ES2449152T3

ES2449152T3 - Procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer de piel

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Publication number: ES2449152T3
Application number: ES08851071.4T
Authority: ES
Inventors: Nadem Soufir
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2014-03-18
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: AU2008327841A1; DK2220256T3; US20110086805A1; FR2923841A1; EP2220256B1; FR2923841B1; PL2220256T3; WO2009065944A1; PT2220256E; EP2220256A1; AU2008327841B2

Abstract

Procedimiento in vitro destinado a identificar a un sujeto que padece o que presenta una predisposición al cáncerde piel, caracterizado porque comprende la etapa de análisis de una muestra biológica de dicho sujeto mediante: a) la detección de un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 de SEC ID no 1, asociado a un solo nucleótido(SNP) se selecciona de entre el grupo que comprende la SNP rs16891982, que corresponde al nucleótido Nen la posición 301 de la SEC ID no 2, estando el nucleótido G asociado a un cáncer cutáneo y que conduce ala presencia de una fenilalanina en la posición 374 de la proteína MATP/SLC45A2 de SEC ID no 3 y el SNPrs26722 que corresponde al nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 4, estando el nucleótido Casociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de un residuo de glutamato en la posición 272 dela proteína MATP/SLC45A2 de SEC ID no 3.

Description

Procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer de piel.

La presente invención se refiere al diagnóstico del cáncer de piel y, más específicamente, a un procedimiento de diagnóstico in vitro del cáncer cutáneo para un sujeto sospechoso de tener o de estar predispuesto al cáncer cutáneo.

El conocimiento de la predisposición genética al melanoma ha evolucionado considerablemente estos últimos quince años. Se han identificado dos genes importantes de predisposición al melanoma, correspondiendo dichos genes a CDKN2A y CDK4. Estos dos genes están esencialmente implicados en la predisposición familiar y en múltiples casos esporádicos de melanomas (HUSSUSSIAN et al., Nat. Genet., vol. 8, p. 15-21, 1994; KAMB et al., Nat. Genet., vol. 8, p. 23-6, 1994; ZUO et al., Nat. Genet., vol. 12, p. 97-9, 1996).

Unos estudios recientes han identificado unos sitios principales implicados en la susceptibilidad sobre los cromosomas 1p22 (GILLANDERS et al., Am. J. Hum. Genet., vol. 73, p. 301-13, 2003) y 9q21 (JONSSON et al., J. Natl. Cancer Inst., vol. 97, p. 1377-82, 2005).

Por lo tanto, existen hoy día unas evidencias recurrentes de una implicación de múltiples factores genéticos en la predisposición al melanoma, y está en progreso la identificación de otras variantes genéticas asociadas a una menor contribución al riesgo de melanoma. Entre estas nuevas variantes, se pueden citar así las variantes de tipo RHC del gen MC1R, para el cual se ha demostrado que constituye un gen del melanoma de baja penetrancia (PALMER et al., Am. J. Hum Genet., vol. 66, p. 176-86, 2000; KENNEDY et al., J. Invest. Dermatol., vol. 117, p. 294-300, 2001; MATICHARD et al., J. Med. Genet., vol. 41, p:e13, 2004; STRATIGOS et al., J. Invest. Dermatol., 2006; LANDI et al., J Natl. Cancer Inst., vol. 97, p:998-1007, 2005; DEBNIAK et al., Int. J. Cancer, vol. 119, p. 2597-602, 2006; HEALY, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., vol. 20, p. 283-8, 2004) y que se trata como un elemento modificador del riesgo de melanoma en los individuos que tienen unas mutaciones de CDKN2A (BOX et al., Am. J. Hum. Genet., vol. 69, p:4, 2001; VAN DER VELDEN et al., Am. J. Hum. Genet., vol. 69, p:4, 2001; CHAUDRU et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., vol. 14, p:2384-90, 2005.). Así, se han identificado cinco variantes alélicas de MC1R (D84E, R142H, R151C, R160W y D294H) por estar muy asociadas con un fenotipo caracterizado por cabello pelirrojo, piel clara, pecas y sensibilidad al sol, y son conocidas ahora bajo el término de variantes RHC.

Por lo tanto, existe también una necesidad importante de identificar otros genes implicados en la susceptibilidad al cáncer de piel con el fin de identificar claramente y completamente a los sujetos que presentan la mayor predisposición al melanoma, con el fin de seguir estos sujetos con prioridad.

La presente invención se basa en el descubrimiento de una asociación fuerte entre algunos alelos del gen MATP/SLC45A2 y el melanoma y, más específicamente, entre el alelo SLC45A2 374F y un riesgo incrementado de melanoma, mientras que el alelo SLC45A2 374L presenta un efecto protector frente al melanoma. Además, se había demostrado previamente que el alelo SLC45A2 374F estaba asociado a una disminución de la cantidad de melanina fotoprotectora (eumelanina) en la epidermis (NORTON et al., Mol Biol Evol., 24:710-22; 2007), lo cual sugiere o bien una disminución de la expresión, o bien una pérdida de función de la proteína MATP/SLC45A2. A partir de los resultados obtenidos por los inventores, es por tanto posible concluir asimismo que la presencia del alelo 374F del gen MATP/SLC45A2 está también asociada a un riesgo incrementado de melanoma, y que la presencia del alelo SLC45A2 374L está asociada a un efecto protector contra el melanoma.

Por "gen MATP/SLC45A2" se entiende en la presente memoria el gen que codifica para la proteína transportadora asociada a las membranas (MATP) denominada originalmente AIM1, y renombrada recientemente "miembro 2 de la familia de los transportadores de soluto" (o SLC45A2). El gen MATP/SLC45A2 está situado en el cromosoma 5p (Gen ID 51151) y presenta la secuencia tal como se describe en el número de acceso NT_006576.15 (SEC ID no 1). La proteína MATP/SLC45A2 (Secuencia del ARNm: número de acceso NM_001012509) presenta la secuencia proteica SEC ID No 3 (número de acceso: NP_001012527).

La proteína MATP/SLC45A2 está designada en la presente memoria indistintamente por los términos "MATP", "SLC45A2" o "MATP/SLC45A2".

Debido a su sobreexpresión establecida en ciertas líneas celulares de melanoma con respecto a su expresión en los melanocitos normales (ausencia de expresión en los tejidos normales), el gen MATP/SLC45A2 se conocía como un antígeno de melanoma (Harada M et al., Cancer Research, 1089-1094; 2001).

La presente invención se basa en el hecho de que el alelo SLC45A2 374F está asociado a un riesgo incrementado de melanoma, mientras que el alelo SLC45A2 374L presenta por el contrario un efecto protector frente al melanoma.

El polimorfismo SLC45A2 L374F se conocía ya en la fecha de la invención. Este polimorfismo había sido descrito en efecto en la técnica anterior como uno de los numerosos polimorfismos identificados en individuos que padecen albinismo oculocutáneo. En dichos pacientes, esta variante parece bastante común y el 8,5% de los individuos

ensayados presentan esta variante de manera heterocigota (Rundshagen U. et al., Human mutation; 23:106-110; 2004). Sin embargo, no se sugiere el paralelismo entre este polimorfismo y la pérdida de pigmentación relacionada con el albinismo. Asimismo, Newton et al. (Am, J. Hum. Genetic; 69: 981-988; 2001) habían identificado este polimorfismo en 67 individuos, incluso en individuos con pigmentación normal, y esto de manera homocigota. Según este último artículo, la mutación L374F de la proteína SLC45A2 es "neutra" frente a los mecanismos de hipopigmentación responsables del albinismo.

Por otra parte, otros estudios han puesto en evidencia la asociación entre el alelo L374F de MATP/SLC45A2 y la pigmentación humana normal en algunas poblaciones, en particular en los afro-americanos (Norton HL et al., Mol. Biol. Evol, 24(3):710-722, 2007; Graf et al., Hum. Mutat., vol. 25, p. 278-84, 2005). Sin embargo, esta asociación no se podría sugerir en la presente invención, ya que varios centenares de genes influyen en la pigmentación sin por ello estar asociados a una predisposición al melanoma (véase por ejemplo Sulem P, Nature Genetics; volumen 39, número 12, 2007).

Así, los presentes inventores han podido demostrar por otro lado que, a pesar de que está asociada a la pigmentación, la variante de MATP/SLC45A2 374 identificada en la presente memoria predice el riesgo de melanoma de manera independiente de las características pigmentarias. Más particularmente, los presentes inventores han mostrado que el efecto SLC45A2 L374F sobre la predisposición al melanoma persiste incluso después de la estratificación sobre las características de pigmentación o en un modelo de regresión logística que integra los 2 factores de riesgo genético (MATP L374F, variantes MC1R) y los factores de riesgo clínicos (color de los ojos, del cabello, fototipo y número de nevus). Esto sugiere que frente al riesgo de melanoma, la información relacionada con el genotipo SLC45A2 L374F no es redundante con las características de pigmentación, y que esta variante es por lo tanto un factor de riesgo de melanoma fuerte e independiente (véase también el artículo de los inventores Guedj M et al., Human Mutation 29(9), 1154-1160, 2008).

En consecuencia, un primer objeto de la invención se basa en un procedimiento in vitro destinado a identificar a un sujeto que padece o que presenta una predisposición al cáncer de piel, caracterizado porque comprende la etapa de análisis de una muestra biológica que procede de dicho sujeto mediante:

a) la detección de un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 (SEC ID no 1), asociado a un solo nucleótido (SNP) se selecciona de entre el grupo que comprende la SNP rs 1689182 (nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 2, estando el nucleótido G asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de una fenilalanina en la posición 374 de la proteína MATP/SLC45A2 (SEC ID no 3) y el SNP rs26722 (nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 4, estando el nucleótido C asociado a un cáncer cutáneo) que conduce a la presencia de un residuo glutamato en la posición 272 de la proteína MATP/SLC45A2 (SEC ID no 3).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, preferentemente a un ser humano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra sólida o líquida procedente de un sujeto. A título de ejemplo de muestras sólidas, se puede citar una muestra de piel y, a título de ejemplo de muestras líquidas se puede citar una muestra de sangre.

Preferentemente, dicha muestra biológica es una muestra sanguínea cuando se efectúa una etapa de detección de un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2.

Más preferentemente, dicha muestra biológica es una muestra de piel cuando se efectúa una etapa de análisis de la expresión del gen MATP/SLC45A2.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cáncer de piel" se refiere a un cáncer que implica un tipo celular de la epidermis o de la dermis, preferentemente dicho cáncer de piel es un melanoma.

Más ventajosamente, dicho polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 está asociado a un nivel de expresión significativamente más bajo del gen MATP/SLC45A2.

Preferentemente, dicho SNP corresponde al SNP rs16891982 (nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 2, estando el nucleótido G asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de una fenilalanina en la posición 374 de la proteína MATP/SLC45A2 (SEC ID no 3).

El experto en la materia, frente a sus conocimientos generales y a la presente descripción, podrá identificar simplemente otros polimorfismos del gen MATP/SLC45A2 asociado a una predisposición al cáncer de piel.

En un modo de realización preferido, el procedimiento de la invención permite identificar a un sujeto que padece o que presenta una predisposición al cáncer de piel analizando, además de uno de los polimorfismos del gen MATP/SLC45A2 y/o su expresión, un polimorfismo de otro gen de susceptibilidad al melanoma.

Este otro gen de susceptibilidad es, por ejemplo, el gen MC1R (gen que codifica para el receptor a la melanocortina 1). En efecto, los presentes inventores han podido demostrar que cuatro polimorfismos del gen del receptor a la melanocortina 1, o MC1R (NP 002377.4, SEC ID no 5), están asociados a un riesgo incrementado de melanoma.

La proteína MC1R está codificada por el gen humano MC1R (Gen ID 4157), que está transcrito en un ARNm de secuencia NM 002386.3 (SEC ID no 10). Se han identificado cinco variantes alélicas de MC1R (D84E, R142H, R151C, R160W y D294H) por estar asociadas en gran medida con un fenotipo caracterizado por cabellos pelirrojo, piel clara, pecas y sensibilidad al sol. Estas variantes alélicas son conocidas ahora bajo el término "variantes RHC" (FLANAGAN et al., Hum Mol Genet, vol. 9, p. 2531-7, 2000; DUFFY et al., Hum. Mol. Genet., Vol. 13, p. 447-61, 2004; REES, Am. J. Hum. Genet., vol. 75, p. 739-51, 2004; Sulem P, Nature Genetics; volumen 39, número 12, 2007).

Ya se han asociado estas variantes con el riesgo de melanoma en múltiples poblaciones (STURM et al., Pigment Cell Res., vol. 16, p. 266-72, 2003; REES, Annu. Rev. Genet., vol. 37, p. 67-90, 2003), y todas se han identificado como generadoras de una pérdida de función en los estudios funcionales (BEAUMONT et al., Hum. Mol. Genet., vol. 14, p. 2145-54, 2005; BEAUMONT et al., Hum. Mol. Genet., 2007). Los inventores han mostrado en la presente memoria también que algunos de estos SNP de MC1R están asociados a un riesgo incrementado de melanoma, de manera independiente a los polimorfismos de MATP/SLC45A2 identificados anteriormente.

En este modo de realización, el procedimiento de la invención es un procedimiento in vitro destinado a identificar a un sujeto que padece o que presenta una predisposición al cáncer de piel, caracterizado porque comprende, además, c) la detección de un polimorfismo del gen MC1R (SEC ID no 10).

En un modo de realización aún más preferido, la detección del polimorfismo del gen MC1R asociado a una predisposición al cáncer de piel corresponde a varios SNP seleccionados preferentemente de entre el grupo que comprende la SNP rs1805006 (nucleótido N en la posición 26 de la SEC ID no 6 (ss2425919), estando el nucleótido A asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de un glutamato en la posición 84 de la proteína MC1R (SEC ID no 5), el SNP rs1805007 (nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 7, estando el nucleótido T asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de una cisteína en la posición 151 de la proteína MC1R (SEC ID no 5), el SNP rs1805008 (nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 8, estando el nucleótido T asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de un triptófano en la posición 160 de la proteína MC1R (SEC ID no :5), el SNP rs1805009 (nucleótido N en la posición 26 de la SEC ID No 9, estando el nucleótido C asociado a un cáncer cutáneo) y que conduce a la presencia de una histidina en la posición 294 de la proteína MC1R (SEC ID no :5).

Son bien conocidas por el experto en la materia unas técnicas para identificar un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 o de MC1R, e incluyen en particular el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), una técnicas de hibridación, las técnicas de secuenciación del ADN, la resistencia a la exonucleasa, la microsecuenciación, la extensión en fase sólida que utiliza unos ddNTPs, la extensión en solución utilizando unos ddNTPs, unos métodos de ligadura de oligonucleótidos, los métodos para detectar los SNP tales como la hibridación dinámica específica de alelo, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la minisecuenciación, la utilización de chips de ADN o también la hibridación de oligonucleótidos específicos de alelo como complemento de una sonda que presenta un marcado simple o doble y con la ayuda de reacciones de PCR.

Preferentemente, dicha técnica para identificar un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 o de MC1R es una técnica que permite detectar un polimorfismo asociado a un solo nucleótido (SNP).

El análisis de la expresión del gen MATP/SLC45A2 se puede realizar gracias a uno de los numerosos métodos bien conocidos por el experto en la materia y que permiten la detección del producto de expresión de dicho gen, tal como su ARN o su producto proteico.

En un modo de realización preferido, la expresión del gen MATP/SLC45A2 se efectúa por análisis de la expresión de transcritos de ARNm o de precursores de ARNm, tal como un ARN nativo, de dicho gen. Dicho análisis se puede realizar preparando el ARNm/ADNc de células de una muestra biológica de un paciente, e hibridación de ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia. El ARNm/ADNc preparado se puede utilizar en un análisis por hibridación o amplificación que incluye, sin limitarse a ellos, los análisis Southern y Northen, los análisis por PCR ("polymerase chain reaction"), tal como la PCR cuantitativa (TAQMAN) y la utilización de sondas ("probes arrays") tales como las matrices ADN GENECHIP® (AFFYMETRIX).

Ventajosamente, el análisis de la expresión del nivel de ARNm transcrito a partir de un gen MATP/SLC45A2 implica un procedimiento de amplificación de los ácidos nucleicos, como por ejemplo la RT-PCR (modo de realización experimental descrito en la patente US no 4.683.202), la reacción en cadena por la ligasa (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 88, p. 189-193, 1991), la replicación de secuencias auto-sostenida ("self sustained sequence replication") (GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 87, p. 1874-1878, 1990), el sistema de amplificación transcripcional, (KWOH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, p. 1173-1177, 1989), la "Q-Beta Replicase" (LIZARDÏ et al., Biol. Technology, vol. 6, p. 1197, 1988), la "rolling circle replication" (Patente U.S. no 5.854.033) o

cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos, seguido de una etapa de detección de las moléculas amplificadas por técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Estos modos de detección son particularmente útiles para la detección de moléculas de ácidos nucleicos en muy bajas cantidades. Tal como se utilizan en la presente memoria, los cebadores de amplificaciones se definen como un par de moléculas de ácidos nucleicos que pueden emparejarse respectivamente a las regiones 3' y 5' de manera específica (hebra positiva y negativa, o a la inversa) y encuadran una región corta de dicho gen. De manera general, los cebadores de amplificación tienen una longitud de 10 a 30 nucleótidos y permiten la amplificación de una región de una longitud comprendida entre 50 y 200 nucleótidos.

En otro modo de realización preferido, la medición de la expresión del gen MATP/SLC45A2 se realiza por análisis de la expresión de la proteína traducida a partir de dicho gen. Dicho análisis se puede realizar utilizando un anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo radiomarcado, marcado con un cromóforo, un fluoróforo, o una enzima), un derivado de anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo conjugado a un sustrato o a una proteína o un ligando de una proteína de un par ligando/proteína (por ejemplo biotina-estreptavidina)) o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo un anticuerpo de una sola cadena, una región hipervariable de un anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente a la proteína traducida a partir del gen MATP/SLC45A2.

Dichos análisis se pueden realizar mediante numerosas técnicas al alcance del experto en la materia que incluyen, sin limitarse a ellos, los ensayos inmunológicos basados en la utilización de la actividad enzimática ("enzyme immunoassay" EIA), los ensayos inmunológicos basados en la utilización de isotopos radioactivos (RIA), el análisis por transferencia Western y los ensayos ELISA ("enzyme linked immunoabsorbant assay").

A título de ejemplo de anticuerpos dirigidos contra la proteína MATP/SLC45A2, se pueden citar los anticuerpos disponibles en ABNOVA CORPORATION o en SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY.

Por lo tanto, unos anticuerpos policlonales también pueden ser preparados por inmunización de un animal apropiado, tal como un ratón, un conejo o una cabra, con la proteína MATP/SLC45A2 (Homo Sapiens; SEC ID no 3)

o un fragmento de ésta. La concentración de anticuerpos en el animal inmunizado puede estar seguida en el transcurso del tiempo por unas técnicas estándares, tales como un ensayo ELISA, utilizando un polipéptido inmovilizado. Un cierto tiempo después de la inmunización, por ejemplo cuando los títulos de anticuerpos específicos son más elevados, las células que producen los anticuerpos pueden ser extraídas del animal y ser utilizadas para preparar unos anticuerpos monoclonales (mAc) mediante las técnicas estándares, tales como la técnica de los hibridomas inicialmente descrita por KOHLER y MILSTEIN (Nature, vol. 256, p. 495-497, 1975), la técnica de los hibridomas de las células B humanas (KOZBOR et al., Immunol., vol.4, p. 72, 1983), la técnica de los hibridomas EBV (COLE et al., En Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p. 77-96, 1985) o la técnica de los triomas. La técnica para la producción de hibridomas es bien conocida (véase: Current Protocols in Immunology, COLIGAN et al. ed., John Wilev & Sons, New York, 1994). Los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal deseado son detectados por cribado de los sobrenadantes de cultivo de hibridomas para los anticuerpos que se unen al polipéptido de interés, por ejemplo utilizando un ensayo ELISA estándar.

El procedimiento según la presente invención puede comprender además una etapa de comparación del nivel de expresión del gen MATP/SLC45A2 en la muestra biológica de dicho sujeto con el nivel de expresión de dicho gen en una muestra control.

Como muestra control, se puede utilizar en particular una muestra biológica que procede de un sujeto sano, a saber que no padece y que no está predispuesto a un cáncer de piel.

Un nivel de expresión significativamente más bajo que el nivel de expresión del mismo gen en la muestra control indica que el paciente padece o está predispuesto a padecer un cáncer de piel.

Un "nivel de expresión significativamente más bajo del gen MATP/SLC45A2" se refiere a un nivel de expresión en una muestra biológica que es inferior a por lo menos el 20% del nivel normal de expresión de dicho gen, preferentemente inferior a por lo menos el 50% del nivel normal de expresión de dicho gen, y de manera particularmente preferida inferior en por lo menos el 90% al nivel normal de expresión de dicho gen.

El nivel "normal" de expresión del gen es el nivel de expresión de dicho gen en una muestra control que corresponde potencialmente a la muestra biológica de un paciente que no presenta cáncer de piel o, preferentemente, a la media del nivel de expresión de dicho gen en diferentes muestras control.

Otro objeto de la presente invención se basa en la utilización, para la preparación de una composición destinada al tratamiento y/o a la prevención de un cáncer de piel en un sujeto, de un compuesto que aumenta específicamente la expresión del gen MATP/SLC45A2 en una célula de la piel.

Por célula de la piel, se entiende una célula de la dermis o de la epidermis. Preferentemente, dicha célula de la piel tiene un melanocito.

Preferentemente, dicho compuesto que aumenta de manera específica la expresión del gen MATP/SLC45A2 se selecciona de entre el grupo que comprende la proteína MATP/SLC45A2 y sus derivados, un polinucleótido que codifica para dicha proteína o un vector que comprende dicho polinucleótido.

Por proteína MATP/SLC45A2, se entiende preferentemente la proteína MATP/SLC45A2 de Homo Sapiens (NP_001012527; SEC ID no 3).

Por "derivado" se entiende una proteína cuya secuencia presenta un porcentaje de identidad de por lo menos el 80%, por ejemplo de por lo menos el 85%, preferentemente de por lo menos el 90%, y de manera particularmente preferida de por lo menos el 95% con la secuencia polipeptídica de la proteína MATP/SLC45A2.

Por porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas, se entiende el porcentaje de aminoácidos idénticos, entre dos secuencias que deben ser comparadas, obtenido con la mejor alineación posible de dichas secuencias. Este porcentaje es puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias se reparten aleatoriamente en toda la longitud de las secuencias de aminoácidos. Por mejor alineación posible o alineación óptima, se entiende la alineación que permite obtener el porcentaje de identidad más elevado. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se realizan habitualmente comparando dichas secuencias después de que éstas hayan sido alineadas según la mejor alineación posible; la comparación se realiza entonces sobre segmentos de comparación con el fin de identificar y comparar unas regiones de similitud. La mejor alineación posible para efectuar una comparación se puede realizar utilizando el algoritmo de homología global desarrollado por SMITH y WATERMAN (Ad. App. Math., vol. 2, p. 482, 1981), utilizando el algoritmo de homología local desarrollado por NEDDLEMAN y WUNSCH (J. Mol. Biol., vol. 48, p. 443, 1970), utilizando el método de similitud desarrollado por PEARSON y LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol. 85, p. 2444, 1988), utilizando unos programas de ordenadores basados en tales algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), utilizando los algoritmos de alineación múltiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p. 1792, 2004). Para obtener la mejor alineación posible, se utilizará preferentemente el programa BLAST con la matriz BLOSUM 62 o la matriz PAM 30. El porcentaje de identidad se determina comparando las dos secuencias alineadas de manera óptima, dichas secuencias podrán comprender unas adiciones

o deleciones con respecto a la secuencia de referencia con el fin de obtener la mejor alineación posible entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posición idéntica entre las dos secuencias, dividiendo el número obtenido por el número total de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por polinucleótido, se entiende una secuencia de ARN o de ADN, preferentemente dicho polinucleótido es una secuencia de ADN.

Más ventajosamente, dicho polinucleótido está unido de manera operacional a una secuencia de expresión génica que dirige la expresión de dicho polinucleótido a una célula eucariota, preferentemente a una célula de la piel. Dicha secuencia de expresión génica corresponde a cualquier secuencia de regulación, tal como una secuencia promotora

o una combinación entre una secuencia promotora y una secuencia activadora, que facilita la transcripción y la traducción eficaz del polipéptido tal como se ha descrito anteriormente. Dicha secuencia de expresión génica puede corresponder a una secuencia promotora viral o eucariota, constitutiva o inducible.

A título de ejemplo de vectores que comprenden dicho polinucleótido, se pueden citar los plásmidos, los cósmidos y los virus, en particular los adenovirus y los retrovirus.

Ventajosamente, dicho compuesto que aumenta específicamente la expresión del gen MATP/SLC45A2 puede estar asociado a un soporte farmacéuticamente aceptable.

A título de ejemplo de soporte farmacéuticamente aceptable, la composición puede comprender unas emulsiones, unas microemulsiones, unas emulsiones aceite en agua, unos lípidos anhidros y unas emulsiones agua en aceite, u otros tipos de emulsiones.

La composición descrita puede comprender además uno o varios aditivos tales como los diluyentes, los excipientes, los estabilizantes y los conservantes. Dichos aditivos son bien conocidos por el experto en la materia y están descritos en particular en "Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a Ed." (diferentes editores, 1989-1998, Marcel Dekker); y en "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems" (ANSEL et al., 1994, WILLIAMS & WILKINS).

Otro objeto descrito se refiere a un procedimiento de selección in vitro de un compuesto susceptible de ser útil para el tratamiento del cáncer de piel, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) obtención de una célula que expresa el gen MATP/SLC45A2;

b) puesta en contacto de dicha célula con por lo menos un compuesto a ensayar;

c) comparación de la expresión del gen MATP/SLC45A2 entre las etapas a) y b);

d) selección del compuesto que induce un aumento del nivel de expresión del gen MATP/SLC45A2 en la célula en la etapa b) con respecto al nivel de expresión de dicho gen en la etapa a).

Ventajosamente, dicha célula que expresa el gen MATP/SLC45A2 se obtiene a partir de un sujeto que presenta un cáncer de piel.

Preferentemente, dicha célula presenta un nivel de expresión significativamente más bajo del gen MATP/SLC45A2, por comparación con una célula extraída de un sujeto que no presenta cáncer de piel.

Preferentemente, dicha célula corresponde a una célula de la piel, y más preferentemente a una célula procedente o derivada de un melanoma.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "compuesto" se refiere a cualquier tipo de moléculas tales como los polipéptidos, los polinucleótidos, los azúcares, los lípidos o cualquier otro compuesto químico.

Los métodos para determinar la expresión del gen MATP/SLC45A2 son bien conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos descritos anteriormente.

La presente invención se describirá con mayor detalle ahora con la ayuda de los ejemplos que ilustran la invención sin limitar de ninguna manera su ámbito.

Ejemplos

Materiales y métodos

Estudio de la población

Se incluyó prospectivamente en el estudio entre 2003 y 2003, 1019 pacientes y 1466 sujetos control, todos de origen caucásico. Los pacientes "melanoma" se reclutaron entre 2003 y 2006 en la cohorte del melanoma (MELAN-COHORT), una cohorte prospectiva que incluye a todos los pacientes con un melanoma del departamento dermatológico de todas las universidades afiliadas al hospital de París (Bichat, Percy, Ambroise Paré, Henri Mondor, Cochin y los hospitales de Saint Louis). El estudio de población está constituido por pacientes de 18 a 80 años de edad con melanomas malignos histológicamente probados. Los pacientes no eran incluidos si eran inmunodeficientes (VIH o trasplantados), o si sufrían de genodermatosis, que predispone a un cáncer de piel (albinismo, síndrome de Gorlin, o epiteliomatosis pigmentaria). El grupo control estaba compuesto por 1466 personas caucásicas, sin ningún antecedente de cáncer de piel.

El comité de ética médica local aprobó el protocolo de estudio. Se obtuvo un consentimiento informado de todos los pacientes y sujetos control inscritos para el estudio. Después de dicho consentimiento informado, el ADN genómico se aisló de los leucocitos de la sangre periférica de todos los participantes utilizando el QIAAMP BLOOD MINI KIT (QIAGEN).

Recogida de los datos sobre los factores de riesgo del melanoma

Los datos sobre las características de la pigmentación se han recogido para todos los pacientes y los 220 sujetos control. Se realizó una entrevista personal y estandarizada, y un examen de la piel del conjunto del cuerpo por un dermatólogo. El informe de los resultados utilizó un formulario de informe de examen estándar.

Las características de la piel se midieron por tipo de piel según la clasificación de FISTZPATRICK (FISTZPATRICK, Arch. Dermatol, vol.124, p. 869-71, 1988) y se evaluaron de la siguiente manera: siempre quemada, nunca morena (tipo de piel I), siempre quemada y después morena (tipo de piel II); siempre morena a veces quemada (tipo de piel III); y siempre morena, nunca quemada (tipo de piel IV). El color de los ojos se clasificó como oscuro (marrón o negro) o claro (azul, verde/castaño o gris) y el color original del cabello (antes del cabello gris) se clasificó utilizando 5 categorías: pelirrojo, rubio, marrón claro u oscuro, y negro. También se han evaluado por medio de un examen físico el recuento total de los nevus del cuerpo (dividido en 4 categorías: <10, 10-50, 50-100, >100), la presencia o ausencia de síndrome del lunar atípico (SLADE et al., J Am. Acad. Dermatol., vol. 32, p. 479-94, 1995) y la presencia

o ausencia de lentigos solares. Por otra parte, en el grupo de melanoma, también se han detallado la localización anatómica de los melanomas, la edad del paciente a diagnosticar y unos datos histopatológicos pertinentes.

Genotipo MC1R, SLC45A2 y OCA2 variables

Los polimorfismos de MC1R retenidos para el análisis genético eran los asociados con el fenotipo color de cabello pelirrojo (Alelos RHC) e incluyen c.252 C>A p.D84E, c425G>A p.R142H, c.p.R151C, c.476 C>T p.R160W y c.880G>C p.D294H (FLANAGAN et al. Hum Mol Genet, vol. 9, p. 2531-7, 2000; DUFFY et al., Hum. Mol. Genet., vol

13, p. 447-61, 2004; REES, Am. J. Hum. Genet., vol. 75, p. 739-51, 2004). Estas variantes están también asociadas con el riesgo de melanoma en múltiples poblaciones (STURM et al., Pigment Cell Res., vol. 16, p. 266-72, 2003; REES, Annu. Rev. Genet., vol. 37, p. 67-90, 2003), y han sido todas identificadas como generadoras de una pérdida de función en los estudios funcionales (BEAUMONT et al. Hum. Mol. Genet., vol. 14, p. 2145-54, 2005; BEAUMONT et al., Hum. Mol. Genet., 2007). Las 2 variantes de SLC45A2 estudiadas eran unos SNP no-sinónimos (C.1122 C>G, L374F y c.814G>A, E372K) que habían sido identificadas anteriormente como asociadas con la pigmentación humana normal (GRAF et al., Hum. Mutat., vol. 25, p. 278-84, 2005). Las variantes de OCA2 estudiadas eran los 3 SNP intrónicos recientemente presentados por estar asociados en gran medida con el color de los ojos, del cabello y de la pigmentación de la piel (rs7495174, rs4778241 y rs4778138) en una población anglo-céltica de Queensland. (DUFFY et al., Am. J. Hum. Genet., vol. 80, p. 241-52, 2007).

Todos los SNP han sido genotipados utilizando el sistema de genotipaje de SNP por PCR de KBIOSCIENCE. El sistema de genotipaje de SNP por PCR de KBIOSCIENCE es un nuevo sistema homogéneo y fluorescente de genotipaje, que utiliza una forma única de PCR específica de alelo que es distinta y diferente del método de discriminación alélica convencional. Este método de genotipaje se validó después por un método de genotipaje independiente, el método de genotipaje de discriminación alélica por ensayo TAQMAN de los SNP (APPLIED BIOSYSTEMS). Además, para los 2/3 de los SNP, la verificación de los genotipos correspondientes también se ha efectuado mediante la secuenciación de 50-100 muestras de ADN (ABRIPRISM 3130).

El genotipaje de las variantes de MC1R se efectuó con éxito en 828 pacientes (82%) y 1067 del control (72,78%). Las 2 variantes SLC45A2 han podido ser genotipadas eficazmente en el 95% de los pacientes y de los control. El genotipaje de las variantes OCA2 también se han efectuado para el 95% de los pacientes y de los control, salvo para OCA2-rs477824, que se ha podido genotipar sólo sobre el 81,2% de los pacientes.

Análisis estadístico

El elemento principal del análisis estadístico se realizó utilizando el COMPUTER R PACKAGE (versión 2.4.1). El nivel de significación para todos los ensayos se fijó a un nivel que corresponde a un porcentaje de error de tipo I de α = 5%. Tomando en consideración el número de ensayos realizados y el nivel de sus asociaciones, la mayoría de ellos habrían permanecido significativos si se hubiera aplicado una corrección de BONFERRONI para tomar en consideración el problema de ensayos múltiples. Todas las relaciones odds (OR) se han detallado con su intervalo de confianza del 95% (CI).

Asociación de los factores genéticos con el melanoma

La conformidad con el equilibrio HARDY-WEINBERG se ha ensayado en los controles utilizando un clásico, un grado de libertad, el ensayo chi al cuadrado. El análisis de la asociación individual de los factores genéticos con los melanomas (las variables MC1R, SLC45A2 y OCA2) se ha realizado comparando los casos y los controles utilizando un ensayo exacto de FISHER de genotipos (codificado con 0, 1 y 2, siendo 0 el genotipo más frecuente). Los OR correspondientes han sido fijados utilizando un análisis lógico estándar de regresión sobre los datos con, para cada polimorfismo, la referencia tomada como el genotipo más frecuente (0). Además, se realizó un análisis de la diversidad haplotípica sobre cada gen por el algoritmo de maximización de la esperanza (EM) utilizando el programa ARLEQUIN (Versión 3.01) (SCHNEIDER et al., Genetics and Biometry Lab, Dept of Anthropology, University of Geneva 2000). El desequilibrio de unión (LD) entre los pares de sitios polimórficos se midió en los controles utilizando las estadísticas comunes D, D' (LEWONTIN, Genetics, vol. 49, p. 49-67,1964) y r (HILL & ROBERTSON, Genetics, vol. 60, p. 615-28, 1968). Por último, las interacciones gen-gen se evaluaron utilizando el mismo sistema de regresión lógica.

Asociación de los factores clínicos con los melanomas

También se realizaron los análisis individuales de los factores clínicos habituales (color de la piel: pálida e intermedia frente a oscura, tipo de piel: I-II frente a III-IV, color del cabello: pelirrojo-rubio-marrón claro frente a marrón-negro, color de los ojos: claro/pálido frente a negro, el número de nevus: <50 frente a >50, las efelides y los lentigos dorsales: presencia frente a ausencia, comparando todos los casos y 220 del control con un ensayo exacto de genotipos de FISHER. Los OR correspondientes se han utilizado de nuevo utilizando un análisis de regresión lógica sobre los datos.

Asociación de los factores genéticos con los factores clínicos

En la medida en la que los tres genes analizados intervienen en la pigmentación, se realizaron también los análisis de asociación individual de los factores genéticos para cada factor clínico, adaptados al estatuto control-caso, de manera que ninguna asociación observada se debía a la asociación entre el melanoma y los factores clínicos considerados. Los OR correspondientes se examinaron por medio de las regresiones lógicas.

Integración de la genética y de los factores clínicos

Debido a que se han asociado con los 3 genes y con el melanoma, los factores clínicos pueden crear unas confusiones potenciales cuando se analiza la asociación de estos genes con la enfermedad. En esta parte de los

5 análisis, se ha utilizado un modelo lógico basado en un grupo de factores clínicos y genéticos para verificar si las asociaciones genéticas con el melanoma se revelaban también en presencia de los factores clínicos. Por último, los OR se han recalculado para los factores genéticos y clínicos seleccionados finalmente por ser los más pertinentes para el melanoma.

10 Resultados

Asociación de los factores genéticos con el melanoma

Para los controles, las frecuencias de genotipo para todos los polimorfismos ensayados se sitúan en el equilibrio de 15 HARDY-WEINBERG.

Los resultados para MC1R se presentan en la tabla I.

Tabla I 20

Genotipo MC1R: Caso Control P OR (Cl)

0/0: 510 841 referencia

1/0: 280 202 < 2,2 x 10 -16 2,29 (1,85-2,82)

1/1: 48 24 3,3 (2-5,45)

Alelos RHC de MC1R: Caso Control OR (Cl)

Sin alelos RHC: 0,793 0,887 referencia

R151C: 0,088 0,0042 2,35 (1,78-3,11)

R160W: 0,065 0,038 1,88 (1,40-2,54)

D294H: 0,042 0,019 2,49 (1,67-3,71)

R142H: 0,013 0,008 1,73 (0,92-3,28)

D84E: 0,0116 0,006 2,10 (1,04-4,25)

Los resultados han mostrado que la presencia de variantes RHC MC1R está asociada en gran medida con el riesgo de melanoma (P< 2,20 x 10-16). El riesgo de melanoma aumenta con el número de alelos RHC de OR = 2,29 con un alelo variante, a OR = 3,3 con dos alelos variantes. Por consiguiente, el efecto de estos polimorfismos sobre la

25 enfermedad es prácticamente acumulativo. Los resultados muestran las frecuencias alélicas menores para los 5 polimorfismos RHC y, con una excepción (R142H), son todos significativamente, individualmente más elevados en los pacientes con un melanoma que en los control.

Además, la asociación de las variantes de MC1R con el melanoma sigue siendo significativa después del ajuste con

30 el tipo de piel (P = 1,6 x 10-6), el color del cabello (P = 9,3 x 10-7), el color de los ojos (P = 6,48 x 10-7), el color del cabello (P = 8 x 10-7) y el número de nevus (P = 3,3 x 10-8).

Las tablas IIa y IIB resumen los resultados para las variantes de SLC45A2.

35 Tabla IIa: genotipo SLC45A2 para los sujetos y los control

SNP: Genotipo Caso Control P OR (Cl)

SLC45A2 E272K: CC 933 1,305 referencia

CT: 33 119 1,10 x10 -6 0,39 (0,26-0,58)

TT: 2 3 0,93 (0,16-5,59)

MAF: 0,019 0,044

SLC45A2 L374F: GG 895 1,160 referencia

GC: 65 246 2,12 x 10 -15 0,34 (0,26-0,46)

CC: 5 20 0,32 (0,24-0,43)

MAF: 0,39 0,10

MAF: frecuencia alélica menor

Tabla Ilb: genotipo SLC45A2 para los sujetos y los control

SLC45A2 haplotipos: Caso (n=1882) Control (n=2794) OR (Cl)

1: C814G1122 1807 (96) 2509 (89,8) referencia

2: C814C1122 39 (2,1) 164 (5,9) 0,33 (0,33-0,47)

3: T814C1122 30 (1,16) 112 (4) 0,37 (0,25-0,56)

SLC45A2 haplotipos: Caso (n=1882) Control (n=2794) OR (Cl)

4: T814G1122 6 (0,32) 9 (0,34) 0,92 (0,34-2,5)

1/1: CG/CG 867 (92,1) 1,126(80,6) Referencia

1/2: CG/CC 39 (4,1) 148(10,6) 0,34 (0,24-0,49)

1/3: CG/TC 28 (3) 100 (7,16) 0,36 (0,24-0,56)

Los resultados muestran que las 2 variantes de SLC45A2 (L374F y E272K) están estrechamente asociadas con el melanoma (P=2,12 x 10-15 y 1,10 x 10-6 respectivamente), con un desequilibrio de unión prácticamente completo entre los dos polimorfismos (D = 0,036, D' = 0,92 y r =0,59). La frecuencia alélica SLC45A2 374F en los control es 5 de 0,90, mientras que es de 0,96 para los pacientes (P=1,30 10 x 10-11). El análisis del haplotipo ha confirmado la asociación entre SLC45A2 y el melanoma (el ensayo exacto de FISHER aplicado a las frecuencias de Haplotipo da P=3,67 x 10-15, tabla 2b). El haplotipo C814C1122 es el más frecuente, habiendo sido encontrado en el 96% de los pacientes y el 89,8% de los control, mientras que los haplotipos C814C1122 y T814C1122 son significativamente más frecuentes en los controles (una diferencia que era debida a la variante L374F, como se precisa en la tabla 2b) y

10 tienen por tanto un efecto protector contra el melanoma. Un análisis similar de los diplotipos indica que 2 diplotipos (CG/CC y CG/TC) que están presentes hasta en el 17,76% de los controles procuran una protección contra el melanoma, mientras que el diplotipo más común (CG/CG) es significativamente más frecuente para los pacientes (92,1%) que para los control (80,1%) (el valor de P del ensayo exacto de FISHERS de los diplotipos = 1,89 x 10-13).

15 Por último, como los resultados han mostrado que el gen MATP/SLC45A2 está unido en gran medida con el melanoma, la secuencia codificante entera (7 exones) de este gen se secuenció para 48 pacientes que padecen melanomas, pero no se han identificado ninguna otra variante no sinónima o mutación patógena del gen SLC45A2.

De manera interesante, la asociación de MATP/SLC45A2 L374F con el melanoma sigue siendo significativa después

20 de la adaptación con el tipo de piel (P = 1,6 x 10-6), el color del cabello (P = 8,7 x 10-7), el color de los ojos (P = 1,21 x 10-4), y el número de nevus (P = 1 x 10-5).

En el caso de OCA2, un solo SNP (OCA2-rs4778138) se mostró débilmente asociado con el melanoma (P = 6,93 x 10-3). Los análisis de haplotipos y de diplotipos inducido por los 3 SNP de OCA2 no indican ninguna asociación

25 significativa más importante de este gen con el melanoma, a pesar de que el haplotipo TGT y el diplotipo anteriormente identificados como asociados en gran medida con el color de los ojos claros eran más frecuentemente observados en los pacientes que padecen melanoma que para los control. Sin embargo, la asociación de este SNP con el melanoma no era tampoco significativa después de la adaptación con el color de los ojos o después de la corrección para unos ensayos múltiples.

30 Se desarrolló un modelo logístico que incluye los factores genéticos, que presenta una asociación estadística con el melanoma (variable MC1R, SLC45A2 , L374F, SLC45A2, E272 K. y OCA2-rs4778138). Se tuvo en cuenta MC1R en función del número de alelos RHC (0, 4 ó 2) y los otros tres se codificaron combinando los genotipos menos frecuentes para reducir el modelo genético de dos parámetros sin perder ninguna información. Las asociaciones de

35 las variantes de MC1R y SLC45A2 L374F con el melanoma son las únicas a ser mantenidas, lo que sugiere que estos factores genéticos desempeñan un papel fuerte e independiente en la enfermedad.

La tabla III muestra el cálculo combinado de OR de los genotipos MC1R y SLC45A2 L374F.

40 Tabla III: cálculo de OR combinado para los genotipos MC1R y SLC45A2 L374F

Genotipo MC1R: Genotipo SLC45A2 Caso Control OR

0
0: 444 561 Referencia

0: 1 32 118 0,34 (0,23-0,51)

0: 2 3 13 0,29 (0,09-0,96)

1: 0 249 130 2,42 (1,89-3,09)

1
1: 20 30 0,84 (0,47-1,49)

1: 2 2 3 1,26 (0,22-7,19)

2: 0 39 11 4,48 (2,29-8,74)

2: 1 3 2 1,89 (0,38-1,52)

2
2: 0 0 na

El valor 0 designa los genotipos más frecuentes, que son tomados como referencia (en el caso de MC1R, la ausencia de variantes RHC, en el caso de SLC45A2 L374F, el genotipo GG), 1 designa la presencia de por lo 45 menos un alelo RHC para MC1R y del genotipo CG para SLC45A2 L374F, y 2 designa la presencia de dos variantes RHC para MC1R y del genotipo CC para SLC45A2 L374F.

"na" corresponde a "no aplicable".

50 La tabla III muestra los OR respectivos de todas las combinaciones de genotipos de los dos importantes factores

genéticos que predisponen al melanoma (MC1R y SLC45A2), e ilustra las diversas combinaciones de riesgo o protectoras.

Por último, se ha realizado un estudio de las interacciones potenciales entre la presencia de la variante de MC1R y cada variante de SLC45A2 o de OCA2, pero no se ha podido identificar ninguna interacción gen-gen.

Asociación de los factores clínicos con el melanoma

Se han estudiado las características clínicas principales de la cohorte del melanoma y 220 del control. Este estudio ha puesto en evidencia que los factores de riesgo más importantes correspondían a un número de nevus > (o igual) a 50 (OR=5,91), a un color de los ojos claro (OR=2,55), al tipo de piel I o II (OR=2,35), a un color de cabello claro (OR=2,18) y a unos lentigos solares (OR=3,19).

Asociación de los factores genéticos con los factores clínicos

En la medida en la que se han identificado estos tres genes por actuar los tres en la pigmentación, se han realizado también unos análisis de asociación individual de los factores genéticos sobre os factores principales de riesgo clínico, y se han adaptado para permitir distinguir el estatuto del control del del paciente que padece melanoma.

La asociación más fuerte era aquella entre OCA2 y el color de los ojos (P<2,20 x 10-16 para cada uno de los tres SNP OCA2), lo que confirma la asociación recientemente demostrada entre estos SNP y el color de los ojos (DUFFY et al., Am. J. Hum. Genet., vol. 80, p. 241-52, 2007). Se ha ensayado también la asociación específica del haplotipo TGT con el color de los ojos, y se ha encontrado también un valor de P muy significativo (P<2,20 x 10-16). Las tres variantes de OCA2 y el haplotipo TGT también estaban asociados en gran medida con el color del cabello (P<0,0001).

El SNP SLC45A2 L374F reveló estar estrechamente asociado con el color de los ojos (IP=2,09 x 10-5), con el color del cabello (P=6,96 x 10-8) y con el tipo de piel (P=6,2 x 10-8).

Por último, las variantes de MC1R han mostrado una asociación significativa con el color del cabello (P=1,49 x 10-8) y con el tipo de piel (P=1,30 x 10-8).

En resumen, el tipo de piel está asociado en gran medida con las variantes de SLC45A2 y de MC1R, el color de los ojos con OCA2 y en una menor medida con SLC45A2, y el color del cabello con los tres genes.

Notablemente, el número de nevus, que era el índice clínico del melanoma más importante en nuestro estudio, no estaba estadísticamente asociado a uno de estos genes de pigmentación.

Integración de la genética y de los factores clínicos

En base a unas asociaciones más fuertes identificadas en este estudio entre los factores clínicos y genéticos y el melanoma, se ha desarrollado un modelo lógico para ensayar la persistencia de las asociaciones con el melanoma y se recalcularon los OR correspondientes cuando los factores de riesgo estaban combinados.

En este modelo, se incluyó sólo el número de nevus ya que se trata del único factor de riesgo que no mostraba ninguna asociación con cada uno de los 3 genes. Se ha observado que la asociación de las variantes de MC1R y SLC45A2 L374F con el melanoma era aún altamente significativa en presencia de un número de nevos (P=1,14 x 10-7 y 3,32 x 10-6 respectivamente).

Además, era fácil calcular los OR acumulativos que resultan de la combinación de estos factores. En este modelo, el OR de las personas que tienen un número de nevus > (o igual) a 50, un alelo RHC para MC1R y el genotipo más frecuente SLC45A2 L374F (GG), OR = 5,26 x 3,85 = 20,25, da una aproximación del riesgo del melanoma para estas personas que es 20 veces más elevado que las que tienen un número de nevus <50, ningún alelo RHC, y uno de los genotipos SLC45A2 protectores.

Por último, el presente estudio ha permitido determinar que el genotipo GG SLC45A2 L374F constituye un nuevo parámetro importante que permite apreciar el riesgo de melanoma en un paciente, estando el alelo SLC45A2 374F claramente asociado con el riesgo de melanoma, mientras que el alelo SLC45A2 374L protegería del melanoma.

Además, el hecho de que el efecto de esta variante de SLC45A2 persiste después de la estratificación sobre las características de pigmentación o en un modelo de regresión lógica que integra los 2 factores de riesgo genético, y el número de nevus sugiere que con respecto al riesgo de melanoma la información relacionada al genotipo SLC45A2 L374F no es redundante con las características de pigmentación, y que esta variante es por lo tanto un factor de riesgo de melanoma fuerte e independiente.

Los resultados que se refieren al marcador SLC45A2 L374F han sido confirmados después sobre una cohorte de individuos españoles (Fernández LP et al., Human mutation 0,1-7, 2008).

Por otro lado, los presentes inventores han confirmado también los resultados que se refieren a los marcadores SLC45A2 L374F y MC1R sobre una población italiana.

5 Estos resultados demuestran por lo tanto sin ambigüedad de que los marcadores SLC45A2 L374F y también MC1R RHC son unos marcadores fiables de predisposición al melanoma, que pueden ser utilizados solos o en asociación para evaluar muy eficazmente el riesgo de predisposición al melanoma en el ser humano en general.

10 Listado de secuencias

<110> Assistance publique- Hôpitaux de Paris SOUFIR, Nadem

<120> Procedimiento in vitro de diagnóstico del cáncer de piel 15

<130> 353788

<150> FR 07/59193

<151> 21/11/2007 20

<160> 10

<170> Patentln versión 3.3 25 <210> 1

<211> 40060

<212> ADN

<213> Homo sapiens 30 <400> 1

<210> 2

<211> 601 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (301)..(301)

<223> N= C o G

<400> 2

<210> 3

<211> 460

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 601 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (301)..C301)

<223> N= C o T

<400> 4

5 <210> 5

<211> 317

<212> PRT

<213> homo sapiens

10 <400> 5 <210> 6

<211> 51 5 <212> ADN

<213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (26)..(26)

<223> N= A o C

<400> 6

<210> 7

<211> 601

<212> ADN 20 <213> homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (301)..(301) 25 <223> N= T o G

<400> 7

5

<210> 8

<211> 601

<212> ADN

<213> homo sapiens

10

<220>

<221> misc_feature

<222> (301)..(301)

<223> N = C o T

15

<400> 8

20 <210> 9

<211> 51

<212> ADN

<213> homo sapiens

25 <220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> N= G o C

30 <400> 9

<210> 10

<211> 3115

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro destinado a identificar a un sujeto que padece o que presenta una predisposición al cáncer de piel, caracterizado porque comprende la etapa de análisis de una muestra biológica de dicho sujeto mediante: 5

a) la detección de un polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 de SEC ID no 1, asociado a un solo nucleótido (SNP) se selecciona de entre el grupo que comprende la SNP rs16891982, que corresponde al nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 2, estando el nucleótido G asociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de una fenilalanina en la posición 374 de la proteína MATP/SLC45A2 de SEC ID no 3 y el SNP

10 rs26722 que corresponde al nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 4, estando el nucleótido C asociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de un residuo de glutamato en la posición 272 de la proteína MATP/SLC45A2 de SEC ID no 3.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la etapa b) de detección de un polimorfismo del 15 gen MC1R de SEC ID no 10.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicho sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano.

20 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho cáncer de piel es un melanoma.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho polimorfismo del gen MATP/SLC45A2 asociado a un solo nucleótido (SNP) corresponde al SNP rs16891982 que corresponde al

25 nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 2, estando el nucleótido G asociado a un cáncer cutáneo, y que conduce a la presencia de una fenilanalina en la posición 374 de la proteína MATP/SLC45A2 de SEC ID no 3.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque dicho polimorfismo del gen MC1R asociado a una predisposición al cáncer de piel corresponde a un polimorfismo asociado a un solo nucleótido 30 (SNP) seleccionado de entre el grupo que comprende el SNP rs1805006 que corresponde al nucleótido N en la posición 26 de la SEC ID no 6, estando el nucleótido A asociado a un cáncer cutáneo, y que conduce a la presencia de un glutamato en la posición 84 de la proteína MC1R de SEC ID no 5, correspondiendo el SNP rs1805007 al nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 7, estando el nucleótido T asociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de una cisteína en la posición 151 de la proteína MC1R de SEC ID no 5, correspondiendo el

35 SNP rs1805008 al nucleótido N en la posición 301 de la SEC ID no 8, estando el nucleótido T asociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de un triptófano en la posición 160 de la proteína MC1R de SEC ID no 5, correspondiendo el SNP rs1805009 al nucleótido N en la posición 26 de la SEC ID No 9, estando el nucleótido C asociado a un cáncer cutáneo y que conduce a la presencia de una histidina en la posición 294 de la proteína MC1R de SEC ID no 5.
7.

Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de análisis de la expresión del gen MATP/SLC45A2 en dicha muestra biológica.
8.

Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende además una etapa de comparación

45 del nivel de expresión del gen MATP/SLC45A2 en dicha muestra biológica con el nivel de expresión del gen MATP/SLC45A2 en una muestra control.