ES2538362T3 - Clasificación, estadificación y pronóstico del cáncer mediante el uso de osteopontina-C - Google Patents

Clasificación, estadificación y pronóstico del cáncer mediante el uso de osteopontina-C Download PDF

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Abstract

Método para clasificar el cáncer de mama en un paciente, que consiste en: determinar el nivel de expresión de osteopontina-c (OPN-c) en una muestra de cáncer de mama y comparar dicho nivel de expresión con un control o valor de referencia, de manera que la presencia de mayores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un mayor grado de cáncer de mama y la presencia de menores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un menor grado de cáncer de mama.

Description

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Las secuencias del HER2 están disponibles públicamente. Así, por ejemplo, los números de acceso al banco de genes NM_001005862.1 y NM_004448.2 (ácido nucleico) y NP_001005862.1 y NP_004439.2 (proteína) revelan secuencias de HER2 humanas. En un ejemplo, una secuencia de HER2 incluye una secuencia completa de tipo natural (o nativa) y variantes (p.ej. polimorfismos) encontradas en células de cáncer de mama. En algunos ejemplos el HER2 tiene una secuencia al menos 80% idéntica, por ejemplo al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a un HER2 nativo (tal como la secuencia de los números de acceso NM_001005862.1, NM_004448.2, NP_001005862.1 y NP_004439.2 al banco de genes) y retiene la actividad del HER2 nativo. En otros ejemplos una secuencia de ácido nucleico de HER2 tiene una secuencia que se hibrida en condiciones muy rigurosas con una secuencia publicada en el número de acceso NM_001005862.1 o NM_004448.2 del banco de genes y retiene la actividad del HER2.
Marcador: un agente capaz de detectar, por ejemplo por espectrofotometría, citometría de flujo o microscopia. Por ejemplo, uno o más marcadores pueden estar unidos a un anticuerpo, permitiendo la detección de la proteína diana. En otro ejemplo uno o más marcadores pueden ir unidos a una sonda de ácido nucleico, permitiendo la detección de la molécula de ácido nucleico diana. Como ejemplos de marcadores cabe citar los isótopos radiactivos, fluoróforos, ligandos, agentes quimioluminiscentes, enzimas y combinaciones de los mismos.
Células o tejido normales: células y tejido no tumoral, no malignos.
Moléculas de ácido nucleico: un desoxirribonucleótido o ribonucleótido polímero, incluyendo sin limitación ADNc, ARNm, ADN genómico y ADN sintético (por ejemplo sintetizado químicamente). La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra doble o sencilla. Si es de hebra sencilla, la molécula de ácido nucleico puede ser de cadena homosentido o antisentido. Además la molécula de ácido nucleico puede ser circular o lineal. La revelación incluye métodos que detectan moléculas de ácido nucleico de OPN-c, ER, PR y HER2.
Osteopontina-c (OPN-c): la osteopontina es una glicoproteína fosforilada multifuncional que está expresada a niveles elevados en los tumores, incluyendo los de mama. Se han identificado varias variantes de empalme de OPN, incluyendo OPN-a (secuencia nativa), OPN-b (secuencia truncada) y OPN-c (secuencia truncada). La OPN-c carece del exón 4 (27 aminoácidos) en la región NH2-terminal de la secuencia madura. La OPN-c carece del dominio reactivo de transglutaminasa (Gly-XGly) que puede mediar en la reticulación covalente homodímera, así como en la formación de heterodímeros con otros componentes de la matriz (como la fibronectina).
Las secuencias de OPN-c están disponibles públicamente. Por ejemplo, los números de acceso al banco de genes D28761 (ácido nucleico) y BAA05951 (proteína) revelan secuencias de OPN-c humanas. En un ejemplo, una secuencia de OPN-c incluye una secuencia de tipo natural (o nativa) y variantes (p.ej. polimorfismos) de OPN-c expresadas en células de cáncer de mama. En algunos ejemplos la OPN-c tiene una secuencia al menos 80% idéntica, por ejemplo al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a una OPN-c nativa (tal como la secuencia de los números de acceso D28761 y BAA05951 al banco de genes). En otros ejemplos una secuencia de ácido nucleico de OPN-c tiene una secuencia que se hibrida en condiciones muy rigurosas con una secuencia publicada en el número de acceso D28761 del banco de genes y retiene la actividad de la OPN-c.
Cebador: moléculas cortas de ácido nucleico, por ejemplo oligonucleótidos de ADN con una longitud de 10 -100 nucleótidos, por ejemplo de 15, 20, 25, 30 o 50 o más nucleótidos de longitud aproximadamente, como el número de nucleótidos contiguos de una molécula de ácido nucleico de OPNc, ER, PR o HER2 (p.ej. una secuencia de gen, ADNc o ARNm). Los cebadores se pueden aparear con una hebra complementaria de ADN diana por hibridación de ácidos nucleicos, a fin de formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana. Se pueden emplear pares de cebadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico por PCR u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en el estado técnico.
Hay métodos para preparar y usar cebadores de ácido nucleico descritos por ejemplo en Sambrook y otros (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, Nueva York, 1989), Ausubel y otros (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998), e Innis y otros (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1990). Los pares de cebadores de PCR se pueden derivar de una secuencia conocida, utilizando por ejemplo programas de ordenador ideados para este fin, tales como Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). El especialista en la materia ya sabe que la especificidad de un cebador particular aumenta con su longitud.
Según un ejemplo, un cebador incluye al menos 15 nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico de OPNc, ER, PR o HER2, por ejemplo al menos 18 nucleótidos consecutivos, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia nucleótida de OPNc, ER, PR o HER2. Estos cebadores se pueden usar para amplificar OPNc, ER, PR o HER2, por ejemplo mediante PCR.
Sonda: secuencia corta de nucleótidos, por ejemplo con una longitud de al menos 8, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 21, al menos 25 o al menos 30 nucleótidos (p.ej. de 8 a 40 o de 10 a 30 nucleótidos), utilizada para detectar la presencia de una secuencia complementaria (tal como una secuencia de ácido nucleico de OPNc,
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Tabla 1: ejemplo de relación de la intensidad de tinción de la OPN-c con el grado tumoral
Informe de resultado
Intensidad de la tinción Observación al microscopio Grado tumoral
Positivo: cualquier tinción IHC de membranas de células tumorales por encima del nivel de fondo, aunque la tinción circunferencial sea completa o incompleta, en más del 0% de células tumorales.
3+ Reactividad fuerte: la tinción suele ser marrón oscura hasta negra, pero no siempre, en un patrón de membrana completo, y produce un contorno grueso de la célula. Puede faltar reactividad citoplasmática o ser de intensidad moderada cuando la tinción de la membrana es muy intensa. Puede haber acentuación citoplasmática submembranosa. 3
2,5
Reactividad intensa: sombras de tinción marrón de oscuridad media (intensidad). La reactividad membranosa es usual pero no siempre completa y produce un contorno circular de la célula neoplásica. La reactividad membranosa incompleta de intensidad moderada también se considera 2+. La reactividad citoplasmática es de intensidad más débil que la reactividad membranosa. 2
2+
Reactividad moderada: sombras de tinción marrón de oscuridad intermedia (intensidad). La reactividad membranosa es usual pero no siempre completa y produce un contorno circular de la célula neoplásica. La reactividad membranosa incompleta de intensidad moderada también se considera 2+. La reactividad citoplasmática es de intensidad más débil que la reactividad membranosa. 2
1,5
Reactividad ligera: tinción membranosa de intensidad intermedia. Puede haber reactividad citoplasmática uniforme que implique todo el citoplasma, pero no debe evaluarse positivamente. 1
1+
Reactividad débil: tinción membranosa tenue o marrón clara. Puede haber reactividad citoplasmática uniforme que implique todo el citoplasma, pero no debe evaluarse positivamente. 1
Negativo: ausencia de tinción de membrana por encima del fondo en todas las células tumorales. Presencia
0,5 Trazas de reactividad: indicios de tinción marrón con localización membranosa y citoplasmática indeterminada. 1
de tinción citoplasmática en ausencia de tinción de membrana.
0 Ninguna reactividad
Los métodos de la presente revelación no se limitan a procedimientos concretos de representación de los niveles de
5 expresión de OPN-c en la muestra del paciente. Aunque puede usarse la típica escala de 1+ a 3+ para representar la intensidad de la señal (por ejemplo cuando se utiliza IHC para detectar una molécula diana), también se pueden emplear otras escalas. En un ejemplo se usa la puntuación media combinada para representar los niveles de OPN-c existentes en la muestra de un paciente. Los métodos de puntuación media combinada pueden proporcionar una escala de 0 hasta 300. Los tejidos se valoran puntuando el citoplasma mediante una típica escala de 1+ a 3+ para
10 representar la intensidad y asignando 3 a las muestras con tinción muy intensa, 1 a las muestras débilmente teñidas y 0 a las muestras de tinción negativa. Las puntuaciones patológicas combinadas se calculan multiplicando la intensidad media (que va de 1 hasta 3) por el porcentaje medio de tejido teñido (que va de 0 hasta 100). La mayor puntuación posible es 300. Para asignar un grado tumoral se puede usar el sistema de Scarff-Bloom-Richardson (SBR) modificado, que tiene en cuenta el grado nuclear, la formación de túbulos y la velocidad mitótica. Para asignar
15 un grado 1, 2 o 3 (o una fase tumoral concreta) se aplica la puntuación combinada de estos factores. En algunos ejemplos, la señal (o el valor comprendido en el intervalo de 0 hasta 300) obtenido a partir de la muestra de tejido se compara con una señal de control (o con el valor o intervalo de valores esperado a partir de una muestra de control). Por ejemplo, el valor resultante de la muestra experimental en el intervalo de 0 hasta 300 se puede comparar con
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BIACORE®. En ejemplos concretos se analiza una muestra de cáncer de mama obtenida del paciente para ver si contiene niveles detectables de OPN-c, ARNm o proteína.
Los fijadores para montar preparaciones celulares y tisulares son bien conocidos del estado técnico e incluyen, sin limitación, fijador de Bouin alcohólico del 95%, fijador de alcohol del 95%, fijador B5, fijador de Bouin, fijador de formalina, fijador de Karnovsky (aldehído glutárico), fijador de Hartman, fijador de Hollande, fijador de Orth (fijador de dicromato) y fijador de Zenker (véase p.ej. Carson, Histotechnology: A Self-Instructional Text, Chicago:ASCP Press, 1997).
Detección de péptidos
En ejemplos concretos se analiza una muestra obtenida del paciente para determinar si contiene niveles detectables de proteína de OPN-c. En algunos ejemplos la muestra es de cáncer mamario. La muestra, por ejemplo una muestra de cáncer de mama, también se puede analizar para detectar la presencia de proteínas de ER, PR y HER2.
Los métodos de detección de proteínas son rutinarios. En algunos ejemplos se usan inmunoensayos para detectar la presencia de proteína de OPN-c en la muestra (y además en algunos ejemplos una o más entre las proteínas de ER, PR y HER2). En general los inmunoensayos incluyen el uso de uno o más agentes de fijación específicos (tales como anticuerpos) que básicamente solo pueden unirse al péptido diana, por ejemplo a OPN-c, ER, PR y HER2. Estos agentes de fijación pueden incluir un marcador detectable (por ejemplo un marcador radiactivo, un fluoróforo o un enzima) que permita detectar la unión a la proteína. Como ejemplos de inmunoensayos utilizables cabe citar, sin limitarse a ellos: Western blot, ELISA, microscopia de fluorescencia y citometría de flujo. Un inmunoensayo particular es la inmunohistoquímica.
En un ejemplo, el agente de fijación específico es un anticuerpo, tal como uno de tipo policlonal or monoclonal, o un fragmento del mismo. En algunos ejemplos el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunos ejemplos el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. Si se desea, el anticuerpo puede incluir un marcador detectable para permitir la detección y en algunos casos la cuantificación del complejo proteína/anticuerpo.
La presencia de señal detectable por encima del fondo o de los niveles de control indica la presencia en la muestra de un péptido diana (p.ej. de proteína de OPN-c y además en algunos ejemplos una o más entre las proteínas de ER, PR y HER2). Por ejemplo, el nivel de OPN-c detectado se pueden comparar con un control o valor de referencia (o intervalo de valores) tal como un valor correspondiente a un nivel esperado de proteína de OPN-c si el cáncer de mama es de grado 3, un valor correspondiente a un nivel esperado de proteína de OPN-c si el cáncer de mama es de grado 2, un valor correspondiente a un nivel esperado de proteína de OPN-c si el cáncer de mama es de grado 1, un valor correspondiente a un nivel esperado de proteína de OPN-c si no hay cáncer de mama (tejido normal) o combinaciones de ellos. Para las proteínas de ER, PR y HER2 se pueden usar valores de referencia similares. En algunos ejemplos el control es una muestra normal (es decir, no tumoral) (o un valor esperado para una muestra normal).
En algunos ejemplos la detección de mayores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor de grado 3, la detección de niveles intermedios de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor de grado 2, mientras que la detección de menores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor de grado 1. En algunos ejemplos la detección de mayores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor más agresivo (de fase III o superior), la detección de niveles intermedios de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor moderadamente agresivo (como de fase II), mientras que la detección de menores niveles de OPN-c indica que el paciente tiene un tumor menos agresivo (de fase I o inferior). La cantidad de OPN-c detectada puede depender del tipo de medición efectuada (véase p.ej. FIG. 3C). La detección de OPN-c o de otro marcador de cáncer (p.ej. PR, ER, HER2) se puede indicar como puntuación citoplasmática combinada media, porcentaje medio de positivos o intensidad porcentual media u otro valor conocido del estado técnico. El valor obtenido para la muestra de cáncer analizada se puede comparar con un valor de referencia (o intervalo de valores) que corresponda, por ejemplo, a un valor o intervalo de valores esperados para un cáncer mamario de grado 1, 2 o 3 (o para una fase concreta del mismo). En algunos ejemplos la referencia es una muestra que tenga una cantidad conocida o esperada de proteína de OPN-c. Por ejemplo, las líneas celulares MCF-7 y ZR-75 son negativas en OPN-c, mientras que las líneas MDA-MB-435 y MDA-MB-231 son positivas en OPN-c (todas estas líneas celulares pueden adquirirse de la American Type Culture Collection [Colección americana de cultivos tipo]). En algunos ejemplos se trata de una muestra de cáncer de mama que tiene un grado 1, 2 o 3 conocido y un valor o intervalo de valores particulares de OPN-c (y en algunos ejemplos también valores de ER, PR y HER2). El valor de OPN-c resultante del análisis (y en algunos ejemplos también los valores analizados de ER, PR y HER2) se puede comparar con el valor de referencia para relacionar el valor de análisis con un grado de cáncer. Por ejemplo, si el nivel de OPN-c detectado en la muestra del paciente es similar o superior al nivel de OPN-c en una muestra de cáncer mamario conocido de grado 3 o cae dentro del intervalo esperado para un cáncer mamario de grado 3, ello indica que el paciente tiene un cáncer de mama de grado 3.
Detección de moléculas de ácido nucleico
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de tumor que exprese OPN-c, como por ejemplo cáncer adrenocortical, ameloblastoma, cáncer ampular, cáncer de vesícula, cáncer óseo, cáncer de mama, cáncer cervical, colangioma, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer gástrico, glioma, tumor de células granulares, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, mola hidatiforme, cáncer pulmonar, linfoma, melanoma, mesotelioma, mieloma, neuroblastoma, cáncer oral, osteocondroma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, pilomatricoma, cáncer prostático, cáncer de células renales, tumor de glándulas salivales, tumores de tejidos blandos, nevus de Spitz, cáncer de células escamosas, cáncer teratoide y cáncer tiroideo.
Los métodos de pronóstico se pueden emplear para predecir la probable progresión del tumor, el tiempo de supervivencia, el probable empeoramiento del estado, etc., por ejemplo el pronóstico en ausencia de terapia (p.ej. de radiación o quimioterapia). Por ejemplo, los métodos se pueden usar para determinar si un tumor puede ser menos agresivo (es decir, de crecimiento menos rápido y/o con menor probabilidad de metastatizar) o más agresivo (es decir, de crecimiento rápido y/o con mayor probabilidad de metastatizar), por ejemplo independientemente de la terapia. Un tumor menos agresivo se puede caracterizar mediante cualquiera de los parámetros conocidos en el estado técnico, incluyendo por ejemplo disminución de la velocidad de crecimiento (p.ej. mayor tasa de apoptosis y/o menor tasa de división celular), menor tasa de metástasis y/o mayor sensibilidad a la quimioterapia. Un tumor más agresivo se puede caracterizar mediante cualquiera de los parámetros conocidos en el estado técnico, incluyendo por ejemplo incremento de la velocidad de crecimiento (p.ej. menor tasa de apoptosis y/o mayor tasa de división celular), mayor tasa de metástasis y/o menor sensibilidad a la quimioterapia. En algunos ejemplos el pronóstico para un paciente se puede caracterizar por la supervivencia real a partir del diagnóstico inicial (por ejemplo 6 meses de supervivencia, 1 año de supervivencia, 2 años de supervivencia o 5 años de supervivencia) y/o por la supervivencia real respecto a la supervivencia media de pacientes en situación análoga. Un mejor pronóstico supone p.ej. una supervivencia del paciente superior a 1 año tras el diagnóstico inicial (por ejemplo superior a 2 o 5 años) o una supervivencia del paciente superior a 6 meses (p.ej. superior a 2, 5 años) respecto a la supervivencia media de pacientes en situación análoga. Un peor pronóstico supone p.ej. una supervivencia del paciente inferior a 5 años tras el diagnóstico inicial (por ejemplo inferior a 2 o 1 año) o una supervivencia del paciente inferior a la supervivencia media de pacientes en situación análoga (por ejemplo, aproximadamente inferior a 3 meses, 6 meses o 1 año en comparación con la supervivencia media).
Tal como se ha descrito arriba, en algunos ejemplos se cuantifica o escala la cantidad de OPN-c, de modo que mayores niveles de OPN-c indican un cáncer más agresivo y un peor pronóstico, mientras que menores niveles de OPN-c indican un cáncer menos agresivo y un mejor pronóstico. Por ejemplo, si se usa la típica escala de 1+ a 3+ para representar la intensidad arriba descrita, la detección de un nivel “1” de OPN-c indica que el paciente tiene un cáncer menos agresivo (p.ej. menor probabilidad de muerte a los 5 años del diagnóstico o menor probabilidad de metástasis), mientras que la detección de un nivel “3” de OPN-c indica que el paciente tiene un cáncer agresivo (p.ej. mayor probabilidad de muerte a los 5 años del diagnóstico o mayor probabilidad de metástasis). En otros ejemplos se usa el método de la puntuación media combinada anteriormente descrito (con valores que van de 0 hasta 300). Por ejemplo, el valor resultante de la muestra experimental en el intervalo de 0 hasta 300 se puede comparar con muestras de control de pronóstico conocido y valores comprendidos en la escala de 0 a 300 o se puede comparar con valores esperados en la escala de 0 a 300 para cada pronóstico. Por ejemplo, si un control de pronóstico malo (p.ej. con una tasa de supervivencia de 5 años menor del 5%) tiene un intervalo de 250 hasta 300 y un control de pronóstico bueno (p.ej. con una tasa de supervivencia de 5 años mayor del 95%) tiene un intervalo de 0 hasta 49, cuando el valor de la muestra experimental obtenido es de 275 se deduce que el pronóstico es malo, mientras que si el valor de la muestra experimental obtenido es de 20 se deduce que el pronóstico es bueno. Un especialista en la materia apreciará que dichos valores solo tienen fines demostrativos y que los valores o intervalos absolutos pueden variar, por ejemplo en función del método utilizado para detectar la expresión.
En otros ejemplos los niveles de ácido nucleico de OPN-c presentes en una muestra de un paciente se normalizan de la manera anteriormente descrita (véanse por ejemplo las patentes US nº 7,056,674 y 7,081,340). En ejemplos concretos, cuanto mayor es la proporción de un gen de mantenimiento particular peor es el pronóstico, mientras que una menor proporción de un gen de mantenimiento particular indica un mejor pronóstico.
Kits
Aquí se revelan kits que pueden usarse para clasificar, estadificar y pronosticar un cáncer de mama u otro tipo de cáncer que exprese OPN, por ejemplo para determinar si un cáncer es más o menos agresivo, para determinar la probabilidad de un cáncer metastatice y predecir el tiempo de supervivencia de un paciente con cáncer. En general el cáncer se clasifica en una escala de 1 a 3, siendo 1 el menos agresivo y 3 el más agresivo.
En ejemplos concretos el kit incluye o consta de un anticuerpo que se une específicamente al receptor de estrógeno (ER), un anticuerpo que se une específicamente al receptor de progesterona (PR), un anticuerpo que se une específicamente al HER2 y un anticuerpo que se une específicamente a OPN-c. En algunos ejemplos el kit no lleva un anticuerpo de PR. En algunos ejemplos el kit incluye o consta de una sonda de ácido nucleico o de un cebador específico para una secuencia de ácido nucleico de ER, una sonda de ácido nucleico o de un cebador específico para una secuencia de ácido nucleico de PR, una sonda de ácido nucleico o de un cebador específico para una secuencia de ácido nucleico de HER2 y una sonda de ácido nucleico o de un cebador específico para una secuencia
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Tabla 3: tinción histoquímica para OPN-c, ER, PR y HER2
Gradotumoral
n OPN-c +, 3receptoresnegativo OPN-c +, 1receptorpositivo OPN-c +, 2receptorespositivo OPN-c +, 3receptorespositivo todosnegativos OPN-c -, 1receptorpositivo OPN-c -, 2receptorespositivo OPN-c -, 3receptorespositivo
1
16 0% 12,5% 43,8% 0% 6,3% 6,3% 25,0% 6,3%
2
23 8,7% 56,5% 8,7% 0% 13,0% 13,0% 0% 0%
3
17 35,3% 41,2% 23,5% 0% 0% 0% 0% 0%
todos losgrados
56 14,3% 39,3% 23,2% 0% 7,1% 7,1% 7,1% 1,8%
La comparación de los porcentajes de muestras teñidas positivamente en presencia de osteopontina-c, frente a los tres receptores de factor de crecimiento en las biopsias de la matriz de tejidos de carcinoma mamario, indica que la
5 OPN-c es un marcador más sensible. También detecta una fracción de cánceres de mama triple negativos. Nótese que las muestras teñidas positivamente en presencia de uno o dos de los receptores se han omitido para mayor claridad.
Ejemplo 5 10
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Ejemplo 7
Clasificación del cáncer de mama en humanos
5 Este ejemplo describe métodos particulares que pueden usarse para clasificar un cáncer de mama tal como el DCIS en un paciente humano. Sin embargo un especialista en la materia apreciará que también se pueden usar métodos similares y otras muestras de cáncer (p.ej. del colon o de otro tejido según la relación del ejemplo 5) en lugar de las muestras de cáncer de mama. En algunos ejemplos esta clasificación se realiza antes de tratar el paciente.
10 Se toman muestras de células o de tejido canceroso de mama del paciente. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de una biopsia de tejido o de una aspiración con aguja mediante métodos rutinarios. En algunos ejemplos, si se usa una muestra de biopsia de tejido pueden obtenerse 1-100 mg de tejido, utilizando por ejemplo un aspirado con aguja fina. En ejemplos concretos las muestras se pueden utilizar directamente o se pueden manipular antes del
15 uso, por ejemplo fijándolas (p.ej. con formalina) o embebiéndolas (p.ej. en plástico o parafina). En algunos ejemplos se aísla ARN o proteínas del tejido, empleando métodos rutinarios (por ejemplo usando un kit comercial).
En un ejemplo los niveles de proteína de OPN-c se determinan en una muestra de cáncer de mama obtenida del paciente. La muestra de cáncer de mama, por ejemplo de tejido o de células existentes sobre un substrato (como el
20 portaobjetos de un microscopio) se incuba con un anticuerpo de OPN-c en un tampón adecuado durante un tiempo suficiente para que el anticuerpo se una a la OPN-c presente en la muestra. Los complejos OPN-c/anticuerpo se detectan por ejemplo usando un microscopio. En algunos ejemplos la muestra de cáncer de mama (u otra muestra del mismo paciente) se analiza para ver los niveles de proteína de ER, PR o HER2 usando anticuerpos idóneos.
25 Los complejos anticuerpo/proteína se pueden detectar mediante un marcador en el anticuerpo o con un anticuerpo secundario marcado. Los portaobjetos de las matrices teñidas resultantes se pueden valorar mediante microscopia óptica por parte de un patologista, según los siguientes criterios:
Informe de resultado
Intensidad de la tinción Observación al microscopio
3+
Reactividad fuerte: la tinción suele ser marrón oscura hasta negra, pero no siempre, en un patrón de membrana completo, y produce un contorno grueso de la célula. Puede faltar reactividad citoplasmática o ser de intensidad moderada cuando la tinción de la membrana es muy intensa. Puede haber acentuación citoplasmática submembranosa.
Positivo: cualquier tinción IHC de membranas de células tumorales por encima del nivel de fondo,
2,5 Reactividad intensa: sombras de tinción marrón de oscuridad media (intensidad). La reactividad membranosa es usual pero no siempre completa y produce un contorno circular de la célula neoplásica. La reactividad membranosa incompleta de intensidad moderada también se considera 2+. La reactividad citoplasmática es de intensidad más débil que la reactividad membranosa.
aunque la tinción circunferencial sea completa o incompleta, en más del 0% de células tumorales.
2+ Reactividad moderada: sombras de tinción marrón de oscuridad intermedia (intensidad). La reactividad membranosa es usual pero no siempre completa y produce un contorno circular de la célula neoplásica. La reactividad membranosa incompleta de intensidad moderada también se considera 2+. La reactividad citoplasmática es de intensidad más débil que la reactividad membranosa.
1,5
Reactividad ligera: tinción membranosa de intensidad intermedia. Puede haber reactividad citoplasmática uniforme que implique todo el citoplasma, pero no debe evaluarse positivamente.
1+
Reactividad débil: tinción membranosa tenue o marrón clara. Puede haber reactividad citoplasmática uniforme que implique todo el citoplasma, pero no debe evaluarse positivamente.
Negativo: ausencia de tinción de membrana por
0,5 Trazas de reactividad: indicios de tinción marrón con localización membranosa y citoplasmática indeterminada.
encima del fondo en todas las células tumorales. Presencia de tinción citoplasmática en ausencia de tinción de membrana.
0 Ninguna reactividad
30 La puntuación resultante se puede usar para clasificar, estadificar o pronosticar el tumor (véase p.ej. la tabla 1).
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  1. imagen1
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