ES2537096A2 - Inmunógenos de vih-1 deficientes en integrasa y métodos para cargar células dendríticas con dichos inmunógenos - Google Patents

Inmunógenos de vih-1 deficientes en integrasa y métodos para cargar células dendríticas con dichos inmunógenos Download PDF

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Abstract

Inmunógenos de VIH-1 deficientes en integrasa y métodos para cargar células dendríticas con dichos inmunógenos. La presente invención se refiere a un método para obtener una célula dendrítica cargada con antígeno in vitro que comprende poner en contacto una célula dendrítica inmadura con un inmunógeno, preferiblemente un inmunógeno de VIH, y simultáneamente, durante al menos parte de dicho paso, colocar dicha célula dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para la maduración que comprenden la incubación de dicha célula dendrítica con un medio que comprende un agente de maduración de células dendríticas seleccionado entre el ligando de TLR4 LPS, y una mezcla de citocinas proinflamatorias seleccionadas entre IL-1β, IL-6 y TNF-α, y la prostaglandina PGE2. La invención se refiere también a inmunógenos de VIH-1 que carecen de una proteína integrasa funcional.

Description

INMUNÓGENOS DE VIH-I DEFICIENTES EN INTEGRASA y MÉTODOS PARA CARGAR CÉLULAS DENDRÍTICAS CON DICHOS INMUNÓGENOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para obtener una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno, en particular una célula dendrítica cargada con un inmunógeno de VIH-I. La invención también se refiere a inmunógenos de VIH-I que carecen de una proteína integrasa funcional ya los usos de los mismos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígeno más potentes en el sistema inmune, que unen la inmunidad innata y adaptativa. Capturan patógenos en la mucosa y después migran al tejido linfoide secundario, donde adquieren el fenotipo maduro requerido para inducir eficazmente respuestas inmunes adaptativas. Después de alcanzar las áreas de células T de los ganglios linfáticos, las CD maduras pueden presentar péptidos derivados de patógenos en asociación con moléculas del sistema de antígeno leucocítico humano (HLA) a células T indiferenciadas. El sistema HLA es el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en seres humanos. Este proceso inicia una respuesta inmune celular que implica células auxiliares T CD4+, linfocitos T citotóxicos CD8+ (LTC) y una respuesta inmune humoral con la activación de células B. No obstante, también se ha propuesto que las CD contribuyen a la propagación de VIl-I-I durante la exposición a V1H-1 in vivo. Las CD están entre las primeras células diana que encuentran y son infectadas por V1H-I , ya que son abundantes en los sitios más comunes para la entrada del virus tal corno las mucosas genital y anal. Desde aquí se mueven a los tejidos linfoides donde interaccionan e infectan células T C04+, la diana principal de VIH-I. Véase, Granelli-Piperno A, el al., 1. Virol. 1998; 72:2733-2737.
Varios trabajos han demostrado que tras la maduración, las CD mejoran su eficacia para transmitir VIH-I mediante {ral1s-infección, un proceso donde las CD retienen y transfieren viriones infecciosos sin llegar a infectarse ellas mismas. En general, todas las señales de maduración aumentan los marcadores fenotípicos para moléculas de HLA y coestimuladoras, pero la capacidad funcional de las CO maduras resultantes varía. Por
consiguiente, dependiendo de su estado de maduración cualitativo, las CD son capaces de polarizar varias respuestas de cé lulas T.
La capacidad de CD maduras de transferir VIH también está muy influ ida por los estímulos de maduración y los subconjuntos de CO resultantes. Sin embargo, estudios previos han observado que las CO maduradas con lipopolisacárido (LPS), tanto CO derivadas de monocitos (COm) como CO mieloides derivadas de sangre, capturan cantidades mayores de VIH-l comparadas con CO derivadas de monocitos inmaduras (COi) o CO mieloides inmaduras. También se ha encontrado que esto se correlaciona con una mayor capacidad para transferir VIH-I a células diana susceptibles.
La maduración con LPS de CO también aumenta la captura de exosomas, vesículas celulares secretadas de origen endocítico con un papel importante en comunicación intercelular. Los exosomas y VIH-I están bioquímicamente relacionados, con similitudes en tamaño, composición, biogénesis y liberación celular. Además, se ha descrito que los exosomas y VIH-I usan una ruta de entrada idéntica en CO maduradas con LPS, colocalizando en el mismo compartimente intracelular C081+. Por tanto, varias líneas de evidencia sugieren que las partículas de VIH-l pueden explotar la ruta de diseminación exosoma-antígeno intrínseca para que CO maduras medien la Iral1s-infección de linfocitos T. También se ha mostrado que los exosomas contribuyen al intercambio de antígeno y activación de células T.
Las CO pueden desempeñar un papel dual en la infección de VIH-I: aumentan la diseminación de VIH-I al tiempo que desencadenan una respuesta adaptativa contra la infección vírica. Aunque está bien documentado que la mayor captura vírica por las CO maduradas con LPS produce una Imns-infección aumentada a cé lulas diana, se sabe poco sobre las capacidades presentadoras de antígeno de este subconjunto de CO.
A pesar de los anterior, existe una necesidad larga y continua en la técnica para inmunógenos de VIH y métodos más eficaces para cargar células dendríticas con inmunógenos, particularmente con inmunógenos de VIH, que pueda apoyar mejor la preparación de vacunas terapéuticas de VIH autólogas más seguras y más eficaces.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método, de aquí en adelante denominado el "primer método de la invención", para obtener una célula pre sentadora de antígeno cargada con antígeno in vi/ro que comprende poner en contacto una célula dendrítica
inmadura con un inmunógeno que comprende dicho antígeno en condiciones adecuadas para el procesamiento del inmunógeno y presentación por la célula presentadora de antígeno. En un segundo aspecto, la invención se refiere a una célula presentadora de ant ígeno cargada con antígeno obtenible por el método según el primer aspecto de la invención.
En aspectos adicionales, la invención se refiere a una célula presentadora de antígeno según la invención para su uso en medicina así como para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que está cargado en la célula presentadora de antígeno.
En otro aspecto, la invención se refie re a una composición inmunogénica o una vacuna que comprende una célula presentadora de antígeno según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa funcional que contiene una deleción en la proteína integrasa o carece de la proteína integrasa.
En aspectos adicionales, la invención se refiere a un genoma vírico de VIH-I caracterizado por carecer parcial o completamente de la región codificante de integrasa, un vector que comprende el genoma vírico de VIH-I caracterizado por carecer parcial o completamente la región codificante de integrasa o una cé lula que comprende un genoma vírico de VIH-l caracterizado por carecer parcial o completamente de la reg ión codificante de integrasa o un vector que comprende un genoma vírico de VIH-I caracterizado por carecer parcial o completamente de la región cod ificante de integrasa para su uso en medicina así como para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por V1H o una enfennedad asociada con una infección por VIH.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método (de aquí en adelante denominado "segundo método de la invención") para obtener una célula dendrítica cargada con un inmunógeno de V1H-1 i/1 vitro que comprende cargar una célula dendrítica con una partícula vírica de VTH que carece de una proteína integrasa funciona l.
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula dendrítica cargada con una partícula vírica de VIH-I que carece de una proteína integrasa funcional obtenible por el segundo método de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una célula dendrítica según la invención para su uso en medicina así como para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por V1H.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición inmunogénica O una vacuna que comprende una célula dendrítica según la invención.
DEPÓSITO DE MJCROORGANISMOS
El plásmido pNL4-3Ll.1N (pNL4-3-Delta-lntegrasa) se depositó el 22 de julio, 20 lO, con el número de acceso OSM 23817 en la OSMZ (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH), lnhoffensrraBe 7 8, D-38l24 Braunschweig, República Federal de Alemania.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Captura vírica y transmisión vírica de VlHNL4_3 y VIHNL4_3AIN en diferentes condiciones celulares. Panel izquierdo: Protocolo para el ensayo de captura de VIH-l de células dendríticas (CO) completamente maduras que se maduraron con LPS (COm LPS) o con ITIP (CDm ITlP) durante 48 horas antes de la incubación vírica; y para CD inmaduras (CDi) y CDi que se maduraron con LPS (CDi+LPS) o con lTlP (CDi+lTIP) durante la incubación vírica. Panel medio: Captura comparativa de VIHNL4_3 y VIHNL4_3AIN por cada condición celular descrita en el panel izquierdo. La determinación de V1H-1 asociado a CO por ELlSA de p24Gag se realizó después de 6 horas de incubación vírica a 3rc. Panel derecho: Transmisión de V1HNL4_3 y VIH NL4_3AIN capturado por cada condición celular a una línea celular indicadora TZM-bl. Los datos muestran valores medios y error estándar de la media (EEM) para tres experimentos independientes incluyendo células de al menos siete donantes diferentes. LPS: lipopolisacárido; ITIP: IL-Ip, TNF-a, IL-6 y PGE2; RLU: unidades de luz relativas.
Figura 2. Análisis comparativo de la producción de ¡nterferón gamma (IFN-y) por el clon de células T CDS+ VIH p1 7GagSL9 EM40-F21 y el clan de células T C04+ VIH p24Gag N2 en ensayos de presentación de antígeno en cada condición de células dendríticas (CO) probada en la figura 1. Panel izquierdo: Protocolo para ensayos de presentación de antígeno de HLA-I y HLA-II de CD inmaduras (CDi), CDi cultivadas con ITlP (CDi+lTIP) o con LPS (CDi+LPS) durante la incubación vírica, y CD completamente maduras cultivadas con ITlP (CDm ITIP) O con LPS (COm LPS) durante 48 horas antes de la incubación vírica. Panel medio: Activación comparativa de C08+ específicas de VIH por cada condición celular descrita en el panel izquierdo. Panel derecho: Activación comparativa de C04+ específicas de VIH por cada condición celular descrita en el panel izquierdo. Los experimentos se realizaron en triplicados y a tres relaciones diana-efector diferentes. Los paneles muestran un experimento representativo de tres que produjeron resultados similares. Los datos muestran valores medios y EEM. HLA: Antígeno leucocítico humano; LPS: lipopolisacárido; ITIP: ILIp, TNF-a, IL-6 y PGE, .
Figura 3. Análisis comparativo de la producción de interferón gamma (TFN-y) por el clon de células T CDS+ EM40-f2 1 (A) y el clon de células T CD4+ N2 (B) en ensayos de presentación de antígenos y el contenido intracelular de p24Gag VIl-INL4_3 en cada condición de célula dendrítica (CO) probada en la figura 2 antes de lanzar el ensayo ELlSPOT. Relación entre la producción de IFN-y por el clon de células T C08+ EM40-F21 (C) y el clon de células T CD4+ N2 (O) en ensayos de presentación de antígenos y la expresión de HLA de clase l (C) y HLA-DR (D) en cada condición de CD probada en la figura 2 antes de lanzar el ensayo ELlSPOT. Los experimentos se realizaron por triplicado para VIHN1A_3 y en tres relaciones diana-efector diferentes. Los paneles muestran un experimento representativo de tres que produjeron resultados similares. Los datos de la secreción de IFN-y se tomaron de la figura 2 y muestran valores medios y EEM. Se obtuvieron resultados similares para VIH NL4_ 311IN (datos no mostrados). HLA: Antígeno leucocítico humano.
Figura 4. Oetenninación del inmunofenotipo de células dendríticas inmaduras (COi) y células dendríticas completamente maduras maduradas durante 48 horas con ITlP (COm ITIP) o con LPS (COm LPS). Ambos estímulos de maduración confirieron un fenotipo maduro a las CD, aumentando las moléculas de HLA de clase 1 y clase 1I (HLA-A, B, C, HLA-DR) en la superficie celular así como moléculas coestirnuladoras (CD80, CD83, C086). LPS: lipopolisacárido; lTl P: IL-Ip, TNf-a, IL-6 y PGE,.
Figura S. (A) Ensayo de fusión vírica de VIHNL4_3 y VIHNL4_311IN en la línea de células T Jurkat usando viriones de VIH-I que contenían proteína quimérica p-lactamasa-Vpr. Los experimentos se realizaron en presencia o ausencia del inhibidor de fusión C34. (B) Imágenes comparativas de microscopía electrónica de células dendríticas completamente ma.duras cultivadas con LPS (COm LPS) expuestas a VTHNL4_3 (panel izquierdo) o VIHNL4_311IN (panel derecho), que muestran localización de vesículas grandes similar. Las estrellas indican partículas capturadas, con la estructura densa a los electrones característica del núcleo de VIH-l.
Figura 6. Análisis comparativo de la producción de interferón gamma (lFN-y) por el
clon de células T CD8+ EM40-F2l cuando se estimula con células dendríticas (CD) pul sadas
con VIHNU_3 (A) o VIHNL4_3t.IN (B) que expresan la variante óptima (SL YNTVATL) o de
escape (SL[NTlAVL) del epitopo SL9.
5
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para obtener una célula presentadora de
antígeno cargada con antígeno basado en cargar una célula dendrítica inmadura con un
lO
inmunógeno, preferiblemente un inmunógeno de VIH-l deficiente en integrasa. Más
preferiblemente, dicha célula se coloca si multáneamente en condiciones adecuadas para la
maduración. Este método pennite obtener células presentadoras de antígeno que tienen
mayores capacidades de presentación de antígenos que las células obtenidas cuando el
antígeno se carga en células dendríticas completamente maduras. La figura 2 muestra que las
15
células presentadoras de antígeno de la invención producen una mayor activación de células T
C08+ específicas de VIH o células T C04+ específicas de VIH que las células presentadoras
de antígeno obtenidas por otros métodos.
La presente invención también se refiere a un inmunógeno de VIH -l deficiente en
integrasa para cargar células dendríticas. Este inmunógeno es más seguro que otros
20
inmunógenos de VIH-l conocidos, tal corno VIH-I inactivado completo. El uso de vacunas
inactivadas de VIH se ha limitado por preocupaciones de seguridad sobre la potencial
infectividad residual en el producto debido a la inactivación incompleta. Sin embargo, los
inmunógenos de VIH-l deficientes en integrasa de la invención tienen la ventaja de so n
incapaces de rep li carse. Los ejemplos de la presente invención muestran que el inmunógeno
25
de VI H-l deficiente en integrasa VIHNL4_3t.IN es capturado por CD y presentado de forma
eficaz a células T CD4+ y CD8+, con la ventaja añadida de que no se produce diseminación
vírica.
1. Definiciones de términos y expresiones generales
30
El ténnino «SIDA", como se usa en el presente documento, se refiere a la fase sintomática de la infección por VIH, e incluye tanto el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (comúnmente conocido como SIDA) como «ARC", O complejo relacionado con
SIDA. Véase, Adler M, el al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Las manifestaciones
inmunológicas y clínicas del SIDA se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo,
infecciones oportunistas y cánceres resultantes de la inmunodeficiencia.
El ténnino "agonista del receptor de IL-I ", como se usa en el presente documento, se
5
refiere a una citocina que actúa como un agonista del receptor de interleuquina-I (IL-I R). Los
agonistas del receptor de ILI incluyen, sin limitación, IL-Ia e IL-I p.
El término "antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier
molécula o fragmento molecular que, cuando se introduce en el cuerpo, induce una respuesta
inmune específica (es decir, humoral O celular) por el sistema inmune. Los antígenos tienen la
lO
capacidad de unirse al sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Los antígenos
habitualmente son proteínas o polisacáridos. Los antígenos adecuados para la presente
invención son partes de bacterias, virus, parásitos y otros microorganismos tales como
cubiertas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbrias y toxinas. Los ejemplos de antígenos
según la invención incluyen antígenos de picomavirus, coronavirus, togavirus, fl avirvirus,
15
rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, retrovirus,
papilomavirus, parvovlrus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus y familias de virus
espongiformes; o de otros patógenos tales como tripanosomas, gusanos planos, gusanos
redondos, helmintos o malaria. Los ejemplos de antígenos víricos adecuados son, sin
limitación: antígenos retrovíricos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) incluyendo
20
los productos génicos de los genes gag, poI, el/v y l/e/, y otros componentes de VIH ;
antígenos víricos de hepatitis, tales como las proteínas S, M Y L del virus de la hepatitis B, el
antígeno pre-S del virus de la hepatitis B y otras hepatitis (por ejemplo, hepatitis A, B y C,
componentes víricos tal como el ARN vírico de la hepatitis C); antígenos víricos de la gripe,
tal como hemaglutinina y neuraminidasa y otros componentes víricos de la gripe; antígenos
25
víricos del sarampión, tal como la proteína de fusión del virus del sarampión y otros
componentes del virus del sarampión; antígenos víricos de la rubeola, tales como las proteí nas
E 1 Y E2 y otros componentes del virus de la ntbeola; antígenos rotavíricos, tal como VP7sc y
otros componentes rotavíricos; antígenos de citomegalovirus, tal como la glicoproteína B de
la envuelta y otros componentes antigénicos de citomegalovirus; antígenos del virus
30
respiratorio sincitial, tal como la proteína de fusión RSV, la proteína M2 y otros componentes
antigénicos del virus respiratorio sincitial; antígeno víricos del herpes simple, tales como
proteínas inmediatas tempranas, glicoproteína D y otros componentes antigénicos del virus
del herpes simple; antígenos víricos varicela zoster, tales como gpl, gpll Y otros componentes
antigénicos víricos de varicela zoster; antígenos víricos de la encefalitis japonesa, tales como las proteínas E, M-E, M-E-NSI, NSI, NSI-NS2A, 80 por ciento de E y otros componentes antigénicos víricos de la encefalitis japonesa; antígenos víricos de la rabia, tal como la glicoproteína de la rabia, nucleoproteína de la rabia y otros componentes antigénicos víricos de la rabia. Véase, Fields B, Knipe O, Eds., «Fundamental Virology", 2a Ed. (Raven Press, Nueva York, NY, EE UU, 1991) para ejemplos adicionales de antígenos víricos.
El término "célula presentadora de antíge no cargada con antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula dendrítica con la capacidad para presentar un antígeno que ha sido procesado por dicha célula.
El término "terapia ant irretroviral" o "ART", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de uno o más fármacos antirretrovirales para inhibir la replicación del VIH. Típicamente, ART implica la administración de al menos un agente antirretroviral (o, comúnmente, una mezcla de antirretrovirales) tales como inhibidor de la transcriptasa inversa nucleosídico (por ejemplo, zidovudina (AZT, lamivudina (3TC) y abacavir), inhibidor de transcriptasa inversa no nucleosídico (por ejemplo, nevirapina y efavirenz) e inhibidor de proteasa (por ejemplo, indinavir, ritonavir y lopinavir). El término terapia antirretroviral altamente activa ("HAART") se refiere a pautas de tratamiento diseñadas para suprimir agresivamente la replicación vírica y evolución de la enfermedad de VIH, que consisten habitualmente en tres o más fármacos diferentes, tal como, por ejemplo, dos inhibidores de transcriptasa inversa nucleosídicos y un inhibidor de proteasa.
El término "autólogo", como se usa en el presente documento, significa que el donante y receptor de la partícula vírica de V1H-1 y la célula dendrítica es el mi smo suj eto.
El término "célula", como se usa en el presente documento, es equivalente a "célula huésped" y se pretende que se refiera a una célula en la que se ha introducido un genoma vírico, un vector o una partícula vírica de Vll-I-l de la invención. Se debe entender que tales témlinos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie, o potencial progenie, de tal célula. Puesto que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula parental, pero se puede incluir todavía en el ámbito del término como se usa en el presente documento.
El término "comprender" O "comprende", como se usa en el presente documento, divulga también "consistir en" según la práctica de patente generalmente aceptada.
La expresión "condiciones adecuadas para la maduración", como se usa en el presente documento, se refiere a cultivar una célula dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para alcanzar la maduración de dicha célula. Las condiciones adecuadas para la maduración las conoce bien el experto en la materia. Se pueden preparar células dendríticas maduras (es decir, maduradas) poniendo en contacto las células dendríticas inmaduras con cantidades o concentraciones eficaces de un agente de maduración de células dendríticas. Los agentes de maduración de células dendrít icas pueden incluir, por ejemplo, BCG, IFNy, LPS, monofosforil lipido A (MPL), eritoran (CAS no. 185955-34-4), TNFa y sus análogos. Las cantidades eficaces de BCG típicamente varían desde aproximadamente 105 a 107 ufc por mililitro de medio de cultivo. Las cantidades eficaces de IFNy típicamente varían desde aproximadamente 100-1000 U por mililitro de medio de cultivo. El bacilo de Calmette-Guerin (BCG) es una cepa avirulenta de M. bovis. Como se usa en el presente documento, BCG se refiere al BCG completo así como a constituyentes de la pared celular, lipoarabidomananos derivados de BCG y otros componentes de BCG que se asocian con la inducción de una respuesta inmune de tipo 2. El BCG opcionalmente está inactivado, tal corno BCG inactivado por calor, BCG tratado con formalina, y similares. Las CD inmaduras típicamente se ponen en contacto con cantidades eficaces de BCG e I FNy durante aproximadamente una hora hasta aproximadamente 48 horas. Los medios de cultivo adecuados incluyen AlM-V®, RPMI 1640, OMEM o X-VIVO ISTM. Los medios de cultivo se pueden suplementar con aminoácidos, vitaminas, citocinas (por ejemplo, GM-CSF) o cationes divalentes, para fomentar la maduración de las células. Típicamente se usan aproximadamente 500 unidades/mi de GMCSF.
La expresión "condiciones adecuadas para el procesamiento del inmunógeno y presentación por la célula presentadora de antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a la incubación de la célula dendrítica en un medio adecuado para permitir la captura del inmunógeno y el procesamiento y presentación de dicho inmunógeno a otras células del sistema inmune.
El término "poner en contacto", como se usa en el presente documento, se refiere a la incubación de una célula dendrítica inmadura en presencia del inmunógeno destinado para cargar en la célula dendrítica. Las CO inmaduras son capaces de capturar e internalizar dichos inmunógenos volviéndose así una célula dendrítica cargada con antígeno (también llamada célula dendrítica pulsada con antígeno). La captura de antígeno por las CO inmaduras está mediada por macropinocitosis, captura de antígeno mediada por receptor y englobe de
cuerpos apoptóticos. Preferiblemente, dicha incubación se realiza a 3rC durante 6 horas. El
éxito del paso de carga del antígeno O pulso se puede ensayar lavando las células dendríticas
pulsadas para eliminar lo s inmunógenos no capturados y li sando dichas células dendríticas
pulsadas para medir el contenido intracelular de antígeno mediante un ensayo ELlSA. Por
5
ejemplo, cuando el inmunógeno es una partícula vírica de VI H, se puede ensayar el contenido
intracelular en antígeno p24Ga g , presente en la superficie de la cápside de las partículas víricas.
El término "célula dendrítica", como se usa en el presente documento, se refiere a
cualquier miembro de una población diversa de tipos celulares morfológicamente similares
encontradas en tejidos linfoides o no linfoides. Las células dendríticas con una clase de
lO
células presentadoras de antígeno "profesionales", y tienen una gran capacidad para
sensibilizar células T restringidas en HLA. Específicamente, las células dendríticas incluyen,
por ejemplo, células dendríticas linfocíticas (incluye ndo células que inducen Th2 O tolerancia
inmune), células dendríticas de médula ósea (generalmente células dendríticas usadas,
incluyendo células dendríticas inmaduras y maduras), células de Langerhans (células
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dendríticas importantes como cé lulas presentadoras de antígeno en la piel), células
interdigitales (di stribuidas en lo s ganglios linfáticos y región de células T del bazo, y que se
cree que funcionan en la presentación de antígeno a células T) y células dendríticas foliculare s
(importantes como células presentadoras de antígeno para células B). Las células dendríticas
se pueden reconocer por la función, o por el fenotipo, particularmente por el fenotipo de
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superficie celular. Estas células se caracterizan por su morfología di stintiva (tienen
proyecciones como velos en la superficie celular), niveles de expresión de intermedios a altos
de HLA de clase 11 en superficie y capacidad de presentar antígeno a células T,
particularmente a células T indiferenciadas. Véase, Steinman R, el al. , Ann. Rev. Immunol.
1991 ; 9:27 1-196. La superficie celular de Las células dendríticas se caracteriza por la
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expresión de los marcadores de superficie celular CDla+, CD4+, CD86+ o HLA-DR+.
El término "agente de maduración de células dendríticas", como se usa en el presente
documento, se refiere a un compuesto capaz de producir la maduración de la célula dendrítica
cuando la célula dendrítica se incuba con dicho compuesto.
El término "precursor de célula dendrítica", como se usa en el prese nte documento, se
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refiere a cualquier célula capaz de diferenciarse a una célula dendrítica inmadura en presencia
de una citocina apropiada (es decir, G-CSF, GM-CSF, TNFa, IL-4, IL-1 3, SCF (li gando de c
kit) , ligando de Flt -3, o una combinación de las mismas). Ejemplos de células precursoras
dendríticas incluyen, pero no están limitados a, células precursoras dendríticas mieloides,
células precursoras dendríticas linfoides y células precursores dendríticas plasmacitoides. Los marcadores de superficie fenotípicos expresados por los varios subconjuntos de células precursoras dendríticas se conocen bien en la técnica y se puede usar para los fines de identificación, por ejemplo, por citometría de flujo o usando técnicas inmunohistoquímicas.
La expresión "enfermedad asociada con una infección por VIH", como se usa en el presente documento, incluye un estado en el que el sujeto ha desarrollado SIDA, pero también incluye un estado en el que el sujeto infectado con VIH no ha mostrado ningún signo O síntoma de la enfermedad.
La expresión "enfermedad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que se carga en la célula presentadora de antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad susceptible de que se prevenga o trate con la administración de un antígeno. Las enfermedades adecuadas incluyen, sin limitación, enfermedades infecciosas (por ejemplo, VIH) y cáncer
El término "gen gag-por , como se usa en el presente documento, se refiere a un gen (gen [D: 155348) que cod ifica las poliproteínas Gag y Poi. La poliproteína Gag se procesa durante la maduración a MA (proteína de matriz, p 17); CA (proteína de cápside, p24); SP 1 (péptido espaciador 1, p2); NC (proteína de nucleocápside, p7); SP2 (péptido espaciador 2, pi) Y p6. La poliproteína Poi se procesa durante la maduración a transcriptasa inversa, integrasa y proteasa de VIH. Las secuencias de los genes gag y poI encontradas en aislados de VIH se pueden encontrar fácilmente (por ejemplo, bases de datos de VIH Gen8ank y Los Alamas).
El término "citocina que utiliza gpI30", como se usa en el presente documento, se refiere a una citocina que señaliza a través de receptores que contienen gp130. El componente transductor de señal glicoproteína gp 130 (gp 130), también llamado CD 130, es una proteína transmembrana que forma una subunidad de receptores de citocina de tipo I en la familia de receptores de IL-6. Las citocinas que utilizan gp130 (también conocidas como citocinas similares a IL-6) útiles en la presente invención incluyen, interleuquina 6 (IL-6), interleuquina l1 (IL-Il), interleuquina 27 (IL-27), factor neurotrófico ciliar (CNTF), cardiotrofina-I (CT1), citocina similar a cardiotrofina (CLC), factor inhibidor de leucemia (UF), oncostatina M (OSM) y proteína similar a interleuquina 6 de herpes virus asociada a sarcoma de Kaposi (KSHV-IL6).
El término "inmunógeno de Vll-I", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno proteico o peptídico derivado de VIH que es capaz de generar una respuesta
inmune en un sujeto y también se refiere a una partícula vírica de VIH, dicha partícula vírica
es una partícula vírica completa O una partícula vírica que carece de uno O más componentes
víricos pero que mantiene la capacidad de generar una respuesta inmune. Los inmunógenos de
VIH para su uso según la presente invención se pueden seleccionar de cualquier aislado de
5
VIH (por ejemplo, cualquier aislado, cepa o ciado de VIHI, VIH-2 o VIH-3). Los aislados de
VIH se clasifican ahora en subtipos genéticos discretos. Se sabe que VIH-I comprende al
menos diez subtipos (Al, A2, A3, A4, B, C, D, E, PL F2, G, H, J Y K). Véase, Taylor B, el al.,
New Engl. J. Med 2008; 359( 18):1965-1 966. Se sabe que VIH-2 incluye al menos cinco
subtipos (A, S, C, D y E). El subtipo S se ha asociado con la epidemia de VIH en hombres
lO
homosexuales y adi ctos de drogas intravenosas en el mundo. La mayoría de los inmunógenos
de VIH-I, aislados adaptados al laboratorio, reactivos y epítopos mapeados pertenecen al
subtipo B. En África subsahariana, India y China, áreas donde la incidencia de nuevas
infecciones por VIH es alta, el subtipo S de VIH-I representa solo una pequeña minoría de
las infecciones, y el subtipo C de VIHI parece ser el subtipo infectante más común. Por
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tanto, en ciertas formas de realización, puede ser preferible seleccionar inmunógenos de
subtipos particulares (por ejemp lo, subtipo B o e de VIH-I). Puede ser deseable incluir
inmunógenos de múltiples subtipos de VIl-I (por ejemplo, subtipos S y C de VIH-I , subtipos
A y S de VIH-2, o una combinación de subtipos de VIH-l , VIH-2 o VIH-3) en una única
composición inmunológica.
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El término "genoma vírico de VIHI" , como se usa en el presente documento, se
refiere a la totalidad de la información hereditaria de virus VIl-I-1. El genoma virico de VIH-I
está flanqueado por dos LTR y está compuesto de dos copias de ARN monocatenario positivo
que codifica los nueve genes del virus. El genoma ARN de VIl-I-I consiste en al menos siete
marcas estructurales (LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS e INS), y nueve genes (gag, poi, env,
25
lal, rev, nef, vif, vpr, vpu, y algunas veces un décimo lev) , que codifica 19 proteínas. El
genoma vírico de VIH-I comprende los siguientes genes:
1) gag (antígeno específico de grupo): codifica la poliproteína Gag, que se procesa
durante la maduración a MA (proteína de matriz, p 17); CA (proteína de cápside,
p24); SP 1 (péptido espaciador 1, p2); NC (proteina de nucleocápside, p7); SP2
30
(péptido espaciador 2, pi ) y p6.
2) poi: codifica las enzimas víricas transcriptasa inversa, integrasa y proteasa de VIH.
3) el/v (de «envue lta"): codifica gp160, el precursor de gp120 y gp41, proteínas
embebidas en la envuelta vírica que permiten que el virus se una a y se fusione con
células diana.
4) Transactivadores: lal (por trans-activador), rev (por regulador de la expresión de
proteína de virión), vpr (por proteína vírica R).
5) Otros reguladores: vif (por infectividad de virión), /le! (por factor negativo), vpu
(por proteína vírica U).
6) lev: este gen solo está presente en unos pocos aislados de VIH-l. Es una fusión de
partes de los genes fal, env y rev, y codifica una proteína con algunas propiedades
de tat, pero pocas o ninguna de las propiedades de rev.
El témlino «partícula vírica de VIH-1 ", como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura aproximadamente esfé rica con un diámetro de alrededor de 120 nm compuesto de dos copias de ARN monocatenario positivo que codifica los nueve genes del virus englobado por una cápside cónica compuesta de 2.000 copias de la proteína vírica p24. El ARN monocatenario está estrechamente unido a las proteínas de la nucleocápside, p7, Y las enzimas necesarias para el desarro llo del virión tales como transcriptasa inversa, proteasas, ribonucleasa e integrasa. Una matriz compuesta de la proteína vírica p 17 rodea la cápside asegurando la integridad de la partícula del virión. Esta está, a su vez, rodeada por la envuelta vírica que está compuesta de dos capas de moléculas grasas llamadas fosfolíp idos tomadas de la membrana de una célula humana cuando una partícula de virus recién formada gema de la célula. Embebidas en la envuelta vírica hay proteínas de la célula huésped y aproximadamente 70 copias de un complejo de proteínas de VIl-I que sobresale a través de la superficie de la partícula vírica. Esta proteína, conocida como Env, consiste en una tapa hecha de tres moléculas llamadas glicoproteína (gp) 120, Y un tallo que consiste en tres moléculas de gp41 que anclan la estructura a la envuelta vírica. Este complejo de glicoproteínas pennite que el virus se una a y se fusione con células diana para iniciar el ciclo infeccioso.
El ténnino "virus de la inmunodeficiencia humana" o "VIH", como se usa en el presente documento se pretende que incluya VIH-I y VIH-2. "YIH-I" significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo l. VIH-1 incluye, pero no está limitado a, partículas víricas extracelulares y formas de VIH-l asociadas con células infectadas por VIH-l. "VIH2" significa el virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 2. VLH-2 incluye, pero no está limitado a, partículas víricas extracelulares y formas de Yil-I-2 asociadas con células infectadas por YIH-2. Preferiblemente, YIH es YIH-l .
El ténnino «célula dendrítica inmadura", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula dendrítica que tiene capacidad de activar células T significativamente baja comparada con una célula dendrítica en un estado maduro. Específicamente, las células dendríticas inmaduras pueden tener una capacidad de presentación de antígeno que es menor de 1/2 , preferiblemente menor de 1/4 de la de células dendríticas cuya maduración se ha inducido añadiendo LPS (1 ¡.tglml) y cultivando durante dos días. La capacidad presentadora de antígeno se puede cuantificar, por ejemplo, usando la capacidad de activación de células T alo (prueba de linfocitos mezclados: se cocultivan células Talo y células dendríticas a una relación células T:células dendríticas de 1: 1 O, o preferiblemente a relaciones variables; se añade 3H-timidina 8 horas antes de tenninar el cultivo y se evalúa la capacidad de crecimiento de células T basada en la cantidad de 3H-timidina incorporada en el ADN de las células 1. Véase, Jonuleit H, el a/., Gene Ther. 2000; 7:249-254. De fo rma alternativa, se puede evaluar ensayando la capacidad de inducir células T citotóxicas (LTC) específicas usando un péptido, en el que se añade un péptido restringido de clase 1 conocido de un cierto antígeno a células dendríticas; las células dendríticas se cocultivan con células T obtenidas de sangre periférica del mismo donante sano del que se han recogido las células dendríticas (con 25 U/mi o preferiblemente 100 U/mi de IL-2 el día 3 o más tarde). Las células T preferiblemente se estimulan con células dendríticas tres veces durante 21 días, más preferiblemente se estimulan con células dendríticas dos veces durante 14 días. Las células efectoras resultantes se cocultivan durante cuatro horas con células diana marcadas con 51 Cr (células tumorales positivas para péptido restringido de clase 1) a una relación de 100: 1 a 2,5:1 (100:1,50:1, 25:1,20:1,12,5:1, 10:1,5:10 2,5:1), preferiblemente a una relación de
10:1, y se cuant ifica el 51Cr liberado de las células diana. Véase, Hristov G, el al., Arch. Dermatol. Res. 2000; 292:325-332. Además, las células dendríticas inmaduras preferiblemente tienen capacidad fagocítica para antígenos, y más preferiblemente muestran expresión baja (por ejemplo, significativamente baja comparada con las CD maduras inducidas por LPS como se ha descrito anterionnente) o negativa de receptores que inducen la coestimulación para la activación de células T. Las células dendríticas inmaduras expresan marcadores de superficie que se pueden usar para identificar tales células por citometría de flujo o tinción inmunohistoquímica.
El ténnino «inmunógeno" , como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que es capaz de provocar una respuesta inmune adaptativa si se inyecta por sí misma. Todos los inmunógenos son también antígenos pero no todos los antígenos son inmunógenos.
El término "composición inmunogénica", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición que induce una respuesta inmune en un sujeto que produce anticuerpos o respuestas inmunes celulares contra un inmunógeno específico. Las composiciones inmunogénicas se pueden preparar, por ejemplo, como inyectables tal como soluciones líquidas, suspensiones y emulsiones. El término "composición antigénica" se refiere a una composición que puede ser reconocida por el sistema inmune del huésped. Por ejemplo, una composición antigénica contiene epítopos que pueden ser reconocidos por componentes humorales o celulares de un sistema inmune huésped.
El término "incubación", como se usa en el presente documento, se refiere a mantener el cultivo de las células dendríticas en un medio de maduración durante un tiempo específico, preferiblemente durante 48 horas, hasta que la célula dendrítica inmadura se transforma en una célula dendrítica madura. El término "medio" es sustrato de maduración que comprende un medio de cultivo adecuado, uno o más agentes de maduración y, opcionalmente, otros supl ementos.
El témlino "proteína integrasa" o "IN", como se usa en el presente documento, se refiere al producto génico de la región inl de un virus, particularmente del virus VIH-I , caracterizado por tener tres dominios claramente identificables; el dominio catalítico central flanqueado por los dominios N-terminal y C-terminal, el último implicado en la unión a ADN. Una única cadena polipeptídica de la mayoría de las fN retrovíricas comprende aproximadamente 290 residuos. Sin embargo, algunas variaciones importantes están presentes. Por ejemplo, la IN de PFV es significativamente más larga, comprende 392 residuos, y la IN de ASV está codificada como una proteína de 323 aminoácidos de longitud que se procesa postraduccionalmente al polipéptido final que consiste en 286 residuos, que es totalmente enzimáticamente activo. Particularmente, la integrasa del virus VTH-l es el producto génico de la región illl del virus, que tiene 288 aminoácidos y se designa como IN. El término "integrasa", como se usa en el presente documento, se refiere a la forma procesada madura del polipéptido integrasa de VIH-l definido con el número de acceso C7B811 en la base de datos Uniprot (publicación 14 de diciembre, 20 11. Versión 18), El término integrasa de VIH-I también se usa para referirse a la integrasa de VIH-I de otras cepas o aislados del virus. La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos de un gran números de integrasas de VIH-l están fácilmente disponibles al público. Véase, bases de datos de secuencias de VIH,
http://www.hiv.1anLgov/content/sequence/HIV/mainpage.html. enero, 2012; bases de datos y compendios de VIH Los Alamos, http://www.hiv.lanl.gov/, enero 2011.
El ténnino "célula dendrítica madura", co mo se usa en el presente documento, es una célula que tiene capacidad presentadora de antígeno significativamente fuerte para células T o similares comparada con una célula dendrítica en el estado inmaduro. Específicamente, las células dendríticas maduras pueden tener una capacidad presentadora de antígeno que es la mitad o más fuerte, preferiblemente equivalente o más fuerte que la capacidad presentadora de antígeno de células dendríticas en las que se ha inducido la maduración añadiendo LPS (1 ~glml) y cultivando durante dos días. Las CD maduras muestran expresión aumentada de moléculas de superficie celular coestimuladoras y secretan varias citocinas. Específicamente, las CD maduras expresan niveles más altos de antígenos HLA de clase I y clase 11 (HLA-A, B, e, HLA-DR) y en general son positivas para la expresión de marcadores de superficie CD80, CD83 y CD86.
El ténnino "medicamento" , como se usa en el presente documento, es entiende que es una composición farmacéutica, particularmente una vacuna, que comprende la composición inmunogénica de la invención.
El ténnino "precursores monocíticos de células dendríticas" o precursores MoCD, como se usa en el presente documento, comprende monocitos que tienen el receptor de GMeSF en su superficie y otras células precursoras mieloides que responden a GM-eSF. Las células se pueden obtener de cualquier tejido donde residen, particularmente tejidos linfoides tales como bazo, médula ósea, ganglios linfáticos y timo. También se pueden aislar precursores monocíticos de células dendríticas del sistema circulatorio. La sangre periférica es una fuente fácilmente accesible de precursores monocíticos de células dendríticas. La sangre de cordón umbilical es otra fuente de precursores monocíticos de células dendríticas.
El ténnino "operativamente unido", como se usa en el presente documento, significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripcíónltraducción in vi/ro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). Véase, Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.
Los términos "soporte farmacéuticamente aceptable", "diluyente farmacéuticamente aceptable", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fannacéuticamente aceptable", usados de forma intercambiable en el presente documento, se refieren a un relleno, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo convencional sólido, semisólido o líquido no tóxico. Un soporte fannacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y naturaleza de los soportes farmacéuticamente aceptables depende de la forma de administración deseada. Los soportes farmacéuticamente aceptables se conocen y se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica. Véase, Faulí i Trillo C, "Tratad.o de Farmacia Galénica" (Ed. Luzán 5, S.A., Madrid, ES, 1993) Y Gennaro A, Ed., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 20' ed. (Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, PA, EE lJU, 2003).
El ténnino "prevención", como se usa en el presente documento, significa la administración de una composición inmunogénica de la invención o de un medicamento que la contiene en una fase inicial o temprana de la infección, para evitar la aparición de signos clínicos.
La expresión "mezcla de citocinas proinflamatorias", como se lisa en el presente documento, se refiere a una mezcla de dos o más citocinas que son capaces de desencadenar la maduración de células dendríticas inmaduras. Los ejemplos de tales citocinas son, sin limitación, IL-I~, IL-6, TNF-a, IL-18, IL-I I, IL-27 e 1FN-a. Las mezclas de citocinas proinflamatorias adecuadas son, sin limitación, una mezcla fonnada por TNF-a y CD40L; una mezcla formada por LFN-a y TNF-a; una mezcla fonnada por IFN-a y CD40L; una mezcla formada por IFN-a, TNF-a y CD40L; una mezcla formada por TNF-a, IL-I~ e IL-6; una mezclada fonnada por IL-Ip, TNF-a, I.FN-a, IFN-y y poli (I:e); una mezclada formada por IL-I , IL-6, TNF-a, IFN-a y CD40L.
El término "prostaglandina", como se usa en el presente documento, se refiere a un miembro de un grupo de compuestos lipídicos que derivan enzimáticamente de ácidos grasos y tienen funciones importantes en el cuerpo animal. Cada prostaglandina contiene 20 átomos de carbono, incluyendo un anillo de 5 carbonos. Ejemplos de prostaglandinas útiles en la presente invención son, sin limitación, prostaciclina h (PGh), prostaglandina E2 (PGE2) y prostaglandina F2u (PGF2u).
El témlino "ligando de TLR4" o "ligando del receptor de tipo to114", como se usa en el presente documento, se refiere a un ligando del receptor de tipo toll 4 (TLR4). TLR4 también se ha designado CD284 (grupo de difetenciación 284) y es un miembro de la familia de receptores de tipo toll, que desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de patógenos y activación del sistema inmune innato.
El término "miembro de la superfamilia de TNF" , como se usa en el presente documento, se refiere a una citocina que pertenece a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). La superfamilia de TNF de citocinas representa un grupo multifuncional de citocinas proinflamatorias que activan rutas de señalización para la supervivencia celular, apoptosis, respuestas inflamatorias y diferenciación celular. Ejemplos de miembros de la superfamilia de TNF incluye, sin limitación, factor de necrosis tumor alfa (TNFa), L1GHT, ligando de CD40 (CD40L), ligando de 4-IBB (4-IBBL), APRIL, ligando de CD27 (CD27L), ligando de CD30 (CD30L), ligando de Fas, ligando relacionado con TNFR inducido por glucocorticoides (GITRL), linfotoxina alfa (LTa), linfotoxina beta (L TP), ligando de OX40 (OX4úL), activador del receptor del ligando de NF-KB (RANKL), factor acti vador de células B de la familia TNF (BAFF), ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), inductor débil de tipo TNF de apoptosis (TWEAK) y VEG l.
El término "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una composición inmunogénica de la invención o de un medicamento que la contiene para controlar la evolución de la enfermedad antes o después de que hayan aparecido signos clínicos. Se entiende que control de la evolución de la enfermedad significa los resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no están limitados a, reducción de los síntomas, reducción de la duración de la enfermedad, estabilización de estados patológicos (específicamente para evitar deterioro adicional), retraso de la evolución de la enfermedad, mejora del estado patológico y remisión (tanto parcial co mo total). El control de la evolución de la enfermedad también implica una extensión de la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se ap licara el tratamiento. Dentro del contexto de la presente invención, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren específicamente a prevenir o retrasar la infección y destrucción de células T CD4+ sanas en un sujeto infectado por VIH-1. También se refiere a la prevención y retraso del inicio de los síntomas de la enfemledad de inmunodeficiencia adquirida tales como recuento de células T CD4+ extremadamente bajo e infecciones repetidas por patógenos oportunistas tales como Mycobacteria spp. , Pneumocyslis car il1ii, y Pl1eumocystis Cfyptococcus. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, un aumento en el recuento de células T CD4+ indiferenciadas absoluto (intervalo 10-3520), un aumento en el porcentaje de células T CD4+ sobre las células inmunes circulantes totales (intervalo 1-50 por ciento) y/o aumento en el recuento de células T CD4+ como porcentaje del recuento de células T CD4+ normales en un sujeto sin infectar (intervalo 1-161 por ciento). "Tratamiento"
también puede significar prolongar la supervivencia del sujeto infectado comparada con la supervivencia esperada si el sujeto no recibiera ningún tratamiento dirigido a YIH.
El término "vacuna", como se usa en el presente documento, se refiere a una composición inmunogénica para la administración in vivo a un huésped, que puede ser un primate, especialmente un huésped humano, para conferir protección contra una enfermedad, particularmente una enfennedad vírica.
El ténnino "vector", como se usa en el presente documento, indica una molécula de ácido nucleico, lineal O circular, que comprende el genoma que codifica todas las proteínas que fOffimn una partícula vírica (excepto una parte o el total de la proteína integrasa) operativamente unido a segmentos adicionales que aseguran su replicación autónoma en una célula huésped de interés. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión, que se define como un vector, que además de las regiones de replicación autónoma en una célula huésped, contiene regiones operativamente unidas al genoma de la invención y que son capaces de aumentar la expresión de productos del genoma según la invención.
El ténnino "partícula vírica", como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula vírica completa y no a una subunidad proteica o péptido. Las partículas víricas (también conocidas como viriones) consisten en dos o tres partes: el material genético del virus hecho de ADN o ARN; una cubierta proteica que protege estos genes; y, en algunos casos, una envuelta de lípidos que rodea la cubierta proteica cuando están fuera de una célula. La forma de la partícula vírica varía desde fonnas helicoidal e icosaédrica simples a estructuras más complejas, dependiendo del virus.
2. Método para obtener 11110 célula presel1ladora de allligello cargada con alltigeno ill Vi/ro
En un primer aspecto, la invención se refiere a un método (en adelante denominado "primer método de la invención") para obtener una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno in vi/ro que comprende poner en contacto una célula dendrítica inmadura con un inmunógeno en condiciones adecuadas para su procesamiento y presentación por la célula presentadora de antígeno.
En una forma de realización preferida, el inmunógeno es una partícula vírica, preferiblemente una partícula vírica de YIH, más preferiblemente una partícula vírica de Y1H
1. La partícula vírica puede contener varios antígenos.
El virus VIH-I muestra un grado inusualmente alto de variabilidad genética en todo su genorna. Comparaciones de secuencias han identificado tres grupos genéticos de VIH-I , designados M, O Y N. Se ha hipotetizado la existencia de un cuarto grupo, "P", basada en un virus aislado en 2009. El grupo M se divide además en subtipos genéticos principales filogenéticamente relacionados (o clados), designados A, B, C, O, E, F, G, H, J Y K. La coinfección con subtipos distintos da lugar a formas recombinantes circulantes (CRF). Junto con las formas recombinantes circulantes (CRF) intersubtipo, el grupo M comprende la mayoría de las variantes de VIH-I en el mundo hoy. El virus VLH-I de la presente invención puede representar cualquiera de los grupos genéticos o subtipos genéticos capaces de infectar un ser humano, y también incluye formas recombinantes circulantes, cepas de laboratorio y aislados primarios. Por tanto, en una forma de realización preferida el inmunógeno es un inmunógeno de VIH.
Los irununógenos de VIH adecuados incluyen la envuelta de VIH (env; por ejemplo, Seq. Ref NCBI NP J357856), gag (por ejemplo, p6, p7, pl7, p24, GenBank AAD39400. 1), la proteasa codificada por poi (por ejemplo, U niProt P03366), nef (por ejemplo, GenBank CAA41585.1, Shugars O, el a/., 1. Virol. 1993; 67(8):4639-4650), así como variantes, derivados y proteínas de fusión de los mismos. Véase, Gómez C, el al. , Vaccine 2007;
25: 1969-1992. Las cepas y combinaciones adecuadas las puede seleccionar el experto en la materia según desee.
El inmunógeno de VIH de la invención es capaz de inducir una respuesta inmune. Particularmente, "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune mediada por células T CD4+ o células T CD8+ a una infección por VIH. Se puede determinar una respuesta inmune a VIH midiendo, por ejemplo, la carga vírica, la proliferación de células T, supervivencia de células T, secreción de citocinas por células T o un aumento en la producción de anticuerpos específicos de antígeno (por ejemplo, concentración de anticuerpo).
La terapia de células dendríticas representa un nuevo y prometedor planteamiento para el tratamiento o prevención de muchas enfennedades tales como cáncer o infección por VIH. Dichas terapias comprenden el uso de células dendríticas que contienen uno o más antígenos que se han introducido artificialmente en dichas células para obtener "células dendríticas cargadas con antígeno".
El método de la invención comprende poner en contacto una célula dendrítica inmadura con un inmunógeno en condiciones adecuadas para su procesamiento y presentación por una célula presentadora de antígeno.
Las células dendríticas afectadas por los métodos de la Invención se pueden
seleccionar para que sean células dendríticas inmaduras o maduras. Las células dendríticas
inmaduras se pueden obtener de una población de precursores de células dendríticas.
Preferib lemente, el precursor de células dendríticas es una célula que se puede diferenciar en
5
una célula dendrítica inmadura en cuatro semanas o menos, más preferiblemente, en 20 días o
menos, incluso más preferiblemente, en 18 días o menos, y aún más preferiblemente, en 16
días o menos. En una fonna de realización preferida, el precursor de células dendríticas se
diferencia a una célula dendrítica inmadura en presencia de GM-CSF e ILA en menos de siete
días, y más preferiblemente, en cinco días.
lO
En una forma de realización preferida, la población de células precursoras dendríticas
es una población de precursores monocíticos de células dendríticas. Más preferiblemente, los
precursores monocíticos de células dendríticas deri van de células mononucleares de sangre
periférica (PBMC). Las PBMC se pueden obtener de sangre completa diluida 1: 1 con
solución salina tamponada o de concentrados de leucocitos (fracciones de "capa leucocítica",
15
MSKCC Blood Bank) por centrifugación estándar en Ficoll-Paque PLUS (sin endotoxina, no.
de catálogo 17-1440-03, Amersham Phannacia Biotech AH, Uppsala, SE). Los precursores
MoCO son PBMC adherentes a plástico (no. de catálogo 35-3003, Falcon, Becton-Dickinson
Labware lnc., Franklin Lakes, NJ, EE UU) en cultivo, y se pueden cultivar en RPMI 1640
completo más suero humano normal (SHN) al 1% (o suero bovino fetal al 10%) en presencia
20
de GM-CSF (1000 UI/ml) e IL-4 (500 UI/ml) con cambio cada 2 dias como se ha descrito.
Véase, Thumer B, el al. , J. Immuno l. Meth. 1999; 223: 1-1 5 y Ratzinger G. el al. , J. lmmunol.
2004; 173:2780-2791.
Las poblaciones de monocitos purificados se pueden aislar de PBMC con anticuerpos
de CDI4+ antes del cultivo para obtener células dendríticas inmaduras. Los monocitos se
25
identifican habitualmente en froti s teñidos por su gran núcleo bilobulado. Además de la
expresión de COI4. los monocitos expresan también, entre otros, uno o más de los siguientes
marcadores de superficie: 125 1-WVH-l , 630 3, adipofilina, C8 12, COI la, COI lb, COI 5,
CD54, Cd163, citidina desaminasa y FIt-1. Véase, Feyle O, el al. , Euf. J. Biochem. ]985;
147:409-419, Malavasi F, el al. , Cell Immuno!. 1986; 97(2):276-285, Rupert J, el al. ,
30
Immunobio!. 1991 ; 182(5):449-464; Ziegler-Heitbrock H, J. Leukoc. Biol. 2000 ; 67:603 -606,
y Pilling O, el al. , PLoS One 2009; 4(10):e-7475.
En general, los precursores monocíticos de células dendríticas se pueden identificar por
la expresión de marcadores tales como CDl 3 y CD33. Los precursores dendríticos mieloides
22
se pueden diferenciar a células dendríticas a través de rutas de CO 14 o CO 1 a. Según esto, una
célula precursora dendrítica de la invención puede ser una célula precursora dendrítica
COI4+CDlao una célula precursora dendrítica COI4-COla+. En ciertas foonas de
realización de la in vención, una cé lula precursora dendrítica mieloide se puede caracterizar
5
por la expresión de los marcadores SCA-l , e-kit, C0 34, CDI6 y CD I4 . En una forma de
realización preferida, la célula precursora dendrítica mieloide es un mo nocito CDI4+. El
monocito CDI4+ también puede expresar el receptor de GM-CSF.
Las células dendríticas inmaduras usadas como material de partida para el método de la
invención pueden ser autólogas al sujeto que se va a tratar. En otras formas de realización, las
lO
células dendríticas inmaduras usadas como material de partida para los métodos de la
invención son células dendríticas heterólogas. Por ejemplo, si se va a tratar la enfermedad de
injerto contra el huésped, las células dendríticas inmaduras que se usan como material de
partida son células dendríticas que se obtuvieron del donante. El sujeto puede ser, por
ejemplo, un ratón, una rata, un perro, un pollo, un caballo, una cabra, un burro O un primate.
15
Lo má s preferiblemente, el sujeto es un se r humano. En una forma de realización preferida, la
célula dendrítica inmadura es una célula dendrítica inmadura deri vada de monocito.
El primer método de la invención comprende poner en contacto dichas células
dendríticas irunaduras con un inmunógeno que comprende el antígeno que se va a introducir
en la célula dendrítica en condiciones adecuadas para el procesamiento del inmunógeno y la
20
presentación por la célula prese ntadora de antígeno. Como resultado, se obtiene una célula
presentadora de antígeno cargada con antígeno.
En una forma de realización, el primer método de la invención comprende además
colocar la célula dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para su maduración en donde
dicho paso de maduración se lleva a cabo simultáneamente con el paso de poner en contacto
25
la célula dendrítica inmadura co n un inmunógeno. En otra forma de realización, la célula
dendrítica irunadura se carga primero con el inmunógeno y se madura después. En aún otra
forma de rea li zación, la célula dendrítica se madura primero y después se carga con el
inmunógeno. Preferiblemente, la célula inmadura se madura mientras se carga con el
inmunógeno.
30
El segundo paso del primer método de la invención comprende colocar dicha célula
dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para su maduración a una célula dendrítica
madura. En una forma de realización preferida, las condiciones adecuadas para la maduración
comprenden la incubación de las células dendríticas inmaduras en un medio que comprende
un agente de maduración de células dendríticas seleccionado del grupo que consiste en:
i) un ligando de TLR4 y
ii) una mezcla de citocinas proinflamatorias.
5
En una forma de reali zación preferida, e l li gando de TLR4 para su uso en el método
según la presente invención incluye, sin limitación, LPS, MPL, proteína de choque térmico 60
(Hsp60), proteína de choque ténnico 70 (Hsp70), proteína de choque térmico gp96,
fibrinógeno, sulfato de heparano, ácido hialurónico soluble, beta-defensina 2 y angelan.
Véase, Kim J, el al. Cancer Letters 201 1; 313(2): 226-234. Más preferiblemente, el li gando de
lO
TLR4 es LPS. Véase, Castiello L, el al. , Cancer Immunol. Immunother. 20 11 ; 60(4): 457
466. Preferiblemente, la incubación con LPS se realiza a una concentración de lOO ng/ml.
En un intento de recrear un medio fisio lógico para la maduración de CD, se han usado
algunas mezclas equilibradas de agentes de maduración. Por tanto, en otra forma de
realización preferida, el agente de maduración celular es una mezcla de citocinas
15
proinflamatorias. En una forma de realización preferida, la mezcla de citocinas
proinflamatorias comprende al menos un agonista del receptor de IL-I, una citocina que
utiliza gp l 30 y un miembro de la superfamilia de TNF. Dicha mezcla de citocinas puede
incluir otros compuestos.
En una forma de realización preferida, el agonista del receptor de IL-I es IL-Ip.
20
Preferiblemente, la concentración eficaz de IL-I pes 300 U/mI. En otra forma de realización
preferida, la citocina que utiliza gpl30 es IL-6. Preferiblemente, la concentración eficaz de
IL-6 es 1000 U/m i de IL-6. En otra fonna de realización preferida, el miembro de la
superfamilia de TNF es TNFa. Preferiblemente, la concentración eficaz de TNFa es 1000
U1ml.
25
La mezcla de citocinas más frecuentemente usada contiene TNF-a, IL-Ip e IL-6. Por
tanto, en una forma de realización preferida, la mezcla de citocinas proinflamatorias
comprende una mezcla de IL-Ijl, IL-6 Y TNF-a. Más preferiblemente, la composición del
medio es 300 U/mi de IL-Ip, IODO U/mi de TNF-a y IODO U/mi de lL-6.
Se ha divulgado que la adición de una prostaglandina a la mezcla de citocinas
30
proinflamatorias mejora el rendimiento, maduración, capacidad migratoria e
inmunoestimuladora de las CD generadas. Véase, Jonuleit H, el al., Eur. J. Immunol. 1997;
27: 3135-3 142. Por tanto, en una forma de realización preferida la mezcla de citocinas
proinflamatorias comprende además una prostaglandina. Más preferi blemente, la
24
prostaglandina utilizada es prostaglandina E2 (PGE2). Preferiblemente, la concentración eficaz de PGE2 es 1 Ilglml. Más preferiblemente, la composición del medio de maduración es 300 U/mi de IL-IP, 1000 U/mi de TNF-a, 1000 U/mi de IL-6 y 1 ~g!ml de PG E,.
Al final del periodo de incubación se obtiene una célula dendrítica madura. La maduración de células dendríticas se puede seguir por métodos conocidos en la técnica para células dendríticas. Se pueden detectar marcadores de superficie de CDm en ensayos tales como citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica. Las COm también se pueden seguir por la producción de citocinas (por ejemplo, mediante ELlSA, otro inmunoensayo O por el uso de una matriz de oligonucleótidos). La maduración de una célula dendrítica se puede confirmar además determinando el inmunofenotipo. Una célula dendrítica inmadura se puede distinguir de una célula dendrítica madura, por ejemplo, basándose en marcadores seleccionados del grupo que consiste en COSO y CDS6. Una célula dendrítica inmadura es débilmente positiva y preferiblemente negativa para estos marcadores, mientras que la célula dendrítica madura es positiva.
Cuando el método de la invención tiene lugar en un cultivo que tiene una población de células dendríticas inmaduras, las condiciones adecuadas para la maduración son tales donde se alcanza la maduración de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menoS el 90% o preferiblemente el 100% de las células dendríticas inmaduras.
El primer método de la invención se caracteriza por el hecho de que ambos pasos: i) el paso de poner en contacto la célula dendrítica inmadura con un inmunógeno, y ii) el paso de madurar la célula dendrítica inmadura, se llevan a cabo simultáneamente durante al menos parte de dichos pasos i) y ii). Por tanto, ambos pasos pueden solapar por completo, cuando la maduración de la célula dendrít ica y el contacto con el inmunógeno empiezan al mismo tiempo; o la célula dendrítica se puede incubar con el inmunógeno solo durante parte del paso de maduración, por ejemplo, cuando la maduración de la célula dendrítica empieza primero y después de algún tiempo durante el paso de maduración la célula dendrítica se pone en contacto con el inmunógeno; o la maduración puede tener lugar solo durante parte de la incubación de la célula dendrítica con el inmunógeno, por ejemplo si la incubación con el inmunógeno empieza primero y luego, después de algún tiempo, se empieza la maduración de la célula dendritica.
Cuando los pasos i) y ii) del primer método de la invención han terminado, se obtiene una célula dendrítica cargada con antígeno madura (es decir, una célula dendrítica madura que tiene el antígeno de interés). La maduración de las células dendríticas se puede confirmar
determinando el inmunofenotipo como se ha indicado previamente. La carga antigénica por
las células dendríticas se puede ensayar por los métodos descritos anteriormente.
En una forma de realización preferida, el inmunógeno que se va a cargar en una célula
dendrítica es una partícula vírica, preferiblemente, una partícula vírica retroviral. En otra
5
forma de realización preferida, el inmunógeno es un partícula de lentivims, preferiblemente,
una partícula vírica de VIH. Más preferiblemente, el inmunógeno es una partícula vírica de
VIH-I.
El virus VIH-I se une y posteriormente infecta células CD4 humanas mediante e l uso
de un correceptor en la superficie celular. Diferentes cepas de VIH-l usan diferentes
lO
correceptores para entrar en las células CD4 humanas. Por tanto, el virus VIH-I puede ser
CCR5-trópico cuando la cepa de virus solo usa el correceptor receptor de quimioquina C-C de
tipo 5 (CCR5) para infectar célul as CD4; CXCR4-trópico cuando una cepa de virus solo usa
el correceptor receptor de Qu imioQuina C-X-C de tipo 4 (CXCR4) para in fectar células CD4;
y dual-trópico cuando la cepa de virus usa cualquier correceptor CCR5 o CXCR4 para
15
infectar células CD4. Véase, Whitcomb J, el al. , Antimicrob. Agents Chemother. 2007 ;
51(2):566-575. Hay var ios ensayos disponibles para distinguir entre diferentes virus trópicos
(por ejemplo, Trofile®, Monogram Biosciences, lnc., San Francisco, CA, EE UU). En una
forma de realización preferida, el virus VLH-I se selecciona de un virus CXCR4-trópico y un
virus CCR5-trópico, preferiblemente es un virus CXCR4-trópico.
20
Los lentivirus, incluyendo VIH , se transmiten como virus ARN monocatenarios de
se ntido positivo, envueltos. Tras la entrada en la célula diana, el genoma de ARN vírico se
convierte (transcripción inversa) en ADN bicatenario por una transcriptasa inversa codificada
por el virus que se transporta junto con el genoma vírico en la partícula vírica. El ADN vírico
resultante se importa después al núcleo celular y se integra en el ADN celular por una
25
integrasa codificada por el virus y cofactores del huésped. Una vez integrado, el virus se
vuel ve latente, lo que permite que el virus y su célula huésped eviten la detección por el
sistema inmune. De forma alternativa, el virus se puede transcribir, producir nuevos genomas
de ARN y proteínas víricas que se empaquetan y liberan de la célul a como nuevas partículas
víricas que empiezan el ciclo de replicación de nuevo.
30
La presente invención divulga que una partícula vírica que carece de una proteína
integrasa func ional puede ser un buen inmunógeno ya que el ADN vírico no se puede integrar
en el ADN celular huésped y por tanto no se puede replicar. Sin embargo, dicha partícula
vírica que carece de una proteína integrasa funcional mantiene la misma estructura de
26
antígenos víricos del virus salvaje y por tanto es capaz de inducir una respuesta mmune comparable.
La integrasa es una enzima específica de retrovirus codificada por todos los genomas de retro virus. Para los fines de esta invención las integrasas incluyen, entre otras, integrasas de VIH-l, VIH-2, virus del sarcoma aviar (ASV), virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), espumavirus humano (PFV), virus de mono Mason-Pfizer (MPMV) y virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). Por tanto, en una forma de realización preferida, el inmunógeno es una partícula vírica que carece de una proteína integrasa funcional, preferiblemente, una partícula retrovírica, y más preferiblemente, una partícula vírica de VIH
1.
La partícula vírica de VIH-l de la invención carece de una proteína integrasa funcional. La expresión "carece de una proteína integrasa funcional" incluye no solo la situación en que la proteína integrasa no se sintetiza y la partícula vírica no contiene integrasa sino que también incluye situaciones en que la proteína integrasa se sintetiza pero es inactiva
o esencialmente inactiva. Una proteína integrasa inactiva o esencialmente inactiva es una proteína integrasa que carece de al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, preferiblemente el 100% de su función (o actividad).
La actividad integrasa se puede evaluar midiendo su actividad residual. Véase, Philippe S, el al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103(47):17684-17689. Otro método indirecto de probar la actividad integrasa es ensayar la capacidad de replicación del virus determinando la cinética de producción de p24Gag en células tales como PBMC por métodos conocidos en la técnica.
Las partículas víricas que carecen de una proteína integrasa funcional para su uso en la presente invención pueden ser deficientes en otra proteína o tener alguna mutación o deleción en el genoma que las codifica con respecto a una partícula vírica salvaje. S in embargo, en una forma de realización más preferida, la partícula vírica de VIH-I contiene un complemento entero de todos los genes víricos excepto del gen poI.
La expresión "contiene un completo entero de todos los genes víricos excepto el gen por' significa que los genes víricos están completos e inalterados excepto el gen poI, que es el gen que codifica la proteína integrasa. Por ejemplo, la partícula vírica de dicha forma de realización puede ser una partícula vírica producida después de manipulación genética de la región codificante de integrasa del genoma de una partícula vírica aislada de la naturaleza (por ejemplo, una muestra de un paciente).
La falta de una proteína integrasa funcional de la partícula vírica de la invención se
puede deber a distintas razones incluyendo:
i) una o más mutaciones naturales o artificiales específicas de sitio que provocan un
cambio en un ami noácido por un amin oácido diferente que produce una falta de la
5
función integrasa. En tal caso la proteína integrasa está presente en la partícula
vírica pero no es func ional.
ii) una deleción de uno O más aminoácidos que produce una falta de la func ión
integrasa. En tal caso la proteína integrasa está presente, tiene un tamaño menor
que la proteína integrasa salvaje pero no es funciona l.
lO
iii) una delación de la región completa del ge noma vírico que codifica la proteína
integrasa. En tal caso la proteína integrasa no está presente en la partícula vírica.
En una forma de rea li zació n más preferida, la partícula vírica de V1H-l que carece de
una proteína integrasa funcional contiene una deleción en la proteína integrasa o carece de la
proteína integrasa, preferiblemente carece de la proteína integrasa.
15
La expres ión "deleción en la proteína integrasa" se refiere a una deleción en uno o más
aminoácidos de la proteína lo que produce así una proteína no fu ncional que tiene un tamaño
menor que la proteína integrasa salvaje (es decir, que el polipéptido integrasa no es la proteína
integrasa de longitud completa). Preferiblemente, la proteína integrasa carece del dominio
catalítico central o una parte de dicho dominio.
20
La expresión "carece de la proteína integrasa", como se usa en el presente documento,
significa que la partícula vírica no es capaz de sintetizar la proteína integrasa debido a una
delación completa de la región del gen que codifica la proteína integrasa.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método (en adelante denominado el
"segundo método de la invención") para obtener una cé lula dendrítica cargada con un
25
inm unógeno de V1H1 i/1 vitro que comprende cargar una célula dendrít ica con una partícula
vírica de V1H-l que carece de una proteína integrasa funcional.
La partícula vírica de VIH-I que carece de proteína integrasa funcional del segundo
método de la invención puede ser una partícula vírica de VIHI generada de una partícula
vírica de VIH-l aislada de un sujeto infectado con VIH-1.
30
La expresión "generar una partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína
integrasa funcional" se refiere a la producción artificial de una partícula vírica de VIH-I que
carece de una proteína integrasa funcional usando técnicas de ingeniería genética. La
generación de dicha partícula vírica defectiva puede ser por mutagénesis dirigida o métodos
28
de deleción géni ca bien conocidos en la técnica. Véase, Brown T, "Gene Cloning" (Chap man
& Hall , London, GB, 1995); Watson R, e/ al. , "Recombinant DNA", 2' Ed. (Scientifi c
Ameri can Books, N ueva York, NY, EE UU, 1992); Alberts S , el al. , "Mo lecul ar Biology of
the Cell " (Garland Publishing In c., Nueva York, NY, EE UU, 2008); Innis M, el al. , Eds. ,
5
"PCR Protocols. A Guide to Methods and Applicati ons" (Academic Press Inc. , San Di ego,
CA, EE UU, 1990); Erlich H, Ed., "PCR Technology. Principies and Applications for D NA
Amplification" (Stockton Press, Nueva York , NY, EE UU, 1989); Sambrook J, el al. ,
"Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co ld
Spring Harbor, NY, EE UU , 1989); Bishop T, el al. , '"Nucleic Acid and Protein Sequen ce. A
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Practical Approach" (IRL Press, Oxford , GB , 1987); Reznikoff W, Ed., O< Maximizing Gene
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Methods in Molecular Bio logy" (E lsevier Sci ence Publi shing Co., Nueva York, NY, EE UU ,
1986), Schleef M, Ed. , "Plasmid for Therapy and Vacc ination" (Wil ey-VC H Verlag GmbH,
Weinheim , DE, 2001 ).
15
Para cuantifi car la reducción en la actividad integrasa producida por la deleción en la
región codifi cante de integrasa, y para cuantificar la actividad integrasa residual que
permanece en el virus después de di cha del ec ión, la partícul a víri ca de V1H-I que carece de
una proteína integrasa funcional se puede someter a un ensayo tal como se ha descrito
previamente. Véase, Philippe S, 2006, anteri omlente.
20
La expresión "partícula vírica de VIH-I ai slada de un suj eto infectado por VIH-I "
significa que la partícula que carece de una proteína integrasa funcional se obtiene después de
manipulación genética de un ge noma vírico obtenido de una partícula vírica de VIH-I aislada
de un individuo infectado con VIH-l.
La partícula víri ca de V1H-I se aísla de l suj eto antes del tratami ento para generar un
25
inmunógeno de VIH-I defi ciente en integrasa. En el contexto del segundo aspecto de la
in vención, el término "aislamiento" o "aislado" se refiere a un a partícul a vírica de VTH-I que
se puede ai slar de linfocitos T CD4+ por métodos conoc idos en la técnica. Tales células se
pueden aislar de una muestra de sangre periférica. Dicha muestra de sangre periférica se
obtiene en condici ones asépticas y puede contener un anticoagul ante.
30
La expres ión "suj eto in fec tado por Vll-I-\" , como se usa en el presente doc umento, se
refi ere a un sujeto humano infectado por VIH-l. Los sujetos infectados por VIH-I se
identifican mediante afecciones clínicas asociadas con la infecc ión por Vll-I y rec uentos de
linfoc itos T CD4+. Desde un punto de vista práctico, el médi co ve la infecc ión por VIH-I
29
como un espectro de trastornos que varían desde infección primaria con O sin el síndrome
agudo de VIH a estado de infección sintomática de enfermedad avanzada. El Centro para el
Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Atlanta, Georgia, ha establecido una
definición autorizada para el diagnóstico de SIDA, que infonna al experto en la materia de si
5
se ha producido el inicio del SIDA: en un sujeto infectado por VIH , el recuento de células T
CD4+ debe estar por debajo de 200 células por mm cúbico de sangre, o debe haber aparición
clínica de una infección oportunista inicial que define SIDA, tal como PCP (es decir,
neumonía por Pneumocystis carinii), candidiasis oral, tuberculosis pulmonar o carcinoma
cervical invasivo. Los métodos de detemúnar el recuento de células T CD4+ de un sujeto se
lO
conocen en la técnica. En una forma de realización preferida, el sujeto tiene terapia
antirretroviral interrumpida.
El sujeto puede ser asintomático o puede haber desarrollado ya alguno de los signos
asociados con enfennedades resultantes de infección por Vll-I-l. Además, el sujeto también
puede estar en tratamiento con una terapia antirretroviral (por ejemplo, terapia HAART). En
15
una forma de realización preferida, el sujeto tiene al menos 450 x 106/1 células T C04+ o más
de 10.000 copias de ARN de VIH-I por mi de plasma.
El segundo método de la invención comprende cargar una célula dendrítica con una
partícula vírica de VIH-I que carece de una proteína integrasa funcional. Este paso se lleva a
cabo esencialmente como se ha descrito anterionnente en el contexto del primer método de la
20
invención.
Las célul as dendríticas usadas en el segundo método de la invención son células
dendríticas maduras que se han obtenido de células dendríticas inmaduras usando cualquiera
de los métodos descritos anterionnente para inducir la maduración de las células dendríticas.
En una forma de realización preferida, las células dendríticas se obtienen por maduración de
25
células dendríticas inmaduras usando un medio que comprende un agente de maduración de
células dendríticas seleccionado del grupo que consiste en:
i) un ligando de TLR4 y
ii) una mezcla de citocina proinflamatorias.
En una forma de realización preferida, e l li gando de TLR4 para su uso en el método
30
según la presente invención incluye LPS. En otra forma de realización, la mezcla de citocinas
proinflamatorias comprende al menos un agonista del receptor de IL-I, una citocina que
utiliza gp l 30 y un miembro de la superfamilia de TNF. Dicha mezcla de citocinas puede
incluir otros compuestos. En una forma de realización aún más preferida, el agonista del
receptor de IL-I es IL-Ip. Preferiblemente, la concentración eficaz de IL-lp es 300 U/mI. En
otra forma de realización preferida, la citocina que utiliza gp 130 es IL-6. Preferiblemente, la
concentración eficaz de IL-6 es 1000 U/mi de IL-6. En otra foona de realización preferida, el
miembro de la superfamilia de TNF es TNFa. Preferiblemente, la concentración eficaz de
5
TNFa es 1000 U/mI.
La mezcla de citocinas más frecuentemente usada contiene TNF-a, IL-Ip e IL-6. Por
tanto, en una forma de realización preferida la mezcla de citocinas proinflamatorias
comprende una mezcla de IGlp, IG6 Y TNF-a. Más preferiblemente, la composición del
medio es 300 U/mi de IL-Ip, 1000 Ufml de TNF-a y 1000 U/mi de IL-6.
lO
En aún otra forma de realización, la mezcla de citocinas comprende una
prostaglandina. Más preferiblemente, la prostaglandina utilizada es prostaglandina E2 (PGE2).
Preferiblemente, la concentración eficaz de PGE2 es 1 ¡.tg/ml. Más preferiblemente, la
composición del medio de maduración es 300 U/mi de IL-Ip, 1000 U/mi de TNF-a, 1000
U/mi de IL-6 y 1 ~g/ml de PGE,.
15
En otra forma de realización, la invención se refiere a un método para obtener una
célula presentadora de antígeno cargada con antígeno in vi/ro que comprende:
(i) colocar la célula dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para la
maduración de dicha célula dendrítica inmadura a una célula dendrítica madura y
(ii) poner en contacto la célula dendrítica madura con un inmunógeno que comprende
20
dicho antígeno en condiciones adecuadas para el procesamiento del inmunógeno
presentación por la célula presentadora de antígeno.
Los pasos (i) y (ii) se pueden llevar a cabo de forma secuencial o simultánea. En una
forma de realización preferida, los pasos (i) y (ii) se llevan a cabo secuencialmente, es decir,
las células dendríticas irunaduras primero se maduran y después las células dendríticas
25
maduras se ponen en contacto con el antígeno.
El paso (i) se lleva a cabo en donde las condiciones adecuadas para la maduración de la
célula dendrítica inmadura a ulla célula dendrítica madura comprende la incubación de dicha
célula en un medio que comprende un agente de maduración de células dendríticas
seleccionado del grupo que consiste en:
30
(i) un li gando de TLR4 y
(ii) una mezcla de citocina proinflamatorias.
En una forma de realización preferida, el li gando de TLR4 para su uso en el método
según la presente invención incluye LPS. En otra forma de realización, la mezcla de citocinas
31
proinflamatorias comprende al menos un agonista del receptor de IL-I, una citocina que
utiliza gp l 30 y un miembro de la superfamilia de TNF. Dicha mezcla de citocinas puede
incluir otros compuestos. En una forma de realización aún más preferida, el agonista del
receptor de IL-I es IL-Ip. Preferiblemente, la concentración eficaz de IL-lp es 300 U/mI. En
5
otra forma de realización preferida, la citocina que utiliza gp 130 es IL-6. Preferiblemente, la
concentración eficaz de IL-6 es 1000 U/mi de IL-6. En otra foona de realización preferida, el
miembro de la superfamilia de TNF es TNFcx. Preferiblemente, la concentración eficaz de
TNFa es 1000 Ulml.
La mezcla de citocinas más frecuentemente usada contiene TNF-a, IL-l p e IL-6. Por
lO
tanto, en una forma de reali zación preferida la mezcla de citocinas prointlamatorias
comprende una mezcla de IL-I p, IL-6 Y TNF-a. Más preferiblemente, la composición del
medio es 300 U/mi de IL-Ip, 1000 U/mi de TNF-a y 1000 Ulml de IL-6.
En aún otra forma de realización, la mezcla de citocinas comprende una
prostaglandina. Más preferiblemente, la prostaglandina utilizada es prostaglandina E2(PGEÚ.
15
Preferiblemente, la concentración eficaz de PGE2 es 1 ~g/ml. Más preferiblemente, la
composición del medio de maduración es 300 U/mi de IL-Ip, 1000 U/mi de TNF-a, 1000
Ulml de IL-6 y I ~g/ml de PG E,.
El segundo método de la invención permite obtener células dendríticas cargadas con
partículas víricas de VIH-I que se pueden usar como una vacuna de células dendríticas en el
20
mismo sujeto del que se aisló la partícula vírica de VIH-L Esto tiene la ventaja de que la
partícula víri ca de VIH-I que carece de una proteína integrasa funcional sea exactamente del
mismo grupo y subtipo que la partícula vírica que infectó el sujeto.
Además, la célula dendrítica usada en el método de la invención también puede ser del
mismo sujeto. En una forma de realización preferida, la célul a dendrítica es aulóloga al sujeto
25
del que se ha aislado la partícula vírica de VIH-I.
La carga de una célula dendrítica con la partícula víri ca de VIH-I de la invenció n se
puede hacer usando una célula dendrítica madura o una célula dendrítica inmadura. En una
forma de realización preferida del segundo método de la invención, la carga de la célula
dendrítica se hace con una célula dendrítica inmadura. En otra forma de realización, la carga
30
de la célula dendrítica se hace con una célula dendrítica madura.
En formas de realización preferidas del segundo método de la in vención, la partícula
vírica de VIH-I que carece de una proteína integrasa funcional y el método de cargar una
célula dendrítica con di cha partícula vírica de VIHI puede ser cualquier partícula víri ca de
VIH-I y cualquier método incluido entre los descritos en el contexto del primer método de la invenc ión.
En una forma de realización preferida, la partícula vírica de VIH-I contiene un complemento entero de proteínas víricas excepto integrasa. En otra forma de realización preferida, la partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa funcional contiene una deleción en la proteína integrasa o carece de la proteína integrasa.
En otra forma de realización preferida, el VIH-I es CXCR4-trópico. Los métodos de la invención permiten obtener células dendríticas cargadas con antígeno adecuadas para su uso como una vacuna.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención es una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno obtenible por el primer método de la invención. Dicha célula presentadora de antígeno cargada con antígeno tiene una mayor capacidad de presentar antígenos que células obtenidas por otros métodos conocidos.
Otro aspecto de la invención es una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno obtenible por el primer método de la invención para su uso en medicina. En otro aspecto, la invención se refiere a una célula presentadora de antígeno obtenible por el primer método de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que se carga en la célula presentadora de antígeno. En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una célula presentadora de antígeno obtenible por el primer método de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que se carga en la célula presentadora de antígeno. En otro aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención en un sujeto de una enfemledad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que se carga en la célula presentadora de antígeno según la invención.
En una forma de realización preferida, el inmunógeno es un inmunógeno de VIH y la enfermedad es una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH. En una forma de realización más preferida, el sujeto que se va a tratar es el mismo sujeto del que se aisló la partícula vírica de VIH-l. En otra forma de realización preferida, el sujeto al que se administra la composición inmunogénica o vacuna está en terapia antirretroviral.
Los términos "medicamento", "tratamiento", "prevención", "infección por VIH" y "enfennedad asociada con una infección por VIH" se definen en el contexto de las composiciones inmunogénicas de la invención y usos terapéuticas de las mismas.
Un aspecto más de la presente invención es una célula dendrítica cargada con una partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa funcional obtenible por el segundo método de la invención.
Los ensayos convencionales utilizados para detectar respuestas de células T incluyen, por ejemplo, ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfoquinas, ensayos de citotoxicidad directa y ensayos de dilución lim itante. Por ejemplo, para medir la inmunidad celular, se usan suspensiones celulares de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas de tejidos linfoides para cuantificar respuestas de células T específicas de antígeno mediante el ensayo ELlSPOT específico de citocina. Véase, Wu S, et al., 1995, 1997, anterionnente. Tales ensayos pueden medir los números de células T específicas de antígeno que secretan IL-2, IL4, IL-5, IL-6, IL-IO e IFN-gamma. Todos los ensayos ELlSPOT se realizan usando Acm de captura y detección comercialmente disponibles (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE UU; BD Bioseienees Pharmingen, San Diego, CA, EE UU). Véase, Wu S, el al. , 1995, 1997, anterionnente; Shata M, 200 1, anteriormente.
Los ensayos para probar la capacidad de las células dendríticas cargadas con ant ígeno de presentar antígenos se describen en los procedimientos generales de la parte experimental de la presenta invención.
3. Inlnunógenos de VIH-I que carecen de una proteína illlegrasafill1cional
La presente invención divulga inmunógenos de Vll-I-I que carecen de una proteína integrasa funcional que son capaces de inducir una respuesta inmune sin replicarse en la célula huésped. Corno se muestra en los ejemplos 1 a 3 de la presente invención, una partícula vírica de VIH-I que carece de una proteína integrasa funcional puede ser capturada por una célula dendrítica y activar células T CD4+ y CD8+ sin producir ninguna transinfección de células CD4+.
Por tanto, un aspecto de la presente invención es una partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa funciona l. En una forma de realización preferida, la partícula vírica de VIH-I carece al menos del 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, preferiblemente, el 100% de su función.
En una forma de realización preferida, la partícula vírica de VIH-l contiene un complemento entero de todos los genes víricos excepto el gen poI. En una forma de realización más preferida, la partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa
funcional contiene una deleción en la proteína integrasa o carece de la proteína integrasa por
completo. Preferiblemente, la partícula vírica de VIH-l carece de la proteína integrasa entera.
En otra forma de rea li zac ión preferida, el V1H-l es CXCR4-trópico.
Dichas formas de realización se han definido previamente en el contexto del primer
5
método de la invención.
4. Genomas, veclores y células de la invención
La presente invención también proporc iona genomas que codifican inmunógenos de
lO
VIH -I que carecen de una proteína integrasa funcional y vectores y cé lulas que lo s
comprenden.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un genoma vírico de VIH-l
caracterizado por carecer parcial o completamente de la reg ión cod ificante de integrasa.
La expresión "la reg ión codificante de integrasa", co mo se usa en el presente
15
documento, se refiere a la región del genoma vírico de V IH-I que codifica la proteína
integrasa.
Mediante "carece parcial o comp letamente la región codificante de integrasa" se
entiende que la región codificante de integra sa no está co mpleta , porque parte de los
nuc1eótidos se han de lecionado o porque la región codificante entera se ha delecionado.
20
El genoma vírico de VIH-I de la invención puede contener una deleción o mutación de
otras regiones del genoma.
En una forma de realización preferida, la falta parcial o completa de la región
codificante de integrasa es la única diferencia entre dicho genoma vírico de V1H-1 que carece
parcial o comp letamente de la región codificante de integrasa y un genoma vírico de VIH-l
25
sa lvaje. En el presente contexto, el término "genoma vírico de Vil-I-l sa lvaje" se refiere a un
genoma vírico de VIH-l que es e l ge noma típico de VIH-l como se produce en la naturaleza.
La forma de rea lización en que "la falta parcial o completa de la región codifican te de
integrasa es la única diferencia entre dicho genoma vírico que carece parcial o completamente
de la región codificante de integrasa y un genoma vírico de VIH-l salvaje" significa que el
30
genoma vírico de VIH-l de la invención que carece parcial o completamente de la región
codi fi cante de integrasa es un genoma vírico de VLH-l idéntico a un genoma vírico de VIHI
sa lvaje excepto en que la región codificante de integrasa está parc ial o completamente
delec ionada.
En una forma de realización más preferida, se ha delecionado la región codificante de integrasa entera. Esto significa que la proteína integrasa no se sintetiza. En una forma de realización incluso más preferida, los nucleótidos 4159 a 5124 del gen gag-poI se han delecionado.
En VIH-I , el gen que codifica la proteasa vírica, pro, y el gen que expresa la polimerasa e integrasa, poI, se traducen como parte de un único precursor poliproteico GagPro-Poi de 160 kDa (p 160). La traducción de Pro-Poi requiere un cambio de marco de -1 que permite la lectura a través del codón de terminación de gag. Como resultado del procesamiento de la proteasa vírica, la proteasa misma (PR), e! heterodímero de la transcriptasa inversa (RT, compuesto de una subunidad de 66 y una de 51 kDa) y la integrasa (IN) se liberan de! precursor. Véase, Cimarelli A, el al., CeLl. Mol. Life Sci. 2002; 59:] 16611 84.
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un genoma como se ha definido previamente.
Por tanto, los vectores adecuados según la prese nte invención incluyen vectores procariotas, tales como plásmidos pUC18, pUC 19 y pBluescript y derivados de los mismos, como los plásmidos mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColEl, pCRI y RP4; fagos y vectores lanzadera, tales como los vectores pSA3 y pAT28; vectores de expresión en levaduras, tales como vectores de tipo plásmido de 2-micrones; plásmidos de integración; vectores YEP; plásmidos centroméricos y análogos; vectores de expresión en células de insecto, tal como los vectores de la serie pAC y de la serie pVL; vectores de expresión en plantas, tales como los vectores de las series pIBI, pEarleyGate, pAYA, pCAMB1A, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y análogos; y vectores de expresión en células eucariotas superiores basados en vectores víricos por ejemplo, adenovirus, virus asociados a adenovirus, retrovirus y lentivirus) así como vectores no víricos, tales como los vectores pSilencer 4.1-CMV (Ambion, Life Teehnologies Corp., Carslbad, CA, EE UU), peDNA3, peDNA3.I/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFI/His, pIND/GS, pRe/HCMY2, pSY40/Ze02, pTRACER-HCMV, pUB6N5-His, pYAX I, pZeoSY2, pCI, pSYL y pKSY-IO, pBPY-I, pML2d Y pTDTl.
El plásmido pNL4-3 basado en pUC (14.833 pb de tamaño) es el vector más ampliamente usado para manipulaciones in vi/ro de las secuencias províricas de V1H-1. El vector pNL4-3 de VIH-I codifica todos los productos génicos conocidos de VIH-1 y su secuencia completa se define en el número de acceso AF324493.2 en la base de datos Gen8ank (publicación del 24 de mayo, 2010). Por tanto, en una forma de realización
preferida el vector es pNL4-3 en donde la región de integrasa falta parcial o completamente, preferiblemente en donde la región codificante de integrasa falta por completo. La presente invención se refiere a un plásmido del que se ha delecionado la región codificante de integrasa eliminando los nucleótidos 4160-5121 del vector pNL4-3. El
5 plásmido resultante se llama pNL4-3óIN que tiene una secuencia SEQ ID NO: l. Por tanto, en una forma de realización preferida el vector es el vector pNL4-3 en donde los nucleótidos 4160-5121 se han delecionado. Preferiblemente, el plásmido es pNL4-3óJN.
El plásmido pNL4-3óIN se ha depositado antes de presentar la presente solicitud de patente en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ),
10 InhoffenstraBe 7 "8, 0-38124 Braunschweig, Alemania, como institución legalmente reconocida para tal fin según el tratado de Budapest, del 28 de abril, 1977, sobre el Reconoc imiento Internacional del Depósito de Microorganismos. La DSMZ ha asignado al plásmido pNL4-3óIN el número de depósito DSM 23817. Por tanto, en una forma de realización más preferida el vector es el plásmido o SM 23817.
15 En otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende un genoma vírico de VIH-l según la invención O un vector según la invención.
Las células adecuadas para la expresión de los inmunógenos de la invención incluyen, sin limitación, células de mamíferos, vegetales, de insecto, fúngicas y bacterianas. Las células bacterianas incluyen, sin estar limitadas a, células bacterianas gram positivas tal como
20 especies de los géneros Bacillus, Slreplomyces y SlaphylococclIs y células bacterianas gram negativas tal como células de los géneros Escherichia y Pseudomonas. Las células fúngicas incluyen, preferiblemente, células de levaduras tales como Saccharomyces, Pichia pasloris y Hal1sel1ula polymorpha. Las células de insecto incluyen, s in estar limitadas a, células de Drosophila y células Sf9. Las células vegetales incluyen, entre otras, células de plantas de
25 cultivo tal como cereales, plantas medicinales, ornamentales o bulbosas. Las células de mamífero incluyen, sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), tal como C HOKI (número de acceso de ATCC CCL-61), OG44 (Chasin L, el al., Som. Ce ll Mol Gene!. 1986; 12:555-556 y Kolkekar A, el al., Biochemistry 1997; 36:10901-10909), CHO-KI TetOn (Clontech Inc., Mountain View, CA, EE UU), CHO designadas ECACC 85050302
30 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO clon 13 (GEIMG, Génova, IT), CHO clon B (GEIMG, Génova, IT), CHO-KI /SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), RR-CHOKI designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), células CHO negativas para dihidrofolato reductasa (CHOI-oHFR, Urlaub G, Chas in L,
Proc. NatL Acad. Sci. USA; 77:42 16-4220), células CV 1 de riñón de mono transformadas con
SV40 (COS, COS-7, número de acceso de ATCC CRL-165 1); células de riñón embrionario
humano (células 293, 293T); células de riñón de hámster neonato (BHK, número de acceso de
ATCC CCL-IO); células de riñón de mono (CV I, número de acceso de ATCC CCL-70);
5
células de riñón de mono verde africano (VERO-76, número de acceso de ATCC CRL-1 587;
YERO, número de acceso de ATCC CCL-8 l); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather J,
Biol. Reprod. 1980; 23:243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, número de
acceso de A TCC CCL--2); células de riñón de perro (MDCK, número de acceso de A TCC
CCL-34); células pulmonares humanas (W I38, número de acceso de ATCC CCL-75); células
lO
de hepatoma humano (HEP-G2, H8 8065); células de tumor mamario de ratón (MMT
060562, número de acceso de ATCC CCL-51); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A,
número de acceso de ATCC CRL-1442); células TRI (Mather J, Ann. NY Acad. Sci. 1982,
383:44-68); células MCR 5 and células FS4. Preferiblemente, las células huésped Son células
HEK-293T. En otra forma de realización preferida, dicha célula es una célul a dendrítica.
15
5. Composiciones inmunogénicas y liSOS terapéuticos de las mismas
Las partículas ví ricas de VIH-l , genomas víricos de VIH -l , vectores o células de la
invención también se pueden usar para preparar una composición inmunogénica. Por tanto,
20
otro aspecto de la presente invención es una composición inmunogénica O una vacuna que
comprende una partícula vírica de VIH-l , un genoma vírico de VIH-I , un vector o una célula
según la invención.
Los ténninos "partícula vírica de VIH-l", "genoma vírico de VIH-I ", "vector" y
"célula" se han definido en el contexto de los aspectos previos de la invención. El término
25
"célula" se refiere a células obtenibles por el primer método de la invención y también a
células obtenibles por el segundo método de la invención.
En un aspecto adicional, la in vención se refiere a un genoma vírico de VIH-I , un
vector, una célula o una composición inmunogénica o vacuna según la invención para su uso
en medicina. La composición inrnunogéni ca o vacuna de la invención contiene al menos un
30
soporte farmacéutic amente aceptable.
El soporte puede contener agentes adicionales tales como agentes humectan tes o
emuls ionantes, agentes reguladores del pH o adyuvantes para aumentar la eficacia de la
formulación. Los adyuvantes utilizables pueden aumentar la respuesta inmunológica
activando células presentadoras de antígeno (CPA), macrófagos o estimulando conjuntos específicos de linfocitos.
Un adyuvante según la presente invención puede ser cualquier ligando adecuado para la activación de un receptor de reconocimiento de patógenos (PRR) expresado en y sobre células dendríticas (CO), células T, células B u otras células presentadoras de antígeno. Los ligando que activan la ruta del receptor del dominio de oligomerización de unión a nuc1eótidos (NOO) pueden ser adecuados para el fin de la invención. Los adyuvantes adecuados para estos ligandos pueden ser derivados de muramil dipéptido. También se pueden citar ligandos que activan los receptores de tipo tol (TLR) para el fin de la invención. Esos receptores son miembros de la familia PRR y se expresan ampliamente en una variedad de células inmunes innatas, incluyendo CO, macrófagos, células cebadas y neutrófilos.
Los adyuvantes también se podrían seleccionar, por ejemplo, del grupo que incluye AIK(SO,h, AINa(S04h, AINH4(S04), sílice, alumbre, AI(OHh, Ca,(P04)" caolin, carbono, hidróxido de aluminio, muramil dipéptidos, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-nonnuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado norMOP), N-acetilmuramil-L-alanil-0-isoglutaminil-L-alanina-2-( )'21-dipalmitoil-sn-glicero-3hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominado MTP-PE), RISI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión al 2 por ciento de escualeno/TWEEN® 80, lipopolisacáridos y sus varios derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FeA), adyuvante incompleto de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AV), cera O de Mycobacterillll1 tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterillln parvum, Bordetella pertllssis, y miembros del género Brucella, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN, derivados de Lípido A, derivados de la toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, derivados de MPL, matrices de péptidos sintéticos o GMDP, interleuquina 1, interleuquina 2, Montanide ISA-51 y QS-21, oligonucleótido CpG, poli I:C, e IL-12, IL-15 o GM-CSF. Véase, Hunter R, US 5.554.372 y lager E, Knuth A, WO 19970288 16.
Para composiciones farmacéuticas que comprenden un agente que es una molécula de ácido nuc1eico, la molécula de ácido nuc1eico puede estar presente en un número de sistemas de distribución conocidos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácidos nuc1eicos, bacterianos, víricos y de mamíferos tales como, por ejemplo, construcciones de expresión recombinantes como se proporcionan en el presente documento. Las técnicas para incorporar ADN en tales sistemas de expresión se han divulgado previamente. Véase, Ulmer J, et al.,
Science 1993; 259:1745-1749 y Cohen J, Science 1993; 259:1691-1692. El ADN también puede estar "desnudo". La captación de ADN desnudo puede aumentar recubriendo el ADN en bolas biodegradables, que se transportan de forma eficaz a las células. Las moléculas de ácido nucleico se pueden administrar a células por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, Akhtar S, el al., Trends Cell Biol. 1992;
2:139-144, Maurer N, el al. , Mol. Membr. Biol. 1999; 16: 129-140, Selbo P, el al. , [nI. 1. Cancer 2000; 87:853-859, Selbo P, el al., Tumour Biol. 2002; 23: 103-112, Sullivan S, el al. , W01994002595, Hoffman A, el al. , US 200 10007666, MacLachlan 1, US 20030077829, y Beigelman L, el al., US 6.395.713. Estos métodos de administración incluyen, pero no están limitados a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis, O por incorporación en otros vehículos (por ejemplo, polímeros biodegradables, hidroge\es, ciclodextrinas, microesferas de ácido poli(láctico-co-glicólico (PLGA) y PLCA, nanocápsulas biodegradables, microesferas bioadhesivas, vectores proteinaceos). Véase, González H, el al., Bioconjug. Chem. ] 999; 10:1068-1074, Castor T, US 20020130430, O'Hare P, el al., WO 2000053722, Wang L, W02003046185, Wang L, el al. , W020030475 18, y Vook N, el al. , US 6.447.796. En otra forma de realización, las moléculas de ácido nucleico también se pueden formular o acomplejar con polietilenimina y derivados de la misma, tal como derivados de polietilenimina-polietilenglicol-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) O polietileniminapolietilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (pEI-PEG-triGAL). Véase, MacLachlan 1, US 20030077829.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un genoma vírico de VIH-I , un vector, una célula o una composición inmunogénica o vacuna según la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por VIH-I o una enfennedad asociada con una infección por VIH. De forma alternativa, la invención se refiere a un genoma vírico de VIH-I , un vector, una célula o una composición inmunogénica o vacuna según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección por VIH o una enfermedad asociada con una infección por VIH-I. De forma alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención en un sujeto de una infección por V1H-1 o una enfermedad asociada con una infección por VIH que comprende la administración a dicho sujeto de un genoma vírico de VIH-l, un vector, una célula o una composición inmunogénica O vacuna según la invención.
El tratamiento beneficioso o efectos preventivos de una composición inmunogénica de VIH-l respecto a la infección por VIH-l o síntomas de SIDA incluye, por ejemplo, prevenir o
retrasar la infección ini cial de un individuo expuesto a VIH-l; reducir la carga vírica en un
individuo infectado con VIH; prolongar la fase asintomática de la infección por VLH ;
mantener cargas víricas bajas en pacientes infectados con VIH cuyos ni veles de vinls han
disminuido mediante terapia antirretroviral (ART); aumentar los niveles de células T CD4 o
5
mitigar la disminución en células T CD4, tanto específicas como no específicas de VIH-I , en
pacientes sin tratamiento farmaco lógico y en pacientes tratados con ART, aumentar la salud
global o calidad de vida en un individuo con SIDA; y prolongar la esperanza de vida de un
individuo con SIDA. Un médico puede comparar el efecto de la inmunización con el estado
del paciente antes del tratamiento, o con el estado esperado de un paciente sin tratar, para
lO
determinar si el tratamiento es eficaz en inhibir el SIDA. En una forma de realización
preferida, las composiciones inmunogénicas de la invención son composiciones preventivas.
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser útiles en el tratamiento
de una infección por VIH-1. Mientras que todos los animales que puedan estar afectados co n
VIH-l o sus equivalentes se pueden tratar de esta manera (por ejemplo, chimpancés, macacos,
15
babuinos o seres humanos), las composiciones inmunogénicas de la invención se dirigen
particularmente a sus usos terapéuticos en seres humanos. Con frecuencia, se puede requerir
más de una administración para producir el efecto terapéutico deseado ; el protocolo exacto
(dosis y frecuencia) se puede establecer por procedimientos clínicos estándar.
La presente invención se refiere además a prevenir o reducir síntomas asociados con
20
infección por VIH . Estos incluyen síntomas asociados con la fa se sintomática secundaria de la
infección por VIH, incluyendo, por ejemplo, culebri ll a, erupción cutánea e infección de la
uñas, llagas en la boca, infección recurrente en nariz y garganta y pérdida de peso. Además,
síntomas adicionales asociados con la fase sintomática principal de la infección por VIH
incluyen, por ejemplo, candidiasis oral y vaginal (Cal1dida), diarrea persistente, pérdida de
25
peso, tos persistente y tuberculosis react ivada o infecc iones de herpes recurrentes, tal como
calenturas (he/pes simplex). Otros sí ntomas del SIDA compl eto que se pueden tratar con la
presente invención incluyen, por ejemplo, diarrea, nausea y vó mitos, candidiasis y llagas
bucales, infecciones vaginales persistentes, recurrentes y cáncer cervical, Iinfoadenopatía
generalizada persistente (pGL), infecciones graves de la piel, verrugas y tiña, infecciones
30
respiratorias, neumonía, especialmente neumonía por Pneumocysfis caril1ii (pep), herpes
zos/el' (o culebrilla), problemas del sistema nervioso, tales como dolores, entumecimiento u
hormigueo en manos y pies, anormalidades neurológicas, sa rcoma de Kaposi, linfoma,
tuberculosis u otras infecciones oportunistas similares.
41
En una forma de realización preferida, las composiciones inmunogénicas O vacunas según la invención se administran al sujeto del que se aislaron la partícula vírica o células dendríticas. Por tanto, en una forma de realización preferida, el sujeto que se va a tratar es el mismo sujeto del que aisló la partícula vírica de VIH-I.
En otra forma de realización preferida, el sujeto al que se adm inistra la composición inmunogénica o vacuna está en terapia antirretroviral (ART), preferiblemente en terapia antirretroviral altamente activa (HAART).
Todas las publicaciones mencionadas anteriormente en el presente documento se incorporan al mismo en su totalidad mediante referencia.
Mientras que la invención anterior se ha descrito en algún deta lle para fines de claridad y entendimiento, el experto en la materia apreciará de una lectura de esta divulgación que se pueden hacer varios cambios en forma y detalle sin separase del verdadero ámb ito de la invención y reivindicaciones adjuntas.
A. Procedimientos generales
l. Cultivos ce/ulares
Las células de sangre periférica de donantes seronegativos de VTH-I fueron proporcionados por el Banc de Sang i de Teixits (BST, Hospital Universitario Germans Trias i Pujol, Badalona, ES) o compradas (EFS, Etablissement Franyais du Sang, Pitié-Salpetriere Hospital, Paris, FR). Las cél ulas mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron de una centrifugación en gradiente de densidad en Fico Ll estándar. Las poblaciones de monocitos purificados se aislaron con bolas magnéticas con selección CDI4+(Miltenyi Siotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE) y se cultivaron con RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 10% (lnvitrogen Corp., Carslbad, CA, EE UU), 1000 Ufml de GM-CSF e lL-4 (R&D) durante 5 días. El medio de cultivo que contenía GM-CSF e IL-4 se cambió los días 2 y 5 de diferenciación de células dendríticas (CO). El día 5 las CO se maduraron añadiendo: i) 100 ng/ml de LPS (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, EE 00) o ii) lL-I~ 300 Ufml, lL-61000 Ufml, TNF-a 1000 Ufml (CellGenix GmbH, Freiburg, DE) y PGE, I~g/ml (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, EE UU) (en adelante denominado "ITlP"). Se determinó el inmunofenotipo de monocitos después del aislamiento de PBMC, CO inmaduras derivadas de monocitos (COi) y CO derivadas de monocitos completamente maduras (CDm) el día 7
mediante citometría de flujo (citómetro de flujo FACSCalibur; SO Siosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU). Los anticuerpos monoclonales (Acm) usados en la determinación del inmunofenotipo celular fueron: CDI4-FITC y -PE (c1on MSE2, Pharmingen, SO Siosciences Co rp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), CD209-PE y -APC (clon 5 DCN46, Pharmingen, SD Siosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), CD4-PerCP (clon SK3, BO Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), HLA-OR-PE y -PerCP (clon L243, BO Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), HLA-Clase I-FlTC (clon W6/32, (Sigma-Aldrich Co., Sain! Louis, MO, EE UU), C086-FITC (clon 2331, Pharmingen, BO Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), C083-PE y -APC (ciD n HBI 5e,
10 Phanningen, BO Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU), y CD80-PE-Cy5 (clon L307.4, Phanningen, SD Siosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU).
Se mantuvieron las líneas celulares TZM-bl (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Bethesda, MD, EE UU y Tranzyme, Inc., Ourham, NC, EE UU) y HEK-293T en medio de Eagle modificado por Oulbecco (DMEM) (lnvitrogen Corp.,
15 Carslbad, CA, EE UU) suplementado con suero bovino fetal al 10%. TMZ-bl es una línea celular HeLa genéticamente manipulada que expresa CD4, CXCR4 y CCR5 y contiene genes indicadores de luciferasa inducible por Tat y p-Gal. Véase, Wei X, el al. , Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46(6): 1896-1905. Todos los medios contenían 100 U/mi de penicilina y I 00 ~g!ml de estreptomicina (Invítrogen Corp., Carslbad, CA, EE UU).
2. Clones de células T específicos de VIH
Los clones de células T CD4+ N2 y FI2 específicos para p24gag de VIH (aa 271-290) y restringidos por HLA-DRp*04 O HLA-OR~*OI respectivamente, se usaron para seguir la 25 presentación de antígenos de HLA-II. Los clones de células T CD8+ EM40-F21 y SL9-2 específicos para p 17gag de VIH (aa 77-85, péptido SL9) y restringidos por HLA-A2 se usaron para seguir la presentación de antígenos de HLA-1. Los clones de células T se reestimularon y expandieron como se ha descrito previamente usando alimentadores irradiados y líneas celulares linfoblastoides autólogas (LCL) cargadas con péptidos análogos en medio de 30 clonación de células T (RPM I 1640 que contenía Suero AS (SAS) al 5%, rhlL-2 100 U/mi y fitohemaglutinina (PHA) 1 Ilglml (PAA) complementado con aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio (Gibco, lnvitrogen Corp., Carslbad, CA, EE UU). Al menos 4 horas antes de los cocultivos con CD, los clones de células T se descongelaron y se dejaron reposar en
medio de clonación sin PHA. Véase, Moris A, el al. , Blood 2004; 103(7):2648-2654 y Moris
A, el al. , Blood 2006; 108(5): 1643-1651.
3. Soluciones madre víricas y plasmidos
5
Se generaron so luciones madre de VIH-I CXCR4-trópico de longitud completa y
competente para replicación (V1HNL4•3) y VIH-I CXCR4-trópico deficiente en integrasa
(VIHNU.3AIN) transfectando la construcción provírica pNL4-3 (N IH AJOS Research and
Reference Reagent Program, NIH, Bethesda, MO, US) y pNL4-3~IN con fosfato de calcio
lO
(CalPhos; BD Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE UU) en células HEK-293T. El
vector provírico pNL4-3 se manipuló para generar el vector Vlli-I CXCR4-trópico deficiente
en integrasa pNL4-3L1lN (SEQ ID NO: I). Tanto pNL4-3 como pNL4-3L1lN se modificaron
para expresar el epitopo óptimo (SLYNTVATL) (SEQ ID NO: 2) y de escape (SLENTlA VL)
(SEQ ID NO: 3) descritos para p l 7gag 77-85 (epítopo SL9) restringido por HLA-A2. Véase,
15
Llano A, el ar , How to optimally define oprimal cytotoxic t-Iymphocyte epitopes in HIV
infection? en Korber B, el al. , Eds. , "Theoretical Bio logy and Biophysics" (Los ALamos
NationaL Laboratory, Los Alamos, Nuevo México, EE UU, 2009) e Iversen A, el al. , Nat.
ImmunoL 2006; 7: 179-189. Se recogieron sobrenadantes que contenían los virus 48 horas
después de la transfección, posteriormente se filtraron (Mi ll ex HV, 0,45 ¡.tm; Millipore Corp.,
20
Billerica, MA, EE UU), se concentraron usando el kit concentrador Lenti-X (Clontech Labs.,
Inc. , Mountain View, CA, EE UU) y se congelaron a -80°C hasta su uso.
Para el ensayo de fusión vírica, se produjeron viriones de VIH-l que contenían la
quimera p-Iactamasa-Vpr (BlaM-Vpr) como se ha descrito previamente. Véase, Cavrois M, el
al. , Nat. Biotechno L. 2002; 20: 1151 -1154. Brevemente, se cotransfectaron células HEK-293T
25
con 60 ~g de ADN provirico pNL4-3 o pNL4-3L1lN, 20 ~g de pCMV-B laM-Vpr (Addgene
Inc. , Cambridge, MA, EE UU) Y 10)lg de vectores pAdVAntage (Promega Corp., Madison,
WI, EE UU). Se recogieron sobrenadantes que contenían los virus 48 horas después, se
filtraron (Mill ex HV, 0,45 ¡.tm; Mi ll ipore Corp., Billerica, MA, EE UU), ultracentrifugaron a
72.000 g durante 90 minutos a 4°C y se congelaron a -80°C hasta su uso. El contenido en
30
p24Gag de todas las so luciones madre de virus se determinó mediante un ensayo ELISA
(PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE UU). Se detenninaron los títulos de todos los virus
usando la línea celular indicadora TZM-bl. Véase, Li M, elat., J. Virol. 2005; 79(16): 10 108
10125. Se ensayó la actividad luciferasa de las células 48 horas después de la infección (Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo, Promega Corp., Madison, WI, EE UU) en un luminómetro Fluoroskan Ascent FL (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE UU).
5 4. Ensayo de jilsión vírica
El ensayo de fusión vírica se realizó como se ha descrito previamente. Véase, Li, 2005, anteriormente. Brevemente, se infectaron 5 x 105 células T Jurkat con 400 ng de p24Gag de HIVNL4_3 o HIVNL4_3t.lN que contenían BlaM-Vpr durante 4 horas (inoculación centrífuga a
10 6000 g durante 90 minutos a 22°C e incubación durante 2,5 horas a 37°C y CO2 al 5%) en presencia o ausencia de inhibidor de fusión C34 5 Ilg/ml (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH, Bethesda, MD, EE 00). Las células se lavaron después en medio independiente de C02 (Gibco, lnvitrogen Corp. , Carslbad, CA, EE UU) para eliminar viriones libres y se cargaron con colorante CCF2-AM I mM (lnvitrogen Corp., Carslbad, CA, EE UU)
15 durante 1 hora a temperatura ambiente como recomienda el fabricante. Después de dos lavados con medio de revelado (medio independiente de CO2 suplementado con SBF al 10%), se dejo seguir el corte de BlaM de la reacción de CCF2 en la oscuridad durante 16 horas a temperatura ambiente en 200 111 de medio de revelado. Por último, las células se lavaron con PBS y se fijaron en una solución de paraformaldehído al 1,2%. La degradación de CCF2-AM
20 por corte de BlaM y su cambio en la fluorescencia de emisión se midió por citometría de flujo usando un SO LSR 11 (BD Siosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE 00). Los datos se recogieron con el software F ACSDiva (BO Biosciences Corp., Franklin Lakes, NJ, EE 00) Y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star lnc., Ashland, OR, EE 00).
25 5. Captura vírica por células del1dríticas y ensayos de tral1sil1!ección
Se incubaron un total de 2,5 x 105 COi y COm maduradas durante 48 horas con !TIP
(COm !TIP) o con LPS (CDm LPS) de al menos 7 donantes diferentes a 3rC durante 6 horas p24Gag
con 50 ng de de HIVN1A_3 o HIVNJA_3t.JN a una concentración final de l x 106
30 células/mI. Durante el pulso vi rico, una parte de las CDi se maduraron con ITIP (CDi+ITIP) y otra con LPS (COi+LPS). Después de la incubación, las células se lavaron extensamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar las partículas víricas no capturadas, y se lisaron con Triton X-lOO al 0,5% a una concentración final de 5 x 106
células/mI. Los lisados se clarificaron de restos ce lulares por centrifugación para medir el contenido de antígeno p24Gag intracelular mediante un ensayo ELlSA (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE UU) como se ha descrito previamente. Véase Izquierdo-Useros N, el al., J. Virol. 2007; 81 :7559-7570. Antes de la lisis, se cocultivaron 104 CO pulsadas con VIH-I con la línea celular indicadora TZM-bl a una relación 1: 1 por pocillo en una placa de 96 pocillos, en un volumen final de 100111. Se ensayó la actividad luciferasa de las células después de 48 horas de cocultivo (Sistema de ensayo de luciferasa Brighty-Glo, Promega Corp., Madison, WI, EE HU) en un luminómetro Fluoroskan Ascent FL (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE UU). Se sustrajeron valores de fondo que consistían en cocultivo de CO no expuestas a VIH-TZM-bl para cada condición celular.
6. Ensayo de presentación de antígenos
Para los experimentos de presentación antígenos de HLA-I, se usaron PBMC de donantes HLA-A2+ para generar CO. COi o COm maduradas durante 48 horas con ITIP (CDm ITIP) o con LPS (CDm LPS) se expusieron durante 24 horas a los virus indicados (500 ng de p24Gag/ml por I x 106 células) a 37°C y C02 a15% en medio de cultivo con IL-4, GMCSF, azidotimidina (AZT) 5 ~M Y nevirapina (NVP) 1,2 ~M (Sigma-Aldrich Co., Sain! Louis, MO, EE 00). De forma alternativa, se cargaron COi con V1H como antes y se maduraron simultáneamente con ITlP (COi+ITIP) O con LPS (COi+LPS). Las células se lavaron después extensamente con PBS para eliminar virus sin capturar y se cocultivaron durante 16-18 horas con clones de LTC EM40-F21 o SL9-2. La activación de cél ulas T se siguió usando un ensayo ELlSPOT de IFNy como se ha descrito previamente. Véase, Moris, 2004, anteriomlente. Como control positivo, se cargaron CO con O, I Ilglml de péptido análogo en las mismas condiciones que las células pulsadas con VIH con activación óptima y lavado extenso antes de cocultivar con células 1. Se restaron valores de control negativo que consistía en cocultivo de CO no expuestas a VIH-clones de células T CD8+.
Para los experimentos de presentación de antígeno de HLA-II, se usaron PBMC de donantes HLA-DRp*04 o HLA-DRp*O I para generar CD. CDi o CDm maduradas durante 48 horas con ITIP (CDm ITIP) O con LPS (CDm LPS) se expusieron durante 6 horas a los virus indicados (285 ng de p24Gag/ml por 1 x 106 células) a 3rC y CO2 al 5% en medio de cultivo con AZT 5 ~M Y NVP 1,2 ~M (Sigma-Aldrich Co., Saint Louis, MO, EE U1J). A continuación, las células se lavaron extensamente con PBS para eliminar virus sin capturar y
se cultivaron durante la noche con IL-4, GM-CSF, AZT y NV P. De forma alternativa, se
cargaron CO i con VIH co mo antes y se maduraron simultáneamente con ITIP (COi+ITIP) o
con LPS (CDi+LPS). A continuación, las células se lavaron con PBS y se cocult ivaron
durante 16-18 horas con clones de células T C04+ N2 o F12. La act ivación de cé lulas T se
5
siguió usa ndo un ensayo ELlSPOT de IFNy. Co mo control positivo, se cargaron CD con 0,1
¡.t g/ml de péptido análogo en las mismas cond iciones que las cé lulas pul sadas con V1H con
activación óptima. Se restaron valores de control negativo que consistía en cocultivo de CD
no expuestas a VIH-clones de cé lulas T C04+.
l O
7. Microscopía eleclrónica y análisis esladíslico
Para el análisis po r microscopía electrónica de la captura vír ica por CD, las cé lulas se
procesaron como se ha descrito previamente. Véase lzquierdo-Useros, 2007, anteri orme nte.
Breve mente, se pu lsaron 3 x 106 Com LPS a 3rC durante la noche con 1.600 ng de p24Gag
15
de HJVN L4 _3 o HIVN L4_3AIN . Después, las cé lulas se lavaron extensamente con PBS y se fijaron
en glutara ldehído al 2,5% durante 1 hora. A continuación, las células se procesaron para
aná lisis de secciones ultrafinas usando un microscopio electrónico Jeol JEM 1010 (Jeol Ltd. ,
Tokio , IP). Todos lo s análisis estadísticos se realizaron usando el software de GraphPad
Pri sm v.5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE UU).
20
B. Ejemplos
Ejemplo ¡
Maduración de eDy captura de V/H-/
25
Se obtuvieron CD co mpl etamente maduras cult ivando CD inmaduras (CDi) con ITIP
(CDm ITIP) o LPS (CDm LPS) durante 48 horas. Después, se incubaron CD i y CD
completamente maduras con HI VNL4 _3 o HIVN L4_3t..IN durante 6 horas. Después de un lavado
extenso, parte de las células se li saron y se deternúnó el VIH-l asociado con CD. Las célul as
30
restantes se cocultivaron con la línea indicadora TZM-bl para ensayar la tran sinfección
mediada por CD. La maduración de CO con LPS (CDm LPS) aumentó la captura de VIHI
comparada con COi (>5 veces, P=0,0039, prueba de Wilcoxon para datos emparejados) y
produjo una mayor tran sinfecc ió n de HIVNL4 _3 a célul as diana (>7 veces, P=0,0 156). El
47
HIVNL4_3L\IN fue capturado con la misma eficacia que el HIVNL4.3 salvaje por CO (P=NS, prueba de Wilcoxon para datos emparejados). Véase, la figura l. Inesperadamente, la maduración de CD con ITIP (CDm ITIP) ni aumentó la captación ni la transmisión de HIVNJA_3 y permaneció a niveles similares que las COi. Los marcadores fenotípicos de maduración y diferenciación entre COm LPS y COm ITIP no divergieron. Véanse las figuras
3 Y 4.
Posteriormente, las capacidades de captación y transinfección de CD maduradas con LPS (CDi+LPS) O con ITlP (CDi+lTlP) durante la captura vírica se compararon con CD completamente maduras antes de la incubación con HJV -1. El objetivo de esta comparación era evaluar si la maduración de las CD durante la carga del antígeno tenía influencia en la captura vírica y posterior transmisión de VIH-l a células susceptibles. Véase, Ahlers J, el al. , Trends Mol. Med. 2009; 15:263-274 y Palueka K, el a/., Immunity 20 10; 33:464-478. Sorprendentemente, no solo las CDi+ITlP, sino también las CDi+LPS, mostraron malas capacidades de captura y transmisión relativas a CDi. Véase la figura l. La maduración de CO con LPS durante el pulso vírico (CDi+LPS) no aumentó la captura de VIH-I a los niveles observados en CDm LPS. Por tanto, las CO completamente maduradas con LPS (COm LPS) mantuvieron la mayor capacidad de capturar y transmitir VIH-I a células susceptibles. Estos resultados muestran que la captura y transmisión de VIH-l mediadas por eo depende no solo en el estado de maduración de las CD, sino también de los estímulos de activación usados para la maduración, así como del intervalo de tiempo entre la maduración de CO y la carga de antígeno. Véase, Izquierdo-Use ros, 2007, anteriormente y Sanders R, el al. , J. Viro\. 2002; 76:7812-7821.
En todos los subconjuntos de células, la captura vírica se correlaciona con la transinfección vírica de HIVNL4.3 a células diana, con mayor capacidad de CDm LPS (P=O,01 56, prueba de Wilcoxon para datos emparejados). La transinfección de HIVNL4.3óIN se abrogó por completo en todas las condiciones celulares (P=O,O 156, prueba de Wilcoxon para datos emparejados).
Por otra parte, HIVNL4.311IN fue capturado por CD con la misma eficacia que HJVNL4.3 competente en replicación. Véase la figura 1. Posteriormente, se analizó la conservación de la integridad y funcionalidad de la envuelta de HJVNL4.311IN. Mediante ensayos de fusión vírica, se demostró que HIVNlA_3óIN era tan fusogénico como el HIVNL4.3 salvaje e igualmente susceptible al inhibidor de fusión C34, incluso aunque faltara su región codificante de integrasa entera. Véase la figura 5A; Cavrois, 2002, anteriormente.
Además, para evaluar si el HIVNL4.3MN seguía el mismo transporte intracelular que el HIVNU.3 salvaje en CO, se siguieron ambas partículas víricas en paralelo por microscopía electrónica en CDm LPS. Los viriones HrvNL4.3 y HrvNL4.3óIN mostraron una estructura idéntica, con un núcleo denso a los electrones característico y acumulación similar en
5 compartimentos intracelulares. Véanse las figuras 5A y 58. Estos descubrimientos indican que la falta de integrasa en HIVNL4_3óIN no altera la fusogenicidad y morfología vírica y que HIVNL4.3óIN se comporta como el virus salvaje para todos los fines prácticos, a pesar de no ser infeccioso.
10 Ejemplo 2 Cap/ura vírica y actividad de células T
Se evaluó la capacidad de CDi, CDm ITlP, CDm LPS, CDi+ITIP y CDi+LPS para presentar antígenos derivados de VIH-I a células T C04+ y C08+ para elucidar, si había 15 alguna, la correlación entre presentación de antígenos y activación de células T a captura vírica. Para este fin se utilizaron varios clones de células T específicos de VIH previamente generados. Para seguir la presentación de antígeno de VIH-I HLA-I, se usaron dos clones diferentes de células T CD8+ EM40-F21 y SL9-2 especificos para p17G" (aa 77-85) de VIH1 y restringidos por HLA-A *02. Véase, Moris, 2004, anterionnente. Como el HIVN1A.3 20 salvaje y su HI VNL4.3óIN derivado no presentaban el epítopo SL9 consenso restringido por HLA-A *02, HJVNL4_3 y HJVNL4_3óIN se manipularon para expresar la secuencia SL9 óptima (SLYNTVATL) (SEQ ID NO: 2) o la variante de escape (SLENTlAVL) (SEQ ID NO: 3) del epítopo SL9. Véase, Llano, 2009 e Iversen, 2006, anterionnente. Se usaron dos clones de células T CD4+ N2 y F12 especí ficos para p24Gag (aa 271-290) de VIH-l y restringidos por 25 HLA-OR~*04 O HLA-OR~*O I , respectivamente, para evaluar la presentación de antígeno de HLA-II. Véase, Morís, 2005, anteríonnente. Se expusieron CO con HLA coincidentes para cada clon de células T específico de VIH-I durante 24 horas (ensayos de HLA-I) o 6 horas (ensayos de HLA-Tl) a HJVNL4_3 o HJVNL4_3óIN. La activación de células T se siguió usando ELlSPOT de IFNy después del cocultivo durante la noche de CD pulsadas con VIH con
30 clones de células T específicos de VIH. Véase la figura 2. Todos los ensayos se realizaron en presencia de NVP y AZT para prevenir la replicación vírica y garantizar que la activación de los clones de células T C04+ y C08+ específicos de VIl-I no era debido a la presentación de síntesis vírica de l/OVO en CO.
Las COm LPS cargadas con HIVNL4 _3 O HIVNL4+ 3L\JN no aumentaron la activación de células T C08+ específicas de VIH comparada con COi. Véase la figura 2. Esto estaba en contraste con la captura vírica extremadamente alta y expresión de moléculas de HLA observada con CDm LPS. Véanse las figuras 1, 3A Y 3C. Por tanto, la captura vírica
5 aumentada no se correlaciona con mejor activación de células T.
Inducir la maduración de CO co mpleta con ITlP tuvo un efecto moderado, si alguno, sobre la activación de LTC específicos de vn-I. Véase la figura 2_ Se ha mostrado previamente que la presentación de antígeno de VIH exógeno restringido por HLA-I requiere fusión de las membranas vírica y celular de una manera dependiente de CD4/correceptor y la
10 liberación de la cápside VIH-I Gag en el citosol de las CO para procesamiento por proteasomas y carga de HLA-1. Véase, Buseyne F, el al. , Na!. Med. 200 1; 7:344-349 y Sabado R, el al., Eur. 1. ImmunoL 2007; 37: 1752-1763. Sin embargo, la maduración de CD se asocia con una caída en la fusión de VIH-I , que, a su vez, tiene un impacto directo en la capacidad de CO maduras de apoyar la replicación vírica. Véase, Cavrois, 2002, anteriormente, y Oong C, el
15 al. , J. Viro\. 2007; 8 1: 11352-11362. Esto puede expli car por qué las CD maduradas con LPS O ITIP que muestran niveles altos de HLA-I y moléculas coestimuladoras indujeron una estimulación baja de clones de células T C08+ específicos de VIH.
A pesar de su alta capacidad de captura vírica, las CDm LPS no aumentaron la activación de C04+ específicas de VD-I cargadas con HIVNIA_3 o HIVNIA-JL\IN (establecido en 20 la figura lA).
De forma interesante, comparadas con CDm ITlP o COm LPS, las COi indujeron un aumento de 3 veces en la activación de clones de células T C D4+ específicas de VIH, lo que está en contraste con su expresión reducida de moléculas de HLA-II y coestimuladoras y su mala capacidad de capturar viriones VIH-1. Véanse las figuras 1,2,38 y 3D. Estos resultados
25 sugieren fuertemente que la captura de VD-I-I por CDm LPS no dirige viriones de V1H hacia compartimentos de degradación y carga de HLA .
Ejemplo 3 Maduración de CD con LPS durante la captura vírica y preseJ1lación de antígenos de HLA-Iy HLA -II
A continuación se examinó el efecto de la maduración de COi durante la carga de V1H1 en la presentación de antígenos por moléculas de HLA-I y HLA-II. Para los ensayos de
presentación de antígenos de HLA-I, las COi se maduraron con ITlP O LPS (COi+ITlP y COi+LPS, respectivamente) y simultáneamente se pulsaron con HIVNL4_3 O HIVNL4_3AIN que expresaban la variante óptima (SL YNTVATL) (SEO ID NO: 2) o de escape (SLENTlAVL) (SEO ID NO: 3) del epitopo SL9 durante 24 horas. Véase, Llano, 2009 e Iversen, 2006, 5 anteriormente. Para los experimentos de HLA-II, las COi se incubaron con HIVNL4.3 O HIVNL4_3AIN durante 6 horas y después se maduraron con ITIP o LPS (COi+ITIP y CDi+LPS, respectivamente). Después de cocultivar durante la noche CO pulsadas con VIH con clones de células T específicos para VIH, la presentación de antígeno se cuantificó por ELlSPOT de IFNy. Véase la figura 2. Todos Los ensayos se realizaron en presencia de NVP y AZT para
10 asegurar que los antígenos no derivan de proteínas de VIH sintetizadas de nuevo.
Se usó el clon de células T C0 8· SL9 pl7G" VIH EM40-F21 (aa 77-85) restringido por HLA-A2 para el análisis de presentación de antígenos de HLA-I exógenos. Se uso el clon de células T C04· p24G ,g VIH N2 (aa 271-290) restringido por HLA-ORP*04 para evaluar la presentación de antígenos de HLA-II.
15 En contraste con CDm ITIP y CDm LPS, las CDi+ITIP y CDi+LPS cargadas con VIH indujeron una activación mayor de células T COS+ específicas de VIH que las COi. Véase la figura 2. Tanto HIVNL4_3 como HIVNL4_3AIN fueron igualmente presentados de forma cruzada a células T CDS+ específicas de VIH. Se observaron diferencias minoritarias en la presentación de antígeno de HLA-I entre CO que maduran con LPS e ITIP, aunque las CDi+LPS
20 representaron un aumento de >3 veces en la secreción de IFNy e ITIP un cambio de > 1,5 veces comparadas con sus homólogas completamente maduras (CDm LPS y CDm ITIP, respectivamente). Es digno de mencionar que ni la captura vírica aumentada ni la expresión de moléculas de HLA-I se correlacionaron con mejor activación de T CDS+. Véanse la figura 3A y 3C. Co mo se esperaba, tanto HIVNL4_3 como HIVNIA-3óIN que expresaban la variante de
25 escape (SLENTlAVL) (SEO ID NO: 3) del epitopo SL9 no indujeron respuestas en el clon de células T COS+ EM40-F21 en ninguna condición de CO. Véase la figura 6. Como se ha establecido previamente, la maduración de CD restringe la fusión de membranas vírica y celular, pero la fusión de VJH es crucial para el procesamiento proteosómico citosólico de las proteínas Gag y la presentación adecuada de antígenos de HLA-I. Véase Buseyne, 2001,
30 Cavrois, 2002 y Sabado, 2007, anteriormente. Aunque las C Oi capturan cantidades menores de viriones, VIH-I es más capaz de fusionarse. Esta propiedad podría ser útil para aumentar la captación de antígeno y la presentación de antígenos de HLA-I de péptidos derivados de VIH.
Comparada con COm LPS y COm ITIP, la maduración con LPS de COi después del pulso vírico (COi+LPS) sustancialmente aumentó la activación de las células T C04+ específicas de VIH. Véase la figura 2. Una vez más, la capacidad de activar clones de células T C04+ específicos de VIH no se correlacionaba con la capacidad de capturar VIH y los
5 niveles de expresión de HLA-II. Véanse las figuras l y 3. Por otra parte, la maduración de COi con ITIP después (COi+ITIP), más que antes (COm ITl P), de la captación de antígeno, no mejoró la presentación de antígenos de HLA-Il. Véase la figura 2. Estos resultados subrayan que la maduración de CO antes o después de la carga de antígeno no garantiza que activación eficaz de células T C04+.
10 El tipo de activación (inducida por ITIP o LPS) también detennina la capacidad de procesar y presentar antígeno. Se ha descrito que la presencia de ligandos de TLR4 (tales como LPS) junto con la carga de antígeno en fagosomas fomenta la presentación de antígenos a células T C04+. Además, la maduración de CD con LPS facilita la proteólisis del antígeno y la formación eficaz de complejos péptido-HLA-II por acidificación de lisosomas. Véase,
15 Manickasingham S, el al. , J. lmmunol. 2000; 165:5027-5034, Blander J, el al. , Nature. 2006; 440:808-812 y Trombetta E, el al., Science 2003; 299: 1400-1403. De forma interesante, las CO cargadas con HJVNL4_311IN deficiente en integrasa indujeron una activación comparable a CO cargadas con HJVNL4_3 en clones de células T tanto C08+ como CD4+ específicos de VIH, lo que demuestra adicionalmente que no se necesita replicación vírica para la
20 presentación de antígenos derivados de VIH. HIVNIA_3ó[N representa un inmunógeno prometedor para el desarrollo de una vacuna contra VIH ya que se procesa y presenta por CO como el VIH salvaje.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    I.Un método para obtener una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno in vi/ro que comprende poner en contacto una célula dendrítica inmadura con un inmunógeno que comprende dicho antígeno en condiciones adecuadas para el procesamiento del inmunógeno y presentación por la célula presentadora de antígeno, en donde dicho método comprende además colocar la célula dendrítica inmadura en condiciones adecuadas para la maduración de dicha célula dendrítica inmadura a una célula dendrítica madura en donde el paso de maduración de la célula dendrítica inmadura se lleva a cabo simultáneamente con el paso de poner en contacto la célula dendrítica inmadura con un inmunógeno durante al menos parte de dicho paso de contacto.
  2. 2.EI método según la reivindicación I en donde las condiciones adecuadas para la maduración de la célula dendrítica inmadura a una célula dendrítica madura comprende la incubación de dicha célula en un medio que comprende un agente de maduración de células dendríticas seleccionado del grupo que consiste en:
    (i)
    un ligando de TLR4, en donde dicho ligando de TLR4 es LPS y
    (ii)
    una mezcla de citocinas proinflamatorias que comprende una mezcla
    de IL-l p, IL-6 Y TNF-a y, además, una prostaglandina.
  3. 3.
    El método según cualquiera de las reivindicaciones I o 2 en donde el inmunógeno es un inmunógeno de VIH.
  4. 4.
    El método según la reivindicación 3 en donde el inmunógeno de VIH es una partícula de V1H.
  5. 5.
    El método según la reivindicación 4 en donde la partícula vírica de VIH-l carece de una proteína integrasa funcional.
  6. 6.
    Una célula presentadora de antígeno cargada con antígeno obtenible por un método según cualquiera de las reivindicaciones l a 5.
  7. 7.
    Una composición inmunogénica o una vacuna que comprende una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 6.
  8. 8.
    Uso de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento
  9. 9.
    Uso de una célula presentadora de antígeno según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad que requiere una respuesta inmune contra el antígeno que está cargado en la célula presentadora de antígeno.
  10. 10.
    Un método según la reivindicación 5 en donde la célula dendrítica que se carga con la partícula vírica de Y1H-I se ha obtenido por maduración de una célula dendrítica inmadura usando un agonista de TLR4, en donde dicho agonista de TLR4 es LPS.
  11. 11.
    Una célula dendrítica cargada con una partícula vírica de VIH-l que carece de una proteína integrasa funcional obtenible por el método según de la reivindicación 10.
  12. 12.
    Una composición inmunogénica o una vacuna que comprende una célula dendrítica según la reivindicación 11 .
  13. 13.
    Uso de una célula dendrítica según la reivindicación 1I para la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de una infección por VIH O una enfermedad asociada con una infección por Vll-I.
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