ES2529187B1 - Procedimiento para producir fertilizantes ricos en aminoácidos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir fertilizantes ricos en aminoácidos.#La presente invención propone un procedimiento de hidrólisis enzimática de harina de sangre para obtener fertilizantes con alto contenido en aminoácidos libres y aporte de hierro hémico, susceptible de ser utilizado como abono orgánico, y con mejor solubilidad que el sustrato de partida, lo que permite su aplicación foliar.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

DESCRIPCION

Procedimiento para producir fertilizantes ricos en aminoacidos SECTOR DE LA TECNICA

La presente invention se enmarca en industria qulmica orientada a la agricultura, en concreto en la production de abonos o fertilizantes y tiene aplicacion en el sector ganadero como procedimiento para valorizar residuos contaminantes.

ESTADO DE LA TECNICA

Residuos procedentes de la qanaderia

Los mataderos, aparte de los residuos derivados del despiece del animal, generan un importante caudal de sangre, que constituye un efluente muy contaminante con una demanda biologica de oxlgeno (DBO5) entre 250.000 y 375.000 mg O2/L. En la actualidad se esta solucionando el vertido de las aguas procedentes del matadero, reutilizando este subproducto, deshidratando la sangre que una vez deshidratada y bajo la forma de harina constituye un concentrado de protelnas: hemoglobina, globulinas y albuminas.

Fertilizantes

Las plantas son capaces de sintetizar todos los aminoacidos necesarios para su crecimiento y funciones fisiologicas utilizando como fuente exclusiva de nitrogeno los nitratos y sales amonicas, absorbidas desde el suelo o directamente por via foliar, combinados con los carbohidratos obtenidos por via fotosintetica. Los nitratos y sales amonicas son los compuestos inorganicos nitrogenados mas comunes utilizados como nutrientes en agricultura.

La asimilacion de nitratos a traves de las ralces se lleva a cabo mediante dos etapas sucesivas donde en un principio los nitratos se reducen a nitritos y posteriormente a amonlaco bajo la action de las enzimas nitrato reductasa (E.C.1.6.6.1) y nitrito reductasa (E.C.1.6.6.4). Ambas estan presentes en los tejidos fotosinteticos y, en menor proportion, en las ralces. El amonlaco se combina posteriormente con los compuestos carbonatados para dar glutamina y acido glutamico. Ambos aminoacidos son la base de las rutas metabolicas mediante las que se sintetizan el resto de amino acidos necesarios para la planta.

Diversos estudios cientlficos demuestran que las plantas necesitan aumentar su contenido en aminoacidos libres bajo condiciones de estres hldrico, salinidad, pesticidas, olas de calor o quemaduras provocadas por herbicidas u otros agentes. Asl, por ejemplo, las plantas incrementan la produccion de metabolitos de bajo peso molecular que ajustan el equilibrio osmotico y previenen las perdidas de agua en condiciones de estres hldrico. Varias especies de plantas acumulan ciertos aminoacidos como la prolina, y los acidos aspartico y glutamico para aumentar su tolerancia frente a las altas temperaturas. Similarmente, la prolina y glicina han demostrado ejercer una accion protectora frente a las bajas temperaturas. Junto a su accion protectora frente a situaciones de estres para la planta, los aminoacidos juegan un papel relevante en varias funciones fisiologicas de la planta, como la fotoslntesis, la polinizacion y la absorcion y transporte de nutrientes.

El aporte directo de aminoacidos permite a la planta superar las situaciones de estres citadas anteriormente sin que esta tenga que recurrir al catabolismo de protelnas estructurales, con el perjuicio consiguiente para el crecimiento y productividad de la planta. El Triptofano, por ejemplo, es fundamental para el desarrollo geminal y radicular. Basado en las ventajas del aporte de aminoacidos para la planta, los primeros fertilizantes ricos en aminoacidos se desarrollaron a finales de los anos setenta.

Los fertilizantes organicos constituyen una via de aprovechamiento para los subproductos derivados de las industrias carnicas, mataderos o residuos de la actividad pesquera. Todas

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

estas actividades generan subproductos no destinadas a envasado, que constituyen una fuente importante para la obtencion de nitrogeno proteico para las plantas. La efectividad de los abonos organicos de este tipo ya ha sido comprobada por diversos estudios.

Entre estos fertilizantes organicos se encuentra la harina de sangre. Este subproducto se utiliza como fertilizante debido a su accion rapida y alto contenido nitroso.

Ademas tiene un alto contenido en protelna (80%, fundamentalmente hemoglobina), y aporta hierro hemico. Este ultimo, gracias a su efecto quelante, estabiliza los nutrientes del suelo mejorando su disponibilidad y absorcion por parte de la planta. No obstante, el uso directo de harina de sangre plantea problemas, dada la baja solubilidad de este sustrato. Esto dificulta la formulacion de disoluciones llquidas que la contengan (por ejemplo, productos fertilizantes de aplicacion foliar). A su baja solubilidad se le une el bajo contenido de aminoacidos libres, ya que la mayorla se encuentran formando parte de las protelnas.

Hidrolisis quimica y enzimatica

La obtencion de un producto rico en amino acidos libres a partir de residuos proteicos se puede llevar a cabo mediante hidrolisis quimica o enzimatica. Aunque la hidrolisis quimica puede dar lugar a un grado de hidrolisis elevado y por tanto un contenido importante en aminoacidos libres totales, estos se encuentran en un 50% p/p bajo la forma dextrogira, y no son por tanto biologicamente activos. Unido a este inconveniente, la hidrolisis quimica destruye aminoacidos necesarios para la planta como el triptofano, de importancia clave en el desarrollo radicular de la planta, y conlleva la generation de sales que se han de eliminar del producto final. Algunos autores [W.I. Chan, K.V. Lo, P.H. Liao, Solubilization of blood meal to be used as a liquid fertilizer, J. Environ. Sci. Health B 42 (2007) 417-422] han propuesto un tratamiento combinado con microondas y peroxido de hidrogeno para hidrolizar la harina de sangre y mejorar asl su solubilidad y contenido en amino acidos libres. Este tratamiento ataca eficazmente los enlaces peptldicos de la protelna, liberando peptidos y amino acidos libres, pero el hidrolizado final presenta una baja calidad nutricional, con fuerte desnaturalizacion de las protelnas y perdidas de nutrientes, unido a la presencia de sustancias toxicas en el producto final.

Todos estos inconvenientes se subsanarlan mediante la hidrolisis enzimatica, en la que todos los aminoacidos generados lo estan bajo la forma levogira. Los aminoacidos levogiros son biologicamente activos puesto que son asimilados por la planta y reconocidos por el sistema enzimatico de la misma, entrando a formar parte de las rutas metabolicas.

Procedimientos de hidrolisis para el aprovechamiento de residuos

Existen procedimientos patentados que reivindican la hidrolisis enzimatica como via para solubilizar residuos industriales de origen vegetal (ES 2 173 036, US 20030165612) tales como tortas desengrasadas de la molturacion de semillas o residuos de las industrias de fermentation. El proceso de solubilization enzimatica emplea endoproteasas para obtener una fase llquida donde se ha solubilizado el 60 - 80% en peso de la protelna de partida. Entre las aplicaciones propuestas para estos hidrolizados se encuentran los fertilizantes organicos solubles.

Un procedimiento similar, recogido en la patente europea EP 2 415 737, reivindica la obtencion de un fertilizante rico en aminoacidos a partir de sangre de cerdos o ganado. El procedimiento comprende una primera fase de homogeneizacion de tamano seguida de hidrolisis enzimatica mediante un extracto de endoproteasas de soja. La reaction transcurre sin control de pH y el rango de temperatura ensayado (50 - 70°C) es superior al empleado en el procedimiento descrito en esta invention, asl como los tiempos de reaccion (8 - 15 h), dando un hidrolizado con una composition en aminoacidos libres rica en acido aspartico, leucina o acido glutamico.

5

10

15

20

25

30

35

40

OBJETO DE LA INVENCION

El objeto de la presente invention es un procedimiento de hidrolisis enzimatica de harina de sangre para obtener productos fertilizantes con alto contenido en aminoacidos libres y aporte de hierro hemico susceptibles de ser utilizados como abono organico, y con mejor solubilidad que el sustrato de partida, lo que permite su aplicacion foliar.

Las principales ventajas que presenta la invencion son:

- La harina de sangre de partida posee alto contenido en protelna (89% p/p), estabilidad microbiologica, y es rica en aminoacidos como la cistelna o la lisina, entre otros.

- La hidrolisis enzimatica del sustrato permite que todos los aminoacidos formados esten en su forma levogira, asimilable por la planta.

- El control del pH durante la reaction permite que la enzima mantenga su actividad durante el transcurso de la reaccion y por tanto permite obtener una solubilidad elevada con tiempos menores que los obtenidos mediante otros procedimientos donde el pH se deja libre.

- Los productos obtenibles mediante el procedimiento pueden llegar a tener niveles de aminoacidos libres de hasta 373 mg/L, dependiendo de las condiciones de operation.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1.-. Esquema del dispositivo experimental. TI: sonda de temperatura; pHI: sonda de pH; pHC: equipo de valoracion con KOH; TC: equipo de calefaccion para el agua de encamisado; A: suspension de harina de sangre; P: hidrolizado final.

Figura 2.- Grafica que muestra los valores maximo y mlnimo observados para la concentration en aminoacidos libres identificados (C.A.L.) en el rango de temperaturas y pH ensayados.

Figura 3.- Grafica que muestra el perfil de la concentracion de aminoacidos libres (C.A.L.) en el hidrolizado obtenido bajo las condiciones del ejemplo 1.

Figura 4.- Grafica que muestra el perfil de la concentracion de aminoacidos libres (C.A.L.) en el hidrolizado obtenido bajo las condiciones del ejemplo 2.

Figura 5.- Grafica que muestra el perfil de la concentracion de aminoacidos libres (C.A.L.) en el hidrolizado obtenido bajo las condiciones del ejemplo 3.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

A lo largo de la presente invencion se entendera por “harina de sangre” al concentrado proteico en polvo que resulta del secado de la fraction celular de la sangre previamente coagulada, con un contenido en protelna mlnimo superior al 80% p/p.

Se entendera por “temperatura de trabajo” al valor medio de temperatura del medio reaccionante, que se mantendra constante en el interior del reactor mediante un sistema de encamisado conectado a bano termostatizado.

Se entendera por “agente vaiorante” al compuesto adicionado durante la reaccion de hidrolisis para mantener constante el pH del medio en el valor deseado. Un ejemplo de agente valorante es el hidroxido potasico (KOH)

Se entendera por “grado de hidrolisis” al porcentaje de enlaces peptldicos rotos durante la reaccion enzimatica, referidos al total de enlaces peptldicos que presenta la protelna de partida.

5

10

15

20

25

30

35

40

Se entendera por “contenido en aminoacidos libres’’ a la masa de aminoacidos libres por volumen de hidrolizado obtenido y filtrado a vado. Se indica como peso /volumen, p/v.

Procedimiento de obtencion de fertilizantes

La presente invention propone el uso de hidrolisis enzimatica de harina de sangre como modo de obtener un hidrolizado final con una composition rica en amino acidos libres y aporte de hierro hemico, susceptible de ser utilizado como abono organico.

Asi, el procedimiento objeto de la invencion es un proceso de hidrolisis enzimatica de harina de sangre caracterizado porque mantiene la temperatura de trabajo constante a lo largo del proceso, preferentemente dentro del intervalo de maxima actividad de la enzima subtilisina empleada (50-60°C). A diferencia de los procedimientos de hidrolisis utilizados habitualmente, donde el pH se deja libre en el transcurso de la hidrolisis, el procedimiento propuesto mantiene el pH constante a lo largo de la reaction mediante adicion de un agente valorante (por ejemplo, KOH).

En su realization mas general, el procedimiento objeto de la invencion comprende los siguientes pasos:

- Disolucion de la harina de sangre en agua

- Calentamiento de la disolucion hasta una temperatura de trabajo comprendida entre 40 y 65°C

- Ajuste del pH hasta un valor de trabajo comprendido entre 6 y 9.

- Adicion de la enzima

- Mantenimiento del pH y la temperatura de forma constante hasta que finalice la reaccion.

Manteniendo el pH constante se consigue que el proceso de hidrolisis necesite menos tiempo y menos cantidad de enzima. El pH juega un papel primordial en la estructura cuaternaria del sustrato e influye tanto en la solubilidad del sustrato como en la exposition de los enlaces peptidicos al ataque enzimatico. La ruptura de enlaces peptidicos en el transcurso de la reaccion conlleva una liberation de protones en funcion del equilibrio de disociacion del grupo amino. La consecuencia directa es una bajada del pH de la disolucion que puede incrementarse a lo largo del proceso mediante la adicion un agente valorante, preferentemente KOH.

La election de KOH como agente valorante frente a otras bases fuertes como la sosa (NaOH), se debe a que su adicion proporciona iones potasio al producto final, incrementando asi su valor fertilizante.

El procedimiento de hidrolisis parte de una disolucion acuosa de sangre que se calienta a una temperatura de entre 40 y 65°C, preferentemente a una temperatura entre 50 y 60 °C, y se modifica el valor del pH de la disolucion hasta situarlo en un valor entre 6 y 9, preferentemente entre 6,5 y 7,5 y mas preferentemente, 7,5. Posteriormente se incorpora la enzima a la disolucion y se mantienen los valores de temperatura y pH hasta que finalice el proceso.

En una realizacion particular, el proceso de hidrolisis finaliza tras un periodo comprendido entre 2 - 4 h, preferentemente 3h. Posteriormente se recupera el hidrolizado final y, opcionalmente, se retira la materia insoluble mediante filtration.

En otra realizacion particular, la enzima se anade en una proportion de entre el 2 y el 10% p/p de la protema contenida en la disolucion acuosa de harina de sangre, preferentemente 10% p/p. Relaciones enzima-sustrato superiores aumentarian el grado de hidrolisis final del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

hidrolizado, y con ello su contenido en aminoacidos libres, pero se prefiere fijar su valor en 10% por criterios economicos, al ser el coste de la enzima un factor limitante en los procesos de hidrolisis.

En otra realization particular, la enzima utilizada es una proteasa de largo espectro, mas particularmente, una serin endoproteasa, preferentemente subtilisina (Bacillus subtilis). Otras enzimas como la tripsina pueden hidrolizar la harina de sangre pero a niveles que no resultan interesantes para esta aplicacion.

De forma preferente se utilizara como material de partida una harina de sangre con un contenido en humedad inferior al 10% p/p, un contenido de protelna entre 85 - 90% p/p y un porcentaje de hierro entre 0,20 - 0,30 % p/p.

A partir de este sustrato se obtiene una disolucion acuosa de harina de sangre con una concentration de entre el 2 y el 20% en peso de protelna, preferentemente un 10%; a la que se le anade la enzima en una relation entre el 2 y el 10% en peso con respecto a la concentracion de protelna.

A modo de ejemplo, si el sustrato es harina de sangre con un 90% p/p de protelna, 1L de disolucion acuosa se obtendrla anadiendo agua a una cantidad de harina de sangre comprendida entre 22,2 y 222,2 g, asumiendo una densidad aproximada para el agua de 1000 g/L.

La filtration se realiza a traves de un medio con un tamano de poro entre 5 - 20 micras. El filtrado resultante se calienta a 80 - 100 °C durante 10 - 15 minutos para inactivar termicamente la enzima.

El hidrolizado se presenta en forma llquida, con contenido en nitrogeno soluble bajo la forma de peptidos y aminoacidos libres, que permite su uso como fertilizante. Dicho hidrolizado puede concentrarse posteriormente por evaporation o liofilizacion para conseguir un producto final con mayor enriquecimiento en aminoacidos libres.

Las ventajas que ofrece este procedimiento, respecto a otros procedimientos de obtencion de abonos ricos en aminoacidos u otros sustratos de partida se enumeran a continuation:

- Se parte de un substrato que constituye un subproducto abundante en los mataderos, que posee un alto contenido en protelna y ademas aporta hierro hemico, de probados beneficios para la planta. Su aprovechamiento es beneficioso desde el punto de vista medioambiental dada la alta carga contaminante de la sangre (DBO5 entre 250 - 375 g de O2/L). El sustrato de partida presenta un contenido importante en aminoacidos tales como la Lisina, Metionina y Cistelna, del que son deficientes otros sustratos.

- El procedimiento para solubilizar la harina de sangre y liberar aminoacidos libres se basa en la hidrolisis enzimatica. A diferencia de la hidrolisis qulmica, todos los aminoacidos liberados por via enzimatica se encuentran bajo la forma levogira y por tanto son biologicamente activos y facilmente asimilables por la planta. Otra ventaja de la hidrolisis enzimatica frente a la qulmica estriba en que no se destruyen aminoacidos como el triptofano. El aporte de triptofano es fundamental para la planta como precursor del acido indolacetico, que potencia el desarrollo de las yemas y del sistema radicular. Por ultimo, la hidrolisis qulmica genera un contenido importante de sales que deben ser retiradas del producto final, aumentando as! su coste de production.

- La hidrolisis enzimatica se realiza bajo control del pH. La ruptura de enlaces peptldicos durante la hidrolisis provoca que se liberen protones al medio y por consiguiente se produzca una bajada en el pH. Dicho descenso disminuye la propia actividad enzimatica, y por tanto la velocidad y rendimiento de la reaction. El control del pH durante la reaccion asegura que la enzima se mantenga en unos niveles aceptables de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

actividad durante la misma y que por tanto se consigan grados de hidrolisis y solubilizacion superiores a las reacciones donde el pH se deja libre.

Sistema para implementar el procedimiento

El procedimiento descrito se puede llevar a cabo en un sistema que comprende los siguientes elementos:

- Un recipiente para contener la disolucion acuosa de harina de sangre. Dicho recipiente permitira la alimentacion de la disolucion y evacuacion del producto final. Dispondra del espacio suficiente para asegurar la correcta agitacion del medio reaccionante.

- Sistema para mantener la temperatura del medio reaccionante a un valor constante, equipado de una sonda de medicion de temperatura conectada a una interfase grafica que permita su monitorizacion en el transcurso de la hidrolisis. A su vez, el medio reaccionante debera estar en contacto termico con un bano termostatizado, a traves un sistema de transmision de calor por encamisado o serpentln.

- Sistema para mantener el pH constante, como un equipo de valoracion automatica dotado de sonda de pH, controlador y bureta dosificadora de agente valorante. Las desviaciones de pH en el medio, respecto al valor fijado para la reaccion, son registradas por la sonda y se corrigen desde el equipo de titracion mediante adicion de agente valorante (KOH).

En una realization preferente (Figura 1), el sistema comprende:

Un reactor encamisado dotado de entradas superiores para introduction de una sonda de temperatura (TI), una sonda de pH (pHI) y una bureta dosificadora de KOH; un equipo de valorization con KOH; pHC, un equipo de calefaccion para el agua de encamisado (TC). El reactor se alimenta mediante la boquilla superior con la suspension de harina de sangre (A) de concentration entre 10 - 12 g/L, preferentemente entre 11,0 -11,5 g/L. Tras alimentacion del medio reaccionante, se ajustara su temperatura al valor de temperatura de trabajo, dentro del intervalo 40 - 65°C, preferentemente entre 50 - 60°C, gracias al bano termostatizado y el sistema por camisa de calefaccion. Una vez ajustada la temperatura de trabajo se procedera al ajuste del pH de trabajo a un valor entre 6 - 7,5 mediante la bureta dosificadora de KOH. En este punto se procedera a la adicion de enzima, en relation de 5 a 10 g por cada 100 g de sustrato, preferentemente 10 g por cada 100 g de sustrato.

Iniciada la reaccion, la temperatura del medio reaccionante y el pH se mantendran en sus valores de trabajo mediante el sistema de encamisado y el equipo de valoracion automatica. Este consta de un control de pH (pHC), una sonda de medicion del pH (pHI), una sonda de medicion de temperatura (TI) y una bureta dosificadora de KOH a concentracion entre 1 - 5 N. El volumen de base anadido durante la reaccion nos permitira determinar la evolution del grado de hidrolisis durante la misma.

Fertilizantes con alto contenido en aminoacidos obtenibles

Los fertilizantes obtenidos mediante el procedimiento descrito tienen una alta concentracion de aminoacidos y comprenden en particular los siguientes aminoacidos en las proporciones indicadas: Cistelna (11,7 - 86,1 mg/L), tirosina (9,5 - 57,6 mg/L), lisina (5,6 - 54,6 mg/L), metionina (5,4 - 29,2 mg/L) y arginina (6,2 - 19,9 mg/L).

La caracterizacion del producto fertilizante en terminos de contenido en aminoacidos libres puede llevarse a cabo mediante separation por columna de cromatografla llquida de alta resolution. La muestra previamente se derivatiza mediante 6-aminoquinolil-N-hydroxysuccimidil carbamato (Waters AccQ Kit, Millipore, Milford, EEUU), presentando asl actividad fluorescente maxima a 395 nm, lo que permite su cuantificacion. Los resultados del analisis cromatografico

5

10

15

20

25

30

35

40

45

revelan una composition variada en aminoacidos libres, fuertemente influenciada por los parametros experimentales (pH, temperatura y relation enzima- substrato) con los que se llevo a cabo la hidrolisis del sustrato. La figura 2 recoge las concentraciones minima y maxima (expresadas en miligramos de aminoacido por litro de hidrolizado) detectadas para cada aminoacido. Los aminoacidos mayoritarios presentes en el hidrolizado fueron cistelna (11,7 - 86,1 mg/L), tirosina (9,5 - 57,6 mg/L), lisina (5,6 - 54,6 mg/L), metionina (5,4 - 29,2 mg/L) y arginina (6,2 - 19,9 mg/L).

MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION

Los reactores de mezcla perfecta empleados en el procedimiento son facilmente escalables, y disponibles en el mercado con diferentes capacidades. El procedimiento en cuestion se ha ensayado con 3 reactores de capacidad 250 mL, 1 L y 10 L, obteniendo resultados similares en cuanto al rendimiento en aminoacidos libres. El criterio de escalado ha sido mantener constante la potencia de agitation especlfica (potencia de agitation por unidad de volumen del medio reaccionante). Ello se ha conseguido mediante el uso de sistemas de agitation de velocidad variable.

Ejemplo de Fertilizante Obtenido 1

Se pesan 2,25 g de harina de sangre con un contenido en protelna del 89% en peso, humedad inferior al 10% en peso y contenido en hierro del 0,2% en peso. La reaction se lleva a cabo mediante un reactor encamisado de 250 mL de capacidad, con tapa separable provista de bocas esmeriladas por las cuales se introduce un electrodo de pH y una sonda de temperatura. La temperatura se fija en 55°C gracias a un bano termostatico. Se asegura un buen grado de mezcla en el reactor mediante un agitador magnetico con el fin de mantener una composition constante en todo el volumen del reactor.

El pH se ajusta a 7,5 mediante adicion de KOH 1 N. Este valor se mantiene constante durante la reaction mediante un sistema de valorization automatica. Tras ajuste del pH, se adiciona la endoproteasa a razon de 100 mg de enzima por g de substrato. El volumen de KOH anadido para mantener el pH constante se monitoriza durante la reaction de modo que nos permite conocer la evolution del grado de hidrolisis en el transcurso de la misma.

Tras 3 horas de reaction enzimatica se recoge el hidrolizado final que se filtra a vaclo mediante un dispositivo tipo Buchner dotado de filtro de celulosa Whatman grado 40 con tamano de poro 8 pm. El filtrado resultante se calienta a 90 °C durante 10 minutos para inactivar termicamente la enzima. Este filtrado constituye el producto final llquido cuyo uso como fertilizante foliar se propone en esta patente.

A esta muestra se le determina el contenido en aminoacidos libres mediante separation por columna de cromatografla llquida de alta resolution. Para ello, la muestra se inyecta en la columna de separation cromatografica (Nova-Pak C18 4pm). La recta de calibrado se obtiene gracias a diferentes patrones de concentration 100 pmol/ pL para cada aminoacido.

La composition en aminoacidos libres para la muestra obtenida bajo las condiciones citadas anteriormente se muestra en la figura 3, donde las concentraciones para cada aminoacido se han expresado en miligramos de aminoacido por litro de fertilizante. Se observa una composition variada en todos los aminoacidos, excepto histidina, con predominio de los aminoacidos cistelna (86,1 mg/L), tirosina (57,6 mg/L), lisina (54,6 mg/L) y metionina (27,9 mg/L).

Ejemplo de Fertilizante Obtenido 2

Se pesan 11,25 g de harina de sangre con un contenido en protelna del 89% en peso, humedad inferior al 10% en peso y contenido en hierro del 0,2% en peso. La reaction se lleva a cabo mediante un reactor encamisado de 1 L de capacidad, con tapa separable provista de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

bocas por las cuales se introduce un electrodo de pH y una sonda de temperatura. La temperatura se fija en 55°C. Se asegura un buen grado de mezcla en el reactor mediante un agitador mecanico con el fin de mantener una composition constante en todo el volumen del reactor.

El pH se ajusta a 6.5 mediante adicion de KOH 2 N. Este valor se mantiene constante durante la reaction mediante un sistema de valorization automatica. Tras ajuste del pH, se adiciona la endoproteasa a razon de 50 mg de enzima por g de substrato. El volumen de KOH anadido para mantener el pH constante se monitoriza durante la reaccion de modo que nos permite conocer la evolution del grado de hidrolisis en el transcurso de la misma.

Tras 3 horas de reaccion enzimatica se recoge el hidrolizado final que se filtra a traves de un cartucho de 10 micras. El filtrado resultante se calienta a 90 °C durante 10 minutos para inactivar termicamente la enzima. Este filtrado constituye el producto final llquido cuyo uso como fertilizante foliar se propone en esta patente.

A esta muestra se le determina el contenido en aminoacidos libres mediante separation por columna de cromatografla llquida de alta resolution. Para ello, la muestra se inyecta en la columna de separacion cromatografica (Nova-Pak C18 4pm). La recta de calibrado se obtiene gracias a diferentes patrones de concentration 100 pmol/ pL para cada aminoacido.

La composicion en aminoacidos libres para la muestra obtenida bajo las condiciones citadas anteriormente se muestra en la figura 4, donde las concentraciones para cada aminoacido se han expresado en miligramos de aminoacido por litro de fertilizante. Se observa una composicion variada en todos los aminoacidos, excepto histidina, con predominio de los aminoacidos cistelna (39,0 mg/L), tirosina (26,7 mg/L), lisina (24,6 mg/L) y metionina (15,4 mg/L).

Ejemplo de Fertilizante Obtenido 3

Se pesan 112,5 g de harina de sangre con un contenido en protelna del 89% p/p, humedad inferior al 10% en peso y contenido en hierro del 0,2% en peso. La reaccion se lleva a cabo mediante un reactor encamisado de 10 L de capacidad, con tapa separable provista de bocas esmeriladas por las cuales se introduce un electrodo de pH y una sonda de temperatura. La temperatura se fija en 50°C gracias a un bano termostatico. Se asegura un buen grado de mezcla en el reactor mediante un agitador magnetico con el fin de mantener una composicion constante en todo el volumen del reactor.

El pH se ajusta a 6 mediante adicion de KOH 4 N. Este valor se mantiene constante durante la reaccion mediante un sistema de valorizacion automatica. Tras ajuste del pH, se adiciona la endoproteasa a razon de 100 mg de enzima por g de substrato. El volumen de KOH anadido para mantener el pH constante se monitoriza durante la reaccion de modo que nos permite conocer la evolucion del grado de hidrolisis en el transcurso de la misma.

Tras 3 horas de reaccion enzimatica se recoge el hidrolizado final que se filtra a vaclo mediante un dispositivo tipo Buchner dotado de filtro de celulosa Whatman grado 40 con tamano de poro 8 pm. El filtrado resultante se calienta a 90 °C durante 10 minutos para inactivar termicamente la enzima. Este filtrado constituye el producto final llquido cuyo uso como fertilizante foliar se propone en esta patente.

A esta muestra se le determina el contenido en aminoacidos libres mediante separacion por columna de cromatografla llquida de alta resolucion. Para ello, la muestra se inyecta en la columna de separacion cromatografica (Nova-Pak C18 4pm). La recta de calibrado se obtiene gracias a diferentes patrones de concentracion 100 pmol/pL para cada aminoacido.

La composicion en aminoacidos libres para la muestra obtenida bajo las condiciones citadas anteriormente se muestra en la figura 5, donde las concentraciones para cada aminoacido se

han expresado en miligramos de aminoacido por litro de fertilizante. Se observa una composition variada en todos los aminoacidos, excepto histidina, con predominio de los aminoacidos cistelna (13,5 mg/L), tirosina (10,5 mg/L), lisina (5,6 mg/L) y metionina (5,4 mg/L).

Claims (6)

1. ES 2 529 187 A1

   10

   15

   20

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de hidrolisis enzimatica de harina de sangre para obtener fertilizantes con alto contenido en aminoacidos que comprende los siguientes pasos:

   - Disolucion de la harina de sangre en agua

   - Calentamiento de la disolucion hasta una temperatura de trabajo comprendida

   entre 40 y 65°C

   - Ajuste del pH hasta un valor de trabajo comprendido entre 6 y 9.

   - Adicion de la enzima

   - Mantenimiento del pH y la temperatura de forma constante hasta que finalice la

   reaccion.
2. 2. Procedimiento segun reivindicacion 1, caracterizado porque el pH se fija en un valor entre 6,5 y 7,5
3. 3. Procedimiento segun reivindicacion anterior caracterizado porque el pH se fija en 7,5.
4. 4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque la cantidad de enzima utilizada esta entre el 2 y el 10% del peso de la protelna contenida en la disolucion acuosa, preferentemente un 10%.
5. 5. Procedimiento segun reivindicacion anterior caracterizado porque la enzima es una endoproteasa de largo espectro, preferentemente subtilisina.
6. 6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el tiempo de reaccion es de 2 a 4h, preferentemente 3h.