ES2525645T3

ES2525645T3 - Péptidos cíclicos que contienen como mínimo un resto aza-beta-3 aminoacilado y sus usos.

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Publication number: ES2525645T3
Application number: ES08867746.3T
Authority: ES
Inventors: Mathieu Laurencin; Céline ZATYLNY-GAUDIN; Joël HENRY; Michèle BAUDY FLOC'H
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Rennes 1
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-08
Publication date: 2014-12-26
Anticipated expiration: 2028-10-08
Also published as: WO2009083663A3; US8603968B2; EP2197899A2; CA2701991A1; FR2922211B1; FR2922211A1; WO2009083663A8; WO2009083663A2; EP2197899B8; US20100305027A1; EP2197899B1

Abstract

Péptidos cíclicos que tienen una alternancia aleatoria entre restos L-α-aminoacilos y restos aza-β3-aminoacilos que tienen la fórmula (A) siguiente: **Fórmula** en la que R1 representa una cadena lateral seleccionada del grupo que incluye cadenas proteogénicas y no proteogénicas, con la condición de que dos restos L-α-aminoacilo estén separados por al menos un resto aza-β3-aminoacilo y que el número total de los restos L-α-aminoacilo y de los restos aza-β3-aminoacilo esté comprendido entre 4 y 8, caracterizado por que los péptidos cíclicos se seleccionan entre hexapéptidos y octapéptidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos cíclicos que contienen como mínimo un resto azaβ3 aminoacilado y sus usos.

[0001] La presente invención tiene por objeto péptidos cíclicos que incluyen al menos un resto azaβ3 aminoacilo, 5 así como sus usos en compuestos farmacéuticos.

[0002] La mayoría de los medicamentos antiinfecciosos disponibles pertenecen a la clase de moléculas químicas pequeñas, pero en la actualidad muchos proyectos de investigación y desarrollo se interesan en la clase de péptidos terapéuticos. 10

[0003] De esta forma, las propiedades anti-infecciosas de algunos péptidos son tema de descubrimientos interesantes en el campo de las sustancias antibacterianas, las cepas bacterianas cada vez son más resistentes a los medicamentos antimicrobianos, de ahí la necesidad de encontrar nuevas moléculas activas.

15

[0004] Recientemente, un grupo ha demostrado que podía construir péptidos antibacterianos y antifúngicos muy pequeños compuestos tan solo de cuatro aminoácidos. Uno de los aminoácidos se sustituye por su enantiómero y una cadena de ácidos grasos está unida a la secuencia del péptido (C16-KKkK). En ese caso, la estructura tridimensional no parece ser un punto básico para la actividad anti-infecciosa del péptido (Makovitzki A., Avrahami D., Shai, Y. PNAS, 2006, 10, 15997). En cambio, la secuencia del péptido y la longitud del ácido graso determinan el 20 espectro de actividad antimicrobiana.

[0005] También se ha descrito una nueva familia, se trata de los péptidos cíclicos, alternando aminoácidos L y D (Fernández-López S., Kim HS., Choi E., Delgado M. Granja JR., Khazanov A., Kraehenbuehl K., Long G., Weinberger DA, Wilcoxen KM., Ghadiri MR., Nature, 2001,412,452; Dartois, V., Sanchez-Quesada J., Cabezas E., 25 Chi E., Dubbelde C., Dunn C., Granja J., Gritzen C., Weinberger D., Ghadiri M.R., Parr T.R. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, 3302; documento WO 02/090503). Estos péptidos sintéticos con propiedades antimicrobianas se autoestructuran y pueden dirigirse a las membranas microbianas y producir en las mismas brechas conducentes a la destrucción de las bacterias in vitro e in vivo.

30

[0006] Esta diversidad de estructuras y de tipos de acción proporcionan a los péptidos antimicrobianos un gran potencial como agentes anti-infecciosos frente a bacterias multirresistentes. Varias moléculas se encuentran en una fase de desarrollo avanzada en el marco de infecciones localizadas y los primeros candidatos contra las infecciones sistémicas están actualmente en evaluación.

35

[0007] Estos péptidos antimicrobianos son uno de los elementos clave de la defensa inmune innata de los organismos multicelulares y por tanto se encuentran tanto en el reino animal como en el reino vegetal. También, las nanoestructuras basadas en péptidos ofrecen muchas posibilidades de variación y permiten acceder a nuevos objetos nanoscópicos.

40

[0008] Para enfrentarse a la aparición de nuevos agentes patógenos y sobre todo a la aparición de los microorganismos multirresistentes, es fundamental identificar nuevos antibióticos.

[0009] Sin embargo, la utilización de péptidos está limitada por una rápida eliminación en medio biológico, inestabilidad metabólica vinculada a su rápida degradación por peptidasas que actúan sobre los enlaces amida. 45 Además, con la excepción de las estructuras estrictamente biológicas, existen pocos pseudopéptidos antimicrobianos biomiméticos que tengan una actividad y una estabilidad superiores al péptido natural.

[0010] De este modo, los inventores han desarrollado la síntesis de análogos de aminoácidos, los azaβ3-aminoácidos, que, una vez incorporados a las secuencias peptídicas, forman pseudopéptidos cuya vida útil está 50 mejorada.

[0011] Estos azaβ3-aminoácidos o ácidos hidrazinoacéticos Nαsustituidos (Cheguillaume A., Doubli-Bounoua l., Baudy-Floc'h M., Le Grel P. Synlett, 2000, 3, 331; documento WO 2004/111086) son monómeros que se pueden considerar como derivados aza de los β3-aminoácidos. Los aza-β3-aminoácidos enlazan su cadena lateral a un 55 átomo de nitrógeno de configuración no fijada, modificación que se traduce en una pérdida de la quiralidad del monómero si se compara la relación con los β3-aminoácidos. No obstante, gracias a la inversión más o menos rápida del nitrógeno, este monómero podrá imitar la orientación de la cadena lateral de un β3-aminoácido de configuración R o S. Por otra parte, la prolongación de la cadena con un grupo metileno aportará una cierta flexibilidad al monómero. 60

imagen1

Los aza-β3-péptidos análogos aza de los β3-péptidos.

[0012] La capacidad de inversión de la configuración de la cadena lateral en el átomo de nitrógeno se ha validado mediante la cristalización de los aza-β3-hexapéptidos cíclicos. Efectivamente, El estudio mediante RX de estos 5 cristales demuestra que los átomos de nitrógeno que soportan las cadenas laterales de estos oligómeros alternan configuraciones R y S a lo largo de la secuencia. Los aza-β3-ciclohexapéptidos existen, por tanto, en forma de dos invertómeros en equilibrio similares a las dos formas de silla del ciclohexano (Le Grel P., Salaün A., Potel M., Le Grel B., Lassagne F., J. Org. Chem. 2006)

10

Representación tridimensional de un aza-β3'-ciclohexapéptido en el estado cristalino.

[0013] Los aza-β3-aminoácidos pueden adoptar las dos configuraciones y pueden formar enlaces de hidrógeno.

[0014] Los inventores han descubierto de modo sorprendente que alternando α-aminoácidos de configuración fija y 15 aza-β3-aminoácidos en los péptidos cíclicos, se fija la configuración de los átomos de nitrógeno, formando de esta manera estructuras quirales que tienen las cadenas laterales cómodas para formar nanotubos que pueden perforar las membranas bacterianas.

[0015] También, la presente invención tiene por objeto péptidos cíclicos que tienen una alternancia aleatoria entre 20 restos L-α-aminoacilos y restos aza-β3-aminoacilos que tienen la fórmula (A) siguiente:

en la que

25

RI representa una cadena lateral seleccionada del grupo que incluye cadenas proteogénicas y no proteogénicas, con la condición de que dos restos L-α-aminoacilo estén separados por al menos un resto aza-β3-aminoacilo y que el número total de los restos L-α-aminoacilo y de los restos aza-β3-aminoacilo esté comprendido entre 4 y 8, caracterizado por que los péptidos cíclicos se seleccionan entre hexapéptidos y octapéptidos.

30

[0016] En el sentido de la presente invención se entenderá por proteogénicos todos los aminoácidos naturales o sintéticos que participan en la constitución de proteínas o de los polipéptidos, en particular: ácido aspártico (Asp o D), asparagina (Asn o N), treonina (Thr o t), serina (Ser o S), Ácido glutámico (Glu o E), glutamina (Gin o Q), glicina (Gly o G), alanina (Ala o a), cisteína (Cys o C), valina (Val o V), metionina (met o M), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), tirosina (Tiro o Y), fenilalanina (Phe o F), histidina (his o H), lisina (lys o K), triptófano (Trp o W), prolina (pro o 35 P) y la arginina (Arg o R).

[0017] En una realización especialmente ventajosa de la invención, los péptidos cíclicos se seleccionan entre hexapéptidos y octapéptidos.

[0018] De forma ventajosa, Los restos L-α-aminoacilados se seleccionan del grupo que incluye los restos de los aminoácidos siguientes: arginina (Arg o R), leucina (Leu o L), lisina (lys o K), fenilalanina (Phe o F), serina (Ser o S), 5 treonina (Thr o T) y triptófano (Trp o W) y en los restos aza-β3-aminoacilos de fórmula (A), RI <4a> en el grupo que incluye los restos de aminoácidos naturales o los restos de aminoácidos no naturales.

[0019] En otra realización ventajosa de la invención los restos de aminoácidos naturales comprendidos en la estructura de los restos de aza-β3-aminoacilo se seleccionan del grupo que incluye los restos arginina, leucina, 10 lisina, fenilalanina, serina, treonina y triptófano y los restos de aminoácidos no naturales se seleccionan del grupo que incluye los restos 1-naftilalanina [(1)Nal), 2-naftilalanina [(2)Nal). de 4-fenilfenilalanina (4Bip), difenilalanina (Dip), 9-antracenilalanina [(9)Ath), 4-piridilalanina [(4)Pal), 3-piridilalanina [(3)Pal) 2-piridilalanina [(2)Pal) fluorofénilalanina (4-Fpa), dodecilalanina (Ami), Nonilalanina (Non), Octilalanina (Oct), ciclohexilalanina (Cha), 4-fluoro-1-naftilalanina (4-F-I-Nal), homoserina (Hse), homo i-hidroxitreonina, y Norleucina (Nie). 15

[0020] En una realización especialmente ventajosa de la invención, los péptidos cíclicos tienen la secuencia (la):

en la que,

20

cada uno de los aa1, aa2, aa3, y aa4, representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo,

cada uno de los aza-β3aa1’, aza-β3aa2’, aza-β3aa3’ y aza-β3aa4’, representa independientemente entre sí un aza-β3-aminoacilo, que tiene la fórmula (A), y m4 y n4 representan cada uno simultáneamente 0 o 1,

o la secuencia (lb): 25

en la que,

cada uno de los aa1, aa2, aa3, y aa4, representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo, 30

cada uno de los aza-β3aa1’, aza-β3aa2’, aza-β3aa3’ y aza-β3aa4’,representa independientemente entre sí un resto aza-β3-aminoácido, que tiene la fórmula (A), y

m4 y n4 representan cada uno simultáneamente 0 o 1,

o la secuencia (lc): 35

en la que,

cada uno de los aa1, y aa2 representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo,

cada uno de los aza-β3aa1’, aza-β3aa2’, aza-β3aa3’ y aza-β3aa4’,representa independientemente entre sí un resto aza-β3-aminoácido, que tiene la fórmula (A) 40

o la secuencia (ld):

en la que,

cada uno de los aa1 y aa2representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo, 45

cada uno de los aza-β3aa1’ y aza-β3aa2’ representa independientemente entre sí un aza-β3-aminoacilo, que tiene la fórmula (A).

[0021] De acuerdo con una realización especial de la invención, los Péptidos cíclicos se seleccionan del grupo que incluye las secuencias siguientes: 50

SEC ID Nº 1: c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (NafNaf),

SEC ID Nº 2: c[-Lys-azaβ3Lys-Leu-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (NaINal),

SEC ID Nº 3: c[-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3Leu-Trp-azaβ3Leu-] (TrypTryp),

SEC ID Nº 4: c[-Lys-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Leu-Trp-azaβ3Leu-] (3KW), 55

SEC ID Nº 5: c[-Trp-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3Leu-] (3K2),

SEC ID Nº 6: c[-Lys-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3(1)Nal-] (4KW),

SEC ID Nº 7: c[-Ser-azaβ3(1)Nal-Phe-azaβ3Lys-Thr-azaβ3Lys-Ser-azaβ3Lys-] (SNaIF),

SEC ID Nº 8: c[-Leu-azaβ3Arg-Arg-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (RNaf),

SEC ID Nº 9: c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-azaβ3Leu-azaβ3(1)Nal-] (Nafaza),

SEC ID Nº 10: c[-Phe-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-Phe-azaβ3(1)Nal-] (PheNal),

SEC ID Nº 13: c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)-Nal-Leu-azaβ3(4F-1)Nal-] (4FluoINaf),

SEC ID Nº 14: c[-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ30ct-Trp-azaβ30ct-] (OctOct],

SEC ID Nº 15: c[-Lys-azaβ3Lys-Cha-azaβ3Amy-Trp-azaβ3(1)Nal-] (Chado), 5

SEC ID Nº 16: c[-Arg-azaβ3Lys-Cha-azaβ3(4)Fpa-Trp-azaβ3Cha-] (FluoKil),

SEC ID Nº 17: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3(2)Nal-Leu-azaβ3(2)Nal-] (Naf2Naf2),

SEC ID Nº 18: c[-Phe-aza-β3Lys-Arg-aza-β3(2)Nal-Phe-azaβ3(2)Nal-] (PheNar2),

SEC ID Nº 19: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3(1)Nal-Leu-azaβ3(4)Fluo-(1)Nal-] (4FluoNaf),

SEC ID Nº 20: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3Bip-Leu-aza-β3Bip-] (BipBip), 10

[0022] Los péptidos cíclicos de acuerdo con la invención tienen la ventaja de excluir totalmente la presencia de D-α-aminoácidos, aminoácidos no naturales de coste elevado.

[0023] De acuerdo con la invención, los péptidos cíclicos se pueden preparar mediante cualquier técnica conocida 15 del experto en la materia a partir de productos disponibles en el comercio o preparados según las técnicas descritas en la bibliografía. Especialmente, se pueden preparar según la técnica descrita por Busnel O, Bi L, Dali H, Cheguillaume A, Chevance S, Bondon A, Muller S, Baudy-Floch M., J Org Chem. 2005 Dec 23;70(26):10701-8.

[0024] Los péptidos cíclicos de acuerdo con la invención se muestran activos contra cepas bacterianas, 20 especialmente bacterias Gram negativas del Grupo 2 (patógenas): Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y las bacterias Gram positivas Bacillus megaterium (grupo 1) y Streptococcus aureus (grupo 2).

[0025] Comparativamente, estos pseudopéptidos cíclicos no ocasionan la lisis de las células sanguíneas y son 25 poco o nada citotóxicos a las concentraciones a las que inhiben, sin embargo, la proliferación de bacterias patógenas.

[0026] Los péptidos cíclicos de acuerdo con la invención se pueden utilizar como medicinas o para desinfección o la antisepsia (desinfección de superficies) en el ser humano o en animales, especialmente en animales y en el 30 hombre.

[0027] Ventajosamente se pueden utilizar como agentes antiinfecciosos o antimicrobianos, especialmente como antibacterianos, antibióticos, antiparasitarios, antivirales, antimicóticos o antifúngicos.

35

[0028] La invención también tiene por objeto composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un péptido cíclico de acuerdo con la invención.

[0029] En este marco, se pueden utilizar junto con cualquier otro excipiente farmacéuticamente aceptable y en cualquier forma que pueda ser farmacéuticamente aceptable tal como por ejemplo, comprimidos, cápsulas duras, 40 cápsulas blandas, jabones y lociones.

[0030] En una realización especialmente ventajosa de la invención, los péptidos cíclicos se pueden asociar con al menos otro agente antiinfeccioso especialmente seleccionado entre el grupo que comprende penicilina, vancomicina, eritromicina u otros agentes terapéuticos. 45

[0031] De acuerdo con la invención, los péptidos cíclicos se pueden utilizar, por tanto, para tratar cualquier tipo de enfermedad infecciosa, especialmente las infecciones intrahospitalarias, tuberculosis, septicemia, neumonía y enfermedades respiratorias.

50

[0032] La invención tiene igualmente por objeto el uso de péptidos cíclicos de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades infecciosas seleccionadas en el grupo que comprende especialmente las infecciones intrahospitalarias, tuberculosis, septicemia, neumonía y enfermedades respiratorias.

55

[0033] La invención tiene igualmente por objeto un método de tratamiento de las infecciones en el hombre o en los animales que comprende la puesta en contacto de las células microbianas con al menos un péptido cíclico de acuerdo con la invención en una cantidad suficiente para inducir la destrucción de las células microbianas sin inducir la muerte de las células de dicho ser humano o animal.

60

[0034] También se pueden utilizar como desinfectantes en cosmetología, para desinfección de superficies o en el ámbito agroalimentario.

[0035] Los ejemplos 1 y 2 y las figuras 1 a 6 que sirven para ilustrar la invención.

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La figura 1 nuestra la síntesis del péptido NafNaf de acuerdo con el ejemplo 1.

La figura 2A representa las concentraciones mínimas que inhiben la proliferación bacteriana (MIC) de péptidos para diferentes cepas; el primer valor corresponde a la concentración más débil que inhibe la actividad bacteriana y el segundo valor, que corresponde a la última concentración para la que se sigue observando el crecimiento bacteriano, donde el valor de MIC está comprendido entre estos dos valores; la figura 2B representa 5 las concentraciones mínimas bactericidas (MBC) del péptido NafNaf para diferentes cepas.

La figura 3 representa la actividad antibacteriana del péptido NafNaf a dosis crecientes para Staphylococcus aureus determinada según el ejemplo 2. La columna "PBB + Bact" corresponde al control, donde las bacterias no entran en contacto con los pseudopéptidos, la columna "PBB" corresponde al control sin bacterias, y la columna

"Ampi 1 μg/ml" corresponde a la ampicilina tomada como patrón de actividad antibacteriana. 10

La figura 4 representa la actividad antibacteriana del péptido NafNaf a dosis crecientes para Salmonella typhimurium determinada según el ejemplo 2. La columna "PBB + Bact" corresponde al control, donde las bacterias no entran en contacto con los pseudopéptidos, la columna "PBB" corresponde al control sin bacterias, y la columna

"Ampi 1 μg/ml" corresponde a la ampicilina tomada como patrón de actividad antibacteriana. 15

La figura 5 representa la curva de actividad hemolítica del pseudopéptido cíclico NafNaf determinada de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3.

La figura 6 muestra la citotoxicidad del pseudopéptido NafNaf a diferentes concentraciones en célula normales y células cancerosas.

La figura 7 representa las concentraciones mínimas que inhiben la proliferación bacteriana (MIC) después de 48 20 horas en el medio de cultivo rico en TSB (Tryptic Soy Broth, caldo de soja tríptico) en diferentes cepas para los péptidos de acuerdo con la invención. La actividad antibacteriana se mide de acuerdo con el ejemplo 5. ND: actividad antibacteriana no detectada entre la gama de concentraciones ensayada; + Bacterias Gram positivas; - Bacterias Gram negativas;

La figura 8 representa la curva de actividad hemolítica de los péptidos de acuerdo con la invención determinada 25 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 1: Preparación del pseudopéptido cíclico NafNaf

[0036] Se representa en la Figura 1. Los números romanos utilizados en el párrafo siguiente se refieren a dicha 30 figura.

[0037] Una resina de cloruro de 2-clorotritilo cargada con 1 mmol/g de L-Ieucina cuya función amina está protegida por un grupo Fmoc (9-Fluorenilmetiloxicarbonilo) (II) se dispone para su hinchado mediante un flujo continuo de dimetilformamida (DMF) durante 5 minutos. El grupo amino de la leucina fijo en la resina se desprotege por paso de 35 la resina por una disolución de piperidina al 20 % en DMF para dar (III); el Fmoc-aza-β3-(1)Nal-OH de fórmula (IV) se activa por una mezcla de N-Hidroxibenzotriazol/O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluorofosfato/N-Etildiisopropil amina (HOBt/TBTU/DIEA) en las proporciones (1/1/2) en disolución en el DMF y acoplado después a la resina desprotegida (III) durante dos horas en flujo continuo, y se obtiene (V). Se realiza seguidamente una desprotección del grupo amina por eliminación del grupo Fmoc por paso sobre la resina de una disolución de 40 piperidina al 20 % en el DMF para obtener (VI) después se realiza un nuevo acoplamiento en las condiciones descritas anteriormente para obtener (VII). Se recomienda realizar el ciclo de activación-acoplamiento-desprotección tantas veces como sea necesario, después se separa el péptido final de su soporte por escisión en diclorometano (DCM) que contienen ácido trifluoroacético (TFA) al 2 %. Se obtiene el compuesto de fórmula (VIII) que cicla en un medio de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/HOBt con alta dilución (4.10-4 M)) en presencia de 4 45 equivalentes de agentes de acoplamiento HOBt, EDC y DIEA; esta ciclación dura dos días. Se obtiene el compuesto (IX) que se trata con una mezcla TFA/H2O/TIS (95/2,5/2,5) para desproteger las cadenas laterales y obtener el compuesto (la), o NafNaf.

Ejemplo 2: Medida de la actividad antibacteriana en medio pobre en PB 50

2.1. Modo operativo

[0038] Los ensayos se realizaron sobre cepas bacterianas Gram negativas del Grupo 2 (patógenas): Escherichia coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae y las cepas Gram positivas: 55 Bacillus megaterium (grupo 1) y Streptococcus aureus (grupo 2).

[0039] Las bacterias se incuban en un medio pobre en PB para bacterias: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Bacillus megaterium y en un medio pobre enriquecido en extracto de ternera PBB en el caso de dos bacterias adicionales: Streptococcus aureus y Salmonella thyphimurium con concentraciones 60 crecientes de péptido o sus análogos, comprendidas entre 1 y 320 μg/ml. Este ensayo se realiza en microplacas de 96 pocillos. Tras una incubación de 18 horas a 30°C o 37 ºC, se realiza una lectura de la densidad óptica de las microplacas a 595 nm destinada a evaluar el crecimiento bacteriano y a determinar la concentración inhibidora mínima (MIC) de cada molécula ensayada. Cada medida se realiza por triplicado.

65

[0040] Además, la concentración bactericida mínima (MBC) se determina dispersando el contenido de los pocillos en los que no se ha producido crecimiento bacteriano en placas que contenían medios ricos (Luria broth o (LB) o Brain Heart Infusion (BHi)). La MBC corresponde a la concentración a la que no se detecta ninguna colonia bacteriana después de una incubación de 24 horas a 30 o 37º C.

5

2.2. Resultados

[0041] Se proporcionan en la tabla de la figura 2 y en las figuras 3 y 4.

[0042] Las cinco secuencias ensayadas resultan activas, aunque solamente dos secuencias (NafNaf y TrypTryp) 10 presentan concentraciones inhibidoras de la proliferación bacteriana (MIC) inferiores a 100 μg/ml (figura 2).

[0043] La secuencia NafNaf tiene valores MIC inferiores a 100 μg/ml para todas las bacterias ensayadas (figura 2).

[0044] Este péptido es muy activo para el estafilococo dorado (Streptococcus aureus) responsable de numerosas 15 enfermedades hospitalarias, con un valor MIC inferior a 5 μg/ml y un valor MBC inferior a 10 μg/ml (figura 2).

[0045] Es también activo para bacterias patógenas gram negativas relativamente resistentes, tales como K. pneumoniae responsables de infecciones respiratorias e intestinales (figura 2). Su actividad antimicrobiana es equivalente a la de los mejores péptidos cíclicos que alteran aminoácidos D y L con valores MIC de una decena de 20 μg/ml para las bacterias Gram positivas y comprendidas entre 15 y 80 μg/ml para las gram negativas.

[0046] El pseudopéptido NafNaf es activo a concentraciones de interés para el conjunto de las cepas estudiadas, especialmente para las bacterias patógenas como Streptococcus aureus y Salmonella thyphimurium donde es activo para concentraciones inferiores a 20 μg/ml. (figuras 3 y 4). 25

[0047] La ampicilina (Ampi) seleccionada como referencia es activa a partir de 1 μg/ml para Streptococcus aureus y Salmonella thyphimurium. Esta concentración puede variar según la cepa bacteriana estudiada

Ejemplo 3: Medida de la actividad hemolítica del péptido NafNaf sobre eritrocitos de conejo 30

3.1. Modo operativo

[0048] La actividad hemolítica de los pseudopéptidos se ensaya en células sanguíneas de conejo. Los eritrocitos recientes de conejo se lavan tres veces con un tampón fosfato salino [tampón PBS (pH 7,4)] por centrifugación 35 durante 5 min a 900 g y el aglomerado final se suspende en PBS. Las disoluciones del pseudopéptido NafNaf diluidas en PBS (90 μl) se colocan en una placa de 96 pocillos. A estas disoluciones se añaden 90 μl de disolución de eritrocitos de conejo a un 2% (v/v) para conseguir un volumen final de 180 μl y una concentración de 1% (v/v) de células sanguíneas. Las suspensiones obtenidas se incuban 1 hora a 37º C. A continuación, las muestras se centrifugan a 500 g durante 5 min. Se transfieren 100 μl de sobrenadante de cada muestra a una nueva placa de 96 40 pocillos. La liberación de hemoglobina se cuantifica midiendo la absorbancia a 415 nm del sobrenadante mediante un lector de microplacas. Los controles correspondientes a la ausencia de hemolisis (blanco) y a una hemolisis del 100 % consisten, respectivamente, a una adición de 90 μl de tampón PBS y 90 μl de una disolución de Triton X-100 al 2 % a los 90 μl de disolución de células sanguíneas al 2%. Cada medida se realiza por triplicado.

45

3.2. Resultados

[0049] Se proporcionan en la figura 5.

[0050] La concentración del péptido NafNaf para la que se consigue una hemolisis del 50% es de 120 μg/ml. 50

[0051] Esta concentración es más elevada que la del péptido cíclico de estructura cercana que alterna los aminoácidos D y L y que responde a la fórmula siguiente:

55

que es hemolítica a 80 μg/ml.

[0052] Así, NafNAf no tiene actividad hemolítica a las concentraciones a las que tiene actividad bactericida, especialmente no tiene acción sobre los eritrocitos a 20 μg/ml, concentración a la que es bactericida para 60 Staphylococcus aureus y Salmonella typhimurium.

Ejemplo 4: Evaluación de la citotoxicidad in vitro

4.1. Modo operativo

[0053] Los efectos de los diferentes pseudopéptidos cíclicos sobre el crecimiento celular se evaluó en placas de 96 5 pocillos estériles. Las células se siembran a 5.105 células por ml de medio de cultivo (100 μl por pocillo). Los diferentes pseudopéptidos (10 μl por pocillo), diluidos en un suero salino, se añaden en el momento de la siembra con la concentración adecuada (desde 1 μg/ml hasta 1 mg/ml). Las incubaciones se realizan a 37ºC en atmósfera húmeda que contienen un 5% de CO2 durante 24 o 48 horas.

10

[0054] Tras la exposición a los compuestos, se evalúa el crecimiento celular midiendo la formación de formazano a partir de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). La absorbancia a 540 nm se mide con un lector de microplacas Titertek Multiscan MCC/340. Cada medida se realiza por triplicado.

4.2. Resultados 15

[0055] Se proporcionan en la figura 6.

[0056] La citotoxicidad del pseudopéptido NafNaf se ha medido en células de hámster (CHO-K1) y en una línea de células de ratón (Ascite 302-sp). 20

[0057] Este pseudopéptido no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células de hámster a 10 μg/ml, concentración bactericida para cepas bacterianas como S. aureus y la dosis letal para el 50% de las células (DL50) es de aproximadamente 40 μg/ml.

25

[0058] Estos resultados obtenidos con las células de hámster no cancerosas se confirman por los resultados obtenidos para la línea de células de ratón Ascite 302-sp que es una línea celular derivada de células cancerosas. La LD50 es ligeramente más débil, pero tiene también un ligero efecto sobre la viabilidad celular a 10 μg/ml.

Ejemplo 5: Medida de la actividad antibacteriana en medio rico 30

5.1. Modo operativo

[0059] Los ensayos se realizaron sobre cepas bacterianas Gram negativas Escherichia coli A Tee 25922, Salmonella enterica A Tee 13076, Pseudomonas aeruginosa A Tee 27853, Klebsiella oxytoca elP 7932, 35 Entreobacter aerogenes A Tee 13048 y Aeromonas caviae A Tee 15468 y cepas Gram positivas: Staphylococcus aureus ATee 25923, Enterococcus faecalis elP 186, Streptococcus equinus ATee 5623, Listeria monocytogenes SOR 100, Bacillus megaterium ATee 10778, Lactococcus gaviae ATee 43921, Micrococcus luteus ATee 10240.

[0060] Las bacterias (105 UFC/ml) se incuban en un medio rico TSB (Tryptic Soy Broth) con concentraciones 40 crecientes de ciclopseudopéptidos (0,78, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 μM). Este ensayo se realiza en microplacas de 96 pocillos. Tras una incubación de 48 horas a 20 °C o 37 ºC, se realiza una lectura de la densidad óptica de las microplacas a 595 nm destinada a evaluar el crecimiento bacteriano y a determinar la concentración inhibidora mínima (MIC) de cada molécula ensayada. Cada medida se realiza por triplicado.

45

5.2. Resultados

[0061] Se proporcionan en la tabla de la Figura 7.

[0062] Las cinco secuencias ensayadas resultan activas. 50

[0063] Los cinco ciclopseudopéptidos pueden inhibir el crecimiento de todas las bacterias Gram positivas ensayadas (bacterias de S.aureus a M. luteus en la tabla de la Figura 7) para valores de concentraciones inferiores o iguales a 50 μM (≤ 50 μM)

55

[0064] A diferencia de los ciclopseudopéptidos que parecen menos activos para las bacterias Gram negativas (bacterias de E. coli a A. caviae tabla de la Figura 7) y uno de estos (Chado) no presenta por otra parte ninguna actividad sobre las bacterias Gram negativas a las concentraciones ensayadas. Las secuencias OctOct y Chado están compuestas por restos aza-β3 aminoácidos que incluyen las cadenas alquiladas (C8 o C12) como cadenas laterales. Esta modificación química parece también inducir una actividad antibacteriana preferentemente dirigida 60 contra las bacterias Gram negativas.

[0065] A. caviae es resistente a todos los ciclopseudopéptidos a las concentraciones ensayadas, y la proliferación de las otras cinco cepas bacterianas Gram negativas está inhibida por los ciclopseudopéptidos NafNaf, 4FluoNaf y Fluokill para valores de MiC comprendidos entre 12,5 y 50 (μM). 65

Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptidos cíclicos que tienen una alternancia aleatoria entre restos L-α-aminoacilos y restos aza-β3-aminoacilos que tienen la fórmula (A) siguiente:

5

en la que R1 representa una cadena lateral seleccionada del grupo que incluye cadenas proteogénicas y no proteogénicas,

con la condición de que dos restos L-α-aminoacilo estén separados por al menos un resto aza-β3-aminoacilo y 10 que el número total de los restos L-α-aminoacilo y de los restos aza-β3-aminoacilo esté comprendido entre 4 y 8, caracterizado por que los péptidos cíclicos se seleccionan entre hexapéptidos y octapéptidos.
2. Péptidos cíclicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizados por que los restos L-α-aminoacilados se seleccionan del grupo que incluye los restos de los aminoácidos siguientes: arginina, 15 leucina, lisina, fenilalanina, serina, treonina y triptófano.
3. Péptidos cíclicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizados por que en los restos aza-β3-aminoacilos que tienen la fórmula (A), R1 representa una cadena lateral seleccionada del grupo que comprende restos de aminoácidos naturales o restos de aminoácidos no naturales. 20
4. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizados por que los restos de aminoácidos naturales se seleccionan del grupo que comprende restos de arginina, leucina, lisina, fenilalanina, serina, treonina y triptófano.
5. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizados por que los restos de aminoácidos naturales 25 se seleccionan del grupo que comprende restos 1-naftilalanina [(1)Nal], 2-naftilalanina [(2)Nal] 4-fenilfenilalanina (4Bip), difenilalanina (Dip), 9-antracenilalanina [(9)Ath], 4-piridilalanina [(4)Pal], 3-piridilalanina [(3)Pal], 2-piridilalanina [(2)Pal], fluorofenilalanina (4-Fpa), dodecilalanina (Amy), Nonilalanina (Non), Octilalanina (Oct), ciclohexilalanina (Cha), 4-fluoro-1-naftilalanina (4-F-I-Nal), homoserina (Hse), homo -hidroxitreonina, y Norleucina (Nie). 30
6. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 1 que tienen la secuencia (1a)

en la que

35

cada uno de los aa1, aa2, aa3, y aa4, representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo,

cada uno de los aza-β3-aa1’, aza-β3-aa2’, aza-β3-aa3’, y aza-β3-aa4’, representa independientemente uno de otro un aza-β3-aminoácido, que tiene la fórmula (A), y

m4 y n4 representan cada uno simultáneamente 0 o 1.

40
7. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 1 que tienen la secuencia (1b)

en la que,

cada uno de los aa1, aa2, aa3, y aa4, representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo, 45

cada uno de los aza-β3-aa1’, aza-β3-aa2’, aza-β3-aa3’, y aza-β3-aa4’ representa independientemente uno de otro un aza-β3-aminoácido, que tiene la fórmula (A), y

m4 y n4 representan cada uno simultáneamente 0 o 1.
8. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 1 que tienen la secuencia (1c): 50

en la que,

cada uno de los aa1 y aa2 representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo,

cada uno de los aza-β3-aa1’, aza-β3-aa2’, aza-β3-aa3’, y aza-β3-aa4’ representa independientemente uno de otro un aza-β3-aminoácido, que tiene la fórmula (A).
9. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 1 que tienen la secuencia (1d):

5

en la que,

cada uno de los aa1 y aa2representa independientemente entre sí un resto L-α-aminoacilo,

cada uno de los aza-β3-aa1, aza-β3-aa2, representa independientemente entre sí un resto aza-β3-aminoácido, que 10 tiene la fórmula (A).
10. Péptidos cíclicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 caracterizados por que se seleccionan del grupo que comprende las siguientes secuencias:

15

SEC ID Nº 1: c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (NafNaf),

SEC ID Nº 2: c[-Lys-azaβ3Lys-Leu-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (NaINal),

SEC ID Nº 3: c[-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3Leu-Trp-azaβ3Leu-] (TrypTryp),

SEC ID Nº 4: c[-Lys-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Leu-Trp-azaβ3Leu-] (3KW),

SEC ID Nº 5: c[-Trp-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3Leu-] (3K2), 20

SEC ID Nº 6: c[-Lys-azaβ3Lys-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ3(1)Nal-] (4KW),

SEC ID Nº 7: c[-Ser-azaβ3(1)Nal-Phe-azaβ3Lys-Thr-azaβ3Lys-Ser-azaβ3Lys-] (SNaIF),

SEC ID Nº 8: c[-Leu-azaβ3Arg-Arg-azaβ3(1)Nal-Leu-azaβ3(1)Nal-] (RNaf),

SEC ID Nº 9: c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-azaβ3Leu-azaβ3(1)Nal-] (Nafaza),

SEC ID Nº 10: c[-Phe-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)Nal-Phe-azaβ3(1)Nal-] (PheNal), 25

SEC ID Nº 13:c[-Leu-azaβ3Lys-Lys-azaβ3(1)-Nal-Leu-azaβ3(4F-1)Nal-] (4FluoINaf),

SEC ID Nº 14: c[-Lys-azaβ3Lys-Trp-azaβ30ct-Trp-azaβ30ct-] (OctOct],

SEC ID Nº 15: c[-Lys-azaβ3Lys-Cha-azaβ3Amy-Trp-azaβ3(1)Nal-] (Chado),

SEC ID Nº 16: c[-Arg-azaβ3Lys-Cha-azaβ3(4)Fpa-Trp-azaβ3Cha-] (FluoKil),

SEC ID Nº 17: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3(2)Nal-Leu-azaβ3(2)Nal-] (Naf2Naf2), 30

SEC ID Nº 18: c[-Phe-aza-β3Lys-Arg-aza-β3(2)Nal-Phe-azaβ3(2)Nal-] (PheNar2),

SEC ID Nº 19: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3(1)Nal-Leu-azaβ3(4)Fluo-(1)Nal-] (4FluoNaf),

SEC ID Nº 20: c[-Leu-aza-β3Lys-Lys-aza-β3Bip-Leu-aza-β3Bip-] (BipBip).
11. Péptidos cíclicos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores como medicamentos. 35
12. Péptidos cíclicos de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizados por que el medicamento es un antiinfeccioso o un desinfectante.
13. Composición farmacéutica que comprende al menos un péptido cíclico de acuerdo con una de las 40 reivindicaciones 1 a 10 asociadas a cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Uso de al menos un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades infecciosas. 45