tratados con B. frereana. No obstante, B. frereana redujo la transcripción de MMP 9 inducida por IL-1α/OSM casi 50%, aunque esta no alcanzara bastante significación (p = 0,079; prueba de la t de 2 muestras).

B. frereana reduce la producción de nitrito inducida por citoquina y suprime la expresión de ARNm de iNOS en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

La cantidad de nitrito producida por los explantes no tratados, y los explantes tratados con B. frereana fue baja (< 5 µM/mg de peso seco de tejido) y no cambió apreciablemente a lo largo del período de cultivo de 28 días (Figura 4A). Como se esperaba, el tratamiento con citoquina aumentó significativamente la producción de nitrito después de 3 (p < 0,0033), 7 (p = 0,0009), 14 (p < 0,0029), 21 (p < 0,0001) y 28 días (p < 0,0001) con respecto a los explantes no tratados (transformación log de los datos), pero B. frereana, inhibió significativamente la producción de nitrito inducida por IL-1α/OSM después de 14 (p = 0,003), 21 (p = 0,0007) y 28 días (p = 0,001) (transformación log de los datos). Los niveles de expresión de ARNm de iNOS se cuantificaron para determinar si la reducción de nitrito en los últimos momentos puntuales podía ser atribuida a la inhibición transcripcional temprana en el período de cultivo (Figura 4B). Hubo cantidades variables pero mínimas de ARNm de iNOS en los explantes de cartílago no tratados después de 3 días en cultivo. No se detectó ARNm de iNOS en el cartílago tratado con B. frereana. Como se esperaba, hubo un incremento aproximado de 50 veces en los niveles de ARNm de iNOS en los explantes estimulados con IL-1α/OSM con respecto a los controles no tratados (p < 0,0001; transformación log), que se redujo aproximadamente 75% en presencia de B. frereana (p = 0,02; transformación log), en concordancia con los niveles de nitrito observados en los medios de cultivo.

B. frereana reduce la producción de PGE2 inducida por citoquina y suprime la expresión de ARNm tanto de PGE2 sintasa como de COX-2 en un modelo in vitro de degradación de cartílago.

La cantidad de PGE2 producida por los explantes no tratados y los explantes tratados con B. frereana no cambió apreciablemente a lo largo del período de cultivo de 28 días (< 25 pg/mg de peso seco de tejido) (Figura 5A). Como se esperaba, el tratamiento con citoquina aumentó significativamente la producción de PGE2 después de 3 (p = 0,012; transformación log), 7 (p = 0,0002), 14 (p = 0,006; transformación log), 21 (p < 0,0001; transformación log) y 28 días (p < 0,0001; transformación log) con respecto a los explantes no tratados, oscilando de 100 -1000 pg/mg peso seco de tejido. En presencia de B. frereana, hubo una inhibición significativa de la producción de PGE2 inducida por IL-1α/OSM en explantes después de 7 (p = 0,03), 21 (p = 0,005; transformación log) y 28 días de tratamiento (p = 0,0005; transformación log). sin embargo no volvió a los niveles basales. Los niveles de expresión de ARNm de PGE2 sintasa también se cuantificaron para determinar si la reducción de PGE2 observada a lo largo del período de cultivo se podría atribuir a la inhibición de la transcripción de PGE2 sintasa (Figura 5B). El ARNm de PGE2 sintasa no fue detectable ni en el cartílago no tratado ni en el tejido tratado con B. frereana después de 3 días de cultivo. IL-1α/OSM estimuló la expresión del ARNm de PGE2 en el cartílago, y esta se redujo casi 60% cuando los explantes estimulados con citoquina se trataron simultáneamente con B. frereana (p = 0,007; prueba de la t de 2 muestras). En conjunto, también se cuantificaron los niveles de ARNm de COX-2 -la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de PGE2. Se observaron cantidades mínimas de ARNm de COX-2 en cartílago no tratado, y los niveles fueron indetectables en cartílago tratado con B. frereana (Figura 5B). Hubo un incremento significativo de 12 veces en los niveles de ARNm de COX-2 en explantes estimulados con IL-1α/OSM con respecto a cartílago no tratado (p < 0,0001), que se redujo aproximadamente 75% cuando se trató simultáneamente con B. frereana (p = 0,0001).

El Epi-lupeol es el principal constituyente de B. frereana.

Aproximadamente 81% de los componentes presentes en el extracto en etanol de B. frereana se identificaron utilizando GC-MS como se ha indicado (Figura 6). El principal componente identificado, y que representa 59,3% del extracto de B. frereana fue epi-lupeol (Figura 6B). Otros componentes minoritarios identificados en el extracto etanólico de B. frereana fueron β-amirina (6,35%), acetato de Lupeol (3,10%), α-amirina (2,38%), dímero 3 de αfelandreno (1,10%), dímero 5 de α-felandreno (0,24%), α-tuyeno (0,34%) y α-felandreno (0,24%).

B. frereana inhibe la Acetilcolinesterasa

Se encontró que los extractos de B. frereana, después de ser pulverizados con la enzima, el sustrato y el reactivo de detección producían manchas de color blanco brillante sobre las placas de TLC sobre un fondo de color amarillo.

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Estos fueron capaces de inhibir la actividad de la acetilcolinesterasa a todas las concentraciones sometidas a ensayo (101,6 -3,17 mg/ml). El patrón de referencia hidrobromuro de galantemina (1 mM), un conocido inhibidor de AChE, también proporcionó una mancha de color blanco brillante sobre la referencia de la placa de TLC. No se observaron manchas de color blanco, correspondientes a falsos positivos, para la placa de TLC de control.

B. frereana elimina células cancerígenas

Uso ilustrativo: Concentraciones del extracto de B. frereana a 800 µg/ml o mayores dieron como resultado una disminución de la absorbancia de formazán, indicando una reducción en la actividad mitocondrial y una reducción en el número de células. Este incremento en el número de células se podía haber producido si los componentes activos del extracto de Boswellia causaran la detención del ciclo celular (citostasis). Una detención del ciclo celular prolongada en una fase distinta de GO es intolerable para la célula y dará como resultado por último daño celular indirecto y muerte celular. Los componentes citotóxicos del extracto de B. frereana pueden, por lo tanto, comportarse como inductor apoptótico y potenciador de la muerte celular para las células cancerosas humanas MCF-7.

Discusión

En el presente estudio, los autores de la presente invención utilizaron un modelo in vitro de degeneración de cartílago (29, 30) para determinar si la especie de Boswellia poco conocida -B. frereana tenía eficacia antiinflamatoria, y por lo tanto se podía explotar como terapia alternativa para el tratamiento de una variedad de trastornos inflamatorios. Se trataron explantes de cartílago con 5 ng/ml de IL-1α y 10 ng/ml de OSM a lo largo de un período de 28 días, en presencia o ausencia de 100 µg/ml de B. frereana. No hubo evidencia de citotoxicidad inducida por IL-1/OSM o B. frereana a lo largo del período de cultivo de 28 días. En este modelo in vitro, ni las citoquinas ni B. frereana tuvieron un efecto discernible sobre la cantidad de sGAG o colágeno retenida en los explantes. No obstante, hubo un incremento significativo en la cantidad de sGAG y colágeno liberada de los explantes después de la estimulación con IL-1α/OSM durante 3 y 21-28 días, respectivamente, que concuerda con los informes anteriores (41, 42). En presencia de IL-1α/OSM aproximadamente 50% del contenido de sGAG se liberó al medio a lo largo del período de 28 días, por lo tanto es ligeramente sorprendente que la cantidad de sGAG en el tejido no refleje esto. Los autores de la presente invención deducen que en presencia de citoquinas, el tejido está sintetizando continuamente nuevo sGAG para remplazar el que se ha perdido (43). La detección de sGAG y colágeno en el medio representa principalmente la degradación y liberación de componentes de la MEC desde el tejido. Curiosamente, B. frereana solo fue capaz de rescatar la degradación de colágeno mediada por IL-1/OSM. A lo largo del período de 28 días, B. frereana no tuvo efecto sobre la cantidad de sGAG liberado al medio después de la estimulación con citoquina; esto sugeriría que debe existir un mecanismo diferente de acción entre el colágeno y sGAG para explicar la inhibición diferencial observada.

Los mediadores clave de la degradación del colágeno incluyen las MMP 9 y 13 (44). Se han observado mayores niveles de MMP 9 activa en cartílago articular patológico (1, 3-6). Para averiguar si el incremento observado en la liberación de colágeno por IL-1α/OSM y la posterior modulación por B. frereana, representaban un fenotipo catabólico, se analizó el estado de expresión y activación de la pro-MMP 9. A lo largo de 28 días, se incrementaron sustancialmente tanto la síntesis de pro-MMP 9 como su activación en explantes estimulados por citoquina, lo que puede haber contribuido a la liberación significativa de colágeno los días 21-28, como se ha informado previamente (44). B. frereana inhibió la síntesis mediada por IL-1α/OSM y la activación de pro-MMP 9 haciendo volver la expresión a los niveles basales. [IL-1α/OSM no tuvo un efecto significativo sobre la expresión de pro-MMP 2, aunque los niveles de MMP 2 activa parecían aumentar. Después de 28 días, B. frereana también inhibió la activación de pro-MMP 2]. Los datos de los autores de la presente invención sugieren que la reducción de la expresión de pro-MMP 9 inducida por IL-1α/OSM en explantes tratados con B. frereana puede surgir de la inhibición transcripcional de MMP 9 que habían observado.

La síntesis de MMP 9 está modulada por una variedad de moléculas pro-inflamatorias incluyendo NO y COX-2 (45), y está bien establecido que tanto NO como COX-2 están implicados en la degradación del cartílago (43, 46). El nitrito, el producto final estable de NO, estaba significativamente elevado en explantes de cartílago estimulados con IL-1α/OSM a lo largo de todo el período de cultivo, mientras en presencia de B. frereana, la producción de NO inducida por citoquina estaba significativamente inhibida. Los autores de la presente invención suponen que el amplio incremento en la síntesis y activación de pro-MMP 9 se puede atribuir, en parte, a los niveles de NO, y que la acción de B. frereana en la inhibición de la producción de NO evita la síntesis y/o activación de MMP 9 aguas abajo. La inflamación de las articulaciones en la OA también aumenta los niveles circulantes de COX-2 -la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de PGE2, lo que ocasiona un aumento de la síntesis de PGE2. Un estudio previo indicó una conexión entre NO y la expresión de COX-2 es un modelo canino de OA experimental (45). La combinación de IL-1α con OSM elevó significativamente la síntesis de PGE2 hasta aproximadamente 80 veces la observada en los explantes de cartílago no tratados, de acuerdo con los estudios anteriores (37, 47). Utilizando la combinación de IL-1α/OSM, B. frereana redujo los niveles de PGE2 aunque estos no volvieron a los niveles basales.

Para comprender mejor el mecanismo de acción de B. frereana en este modelo inflamatorio in vitro de degradación de cartílago, los autores de la presente invención cuantificaron la cantidad de transcritos génicos para iNOS, PGE2 sintasa y COX-2 utilizando qPCR. Se observó que todos aumentaban significativamente en los explantes tratados con IL-1α/OSM, y en presencia combinada con B. frereana, los niveles de transcripción génica se redujeron

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Referencias

1.

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Tabla 1.

Gen de interés

Secuencia de cebador Tamaño del producto (pb)

iNOS

F 5'-TGTTCAGCTGTGCCTTCAAC-3' 232

imagen13

R 5'-AAAGCGCAGAACTGAGGGTA-3'

PGE2 sintasa

F 5'-GGACGCTCAGAGACATGGAG-3' 206

imagen14

R 5'-TATGCCACGGTGTGTACCATA-3'

MMP9

F 5'-TAGCACGCACGACATCTTTC-3' 121

R 5'-GAAGGTCACGTAGCCCACAT-3'

Tabla 2. Contenido de resina de oleorresina de B. frereana después de la extracción con hexano (disolvente no polar) y etanol (disolvente polar).

Disolvente de Extracción

Peso de oleorresina original (g) Peso de resina extraída (g) % Resina1 (fracción soluble en etanol) % Residuo de Goma2

Hexano

20,0 19,8 98,8 1,3

Etanol

20,0 19,9 99,3 0,7

1La resina también contiene una pequeña cantidad de aceite esencial -véase la tabla 4 para el contenido de aceite esencial de B. frereana, 2Calculado restando % contenido de resina de 100.

imagen15

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Tabla 5. Contenido de aceite esencial de la oleorresina de B. frereana extraída por medio de hidro-destilación.

Disolvente Extracción

de Peso de oleorresina original (g) Peso de aceite esencial extraído (g) % esencial Aceite

Vapor de agua

imagen16 50,4 0,4 0,9

Tabla 6. Componentes químicos identificados en diferentes extractos de oleorresina de B. frereana (aceite esencial, hexano y etanol);

Componentes químicos

Fracción aislada (Método de extracción)

Aceite esencial (Destilación vapor de agua)

Resina (Hexano) Resina (Etanol)

% Área del pico

% Área del pico

% Área del pico

α-Tuyeno

imagen17 9,85 0,76 0,34

α-Pineno

imagen18 0.011 N.D

Sabineno

2,62 N.D N.D

β-Pineno

imagen19 N.D N.D

α-Felandreno

imagen20 Vestigial 0.118 0.074

m-Cimeno

imagen21 1,62 N.D Vestigial

p-Cimeno

imagen22 5,49 0.21 0.136

Tuyol

imagen23 5,22 0.18 0.135

Eucaliptol

imagen24 0,91 0.065 0.058

Tuyol

imagen25 2,87 0.047 0.042

trans-2-Caren-4-ol

imagen26 1,92 N.D N.D

Desconocido

imagen27 3,89 N.D N.D

trans-Pinocarveol

imagen28 2,51 N.D N.D

(S)-cis-Verbenol

imagen29 0,62 N.D N.D

Tuyen-2-eno/Tuyona

imagen30 3,19 0,056 0,050

Sabinol

imagen31 3,62 0.047 Vestigial

Terpinen-4-ol

imagen32 6,59 N.D N.D

p-Cimen-8-ol

imagen33 2,67 N.D N.D

α-Terpineol

imagen34 1,55 N.D N.D

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Componentes químicos

Fracción aislada (Método de extracción)

Aceite esencial (Destilación vapor de agua)

Resina (Hexano) Resina (Etanol)

% Área del pico

% Área del pico

% Área del pico

Verbenona

imagen35 0,94 N.D N.D

Cuminaldehído

imagen36 0,87 N.D N.D

Desconocido

imagen37 3,07 N.D N.D

Acetato de bornilo

imagen38 0,54 N.D N.D

Cuminol

imagen39 1,52 N.D N.D

Carvacrol

imagen40 1,53 N.D N.D

β-Burboneno

imagen41 2,89 0,100 0,095

t-Cadinol

imagen42 0,37 N.D Vestigial

Dímero 1 de α-felandreno

imagen43 0,14 N.D Vestigial

Dímero 2 de α-felandreno

imagen44 0,56 0,044 Vestigial

Dímero 3 de α-felandreno

imagen45 11,45 1,34 1,103

Dímero 4 de α-felandreno

imagen46 0,42 0,057 0,042

Dímero 5 de α-felandreno

imagen47 2,35 0,299 0,243

Lupeol

imagen48 N.D 0,094 0,087

β-Amirina

imagen49 N.D 6,502 6,357

α-Amirina

imagen50 N.D 2,39 2,384

epi-Lupeol

imagen51 N.D 60,32 59,32

Desconocido

imagen52 N.D 7,28 7,266

Acetato de lupeol

imagen53 N.D 2,96 3,105

% Compuestos identificados

imagen54 81,79 82,88 80,85

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Comparación del perfil cromatográfico de GC-MS del aceite esencial y extracto en hexano de B. frereana Tabla 7 Valores de DL50 de células MCF-7 a las 24, 48 y 72 h de incubación.

MCF-7

Dosis DL50 (µg/ml)

24 horas

1630

48 horas

1450

72 horas

1310

Claims (1)

1. imagen1