ES2420757T3 - Métodos de diagnóstico de la fibrosis hepática - Google Patents

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Abstract

Método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo, que comprende lasetapas de: (a) detectar macroglobulina-α2 en una muestra de dicho individuo, (b) detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho individuo, (c) detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho individuo, y (d) diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho individuo basándose en la presencia onivel de MG-α2, AH y TIMP-1.

Description

Métodos de diagnóstico de la fibrosis hepática
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere de manera general a los campos de la hepatología y la fibrosis y, más concretamente, a un panel de marcadores serológicos que conjuntamente son diagnósticos de la fibrosis hepática.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
La fibrosis progresiva del hígado, riñones, pulmones y otros órganos frecuentemente resulta en el fallo orgánico, que conduce al trasplante de órgano o a la muerte y afecta a millones de personas en los Estados Unidos y en todo el mundo. La fibrosis hepática, por ejemplo, es la causa gastrointestinal no maligna más importante de muerte en los Estados Unidos, y la progresión de la fibrosis es el determinante principal de morbilidad y mortalidad en pacientes con enfermedad hepática crónica. Además, el proceso de la fibrosis es común a enfermedades hepáticas de muchas etiologías, incluyendo la hepatitis B y C vírica crónica, enfermedades hepáticas autoinmunológicas tales como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa, la cirrosis biliar primaria y la enfermedad hepática inducida por medicamentos. La fibrosis observada en estos trastornos resulta de insultos crónicos al hígado, tales como la infección vírica, el alcohol o fármacos.
La hepatitis C, por ejemplo, es una de las causas principales de enfermedad hepática crónica en los Estados Unidos, en donde se estima que 3,9 millones de personas se encuentran infectadas crónicamente por virus de la hepatitis C (VHC) y aparecen aproximadamente 30.000 nuevos casos de VHC aguda cada año (Alter, Semin. Liver Dis. 15:5-14, 1995). La prevalencia de la hepatitis C se estima en 1,8% en los Estados Unidos, con hasta 10.000 muertes al año, resultando probablemente de la infección crónica de hepatitis C (Alter, supra, 1995).
Aunque la fibrosis hepática es un proceso reversible que resulta en la acumulación de matriz extracelular, la cirrosis hepática es un proceso irreversible caracterizado por bandas gruesas de matriz que circundan por completo el parénquima formando nódulos. Si no se trata, la fibrosis del hígado conduce a cirrosis y finalmente a enfermedad hepática de estadio terminal o a cáncer. La cirrosis del hígado es una condición común que con frecuencia no se llega a detectar. Por ejemplo, en una muestra de gran tamaño de la población danesa general, la prevalencia de cirrosis hepática era de 4,5%, de entre los que un tercio no habían sido diagnosticados en el momento de la muerte (Graudal, J. Intern. Med. 230:165-171, 1991).
El diagnóstico oportuno y exacto de la fibrosis hepática resulta importante para el tratamiento médico eficaz. A título de ejemplo, los pacientes con hepatitis C y cirrosis es menos probable que respondan al tratamiento con interferón-a que los pacientes con una enfermedad menos avanzada (Davis, Hepatology 26 (supl. 1):122-127S). De manera similar, los tratamientos para la infección crónica por VHC pueden estar contraindicados en pacientes con enfermedad histológicamente avanzada y descompensada (NIH Consensus Development Conference Panel Statement, Hepatology 26(supl. 1):25-105S, 1997). La importancia del diagnóstico precoz queda adicionalmente enfatizada por complicaciones tempranas graves tales como la ruptura de varices asociadas a la cirrosis; estas complicaciones pueden evitarse mediante una detección precoz de la cirrosis (Calés y Pasqual, Gastroenterol. Clin. Biol. 12:245-254, 1988).
El diagnóstico de la presencia o severidad de la enfermedad hepática fibrótica resulta difícil, siendo la biopsia hepática el método actualmente más fiable del que se dispone. Desafortunadamente, la biopsia hepática presenta varias limitaciones: dolor en aproximadamente 30% de los pacientes; riesgo de complicaciones severas, tales como hemorragias o infección; una tasa de muerte de 3 en 10.000, y el coste de la hospitalización (Nord, Gastrointest. Endosc. 28:102-104, 1982; Cadranel et al., Hepatology 32:47-481, 2000, y Poynard et al., Can. J. Gastroenterol. 14:543-548, 2000). Además, algunas enfermedades de progresión lenta tales como la hepatitis C requieren biopsias repetidas para una evaluación continua de la progresión de la enfermedad, incrementando de esta manera los riesgos y costes del procedimiento. Finalmente, la biopsia puede no detectar la enfermedad debido a la distribución heterogénea de los cambios patológicos en el hígado; por lo tanto, no resulta inesperado que se observen falsos negativos en un porcentaje significativo de casos biopsiados (Nord, supra, 1982).
Durante años se han buscado marcadores bioquímicos o serológicos que reflejen los procesos fibróticos de la enfermedad hepática y que puedan servir como sustituto de la biopsia hepática. Sin embargo, el rendimiento de cualquier marcador por sí solo no ha sido suficientemente bueno para sustituir el procedimiento de la biopsia en la detección o estadificación de la fibrosis. De esta manera, existe una necesidad de un método no invasivo de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática. La presente invención satisface dicha necesidad al
proporcionar un método conveniente y fiable para la detección de fibrosis hepática que resulta adecuado para los ensayos en serie. Se proporcionan asimismos ventajas relacionadas.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la detección de la macroglobulina-a2 (MG-a2) en una muestra del individuo; la detección de ácido hialurónico (AH) en una muestra procedente del individuo; la detección de inhibidor de metaloproteinasa-1 en tejidos (TIMP-1) en una muestra del individuo, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar una fibrosis hepática leve o la inexistencia de la misma (F0-F1), de la fibrosis hepática moderada a severa (F2-F4).
Los métodos de la invención para el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática pueden resultar útiles en una diversidad de poblaciones de pacientes, incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, aquéllas con hepatitis vírica, enfermedades hepáticas autoinmunológicas tales como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa y la enfermedad hepática inducida por medicamentos. En una realización, se utiliza un método de la invención para diagnosticar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática en un individuo infectado por virus de la hepatitis C.
Puede resultar útil una diversidad de medios para detectar a2-MG, AH y TIMP-1 en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse, utilizando, por ejemplo, uno o más de los agentes de unión específicos de MGa2, tales como anticuerpos anti-MG-a2. En otra realización, se pone en práctica un método de la invención mediante la determinación del nivel de actividad de MG-a2 en una muestra del individuo.
También puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar ácido hialurónico en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de AH en una muestra, por ejemplo utilizando uno o más agentes de unión específicos de AH, tales como proteínas de unión a AH (PUAH) o anticuerpos anti-AH.
De manera similar, también puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar TMP-1 en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse. El nivel de proteína TIMP-1 puede determinarse, por ejemplo, utilizando uno o más agentes específicos de TIMP-1, tales como anticuerpos anti-TIMP
1. En otra realización, la invención se pone en práctica mediante el ensayo de la actividad de TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse.
La invención proporciona, por ejemplo, un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación del nivel de AH en una muestra del individuo, y la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo y el diagnóstico de la presencia o severidad de fibrosis hepática en el individuo basándose en los niveles de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1. Si se desea, puede determinarse cada uno de los niveles de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1 utilizando un ensayo ligado a enzima.
Puede resultar útil una diversidad de muestras en la práctica de los métodos de la invención, incluyendo, por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático. En una realización, se obtiene una sola muestra del individuo que debe diagnosticarse. Dicha célula puede ser, por ejemplo, una muestra de suero. Dicha muestra también puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido, por ejemplo, una muestra de biopsia hepática. La presente invención proporciona además un método para diferenciar en un individuo una fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa. El método incluye las etapas de poner en contacto una dilución apropiada de una muestra del individuo con anticuerpo anti-MG-a2 bajo condiciones adecuadas para formar un primer complejo de MG-a2 y anticuerpo anti-MG-a2, el lavado del primer complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de primer complejo que contiene MG-a2, el contacto de una dilución apropiada de una muestra del individuo con una proteína de unión a AH bajo condiciones adecuadas para formar un segundo complejo de AH y proteína de unión a AH, el lavado del segundo complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de segundo complejo que contiene AH, el contacto de una dilución apropiada de una muestra del individuo con anticuerpo anti-TIMP-1 bajo condiciones adecuadas para formar un tercer complejo de TIMP-1 y anticuerpo anti-TIMP-1, el lavado del tercer complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de tercer complejo que contiene TIMP-1, y la diferenciación de la fibrosis hepática leve
o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en el individuo basándose en las cantidades de complejos que contienen MG-a2, AH o TIMP-1.
Los métodos de la invención pueden ponerse en práctica mediante la detección de los tres marcadores MG-a2, AH y TIMP-1 sin detectar marcadores serológicos adicionales o pueden combinarse con un método de detección de uno o más marcadores adicionales. De esta manera, en una realización, la invención se pone en práctica mediante la detección de MG-a2, AH y TIMP-1 y también la detección de por lo menos uno de los marcadores de fibrosis siguientes: propéptido procolágeno III N-terminal (PIIINP), laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, ApoA2 ó ApoB. En una realización adicional, la presencia o severidad de la fibrosis hepática se diagnostica mediante la detección de MGa2, AH, TIMP-1 y YKL-40 en una muestra de un individuo.
La presente invención proporciona además un método de seguimiento de la eficacia de la terapia antifibrótica en un paciente mediante la detección de macroglobulina-a2 en una muestra de un paciente en el que se ha administrado una terapia antifibrótica, la detección de ácido hialurónico (AH) en una muestra del paciente, la detección de inhibidor de tejidos de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra del paciente, y la determinación de la presencia
o severidad de fibrosis hepática en el paciente basada en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1, realizando de esta manera el seguimiento de la eficacia de la terapia antifibrótica. Dicho método puede incluir además, si se desea, comparar la presencia o severidad de la fibrosis hepática determinada en la etapa (d) con la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el paciente con mayor antelación. Los métodos de la invención pueden utilizarse para realizar un seguimiento, por ejemplo, de la progresión o regresión de la fibrosis con el tiempo en un paciente tratado con una o más terapias antifibróticas, o para comparar, por ejemplo, las eficacias de dos o más terapias antifibróticas.
En una realización, se detectan como máximo tres marcadores de fibrosis. En otra realización, el método incluye la etapa de detectar en una muestra del paciente por lo menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 ó apoB.
Puede resultar útil una diversidad de medios para detectar MG-a2, AH y TIMP-1 en un método de la invención. La etapa (a) puede ponerse en práctica, por ejemplo, mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en la muestra. En una realización, el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-MG-a2. La etapa (b) puede ponerse en práctica, por ejemplo, mediante la determinación del nivel de AH en la muestra. En una realización, el nivel de AH se determina utilizando uno o más proteínas de unión a AH. La etapa (c) puede ponerse en práctica, por ejemplo, mediante la determinación del nivel de TIMP-1 en dicha muestra. En una realización, el nivel de TIMP-1 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-TIMP-1.
En la presente memoria se proporciona además un método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo mediante la determinación del nivel de MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación de un nivel de AH en una muestra del individuo, la determinación de un nivel de TMIP-1 en una muestra del individuo, y el diagnóstico de que el individuo presenta una fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis en el caso de que el nivel de MG-a2 sea inferior a un valor de corte X1 de MG-a2, el nivel de AH sea inferior a un valor de corte Y1 de AH o el nivel de TIMP-1 sea inferior a un valor de corte Z1 de TIMP-1, el diagnóstico de que el individuo presenta una fibrosis hepática moderada a severa en el caso de que el nivel de MG-a2 sea superior a un valor de corte X2 de MG-a2, el nivel de AH es superior a un valor de corte Y2 de AH y el nivel de TIMP-1 es superior a un valor de corte Z2 de TIMP-1, y el diagnóstico de que los restantes individuos presentan un estatus indeterminado.
Los métodos de la invención basados en valores de corte dobles para los niveles de los marcadores MG-a2, AH y TIMP-1 pueden resultar útiles para diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en una diversidad de poblaciones de pacientes. Los métodos de la invención pueden resultar útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de que un individuo presenta una enfermedad hepática, tal como la hepatitis vírica, una enfermedad hepática autoinmunológica tal como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa o una enfermedad hepática inducida por medicamentos. En una realización, los métodos de la invención se utilizan para diferenciar una fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo infectado por el virus de la hepatitis C. Entre las muestras que resultan útiles en los métodos de la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático. En una realización, se pone en práctica un método de la invención mediante la determinación del nivel de MG-a2, el nivel de AH y el nivel de TIMP-1 en una o más muestras de suero del individuo que debe diagnosticarse.
De esta manera, la presente invención proporciona, por ejemplo, un método para diferenciar la fibrosis hepática leve
o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo en el que la diferenciación se basa en un valor de corte X1 de entre 1,8 y 2,2 mg/ml, un valor de corte Y1 de entre 31 y 39 ng/ml, un valor de corte Z1 de entre 900 y 1.100 ng/ml, un valor de corte X2 de entre 1,8 y 2,2 mg/ml, un valor de corte Y2 de entre 54 y 66 ng/ml y un valor de corte Z2 de entre 1.415 y 1.735 ng/ml. En una realización particular, la diferenciación se basa en
un valor de corte X1 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y1 de 35 ng/ml, un valor de corte Z1 de 1.000 ng/ml, un valor de corte X2 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y2 de 60 ng/ml y un valor de corte Z2 de 1.575 ng/ml. En otra realización, la diferenciación se basa en un valor de corte X1 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y1 de 37 ng/ml, un valor de corte Z1 de 1.100 ng/ml, un valor de corte X2 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y2 de 60 ng/ml y un valor de corte Z2 de 1.575 ng/ml. En una realización adicional, se seleccionan X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2, de manera que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 30%, se diagnostica que por lo menos 65% de los individuos en la población presenta fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis hepática o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%. En otra realización, se seleccionan X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2, de manera que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 30%, se diagnostica que por lo menos 65% de los individuos en dicha población presenta fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis hepática o fibrosis moderada/severa con un valor predictivo positivo de por lo menos 90% y un valor predictivo negativo de por lo menos 90%. En todavía una realización adicional, se seleccionan X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2, de manera que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 10%, se diagnostica que por lo menos 70% de los individuos en la población presenta fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis hepática o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%.
También se da a conocer un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con un valor de corte X1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; mediante comparación de un nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con un valor de corte Y1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que, en una población con una prevlanecia de hasta 40% de fibrosis, por lo menos 65% de los individuos en la población son diagnosticados con una precisión de por lo menos 90%.
El método puede incluir, si se desea, comparar un nivel de un tercer marcador fibrótico Z en el individuo con un valor de corte Z1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad o negatividad de X, Y y Z. El primer marcador fibrótico es MG-a2, el segundo marcador fibrótico es AH y el tercer marcador fibrótico es TIMP-1.
Los niveles de por lo menos estos tres marcadores fibróticos se comparan y, en una realización adicional, se comparan los niveles de exactamente tres marcadores fibróticos. En realizaciones adicionales, se comparan los niveles de por lo menos cuatro o por lo menos cinco marcadores fibróticos. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar la fibrosis leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa.
En una realización específica, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 65% de los individuos en una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 30% con una precisión de por lo menos 93%. En una realización adicional, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 70% de los individuos en una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 20% con una precisión de por lo menos 94%. En todavía una realización adicional, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 70% de los individuos en una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 10% con una precisión de por lo menos 96%.
La presente invención proporciona además un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con un valor de corte X1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; la comparación de un nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con un valor de corte Y1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que los valores de corte X1 e Y1 se optimizan individualmente para proporcionar una característica de rendimiento deseada, en la que el primer marcador fibrótico es MG-a2, el segundo marcador fibrótico es AH y el tercer marcador fibrótico es TIMP-1. El método de la invención
incluye las etapas de comparar el nivel de un tercer marcador fibrótico Z en el individuo con un valor de corte Z1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad o negatividad de X, Y y Z, en los que los valores de corte X1, Y1 y Z1 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada, en la que se comparan los niveles de MG-a2, AH y TIMP-1. En otra realización, se optimizan los valores de corte utilizando el análisis del diseño experimental (ADE). En realizaciones adicionales, se comparan los niveles de exactamente tres, por lo menos tres, por lo menos cuatro o por lo menos cinco marcadores fibróticos. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar la fibrosis leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa.
La invención proporciona además un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con dos valores de corte X1 y X2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; la comparación del nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con dos valores de corte Y1 e Y2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que, en la que los valores de corte X1, Y1, X2 e Y2 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada. Un método de la invención incluye además las etapas de comparar un nivel del tercer marcador fibrótico Z en el individuo con dos valores de corte Z1 y Z2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad o negatividad de X, Y y Z, en el que los valores de corte X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada. Los valores de corte pueden optimizarse convenientemente, por ejemplo utilizando el análisis ADE.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 1, y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID nº 2) para la macroglobulina-a2 humana madura, disponible de GenBank, número de acceso M36501.
La figura 2 muestra la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 3, y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID nº 4) para el inhibidor tisular humano de metaloproteinasa-1 (TIMP-1), disponible de GenBank, nº de acceso NM_003254.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Tal como se da a conocer en la presente memoria, los niveles séricos de varios marcadores bioquímicos se analizan en una población de pacientes con hepatitis C confirmada y que presentan un estadio Metavir (puntuación de fibrosis) conocida de F0 a F4, en la que F0 representa una fibrosis muy leve o ausente, y F1, F2 y F3 representan estadios intermedios de fibrosis, y F4 representa fibrosis severa (Knodell et al., Hepatology 1:431-435, 1981). Ver las Tablas 2 y 3. Mediante la utilización del análisis del diseño de experimentos (ADE) para la variación simultánea de múltiples valores de corte, se identificó un panel de cuatro marcadores constituido de ácido hialurónico (AH), PIIINP, colágeno de tipo IV y macroglobulina-a2 (MG-a2) que podía diferenciar la fibrosis F0-F1 (ausente o leve) de la fibrosis F2-F4 (moderada a severa) con una precisión de aproximadamente 77% en una población de pacientes con una prevalencia de fibrosis del 60%.
Tal como se da a conocer en mayor detalle en la presente memoria, en el Ejemplo I, dos paneles de tres marcadores, MG-a2/AH/TIMP-1 y MG-a2/AH/YKL-40 también diferenciaron bien la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4 al optimizar los valores de corte utilizando el análisis ADE. En particular, cada uno de los panales MG-a2/AH/TIMP1 y MG-a2/AH/YKL-40 presentó un mejor rendimiento que el panel de cuatro marcadores y fueron capaces de diferenciar la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4 con una precisión de aproximadamente 80% en la población de estudio. Tal como puede observarse en la Tabla 6, línea 15, por ejemplo, el panel MG-a2/AH/TIMP-1 presentó una sensibilidad de 83,48% y una especificidad de 75,95% en la población de estudio, que presentaba una prevalencia de fibrosis de 60%. Estos resultados demuestran que el panel de tres marcadores MG-a2/AH/TIMP-1 puede resultar útil para diferenciar la fibrosis leve o ausente de la fibrosis moderada a severa.
Basándose en estos resultados, la presente invención proporciona un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la detección de MG-a2 en una muestra del individuo, la detección de AH en una muestra del individuo, la detección de TIMP-1 en una muestra del individuo, y el diagnóstico de la presencia o severidad de fibrosis hepática en el individuo basado en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar una fibrosis hepática leve o la inexistencia de la misma (F0-F1), de la fibrosis hepática moderada a severa (F2-F4).
Trastornos fibróticos hepáticos y otros trastornos fibróticos
Los métodos de la invención pueden resultar útiles para diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en una diversidad de individuos, incluyendo los que corren riesgo de sufrir o manifiestan uno o más síntomas de un trastorno hepático caracterizado por fibrosis. Los métodos de la invención pueden utilizarse para diagnosticar fibrosis hepática en un individuo que presenta, por ejemplo, hepatitis vírica, tal como virus de la hepatitis A, B o C, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tal como VIH-1, hepatitis persistente crónica o hepatitis activa crónica, enfermedad hepática autoinmunológica, tal como hepatitis autoinmunológica, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática grasa, enfermedad hepática no alcohólica, incluyendo la enfermedad hepática grasa no alcohólica y la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, atresia
biliar, enfermedad hepática resultante de tratamiento médico (enfermedad hepática inducida por medicamentos) o una enfermedad hepática congénita. Los métodos de la invención pueden resultar extremadamente útiles, por ejemplo para reducir problemas de potencial daño hepático debido al tratamiento de metotrexato. El seguimiento periódico de la fibrosis hepática en individuos tratados con metotrexato u otros fármacos asociados a riesgo de daño hepático puede llevarse a cabo convenientemente utilizando los métodos no invasivos de la invención, sin los riesgos asociados a la biopsia hepática.
En una realización, los métodos de la invención resultan útiles para diferenciar los individuos que presentan una puntuación Metavir de F0 ó F1 de los individuos que presentan una puntuación Metavir de F2, F3 ó F4. La puntuación Metavir es un sistema aceptado de evaluación del grado de los especímenes de biopsia hepática y se describe en Knodell, supra, 1981. F0 es equivalente a la ausencia de fibrosis; F1 significa fibrosis portal sin septos. F2 significa fibrosis portal con unos cuantos septos. F3 significa numeros septos sin cirrosis. F4 significa cirrosis.
Se entiende que los métodos diagnósticos de la invención son aplicables a una diversidad de individuos, incluyendo individuos con enfermedad crónica o activa, individuos con uno o más síntomas de enfermedad fibrótica, individuos asintomáticos o sanos e individuos con riesgo de una o más enfermedades fibróticas. Además, resultará evidente para el experto en la materia que los métodos de la invención pueden resultar útiles, por ejemplo, para corroborar un diagnóstico inicial de enfermedad o para determinar la progresión de la fibrosis en un individuo con un diagnóstico definitivo previo de enfermedad fibrótica. Los métodos de la invención pueden utilizarse para realizar un seguimiento del estatus de una enfermedad fibrótica durante un periodo de tiempo y puede utilizarse además, si se desea, para realizar un seguimiento de la eficacia del tratamiento terapéutico. Si se desea, los resultados obtenidos de una muestra de un individuo sometido a terapia pueden compararse, por ejemplo, con los resultados de línea base del individuo previamente al tratamiento, con resultados anteriores durante el tratamiento o con un valor histórico o de referencia.
Los métodos de la invención resultan útiles para diagnosticar la severidad de la fibrosis hepática en un individuo. De esta manera, los métodos de la invenicón pueden resultar útiles para determinar el "estadio" o grado de fibrosis hepática. En una realización, se utiliza un método de la invención para determinar la puntuación Metavir de un individuo, por ejemplo un individuo con hepatitis C vírica. Tal como se ha indicado anteriormente, la puntuación Metavir es un sistema de puntuación de la fibrosis bien establecido que utiliza los valores de F0 (ausencia), F1 (fibrosis portal sin septos), F2 (fibrosis portal con pocos septos), F3 (fibrosis portal con numerosos septos en ausencia de fibrosis) y F4 (cirrosis). En otras realizaciones, se utiliza un método de la invención para determinar la puntuación Knodell (índice de actividad histológica), la puntuación Ishak (índice modificado de actividad histológica)
o la clasificación Scheuer de un individuo, por ejemplo un individuo con hepatitis C vírica. En una realización adicional, se utiliza un método de la invención para determinar la severidad de la fibrosis hepática en un individuo con EHNA, por ejemplo mediante la determinación según la propuesta de Brunt (Brunt et al., Am. J. Gastroenterol. 94:2467-2474, 1999). Se entiende que, en casos en los que se determina la severidad de la fibrosis hepática o de otro tipo de fibrosis según un método de la invención, cualquiera de los sistemas de puntuación anteriormente indicados o de otros sistemas aceptados de la técnica o claramente definidos puede resultar útil para informar de resultados que indican la severidad de la fibrosis.
Muestras
Puede resultar útil una diversidad de muestras en la práctica de los métodos de la invención, incluyendo, por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático. En una realización, se obtiene una sola muestra del individuo que debe diagnosticarse. Dicha célula puede ser, por ejemplo, una muestra de suero.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra" se refiere a un espécimen biológico que contiene uno o más marcadores fibróticos, tales como MG-a2, AH o TIMP-1. Una muestra puede ser, por ejemplo, una muestra líquida, tal como sangre completa, plasma, saliva, orina, líquido sinovial u otro líquido corporal, o una muestra de tejido, tal como una muestra de pulmón, hígado, riñón, próstata o mama. El experto en la materia entenderá que pueden diluirse las muestras líquidas, si se desea, previamente al análisis.
El experto en la materia entenderá que puede obtenerse una sola muestra del individuo que debe diagnosticarse y que puede subdividirse previamente a la detección de MG-a2, AH y TIMP-1. El experto en la materia entenderá además que, si se desea, pueden obtenerse dos o más muestras del individuo que debe diagnosticarse y que las muestras pueden ser del mismo tipo o de un tipo diferente. En una realización, se detecta cada uno de MG-a2, AH y TIMP-1 en muestras de suero. En otra realización, se obtiene una sola muestra de suero de un individuo y se subdivide previamente a la detección de MG-a2, AH y TIMP-1.
Macroglobulina-a2
Los métodos de la invención se basan, en parte, en la detección de macroglobulina-a2 en una muestra. La MG-a2
es un componente conservado altamente abundante del plasma que funciona como una proteína de unión a proteasa de amplio espectro que elimina las proteasas activas de los líquidos tisulares. Al contrario que los inhibidores de sitio activo de proteasa, miembros de la familia de la macroglobulina-a2, no inactivan la actividad catalítica de sus sustratos proteasa, sino que actúan mediante atrapamiento físico de la proteasa diana dentro de los pliegues del miembro de la familia de MG-a2. La MG-a2 misma es cortada por proteasas diana; la reorganización de la molécula de MG-a2 resulta en el secuestro de la proteasa diana dentro de un bolsillo interno de la molécula de MG-a2 (Starkey et al., Biochem. J: 131:823-831, 1973). Aunque una proteasa atrapada por MG-a2 se encuentra estéricamente bloqueada para interactuar con sustratos macromoleculares, tales como proteínas, sigue siendo activa contra sustratos de baja masa molecualr, tales como los compuestos amida y éster, los cuales son capaces de difundirse hasta el interior de la jaula MG-a2 y acceder al sitio enzimático. De esta manera, la actividad de la MGa2 se caracteriza, en parte, por la capacidad de inhibir la actividad proteolítica pero no la actividad amidolítica de un sustrato proteasa. La MG-a2 se caracteriza además por la capacidad de proteger las proteasas atrapadas frente a anticuerpos e inhibidores de sitio activo de alta masa molecular. Por ejemplo, la tripsina unida a la MG-a2 se encuentra protegida frente a la inhibición por el inhibidor de tripsina de soja (ITS).
En contraste con la limitada especificidad de los inhibidores de sitio activo de proteasa, la MG-a2 actúa sobre un amplio espectro de proteasas con una especificidad de sustrato y actividad catalítica diversas. Entre dichas proteasas diana se incluyen la tripsina, la subtilisina, la quimotripsina, la plasmina, la elastasa, la termolisina y la papaína. La diversidad de sustratos está determinada, en parte, por la región "cebo" de la MG-a2, una secuencia altamente flexible y expuesta al solvente de 30 a 40 residuos que contiene por lo menos un sitio sensible al corte por parte de cada una de las clases principales de enzima proteolítico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "macroglobulina a2" es sinónima de "MG-a2" y se refiere a una proteína con una homología estructural significativa con la MG-a2 humana (SEC ID nº 2) y que presenta una actividad inhibidora de proteasa de amplio espectro. La MG-a2 contiene un único enlace tiol-éster que resulta inactivado por pequeñas aminas primarias tales como la metilamina. De esta manera, la actividad de la MG-a2 puede caracterizarse, en parte, por la actividad inhibidora de proteasa sensible a metilamina. La MG-a2 puede distinguirse, si se desea, de otros miembros de la familia de la macroglobulina-a2, tales como proteínas de unión a proteasa relacionadas y C3, C4 y C5 del sistema del complemento (Sottrup-Jensen, "a2-Macroglobulin and Related Thiol Ester Plasma Proteins", en Putnam (editor), The Plasma Proteins: Structure, Function and Generic Control, segunda edición, Orlando: Academic Press, páginas 191-291, 1987. Se entiende que un ensayo de detección de MG-a2 puede ser específico para MG-a2 ó puede detectar adicionalmente otro u otros miembros de la familia de la macroglobulina-a2.
Los métodos de la invención se basan, en parte, en la detección de la macroglobulina-a2 en una muestra. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "detección de MG-a2" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo o cualitativo para determinar la presencia de MG-a2. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "determinación del nivel de MG-a2" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo directo o indirecto de MG-a2.
De manera similar, la detección de cualquier marcador fibrótico especificado en una muestra se refiere a la determinación de si el marcador se encuentra presente en la muestra, presentando dicho marcador fibrótico una correlación positiva o negativa con la fibrosis hepática o con otros trastorno fibrótico, tales como los indicados anteriormente en la presente memoria. Se entiende que la detección puede referirse al análisis no cuantitativo, por ejemplo la presencia o la ausencia de una característica particular, variable o sustancia bioquímica o sérica.
El diagnóstico se basa en el análisis de la muestra para la presencia o el nivel del marcador fibrótico o de otra característica y la comparación del mismo con un valor de referencia, en el que el valor de referencia sirve para ayudar a diferenciar los individuos con un trastorno fibrótico respecto de otros individuos. En el caso de que el marcador fibrótico sea un marcador bioquímico o sérico, la determinación de un "nivel" en una muestra se refiere a cuantificar el marcador fibrótico mediante la determinación de, por ejemplo, la cantidad relativa o absoluta de ARN, proteína o actividad del marcador fibrótico. De esta manera, determinar un nivel en una muestra comprende, aunque sin limitación, el análisis de los niveles relativos y absolutos de ARN, proteína y actividad, así como otras medidas directas e indirectas del marcador fibrótico tal como se comenta en mayor detalle posteriormente. Se entiende que cualquier ensayo que resulte útil para determinar un "nivel" de un marcador fibrótico también resulta útil para "detectar" el marcador.
Se conoce de la técnica una diversidad de ensayos para detectar MG-a2 y entre ellos se incluyen ensayos directos e indirectos para ARN de MG-a2, proteína MG-a2 y actividad de MG-a2. La MG-a2 puede detectarse, o puede determinarse un nivel de MG-a2, por ejemplo, mediante el análisis de los niveles de ARNm de MG-a2 utilizando técnicas rutinarias, tales como el análisis de transferencia northern o la PCR-RT, u otros métodos basados en la hibridación con una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a una parte de la secuencia codificante de MG-a2. Por ejemplo, se describen condiciones y sondas para el análisis de transferencia northern y la hibridación de transferencia en ranura de ARN en muestras humanas en Ortego et al., Exp. Eye Res. 65:289-299, 1997, y
Simon et al., Cancer Res. 56:3112-3117, 1996, respectivamente.
La MG-a2 también puede detectarse, o puede determinarse un nivel de MG-a2, mediante el ensayo para la proteína MG-a2 utilizando una diversidad de métodos. Los inmunoensayos, incluyendo los radioinmunoensayos, los inmunoensayos ligados a enzima y los ensayos de sándwich de dos anticuerpos, tales como los descritos en mayor detalle posteriormente, resultan útiles en los métodos de la invención. Por ejemplo, en los ensayos de nefelometría, los complejos de MG-a2 y anticuerpo anti-MG-a2 resultan en una dispersión lumínica incrementada que se convierte en una señal de tasa máxima, que es una función de la concentración de MG-a2 en la muestra. La MG-a2 también puede detectarse, por ejemplo, mediante inmunonefelometría láser utilizando un analizador nefelómetro Behring (Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biol. Chem. 27:261-276, 1989) y antisuero de conejo anti-MG-a2 humano, tal como se describe en Naveau et al., Dig. Diseases Sci. 39:2426-2432, 1994, o mediante la utilización del ensayo de nefelometría disponible comercialmente de Beckman Coulter (Brea, CA, kit nº 449430). Además, los anticuerpos anti-MG-a2 monoclonales y policlonales que resultan útiles en inmunoensayos pueden obtenerse fácilmente de una diversidad de fuentes. A títulos ejemplos, los anticuerpos purificados por afinidad de cabra anti-MG-a2 humana y de cabra anti-MG-a2 marcado con peroxidasa adecuados para inmunoensayos tales como los ensayos ELISA y la transferencia Western se encuentran disponibles de Cedarlane Laboratories Limited (Ontario, Canada; CL20010AP y CL20010APHP) y de Affinity Biologicals Incorporated (Ontario, Canada; GAA2M-AP y GAA2M-APHRP). Los niveles de proteína MG-a2 también pueden determinarse mediante cuantificación de la cantidad de proteína MG-a2 purificada. La purificación de la macroglobulina-a2 puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante HPLC, sola o en combinación con espectrometría de masas, o tal como se describe, por ejemplo, en Hall y Roberts, Biochem. J. 171:27-38, 1978, o en Imber y Pezzo, J. Biol. Chem. 256:8134-8139, 1981. La cuantificación puede determinarse mediante métodos bien conocidos, incluyendo los ensayos de Bradford, la tinción con azul de Coomassie y ensayos para proteína marcada radioactivamente.
Una diversidad de ensayos para la actividad de MG-a2 también pueden resultar útiles para detectar MG-a2 ó para determinar el nivel de MG-a2 en una muestra según un método de la invención. La MG-a2 puede detectarse, o puede determinarse indirectamente un nivel de MG-a2, por ejemplo, como función de la inhibición de la actividad de la proteasa diana, sin una inhibición correspondiente de la actividad amidolítica. Tal como se ha comentado anteriormente, las proteasas unidas a MG-a2 conservan la capacidad de hidrolizar los enlaces amida y éster de sustratos pequeños, aunque los sustratos de masa molecular elevada, tales como proteínas, no pueden ser hidrolizados (ver, por ejemplo, Armstrong et al., Develop. Compar. Immunol. 23:375-390, 1999). A título de ejemplo, la MG-a2 puede detectarse o puede determinarse el nivel de MG-a2 mediante el ensayo para la inhibición de la actividad de tripsina, subtilisina, quimotripsia, plasmina, elastasa, termolisina o papaína sin inhibición de la actividad amidolítica. Entre los sustratos convenientes que deben analizarse se incluyen la caseína marcada con 14C y la fibrina-125I.
La característica de la especificidad amplia de sustrato proteasa distingue la MG-a2 de los inhibidores de sitios activos de proteasa. Basándose en esta característica, puede detectarse la MG-a2 ó puede determinarse el nivel de MG-a2 mediante el ensayo para la inhibición de la actividad de dos o más proteasas con diferentes especificidades de sitio activo. La MG-a2 puede detectarse o puede determinarse el nivel de MG-a2 en una muestra, por ejemplo mediante el análisis de la reducción de la actividad de proteasa de dos o más proteasas diana, tales como dos o más de las proteasas siguientes: tripsina, subtilisina, quimotripsina, plasmina, elastasa, termolisina y papaína. Los sustratos de proteasa marcados, tales como caseína-14C o la fibrina-125I pueden resultar útiles en dichos métodos (Armstrong et al., supra, 1999).
La MG-a2 también puede detectarse, o puede determinarse el nivel de MG-a2, basándose en la capacidad de la MG-a2 de proteger una proteasa unidad frente a un anticuerpo o un inhibidor de elevado peso molecular. Puede añadirse una proteasa diana, tal como tripsina, subtilisina, quimotripsina, plasmina, elastasa, termolisina o papaía, a una muestra de plasma. Tras la eliminación de la proteasa no unida, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con anticuerpo anti-proteasa, puede determinarse la cantidad de proteasa unida por la MG-a2 utilizando un sustrato amida o éster de baja masa molecular. La cantidad de sustrato de baja masa molecular hidrolizado es un indicador de la cantidad de proteasa protegida, unida a MG-a2, y, por lo tanto, de la concentración de MG-a2. De manera similar, puede hacerse reaccionar una muestra con una proteasa tal como tripsina y posteriormente con un exceso de inhibidor de proteasa, tal como inhibidor de tripsina de soja, antes del ensayo de la actividad residual de tripsina con un sustrato de baja masa molecular tal como amida BAPpNA (p-nitroanilida de Na-benzoil-DL-arginina (Ganrot, Clin. Chem. Acta 14:493-501, 1966; Armstrong et al., J. Exp. Zool. 236:1-9, 1985)). La tripsina no secuestrada por MG-a2 resulta inactivada por el inhibidor de tripsina, quedando sólo la tripsina protegida por MG-a2 con capacidad para la hidrólisis del sustrato. De esta manera, una reacción positiva en un ensayo de inhibidor de tripsina de soja detecta la MG-a2 y es una medida cuantitativa de la cantidad de MG-a2 (Armstrong et al., supra, 1999). El experto en la materia entenderá que la presencia de inhibidores de proteasa de baja masa molecular capaces de inactivar enzima unido a MG-a2 pueden afectar a los resultados obtenidos con dicho ensayo. Se entiende además que dichos ensayos y otros ensayos rutinarios para la actividad de MG-a2, así como de los niveles de ARN o proteína MG-a2, pueden resultar útiles para detectar MG-a2 ó para determinar un nivel de MG-a2 en un método de la invención.
Ácido hialurónico
Los métodos de la invención se basan además, en parte, en la detección de ácido hialurónico o en la determinación del nivel de ácido hialurónico en una muestra. El ácido hialurónico, también conocido como hialuronato o hialuronano, es un polisacárido de elevado peso molecular con un esqueleto no ramificado constituido por fracciones alternantes de ácido glucurónico y �(1,3)-N-acetilglucosamina unidas mediante enlaces �-1,4. El ácido hialurónico puede presentar una longitud de entre unas cuantas y más de 1.000 unidades diméricas, presentando cada unidad dimérica un peso molecular de aproximadamente 450 D. El ácido hialurónico, el cual es producido principalmente por fibroblastos y otras células especializadas del tejido conectivo, desempeña una función estructural en la matriz del tejido conectivo. Además, el ácido hialurónico se encuentra ampliamente distribuido en el cuerpo y puede encontrarse en forma de molécula libre en, por ejemplo, plasma, líquido sinovial y orina. En el plasma, el ácido hialurónico presenta una semivida relativamente corta.
Los niveles séricos de AH pueden encontrarse elevados en enfermedades hepáticas, incluyendo la cirrosis (Bramley et al., J. Hepatol. 13:8-13, 1991; Ueno et al., Gastroenterol. 105:475-481, 1993); Oberti et al., Gastroenterol. 113:1609-1616, 1997, y McHutchison et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 15:945-951, 2000). Los niveles séricos de AH también pueden encontrarse elevados durante la inflamación sinovial y la destrucción del cartílago observadas en la artritis reumatoide; se ha observado que dichos niveles se correlacionan con la actividad de la enfermedad y el grado de implicación sinovial (Konttinen et al., Clin. Chimica Acta 193:39-48, 1990; Poole et al., Arthritis Rheum. 37:1030-1038, 1994); Goldberg et al., Arthritis Rheum. 34: 799-807, 1991, y Emlem et al., J. Rheum. 23:974-978, 1996). También pueden encontrarse presentes niveles séricos elevados de AH en, por ejemplo, pacientes con osteoartritis (OA), esclerosis sistémica progresiva (ESP) y lupus eritematoso sistémico (LES).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ácido hialurónico" es sinónima de "AH" y se refiere a un polímero de dos o más unidades diméricas de fracciones alternantes de ácido glucurónico y �(1,3)-Nacetilglucosamina unidades mediante enlaces �-1,4. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "detección de AH" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo o cualitativo para determinar la presencia de AH, y la expresión "determinación del nivel de AH" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo directo o indirecto de AH. En vista de lo anteriormente expuesto, se entiende que la expresión "detección de AH" comprende "determinar el nivel de AH".
El AH puede detectarse, o puede determinarse el nivel de AH, utilizando uno de entre una diversidad de ensayos bien conocidos basados en proteínas de unión a AH o anticuerpos anti-AH, o mediante cuantificación del AH purificado. Las proteínas de unión a AH, por ejemplo, pueden resultar útiles para detectar el AH; un ensayo radiométrico de AH basado en proteína de unión a AH marcado con 125I se encuentra disponible de Pharmacia (Guechot et al., Clin. Chem. 42:558-563, 1996). Otros ensayos comerciales basados en proteínas de unión a AH se encuentran disponibles de, por ejemplo, Corgenix (Westminster, CO, kit nº 029001). Además, el AH puede detectarse, o determinarse el nivel de AH, utilizando hialuronectina, tal como se describe en Maingonnat y Delpech, Ann. Clin. Biochem. 28:305-306, 1991, o utilizando el kit disponible de Nalgenunc International (Rochester, NY; Delpech y Bertrand, Anal. Biochem. 149:555-565, 1985). Entre los ensayos para detectar AH o para determinar un nivel de AH se incluyen una diversidad de ensayos de unión competitiva y no competitiva, por ejemplo ensayo de unión competitiva utilizando proteína de unión a AH marcada con 125I; ensayos de unión competitiva basados en hialuronectina (HN) marcada con fosfatasa alcalina, y ensayos de unión no competitiva basados en proteoglicano marcado con peroxidasa o proteína de unión a AH marcada con peroxidasa, entre otros (Lindquist et al., Clin. Chem.
38: 127-132 (1992)). Ver también Delpech y Bertrand, supra, 1985; Engstrom-Laurent et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 45:497-504, 1985; Brandt et al., Acta Otolaryn. 442(supl.):31-35, 1987; Goldberg, Anal. Biochem. 174:448458, 1988; Chichibu et al., Clin. Chim. Acta 181:317-324, 1989; Li et al., Conn. Tissue Res. 19:243-254, 1989; Poole et al., Arth. Rheum. 33:790-799, 1990; Poole et al., J. Biol. Chem. 260:6020-6025, 1985, y Laurent and Tengblad, Anal. Biochem. 109:386-394, 1980). Los ensayos para detectar AH o para determinar el nivel de AH en una muestra pueden llevarse a cabo utilizando una diversidad de formatos de inmunoensayo, incluyendo los radioinmunoensayos y los inmunoensayos ligados a enzima. El antisuero anti-AH útil en los inmunoensayos puede ser, por ejemplo el antisuerpo anti-AH de oveja purificado por afinidad disponible de Biotrend (Cologne, Alemania, nº 5029-9990).
También puede determinarse el nivel de AH mediante la purificación del AH de una muestra y la cuantificación de la cantidad de polisacárido purificado. Puede utilizarse la cromatografía líquida de alto rendimiento sola o conjuntamente con espectrometría de masas. A título de ejemplo, puede utilizarse la HPLC para determinar los niveles de AH tras la digestión de muestras que contienen un estándar interno con hialuronidasa, la separación con una columna de fase inversa de octadecilisililo y la elución con fosfato de tetrabutilamonio 0,01 M-acetonitrilo (83:17, v/v) a pH 7,35 (Payan et al., J. Chromatogr. 566:9-18, 1991).
Se ha demostrado que los niveles de AH se correlacionan con los niveles de hialuronidasa (Bray et al., Am. Rev. Respir. Dis. 3:284-288, 1991). De esta manera, el AH puede detectarse, o puede determinarse el nivel de AH,
indirectamente mediante ensayo de la actividad de hialuronidasa. Se conocen de la técnica ensayos de actividad de hialuronidasa, tal como se describe en Bray et al., supra, 1991. El experto en la materia entenderá que dichos ensayos y otros ensayos rutinarios para determinar los niveles de hialuronidasa o de AH se encuentran comprendidos en las expresiones "detección de AH" y "determinación del nivel de AH" y pueden resultar útiles en el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática según un método de la invención.
TIMP-1
Los métodos de la invención se basan además en la detección de TIMP-1 en una muestra y, en realizaciones particulares, en la determinación de un nivel de TIMP-1 en una muestra. Los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) regulan la actividad de las metaloproteinasas de matriz (MMP), los cuales son un grupo importante de enzimas degradativos de la ECM que incluye la gelatinasa A (MMP-2) y la gelatinasa B (MMP-9). En el hígado normal, los componentes matriciales, tales como colágenos, fibronectina, laminina, tenascina, undulina y entactina son constantemente remodelados por los enzimas degradativos de la matriz, controlando la deposición de la matriz extracelular. La elevación de los niveles de TIMP resulta en la inhibición de la actividad de MMP y favorece la acumulación de la matriz extracelular. Los TIMP, incluyendo TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4, interactúan con las metaloproteinasas de matriz con una estequiometría 1:1 e inhiben la actividad de metaloproteasa mediante unión no covalente reversible. TIMP-1, TIMP-2 y TIMP-3 presentan actividades inhibidoras de MMP similares, inhibiendo la actividad proteolítica de la colagenasa, la gelatinasa, la estromelisina, la proteoglicanasa y las metaloelastasas, aunque su localización y regulación son diferentes (Cawston et al., "Protein Inhibitors of Metalloproteinases", en: Barrett and Salvesen (editores), Proteinase Inhibitors, Amsterdam, Elsevier, páginas 589 a 610, 1986).
La TIMP-1 humana es una sialoglucoproteína de 184 aminoácidos con un peso molecular de 28,5 kDa (Murphy et al., Biochem. J. 195:167-170, 1981; Dockerty et al., Nature 318:66-69, 1985, y Bodden et al., J. Biol. Chem. 269: 18943-18952, 1994). La TIMP-1 inhibe todas las metaloproteinasas activas, por ejemplo la colagenasa MMP-1, así como la estromelisina y la gelatinasa B (MMP-9). La secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID nº 3, y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID nº 4) de la TIMP-1 humana se muestran en la figura 2.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1" es sinónima de "TIMP-1" y se refiere a una proteína con una homología estructural significativa con la TIMP-1 humana (SEC ID nº 4) que inhibe la actividad proteolítica de las metaloproteinasas con una especificidad similar a la TIMP-1 humana. La presencia de TIMP-1 humana puede detectarse convenientemente mediante la presencia de epítopos, los cuales son reactivos con un anticuerpo anti-TIMP-1 específico conocido, tal como 7-6Cl ó 7-23G9.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "detección de TIMP-1" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo o cualitativo para determinar la presencia de TIMP-1, y la expresión "determinación del nivel de TIMP-1" se refiere a cualquier ensayo cuantitativo directo o indirecto de TIMP-1. En vista de lo anteriormente expuesto, se entiende que la expresión "detección de TIMP-1" comprende "determinación del nivel de TIMP-1".
Los ensayos de detección de TIMP-1 y para determinar un nivel de TIMP-1 incluyen ensayos bien conocidos de TIMP-1, ARN, proteínas y actividades enzimáticas. Los métodos para determinar los niveles de ARN de TIMP-1 mediante análisis de transferencia northern o PCR-RT son bien conocidos de la técnica (Yoshijiet et al., Int. J. Cancer 69:131-134, 1996; Janowska-Wieczorek et al., Exp. Hematol. 28:1274-1285, 2000, y Groft et al., Br. J. Cancer 85:55-63, 2001) se describen en mayor detalle posteriormente. La proteína TIMP-1 puede detectarse, o el nivel de proteína TIMP-1 puede determinarse convenientemente, por ejemplo mediante radioinmunoensayo tal como se describe en Brophy et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903, 1990, o mediante ensayo sándwich de dos anticuerpos, tal como se describe en Murawaki et al., Clinica Chimica Acta 218:47-58, 1993. Las concentraciones plasmáticas de proteína TIMP-1 pueden someterse a ensayo mediante ELISA con un kit disponible comercialmente de Amersham Pharmacia (ver también el Ejemplo III). Los niveles de proteína TIMP-1 también pueden determinarse mediante cuantificación de la cantidad de proteína TIMP-1 purificada. La purificación de TIMP1 puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante HPLC, sola o en combinación con espectrometría de masas, o tal como se describe, por ejemplo, en Murphy et al., Biochem. J. 195:167-170, 1978, o en Stricklin y Welgus, J. Biol. Chem. 258:12252-12258, 1983. TIMP-1 también puede detectarse o determinarse un nivel de TIMP-1 mediante el ensayo para la inhibición de la actividad de una o más metaloproteasas, por ejemplo utilizando la zimografía inversa en gelatina, tal como se describe en Kossakowska et al., Amer. J. Pathology 153:1895-1902, 1998. Los ensayos para ARN, proteína o actividad de TIMP-1 se describen en mayor detalle posteriormente, y el experto en la materia entenderá que estos ensayos y otros ensayos rutinarios para detectar TIMP-1 se encuentran comprendidos en los métodos de la invención.
Análisis de inclusión/descarte
Tal como se da a conocer en la presente memoria, pueden utilizarse dos conjuntos de valores de corte para incrementar la precisión de un ensayo basado en el panel de tres marcadores MG-a2/AH/TIMP-1. Tal como se
indica en el Ejemplo II, un primer conjunto de valores de corte para MG-a2, AH y TIMP-1 se seleccionó basándose en la optimización para la sensibilidad con el fin de, en primer lugar, descartar la fibrosis, seguido del análisis de la población "positiva" utilizando un segundo conjunto de valores de corte optimizado para especificidad con el fin de determinar la presencia de fibrosis significativa. La Tabla 7 muestra los resultados de la estrategia de doble optimización sobre la población de estudio de 194 pacientes de VHC. Los valores de corte primarios se fijaron en 2,0 mg/ml, 35 ng/ml y 1.000 ng/ml para MG-a2, AH y TIMP-1, respectivamente, para alcanzar una elevada sensibilidad en el análisis primario. Cualesquiera muestras con los tres niveles, de MG-a2, de AH y de TIMP-1, superiores a los valores de corte primarios se indicó tentativamente que eran positivos para fibrosis F2-F4 y se evaluaron adicionalmente utilizando un segundo conjunto de valores de corte de 2,0 mg/ml, 60 ng/ml y 1.575 ng/ml para MGa2, AH y TIMP-1, respectivamente, los cuales se obtuvieron mediante la optimización para la especificidad.
Mediante la utilización del segundo conjunto de valores de corte optimizados para especificidad elevada, 54 de los 122 pacientes inicialmente designados como positivos para fibrosis F2-F4 se confirmaron como positivos, de los cuales sólo uno era un falso positivo. En resumen, de los 194 pacientes de VHC en la población de estudio, se clasificaron 72 como negativos (que presentaban fibrosis F0-F1) y 54 se clasificaron como positivos (que presentaban fibrosis F2-F4), mientras que 68 muestras presentaron resultados indeterminados y no se clasificaron. Al excluir las muestras indeterminadas, el panel de MG-a2/AH/TIMP-1 produjo un valor predictivo positivo de aproximadamente 98% y un valor predictivo negativo de aproximadamente 79%. Además, en una población de pacientes más típica que presentaba una prevalencia de fibrosis de 30%, el mismo panel produjo valores predictivos positivos y negativos próximos a 93%. Estos resultados indican que la utilización de niveles de corte primarios y secundarios, en los que se optimiza inicialmente la sensibilidad, seguido de la optimización de la especificidad, puede incrementar la precisión global de un ensayo de tres marcadores, resultando en un ensayo de panel con una precisión de aproximadamente 93% para las muestras no indeterminadas, lo que constituye aproximadamente 70% de las muestras sometidas a ensayo.
De esta manera, la presente invención proporciona un método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo mediante la determinación del nivel de MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación de un nivel de AH en una muestra del individuo, la determinación de un nivel de TIMP-1 en una muestra del individuo, y el diagnóstico de que el individuo presenta una fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis en el caso de que el nivel de MG-a2 sea inferior a un valor de corte X1 de MG-a2, el nivel de AH sea inferior a un valor de corte Y1 de AH o el nivel de TIMP-1 sea inferior a un valor de corte Z1 de TIMP-1, el diagnóstico de que el individuo presenta una fibrosis hepática moderada a severa en el caso de que el nivel de MG-a2 sea superior a un valor de corte X2 de MG-a2, el nivel de AH es superior a un valor de corte Y2 de AH y el nivel de TIMP-1 es superior a un valor de corte Z2 de TIMP-1, y el diagnóstico de que los restantes individuos presentan un estatus indeterminado.
Los métodos de la invención basados en valores de corte dobles para los niveles de los marcadores MG-a2, AH y TIMP-1 pueden resultar útiles para diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en una diversidad de poblaciones de pacientes. Dichos métodos pueden resultar útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de que un individuo presenta una enfermedad hepática, tal como la hepatitis vírica, una enfermedad hepática autoinmunológica tal como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa o una enfermedad hepática inducida por medicamentos. En una realización, se utiliza un método de la invención para diferenciar una fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo infectado por el virus de la hepatitis C. Entre las muestras que resultan útiles en los métodos de la invención basados en valores de corte dobles se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático. En una realización, se pone en práctica un método de la invención mediante la determinación del nivel de MG-a2, el nivel de AH y el nivel de TIMP-1 en una o más muestras de suero.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo en el que la diferenciación se basa en un valor de corte X1 de entre 1,8 y 2,2 mg/ml, un valor de corte Y1 de entre 31 y 39 ng/ml, un valor de corte Z1 de entre 900 y 1.100 ng/ml, un valor de corte X2 de entre 1,8 y 2,2 mg/ml, un valor de corte Y2 de entre 54 y 66 ng/ml y un valor de corte Z2 de entre 1.415 y 1.735 ng/ml. En otra realización, la diferenciación se basa en un valor de corte X1 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y1 de 35 ng/ml, un valor de corte Z1 de 1.000 ng/ml, un valor de corte X2 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y2 de 60 ng/ml y un valor de corte Z2 de 1.575 ng/ml. En todavía otra realización, la diferenciación se basa en un valor de corte X1 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y1 de 37 ng/ml, un valor de corte Z1 de 1.100 ng/ml, un valor de corte X2 de 2,0 mg/ml, un valor de corte Y2 de 60 ng/ml y un valor de corte Z2 de
1.575 ng/ml. En una realización adicional, se seleccionan X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2, de manera que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 30%, se diagnostica que por lo menos 65% de los individuos en la población presenta fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis hepática o fibrosis moderada a severa con una precisión de por lo menos 90%. En todavía una realización adicional, se seleccionan X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2, de manera que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 10%, se diagnostica que por lo
menos 70% de los individuos en la población presenta fibrosis hepática leve o no presenta fibrosis hepática o fibrosis moderada a severa con una precisión de por lo menos 90%.
Tal como se ha indicado anteriormente, los métodos de la invención son altamente precisos para determinar la presencia o severidad de la fibrosis en un subgrupo de la población de pacientes entera sometida a ensayo. Por ejemplo, tal como se muestra en la Tabla 7, los métodos de la invención alcanzan una precisión superior al 93% en la determinación del estatus de la fibrosis F0-F1 ó F2-F4 en aproximadamente 70% de una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de 30%. El 30% restante de la población de pacientes se indica que presenta un estatus indeterminado. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "estatus indeterminado" se refiere a que el individuo no puede ser fiablemente diagnosticado con un valor predictivo suficiente. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "X1" o "X2" se refiere a un valor de corte de MG-a2 respecto al que se compara el nivel de una muestra experimental de MG-a2. De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el término "Y1" o "Y2" se refiere a un valor de corte de AH respecto al que se compara el nivel de una muestra experimental de AH. El término "Z1" o "Z2", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un valor de corte de TIMP-1 respecto al que se compara el nivel de una muestra experimental de TIMP-1. Los valores de corte X1, Y1 y Z1 se agrupan para determinar la presencia o severidad de la fibrosis en una muestra. Los valores de corte X2, Y2 y Z2 se agrupan para determinar la presencia o severidad de la fibrosis en una muestra. Una muestra que presentase un nivel de MG-a2 inferior a X1, un nivel de AH inferior a Y1, o un nivel de TIMP-1 inferior a Z1 se clasificaba como presentando una fibrosis F0-F1. Una muestra que presentase un nivel de MG-a2 superior a X1, un nivel de AH superior a Y1, y un nivel de TIMP-1 superior a Z1 se consideraba posiblemente positivo para fibrosis F2-F4 y que merceía un análisis adicional. Además, una muestra que presentase un nivel de MG-a2 superior a X2, un nivel de AH superior a Y2, y un nivel de TIMP-1 superior a Z2 se consideraba que presentaba fibrosis F2-F4. Una muestra que presentase un nivel de MG-a2 superior a X1, un nivel de AH superior a Y1, y un nivel de TIMP1 superior a Z1, pero uno o más niveles inferiores a X2, Y2 ó Z2 se clasificaba como presentando un "estatus indeterminado". Se entiende que X2 generalmente es igual o superior a X1; Y2 generalmente es igual o superior a Y1 y Z2 generalmente es igual o superior a Z1.
El experto en la materia podrá seleccionar los valores de cortee X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2 de MG-a2, AH y TIMP-1 para conseguir uno o más parámetros clínicamente útiles, tal como una sensibilidad o especificidad, un valor predictivo negativo deseado, un valor predictivo positivo o una precisión deseados para una población de pacientes que presente una prevalencia particular de fibrosis. La metodología de optimización del diseño factorial, también conocida como Diseño de Experimentos, puede utilizarse para, por ejemplo, seleccionar los valores de corte apropiados. Tal como se da a conocer en la presente memoria, en el Ejemplo II, el software de optimización (DOE Keep It Simple Statistically, de Air Academy Associates (Colorado Springs, CO) se utilizó en un experimento de diseño central compuesto para variar simultáneamente los tres valores de corte X1, Y1 y Z1 y después para variar simultáneamente los tres valores de corte X2, Y2 y Z2. En particular, se varió el valor de corte de MG-a2 entre 2,0 y 5,0 mg/ml; el valor de corte de AH se varió entre 25 y 75 ng/ml y el valor de corte de TIMP-1 se varió entre 1.000 y
1.700 ng/ml. Mediante la comparación de los resultados de ensayo determinados para los 194 pacientes en la base de datos (ver la Tabla 4) con los valores de corte asignados X1, Y1 y Z1, se determinó que cada una de las 194 muestras era un verdadero positivo, un verdadero negativo, un falso positivo o un falso negativo, y se determinaron los parámetros clínicos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y precisión para la población de pacientes de estudio. Aunque la determinación de los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 se ilustra en la presente memoria utilizando el programa KISS de ADE, el experto en la materia entenderá que también pueden utilizarse otros programas informáticos para identificar interacciones cooperativas entre múltiples variables y para llevar a cabo cálculos simultáneos de ecuaciones. Por ejemplo, el software de optimización ECHIP, disponible de ECHIP, Incorporated (Hockessin, DE) o el software de optimización Statgraphics, disponible de STSC, Incorporated (Rockville, MD) también pueden resultar útiles para determinar los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 que resultan útiles en los métodos de la invención.
Los parámetros clínicos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y precisión se calculan utilizando verdaderos positivos, falsos positivos, verdaderos negativos y falsos negativos. Una muestra "verdadero positivo" es una muestra positiva para el estadio indicado de fibrosis según la biopsia clínica, que además ha sido diagnosticada como positiva según un método de la invención. Una muestra "falso positivo" es una muestra negativa para el estadio indicado de fibrosis según la biopsia, que además ha sido diagnosticada como positiva según un método de la invención. De manera similar, una muestra "falso negativo" es una muestra positiva para el estadio indicado de fibrosis según la biopsia, que además ha sido diagnosticada como negativa según un método de la invención. Una muestra "verdadero negativo" es una muestra negativa para el estadio indicado de fibrosis según la biopsia, que además ha sido diagnosticada como negativa según un método de la invención. Ver, por ejemplo, Motulsky (editor), Intuitive Biostatistics, New York: Oxford University Press, 1995.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sensibilidad" se refiere a la probabilidad de que un método diagnóstico de la invención proporcione un resultado positivo en el caso de que la muestra sea positiva, por ejemplo
fibrótica con una puntuación Metavir de F2-F4. La sensibilidad se calcula como el número de resultados verdaderos positivos dividido por la suma de verdaderos positivos y falsos negativos. La sensibilidad esencialmente es una medida de lo bien que un método identifica correctamente los pacientes que presentan enfermedad fibrótica. En un método de la invención, los valores X1, Y1, Z1, X2, Y2 e Y2 pueden seleccionarse de manera que la sensibilidad del diagnóstico de un individuo sea de por lo menos aproximadamente 70%, y puede ser de, por ejemplo, por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, o en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "especificidad" se refiere a la probabilidad de que un método diagnóstico de la invención proporcione un resultado negativo en el caso de que la muestra no sea positiva, por ejemplo que no sea del estadio Metavir de fibrosis F2-F4. La especificidad se calcula como el número de resultados verdaderos negativos dividido por la suma de verdaderos negativos y falsos positivos. La especificidad es esencialmente una medida de lo bien que un método excluye aquellos pacientes que no presentan fibrosis. En un método de la invención, los valores de corte X1, Y1, Z1, X2, Y2 e Y2 pueden seleccionarse de manera que, en el caso de que la sensibilidad del diagnóstico de un individuo sea de por lo menos aproximadamente 70%, la especificidad del diagnóstico de un individuo se encuentre comprendida en el intervalo de entre 70% y 100%, por ejemplo de por lo menos 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, o en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. Tal como se ilustra en el Ejemplo II, se alcanzó una especificidad superior al 98% y una sensibilidad de aproximadamente 77% en la población de pacientes no indeterminados, en la que aproximadamente 70% de la población de pacientes presentaba una prevalencia de fibrosis del 30%.
La expresión "valor predictivo negativo" tal como se utiliza en la presente memoria es sinónima de "VPN" y se refiere a la probabilidad de que un individuo que se ha diagnosticado que no presenta fibrosis realmente sí presente la enfermedad. El valor predictivo negativo puede calcularse como el número de resultados verdaderos negativos dividido por la suma de verdaderos negativos y falsos negativos. El valor predictivo negativo se determina a partir de las características del método diagnóstico, así como de la prevalencia de fibrosis en la población analizada. En un método de la invención, los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que el valor predictivo negativo en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 10% se encuentre comprendida en el intervalo de entre 75% y 99% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95%, en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. Los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que el valor predictivo negativo en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 20% se encuentre comprendida en el intervalo de entre 75% y 99% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95%, en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. Además, los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que el valor predictivo negativo en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30% se encuentre comprendida en el intervalo de entre 75% y 99% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95%, en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo.
La expresión "valor predictivo positivo" tal como se utiliza en la presente memoria es sinónima de "VPP" y se refiere a la probabilidad de que un individuo que se ha diagnosticado que no presenta fibrosis realmente sí presente la condición. El valor predictivo positivo puede calcularse como el número de resultados verdaderos positivos dividido por la suma de verdaderos positivos y falsos positivos. El valor predictivo positivo se determina a partir de las características del método diagnóstico, así como de la prevalencia de fibrosis en la población analizada. En un método de la invención, los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que, en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 10%, el valor predictivo positivo del método sea de por lo menos aproximadamente 75% y puede ser de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, o de por lo menos 95%, en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. Los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 también pueden seleccionarse de manera que, en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 20%, el valor predictivo positivo del método sea de por lo menos aproximadamente 75% y puede ser de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, o de por lo menos 95%, en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. De manera similar, los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 también pueden seleccionarse de manera que, en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, el valor predictivo positivo del método sea de por lo menos aproximadamente 75% y puede ser de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, o de por lo menos 95%, en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo.
Los valores predictivos, incluyendo los valores predictivos negativos y positivos, están influidos por la prevalencia de la enfermedad en la población analizada. En los métodos de la invención, los valores de corte X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2 pueden seleccionarse para producir un parámetro clínico deseado para una población clínica con una prevalencia particular de fibrosis hepática. Por ejemplo, pueden seleccionarse valores de corte para una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25% ó 30%, las cuales pueden observarse en, por ejemplo, la consulta de un hepatólogo. Los valores de corte también pueden seleccionarse para una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% ó 8%, las cuales pueden ser representativas de la prevalencia de fibrosis observada en, por ejemplo, la consulta de un médico generalista.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "precisión" se refiere a la concordancia global entre el método diagnóstico y el estado de enfermedad. La precisión se calcula como la suma de los verdaderos positivos y los verdaderos negativos dividida por el número total de resultados muestrales y resulta afectada por la prevalencia de fibrosis en la población analizada. Los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que la precisión de un método de la invención en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 10% sea de por lo menos aproximadamente 80% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. Los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 también pueden seleccionarse de manera que la precisión de un método de la invención en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 20% sea de por lo menos aproximadamente 80% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo. De manera similar, los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 pueden seleccionarse de manera que la precisión de un método de la invención en una población de pacientes que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30% sea de por lo menos aproximadamente 80% y puede ser, por ejemplo, de por lo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% en por lo menos 60% de la población de pacientes sometida a ensayo, por ejemplo en por lo menos 65%, 70%, 75% ó 80% de la población de pacientes sometida a ensayo.
Métodos no limitados a marcadores específicos
También se da a conocer un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con un valor de corte X1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; mediante comparación de un nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con un valor de corte Y1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que, en una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 40%, por lo menos 65% de los individuos de la población son diagnosticados con una precisión de por lo menos 90%.
El método puede incluir, si se desea, comparar un nivel de un tercer marcador fibrótico Z en el individuo con un valor de corte Z1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad o negatividad de X, Y y Z. En el método de la invención, el primer marcador fibrótico es MG-a2, el segundo marcador fibrótico es AH y el tercer marcador fibrótico es TIMP-1.
En otra realización, los niveles de por lo menos estos tres marcadores fibróticos se comparan y, en una realización adicional, se comparan los niveles de exactamente tres marcadores fibróticos con los valores de corte respectivos de los mismos. En realizaciones adicionales, se comparan los niveles de por lo menos cuatro o por lo menos cinco marcadores fibróticos. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar la fibrosis leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa.
En una realización específica, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 65% de los individuos de una población con una prevalencia de la fibrosis de hasta 30% con una precisión de por lo menos 93%. En una realización adicional, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 70% de los individuos de una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 20% con una precisión de por lo menos 94%. En todavía una realización adicional, un método de la invención sirve para diagnosticar por lo menos 70% de los individuos en una población con una prevalencia de fibrosis de hasta 10% con una precisión de por lo menos 96%.
Los métodos de la invención proporcionan un rendimiento inigualado en el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática. Aunque no se proporciona un diagnóstico de todos los pacientes, la mayoría son diagnosticados con una precisión extremadamente buena. A título de ejemplo, en una población de pacientes con una prevalencia de fibrosis de aproximadamente 40%, prácticamente el 70% de la población son diagnosticados con
una precisión de más de 91% y con un valor predictivo positivo superior a 96% y un valor predictivo negativo superior a 89%. Este excelente rendimiento contrasta con métodos alternativos tales como el método de Poynard et al., Lancet 357:1069, 2001. Mediante la utilización del método de Poynard et al. basado en el análisis de los seis marcadores MG-a2, globulina-a2, bilirrubina total, globulina-y, apoA1 y GGT, sólo aproximadamente 50% de una población que presenta una prevalencia de fibrosis de aproximadamente 40% resulta diagnosticada, y sólo con una precisión de aproximadamente 89% (ver la Tabla 8). De esta manera, los métodos de la invención proporcionan una mejora, en el aspecto de que se diagnostica un porcentaje significativamente superior de una población de pacientes (aproximadamente 70%, comparado con aproximadamente 50%) y con una precisión superior al 91%, comparado con una precisión de aproximadamente 89% (ver la Tabla 8). Debido a las nuevas características de rendimiento del método de la invención, la biopsia típicamente no resulta necesaria en por lo menos 65% de la población de pacientes, y los pacientes diagnosticados pueden fiarse de un diagnóstico que presenta una precisión superior al 90%.
Al igual que otros métodos de la invención, puede utilizarse un método de la invención basado en la comparación de por lo menos tres marcadores fibróticos para diagnosticar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática en un individuo que presenta, o que se sospecha que presenta, cualquier trastorno hepático, incluyendo la hepatitis vírica, una enfermedad hepática autoinmunológica tal como la hepatitis autoinmunológica, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad hepática grasa o la enfermedad hepática inducida por medicamentos, o cualquiera de las de más enfermedades hepáticas indicadas anteriormente en la presente memoria. De manera similar, puede utilizarse un método de la invención basado en la comparación de por lo menos tres marcadores fibróticos para diagnosticar la presencia o la severidad de los trastornos fibróticos, incluyendo la fibrosis pulmonar, la fibrosis renal, la fibrosis prostática, la fibrosis mamaria o una enfermedad reumatoide, u otro trastorno fibrótico indicado en la presente memoria o conocido de la técnica.
Un método de la invención se basa en la comparación del nivel de un marcador fibrótico con un valor de corte predeterminado. Para los marcadores que se correlacionan positivamente con la fibrosis, la positividad está indicada por un nivel que es superior al del valor de corte predeterminado. Para los marcadores que se correlacionan negativamente con la fibrosis, la positividad está indicada por un nivel que es inferior al del valor de corte predeterminado. Los valores de corte que resultan útiles en los métodos de la invención pueden determinarse tal como se indica en la presente memoria, por ejemplo utilizando el análisis del diseño de experimentos (ADE).
Respecto a los otros métodos diagnósticos de la invención, estos métodos pueden ponerse en práctica utilizando una diversidad de marcadores fibróticos conocidos de la técnica o indicados en la presente memoria. Entre dichos marcadores fibróticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, MG-a2, AH, TIMP-1, PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 ó apoB. Se han indicado anteriormente en la presente memoria o son conocidos de la técnica marcadores fibróticos serológicos, bioquímicos, clínicos y ecográficos adicionales, y pueden incluirse en cualquier combinación en un método de la invención. Además, se entiende que la comparación entre el primer y el segundo marcadores fibróticos y cualesquiera marcadores fibróticos adicionales puede llevarse a cabo simultáneamente o en cualquier orden y utilizando cualquier combinación de formatos de ensayo.
Tal como se ha indicado anteriormente, el "nivel" de un marcador fibrótico puede ser una cantidad relativa o absoluta de, por ejemplo, ARN, proteína o actividad y puede ser una medida directa o indirecta del marcador fibrótico. Además, el valor del nivel puede obtenerse de una fuente secundaria, tal como un médico o un laboratorio diagnóstico, o puede determinarse utilizando cualquier muestra y ensayo convenientes, incluyendo, aunque sin limitación, los indicados anteriormente en la presente memoria. Entre los métodos que resultan útiles para determinar el nivel de un marcador fibrótico para llevar a cabo las comparaciones incluidas en los métodos de la invención se incluyen, por ejemplo, métodos de hibridación tales como PCR-RT y el análisis de transferencia de ARN, inmunoensayos, incluyendo los ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) y los radioinmunoensayos (RIA), los inmunoensayos de tipo sándwich, la transferencia western cuantitativa y otros ensayos estándares para determinar los niveles de las proteínas y, en caso aplicable, ensayos de la actividad del marcador fibrótico. Dichos ensayos son rutinarios de la técnica y se han indicado anteriormente en la presente memoria.
La presente invención proporciona además un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con un valor de corte X1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; la comparación del nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con un valor de corte Y1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que los valores de corte X1 e Y1 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada.
El método de la invención incluye las etapas de comparar el nivel de un tercer marcador fibrótico Z en el individuo con un valor de corte Z1 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el
diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad o negatividad de X, Y y Z, en el que los valores de corte X1, Y1 y Z1 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada, en la que se comparan los niveles de MG-a2, AH y TIMP-1. En otras realizaciones se comparan los niveles de exactamente tres, por lo menos tres, por lo menos cuatro o por lo menos cinco marcadores fibróticos. Un método de la invención puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar la fibrosis leve o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa. Los valores de corte pueden optimizarse tal como se indica en la presente memoria, por ejemplo utilizando el análisis ADE.
La invención proporciona además un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante comparación del nivel de un primer marcador fibrótico X en el individuo con dos valores de corte X1 y X2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el primer marcador fibrótico X; la comparación del nivel de un segundo marcador fibrótico Y en el individuo con dos valores de corte Y1 e Y2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el segundo marcador fibrótico Y, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en la positividad o negatividad de X e Y, en el que, en la que los valores de corte X1, Y1, X2 e Y2 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada. Entre dichas características de rendimiento se incluyen sensibilidades, especificidades, VPP, VPN y precisiones particulares, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria.
El método de la invención incluye además las etapas de comparar un nivel del tercer marcador fibrótico Z en el individuo con dos valores de corte Z1 y Z2 con el fin de determinar si el individuo es positivo para el tercer marcador fibrótico Z y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la positividad
o negatividad de X, Y y Z, en el que los valores de corte X1, Y1, Z1, X2, Y2 y Z2 se optimizan individualmente, proporcionando una característica de rendimiento deseada. En un método de la invención, los valores de corte pueden optimizarse convenientemente, por ejemplo utilizando el análisis ADE.
Metodología
Puede resultar útil una diversidad de medios para detectar MG-a2, AH y TIMP-1 y para determinar un nivel de MGa2, AH y TIMP en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse, utilizando, por ejemplo, uno o más de los agentes de unión específicos de MG-a2, tales como anticuerpos anti-MG-a2. En otra realización, se pone en práctica un método de la invención mediante el ensayo de la actividad de MG-a2 en una muestra del individuo.
También puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar AH o para determinar un nivel de AH en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de AH en una muestra utilizando uno o más agentes de unión específicos de AH, tales como proteínas de unión a AH o anticuerpos anti-AH.
De manera similar, también puede utilizarse una diversidad de medios en un método de la invención con el fin de detectar TMP-1 ó para determinar el nivel de TIMP-1 en una muestra. En una realización, la invención se pone en práctica mediante la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse. El nivel de proteína TIMP-1 puede determinarse, por ejemplo, utilizando uno o más agentes específicos de TIMP-1, tales como anticuerpos anti-TIMP-1. En otra realización, la invención se pone en práctica mediante el ensayo de la actividad de TIMP-1 en una muestra del individuo que debe diagnosticarse.
En una realización particular, la invención proporciona un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación del nivel de AH en una muestra del individuo, y la determinación del nivel de proteína TIMP-1 en una muestra del individuo y el diagnóstico de la presencia o severidad de fibrosis hepática en el individuo basándose en los niveles de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1. Si se desea, puede determinarse cada uno de los niveles de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1 utilizando un ensayo ligado a enzima.
En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo mediante la puesta en contacto de una dilución apropiada de una muestra del individuo con anticuerpo anti-MG-a2 bajo condiciones adecuadas para formar un primer complejo de MG-a2 y anticuerpo anti-MG-a2, el lavado del primer complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de primer complejo que contiene MG-a2, el contacto de una dilución apropiada de una muestra del individuo con una proteína de unión a AH bajo condiciones adecuadas para formar un segundo complejo de AH y proteína de unión a AH, el lavado del segundo complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de segundo complejo que contiene AH, el contacto de una dilución apropiada de una muestra del individuo con anticuerpo anti-TIMP-1 bajo condiciones adecuadas para formar un tercer complejo de TIMP-1 y anticuerpo anti-TIMP-1, el lavado del tercer complejo para eliminar moléculas no unidas, la determinación de la cantidad de tercer complejo que contiene TIMP-1, y la diferenciación de la fibrosis hepática leve
o la ausencia de la misma de la fibrosis hepática moderada a severa en el individuo basándose en las cantidades de complejos que contienen MG-a2, AH o TIMP-1.
Se entiende que la detección de MG-a2, AH y TIMP-1, o la detección de MG-a2, AH y YKL-40, tal como se comenta en mayor detalle posteriormente, puede llevarse a cabo mediante el ensayo para la cantidad de proteína o polisacárido de manera directa, o, en el caso de MG-a2 y TIMP-1, puede determinarse mediante el ensayo para los niveles de ARN o de actividad enzimática de una proteasa regulada por MG-a2 ó TIMP-1. De manera simialr, en el caso de que se detecte uno o más marcadores fibróticos adicionales en un método de la invención, el marcador puede someterse a ensayo directamente, o puede someterse a ensayo un precursor, tal como ARN, o un producto de degradación o proteolítico, o una actividad correlacionada con los niveles del marcador. Se entiende que la determinación de un nivel de MG-a2, AH, TIMP-1 y YKL-40, o de un nivel de cualquier marcador adicional de fibrosis, puede llevarse a cabo utilizando valores absolutos, por ejemplo para niveles de ARN o proteína o actividad enzimática, o pueden determinarse como valores relativos en comparación con uno o más valores de referencia.
Se entiende además que cada uno de los tres ensayos de marcador fibrótico (MG-a2/AH/TIMP-1 ó MG-a2/AH/YKL40), así como cualesquiera ensayos adicionales, se llevan a cabo independientemente de los demás, en cualquier orden, y que cualquier combinación de formatos de ensayo se encuentra comprendida en la invención. A título de ejemplo, puede determinarse un nivel de MG-a2 y AH mediante el ensayo para la concentración de MG-a2 y AH, mientars que se determina un nivel de TIMP-1 mediante el ensayo para la actividad enzimática de TIMP-1. A título de ejemplo adicional, puede determinarse un nivel de MG-a2 utilizando un radioinmunoensayo, mientras que se determinan los niveles de AH y de TIMP-1 utilizando ensayos ligados a enzima. El experto en la materia entenderá que la detección de los tres marcadores fibróticos (MG-a2/AH/TIMP-1 ó MG-a2/AH/YKL-40) y la detección de cualesquiera marcadores adicionales pueden llevarse a cabo simultáneamente o en cualquier orden. Además, puede obtenerse una sola muestra, tal como una muestra de suero, de un individuo, y subdividirse en tres partes para detectar MG-a2, AH y TIMP-1 ó MG-a2, AH y TIMP-1, o los marcadores pueden detectarse utilizando diferentes muestras, que pueden ser del mismo tipo o de tipos diferentes y pueden encontrarse no diluidas o diluidas en el mismo grado o en grados diferentes. En el caso de que se utilicen dos o más muestras, las muestras habitualmente se obtienen del individuo en un intervalo de tiempo relativamente corto, por ejemplo varios dias a varias semanas.
Métodos de ARN
PUeden utilizarse métodos de hibridación para detectar ARNm de MG-a2 ó de TIMP-1 ó para determinar el nivel de ARNm de MG-a2 ó de TIMP-1 de otro marcador fibrótico que resulte útil en la invención, tal como YKL-40. Son bien conocidos de la técnica numerosos métodos para determinar los niveles de ARNm mediante hibridación específica o selectiva con una sonda de ácidos nucleicos complementaria. Entre dichos métodos se incluyen procedimientos de hibridación en solución, así como procedimientos de hibridación en fase sólida en los que la sonda o muestra se inmoviliza sobre un soporte sólido. Entre los ejemplos específicos de métodos útiles se incluyen métodos de amplificación tales como los métodos de amplificación de diana y señal y entre ellos se incluyen la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y la PCR-transcriptasa inversa (PCR-RT), la amplificación mediada por la transcripción (Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA), la amplificación de ADN de cadena ramificada (ADNr) (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA), la amplificación con desplazamiento de cadena (ADC, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y la amplificación por reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Entre los métodos adicionales que resultan útiles en la invención se incluyen la protección frente a ARNasa, el análisis de transferencia northern u otra transferencia de ARN, la transferencia por puntos o la tecnología basada en membranas; la tira "dip stick"; las agujas y las matrices bidimensionales inmovilizadas sobre un chip. Las condiciones para la determinación de los niveles de ARNm son bien conocidas de la técnica utilizando procedimientos de hibridación tanto en solución como en fase sólida, tal como se describen en, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento nº 47), John Wiley & Sons, New York, 1999.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR-RT, puede resultar útil en los métodos de la invención. La PCR
o la PCR-RT pueden llevarse a cabo con ARN aislado o en bruto o en muestras parcialmente fraccionadas, por ejemplo células peletizadas a partir de una muestra de sangre completa. Los métodos de PCR son bien conocidos de la técnica, tal como se describen, por ejemplo, en Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, 1995. Los formatos multimuestra, tales como las matrices bidimensionales, ofrecen la ventaja de analizar numerosas muestras diferentes en un único ensayo. Los métodos basados en tiras dipstick de fase sólida también pueden resultar útiles en la invención y ofrecen la ventaja de poder analizar con rapidez una muestra líquida y obtener un resultado inmediato.
Las sondas para la detección de ARNm de MG-a2 y TIMP-1 ó para determinar los niveles de ARNm de MG-a2 y TIMP-1, son bien conocidos de la técnica. El experto en la materia podrá utilizar, por ejemplo, una sonda correspondiente a parte o la totalidad de la secuencia de ácidos nucleicos de MG-a2 humana mostrada en la figura 1 (SEC ID nº 1) o parte o la totalidad de la secuencia de ácidos nucleicos de la TIMP-1 humana mostrada en la figura 3, respectivamente. Las condiciones apropiadas para los diversos formatos de ensayo para la detección del ARNm
de MG-a2 y TIMP-1 ó para la determinación de los niveles de ARNm de MG-a2 y TIMP-1 son bien conocidos de la técnica o pueden establecerse utilizando métodos rutinarios. A título de ejemplo, se indican las condiciones y sondas para el análisis de transferencia northern del ARNm de MG-a2, por ejemplo en Ortego et al., supra, 1997. A título de ejemplo adicional, se indican las condiciones y sondas para la hibridación de transferencia en ranura de ARN para determinar la expresión del ARN de MG-a2 en muestras humanas en Simon et al., supra, 1996. De manera similar, el análisis de transferencia northern del ARN de TIMP-1 en muestras humanas puede llevarse a cabo tal como se describe en, por ejemplo, Yoshiji et al., supra, 1996; los ensayos de PCR-RT de TIMP-1 en muestras humanas también son bien conocidos de la técnica y se describen en, por ejemplo, Janowska-Wieczorek et al., supra, 2000, y en Groft et al., supra, 2001. El experto en la materia entenderá que estos ensayos y otros pueden resultar útiles para detectar el ARN de MG-a2, TIMP-1 ó YKL-40 ó para determinar los niveles de ARN de MG-a2, TIMP-1 ó YKL-40 ó los niveles de otros marcadores fibróticos que resultan útiles en los métodos de la invención.
Inmunoensayos
Una diversidad de formatos de inmunoensayo, incluyendo los formatos de inmunoensayo competitivo y no competitivo, ensayos de captura de antígeno y ensayos de tipo sándwich de dos anticuerpos también resultan útiles en los métodos de la invención (Self y Cook, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65, 1996). En una realización, un método de la invención se basa en uno o más ensayos de captura de antígeno. En un ensayo de captura de antígeno, se une anticuerpo a una fase sólida y se añade muestra de manera que MG-a2, AH, TIMP-1, YKL-40 u otro antígeno marcador de fibrosis sea ligado por el anticuerpo. Tras eliminar mediante lavado las proteínas no unidas, puede cuantificarse la cantidad de antígeno unido, si se desea utilizando, por ejemplo, un radioensayo (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). El experto en la materia entenderá que los inmunoensayos útiles en la invención se llevan a cabo bajo condiciones de exceso de anticuerpos, o como competiciones de anticuerpos, con el fin de cuantificar la cantidad de antígeno y, de esta manera, determinar el nivel de MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40.
Los ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) pueden resultar útiles en los métodos de la invención. Un enzima tal como la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina (AP), la �-galactosidasa o la ureasa puede unirse, por ejemplo, a un anticuerpo anti-MG-a2, anti-AH, anti-TIMP-1 ó anti-YKL-40 ó a un anticuerpo secundario para la utilización en un método de la invención. Puede utilizarse un sistema de detección de peroxidasa de rábano picante, por ejemplo con el sustrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB), que rinde un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que resulta detectable a 450 nm. Entre otros sistemas ligados a enzima convenientes se incluyen, por ejemplo, el sistema de detección de fosfatasa alcalina, que puede utilizarse con el sustrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo, rindiendo un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. De manera similar, puede utilizarse un sistema de detección de �-galactosidasa con el sustrato cromogénico onitrofenil-�-D-galactopiranósido (ONPG), rindiendo un producto soluble detectable a 410 nm, o puede utilizarse un sistema de detección de ureasa con un sustrato tal como violeta de urea-bromocresol (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO). Pueden obtenerse anticuerpos primarios y secundarios ligados a enzima que resultan útiles, a partir de varias fuentes comerciales, tales como Jackson Immuno-Research (West Grove, Pa), tal como se describe en mayor detalle posteriormente.
La detección quimioluminiscente también puede resultar útil para detectar MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40, o para determinar el nivel de MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 u otro marcador fibrótico según un método de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos secundarios quimioluminiscentes comercialmente de diversas fuentes, tales como Amersham.
La detección fluorescente también puede resultar útil para detectar MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40, o para determinar el nivel de MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 u otro marcador fibrótico en un método de la invención. Entre los fluorocromos útiles se incluyen, aunque sin limitación, DAPI, fluoresceína, Hoechst 33258, R-ficocianina, Bficoeritrina, R-ficoeritrina, rodamina, rojo de Texas y lisamina Pueden resultar útiles en la invención los agentes de unión específicos de MG-a2, de AH, de TIMP-1 ó de YKL-40 marcados con fluoresceína o rodamina, tales como anticuerpos anti-MG-a2, anti-AH, anti-TIMP-1 ó anti-YKL-40, o anticuerpos secundarios marcados con fluoresceína o rodamina. Pueden obtenerse anticuerpos fluorescentes útiles comercialmente, por ejemplo de Tago Immunologicals (Burlingame, CA), tal como se describe en mayor detalle posteriormente.
Los radioinmunoensayos (RIA) también pueden resultar útiles en los métodos de la invención. Dichos ensayos son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, Brophy et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903, 1990, describe un radioinmunoensayo para la detección de TIMP-1, y Pharmacia fabrica un ensayo radiométrico para la cuantificación de AH utilizando una proteína de unión a AH marcada con 125I (Guechot et al., Clin. Chem. 42:558563, 1996). Pueden llevarse a cabo radioinmunoensayos, por ejemplo con anticuerpo primario o secundario marcado con 125I (Harlow y Lance, supra, 1988).
Puede analizarse una señal de un reactivo detectable, por ejemplo utilizando un espectrofotómetro, para detectar
color procedente de un sustrato cromogénico, un contador de radiación para detectar radiación, tal como un contador gamma para la detección de 125I, o un fluorímetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de una determinada longitud de onda. En el caso de que se utilice un ensayo ligado a enzima, puede llevarse a cabo el análisis cuantitativo de la cantidad de MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 u otro marcador fibrótico, utilizando un espectrofotómetro, tal como un lector de microplacas EMAX (Molecular Devices, Menlo Park, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se entiende que los ensayos de la invención pueden automatizarse o llevarse a cabo robóticamente, si se desea, y que puede detectarse simultáneamente la señal de múltiples muestras.
Los métodos de la invención también comprenden la utilización de inmunoensayos basados en la electroforesis capilar (IEEC), que puede encontrarse automatizada, si se desea. También pueden utilizarse inmunoensayos conjuntamente con fluorescencia inducida por láser, tal como se describe, por ejemplo, en Schmalzing y Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93, 1997, y en Bao, J. Chromatogr., B. Biomed. Sci. 699:963-80, 1997. Los inmunoensayos de liposomas, tales como los inmunoensayos de inyección de flujo de liposomas y los inmunosensores de liposomas, también pueden utilizarse para detectar MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40, o para determinar el nivel de MGa2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 u otro marcador fibrótico según un método de la invención (Rongen et al., J. Immunol. Methods 204: 105-133, 1997).
Los inmunoensayos enzimáticos de tipo sándwich también pueden resultar útiles en los métodos de la invención. En un ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos, se une un primer anticuerpo a un soporte sólido y se deja que el antígeno se una al primer anticuerpo. La cantidad de MG-a2, AH, TIMP-1, YKL-40 u otro antígeno marcador fibrótico se cuantifica mediante la medición de la cantidad de un segundo anticuerpo que se une al marcador fibrótico.
A título de ejemplo, un inmunoensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos puede resultar útil para determinar el nivel de TIMP-1, tal como se describe en Murawaki et al., supra, 1993. Brevemente, se diluye suero (25 ml) 41 veces con tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,0 (1,0 ml). La muestra diluida (20 ml) se mezcla con 0,3 ml de tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, que contiene 50 ng/ml de anticuerpo monoclonal (Fab del clon 7-6C1) marcado con peroxidasa de rábano picante, albúmina de suero bovino al 1%, Tween-20 al 0,1%, NaCl 0,1 M y timerosal al 0,005%. Se transfiere una alícuota de 0,1 ml de la solución mezclada a cada pocillo de microplaca previamente recubierto con un segundo anticuerpo monoclonal (clon 7-23G9) que presenta una especificidad de epítopo diferente, y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sin agitación. La placa se lava tres veces con 0,3 ml de tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, que contiene Tween-20 al 0,1% y NaCl 0,1 M. La actividad de peroxidasa unida a la placa se somete a ensayo mediante una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente con 0,1 ml de tampón de ácido cítrico-fosfato sódico 0,15 M, pH 4,9, que contiene 0,5 mg/ml de o-fenilendiamina y H2O2 al 0,02%. Tras detener la reacción mediante la adición de 0,1 ml de H2SO4 2 N, se mide la absorbancia a 492 nm en un lector de microplacas utilizando un estándar de TIMP-1 de suero humano. La linealidad de la relación entre la cantidad de TIMP-1 y la absorbancia a 492 nm se demuestra mediante representación en escala logarítmica y proporciona un intervalo de ensayo de entre aproximadamente 1,5 y 300 mg/pocillo.
La transferencia western cuantitativa también puede utilizarse para detectar MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40, o para determinar el nivel de MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 u otro marcador fibrótico en un método de la invención. Las transferencias western pueden cuantificarse mediante métodos bien conocidos, tales como la densitometría de escaneo. A título de ejemplo, se someten a electroforesis muestras de proteínas en geles Laemmli de SDS-PAGE al 10%. Los anticuerpos monoclonales murinos primarios, por ejemplo contra MG-a2, AH, TIMP-1 ó YKL-40 humanos se hacen reaccionar con el filtro de transferencia y la unión de anticuerpos se confirma que es lineal utilizando un experimento preliminar de transferencia en ranura. Se utilizan anticuerpos de cabra antiratón acoplados a peroxidasa de rábano picante (BioRad) como el anticuerpo secundario y se lleva a cabo la detección de la señal utilizando la quimioluminiscencia, por ejemplo con el kit Renaissance de quimioluminiscencia (New England Nuclear, Boston, MA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se analizan autorradiografías de los filtros utilizando un densitómetro de escaneo (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) y se normalizan respecto a un control positivo. Los valores se expresan, por ejemplo, en forma de proporción entre el valor real y el control positivo (índice densitométrico). Dichos métodos son bien conocidos de la técnica, tal como se describen en, por ejemplo, Parra et al., J. Vasc. Surg. 28:669-675, 1998.
Fuentes de anticuerpos
Tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria, los inmunoensayos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, los ensayos de inmunosorción ligada a enzima y el análisis de transferencia western cuantitativo, pueden resultar útiles en los métodos diagnósticos de la invención. Dichos ensayos se basan en uno o más anticuerpos, por ejemplo los anticuerpos anti-MG-a2, anti-AH, anti-TIMP-1 ó anti-YKL-40. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" se utiliza en su sentido más amplio para incluir los anticuerpos policlonales y monoclonales, así como los fragmentos polipeptídicos de anticuerpos que conservan una actividad de unión de MG-a2, AH, TIMP-1, YKL-40 ó del antígeno marcador fibrótico relevante de 1x105 M-1. El experto en la materia entenderá que los fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos de los anticuerpos anti-MG-a2, anti
AH, anti-TIMP-1 y anti-YKL-40, e incluyendo los fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv, pueden conservar actividad de unión para el antígeno marcador fibrótico relevante y, de esta manera, se encuentran incluidos dentro de la definición del término anticuerpo utilizada en la presente memoria. Los métodos de preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales son rutinarios de la técnica, tal como se describen en, por ejemplo, Harlow y Lane, supra, 1988.
El término anticuerpo, tal como se utiliza en la presente memoria, también comprende los anticuerpos y fragmentos de origen no natural que contienen, como mínimo, un dominio VH y un dominio VL, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos Fv de una cadena (scFv) que se unen específicamente a MGa2, AH, TIMP-1, YKL-40 ó al antígeno marcador fibrótico relevante. Dichos anticuerpos de origen no natural pueden construirse utilizando la síntesis peptídica en fase sólida, producirse recombinantemente u obtenerse, por ejemplo, mediante cribado de bibliotecas combinatoriales que consisten de cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables, tal como se describe en Borrebaeck (editor), Antibody Engineering (segunda edición), New York, Oxford University Press, 1995.
Son bien conocidos de la técnica una diversidad de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-MG-a2, anti-AH, anti-TIMP-1 y anti-YKL-40 que resultan útiles y, en muchos casos, que se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, se encuentra disponible de Beckman Coulter un ensayo nefelométrico para la macroglobulina-a2 (kit nº 449430) y los anticuerpos purificados por afinidad de cabra anti-MG-a2 humana y de cabra anti-MG-a2 humana marcado con peroxidasa para ELISA y transferencia western, por ejemplo de Cedarlane Laboratories Limited (CL20010AP y CL20010APHP) y de Affinity Biologicals Incorporated (GAA2MAP y GAA2M-APHRP). De manera similar, puede obtenerse anticuerpo purificado por afinidad de oveja anti-AH de Biotrend (nº 5029-9990).
Los anticuerpos anti-TIMP-1 humano también se encuentran fácilmente disponibles de una diversidad de fuentes comerciales. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-TIMP-1 humano nº 147-6D11 resulta adecuado para ensayos ELISA o análisis de transferencia western y puede obtenerse de Medicorp, Inc. (Montréal, Canada) y el anticuerpo monoclonal anti-TIMP-1 humano nº MAB970 se encuentra disponible de R&D Systems, Inc., para la utilización en, por ejemplo, transferencia western o ensayos ELISA de tipo sándwich. MAB970 puede combinarse, por ejemplo, con anticuerpo anti-TIMP-1 humano biotinilado (BAF970) de R&D Systems, Inc., para la detección de TIMP-1 mediante ELISA de tipo sándwich. Además, puede obtenerse anticuerpo policlonal de conejo anti-TIMP-1 humano y anticuerpos monoclonales de ratón antihumanos, que resultan adecuados, por ejemplo, para la transferencia western con detección incrementada de quimioluminiscencia, de Research Diagnostics Inc. (RDI-TIMP1abr y RDI-TIMP1-C1).
Ensayos de actividad
Tal como se ha comentado anteriormente, los ensayos basados en la actividad de un marcador fibrótico también pueden resultar útiles para detectar MG-a2, AH o TIMP-1 o para determinar el nivel de MG-a2, AH o TIMP-1 u otro marcador fibrótico y, por lo tanto, resultan útiles en los métodos de la invención. A título de ejemplo, una diversidad de ensayos de la actividad de MG-a2 puede resultar útil para detectar MG-a2 o para determinar el nivel de MG-a2 en una muestra en un método de la invención. Debido a que las proteasas de unión a MG-a2 muestran una actividad proteolítica inhibida pero conservan la capacidad de hidrolizar enlaces amida y éster de sustratos pequeños, puede detectarse la MG-a2, o determinarse un nivel de la misma, mediante el ensayo de la inhibición de la actividad de tripsina, subtilisina, quimotripsina, plasmina, elastasa, termolisina o papaína o la actividad de otra proteasa diana sin inhibición de la actividad amidolítica. Algunos sustratos tales como la caseína marcada o la fibrina marcada pueden resultar útiles para el ensayo para la inhibición de la actividad de la proteasa diana. Además, basándose en su amplia especificidad de sustrato proteasa, puede determinarse el nivel de MG-a2 mediante el ensayo para la inhibición de la activida de dos o más proteasas diana utilizando, por ejemplo, caseína-14C y fibrina-125I (Armstrong et al., supra, 1999). La MG-a2 también puede detectarse, o determinarse el nivel de MG-a2, basándose en la capacidad de la MG-a2 de proteger una proteasa unidad frente a un anticuerpo o un inhibidor de elevado peso molecular. Tras la reacción de una muestra con, por ejemplo, tripsina y después inhibidor de tripsina, se somete a ensayo la actividad residual de tripsina con un sustrato de bajo peso molecular, tal como la amida BApNA (Ganrot, supra, 1966; Armstrong et al., supra, 1985). La actividad de tripsina tras el tratamiento con inhibidor de tripsina es indicativa de MG-a2. Estos ensayos y otros ensayos bien conocidos de la actividad de MG-a2 pueden resultar útiles en los métodos de la invención.
De manera similar, los ensayos de actividad de TIMP-1 son bien conocidos de la técnica. En particular, un ensayo para la capacidad de inhibir la actividad de proteasa de una metaloproteinasa de matriz, por ejemplo utilizando la zimografía inversa en gelatina. La zimografía inversa en gelatína se lleva a cabo mediante la inclusión de una gelatinasa, tal como la gelatinasa A, en una mezcla de gel con el sustrato gelatina. El medio condicionado, tal como medio condicionado procedente de células renales de hámster neonato pueden utilizarse como una fuente conveniente de gelatinasa. Se sometieron a electroforesis muestras de plama y se analizó el patrón resultante, por ejemplo mediante digitación con escáner utilizando un escáner Hewlett Packard. Se observó actividad de TIMP-1 como una reducción de la degradación de la gelatina. Ver, por ejemplo, Kossakowska et al., supra, 1998. El experto
en la materia reconocerá que estos ensayos y otros ensayos rutinarios de la actividad de TIMP-1 pueden resultar útiles en los métodos de la invención.
Marcadores adicionales
Resulta evidente que los métodos de la invención pueden ponerse en práctica, si se desea, mediante la detección de los tres marcadores MG-a2, AH y TIMP-1 sin someter a ensayo cualesquiera marcadores adicionales o evaluar cualesquiera otras características clínicas o ecográficas. Además, estos tres ensayos pueden utilizarse como un panel en combinación con uno o más ensayos adicionales de marcador fibrótico o la evaluación de una o más variables clínicas o ecográficas. En realizaciones específicas, la invención proporciona un método de diagnóstico de la presencia o severidad de fibrosis hepática en un individuo mediante la detección de MG-a2, AH y TIMP-1 en una muestra y también la detección de por lo menos uno de los marcadores siguientes: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 ó apoB. En una realización, un método de la invención para el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática incluye las etapas de detección de MG-a2, AH, TIMP-1 y YKL-40 en una muestra. En una realización adicional, un método de la invención se encuentra limitado a la detección de MG-a2, AH, TIMP-1 e YKL-40, y no se detecta ningún marcador fibrótico adicional.
En vista de lo anteriormente expuesto, resulta evidente que pueden combinarse los ensayos de uno o más marcadores de fibrosis bioquímicos o séricos adicionales o la evaluación de una o más variables clínicas o ecográficas asociadas a fibrosis con la detección de MG-a2, AH y TIMP-1 con el fin de diagnosticar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática. Entre los ejemplos de marcadores bioquímicos y séricos adicionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB. Entre los marcadores bioquímicos y séricos adicionales que resultan útiles en la invención se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, colágenos tales como el colágeno de tipo I, la fibronectina, la vitronectina, la endotelina, la undulina; moléculas de adhesión tales como selectinas, moléculas vasculares de adhesión celular (MVAC) y moléculas de adhesión intercelular (MAIC); citoquinas proinflamatorias tales como el factor-a de necrosis tumoral (TNF-a), la pseudocolinesterasa, la manganeso superóxido-dismutasa, la N-acetil-�-glucosaminidasa (�-NAG), la glutatión peroxidasa, el factor de crecimiento del tejido conectivo (FCTC), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), el receptor de FCDP, la proteína quimiotáctica de monocitos-1 (PQM-1), la óxido nítrico sintetasa inducible, la nitrotirosina, la bilirrubina, la ferritina y la a-fetoproteína, la y-glutamil-transpeptidasa (GGT), la aspartato aminotransferasa (AST), la alanino aminotransferasa (ALT), la proporción AST/ALT, la albúmina, las globulinas-y, el bloque-�y, el índice protrombina, la puntuación de Child-Pugh, el índice PGA (tiempo de protrombina, concentración de GGT y concentración de apoA1), el índice PGAA (puntuación PGA con nivel de macroglobulina-a2), la hemoglobina, el volumen corpuscular medio, el recuento de linfocitos, el colesterol, la urea, la creatinina, el sodio y el recuento de plaquetas.
Una variable clínica o ecográfica también puede ser un "marcador" fibrótico que resulte útil en los métodos de la invención. De esta manera, el análisis de una o más variables clínicas o ecográficas puede combinarse con la detección de MG-2a, AH y TIMP-1 con el fin de diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática u otro trastorno fibrótico, tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. A título de ejemplos, dicha variable clínica puede ser la edad o sexo del paciente, o la presencia de eritema palmar, contractura de Dupuytren, dedos "en palillo de tambor", arañas vasculares, hígado firme, esplenomegalia o circulación colateral. Entre las variables ecográficas que resultan útiles en un método de la invención se incluyen, por ejemplo, la longitud del hígado (riñón derecho), una superficie hepática irregular, heterogeneidad hepática, la longitud del bazo, ascites o circulación colateral. Ver, por ejemplo, Oberti et al., Gastroenterol. 113:1609-1616, 1997. Se entiende que el análisis de estas variables y otras variables clínicas o ecográficas bien conocidas puede resultar útil en un método de la invención. Además, un método de la invención comprende la determinación de la variable clínica o ecográfica, por ejemplo, la palpación del hígado, o puede basarse en una o más variables clínicas o ecográficas históricas o determinadas anteriormente.
Los ensayos para la detección de marcadores bioquímicos o séricos que resultan útiles en la invención son bien conocidos de la técnica y en muchos casos se encuentran disponibles comercialmente. Entre dichos ensayos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, métodos basados en la amplificación, tales como la PCR-RT y otros métodos para el análisis cuantitativo de los niveles de ARN; inmunoensayos tales como los radioinmunoensayos, los ensayos ligados a enzimas, los ensayos de tipo sándwich de dos anticuerpos y el análisis de transferencia western cuantitativo y ensayos de la actividad biológica, tal como la actividad enzimática. Los ensayos de PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 ó apoB se encuentran disponibles comercialmente de diversas fuentes, tal como se resume en la Tabla 1.
Los ensayos de marcadores bioquímicos o séricos adicionales que pueden combinarse con la detección de MG-a2,
AH y TIMP-1 en un método de la invención también son bien conocidos de la técnica. La fibronectina, por ejemplo, puede someterse a ensayo convenientemente mediante ensayo turbidimétrico disponible de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania). La pseudocolinesterasa (PCHE) puede someterse a ensayo utilizando metodología estándar disponible de Boehringer. Los niveles de la N-acetil-�-glucosaminadasa (�-NAG) pueden determinarse mediante ensayo de la actividad enzimática utilizando un kit disponible de Cortecs diagnostics. Los niveles de manganeso superóxido-dismutasa (Mn-SOD) pueden determinarse convenientemente mediante ELISA utilizando un kit disponible, por ejemplo, de Bender MedSystem. Los niveles de glutatión peroxidasa pueden determinarse mediante ensayo de la actividad enzimática utilizando, por ejemplo, un kit disponible de Randox Laboratories Ltd. (Oceanside, CA).
TABLA 1 FUENTES COMERCIALES DE ENSAYOS DE MARCADORES FIBRÓTICOS
Marcador
Compañía Ensayo Número de catálogo
PIIINP
Orion Diagnostica (Espoo, Finlandia) RIA 05903
laminina tenascina
Chemicon Intl. (Temecula, CA) Chemicon Intl. (Temecula, CA) ELISA ELISA ECM310 ECM320
colágeno de tipo IV
Iatron Laboratories (Tokyo, Japón) RIA KCAD1
YKL-40
Metra Biosystems (Mountain View, CA) ELISA 8020
MMP-3
Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ) ELISA RPN 2613
MMP-2
Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ) ELISA RPN 2617
Complejo MMP-9/TIMP-1
SBA Sciences (Turku, Finlandia) ELISA MP2215
ligando sFas
Bender MedSystems Diagnostics (Vienna, Austria) ELISA BMS260/2
TGF-�1
R&D Systems (Minneapolis, MN) ELISA DB100
IL-10
R&D Systems (Minneapolis, MN) ELISA HS100B
apoA1
AlerChek, Inc. (Portland, ME) ELISA A70101
apoA2
AlerChek, Inc. (Portland, ME) ELISA A70102
apoB
Sigma Diagnostics (St. Louis, MO) IT* 357-A
* inmunoturbidimétrico
Los niveles totales o directos de bilirrubina, GGT, AST y ALT pueden determinarse utilizando un autoanalizador, tal como Hitachi 917 Automate (Mannheim, Alemania) con reactivos de Roche Diagnostics. Los niveles de albúmina pueden determinarse, por ejemplo, mediante el método del verde bromocresol, tal como se describe en Doumas et al., Clin. Chim. Acta 31:87-96, 1971, y los niveles de ferritina y de a-fetoproteína pueden determinarse convenientemente utilizando, por ejemplo, un inmunoensayo disponible de Boehringer. Además, los niveles de globulina-a1, globulina-a2, globulina-y globulina-y pueden determinarse, por ejemplo, mediante electroforesis de proteínas séricas en un sistema automático (Hydrasys e Hyrys, Sebia; Issy-Les-Moulineaux, Francia). Los métodos para determinar la actividad de protrombina también son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen el método de coagulación de Organon Technika (West Orange, NJ). El índice PGA puede determinarse tal como se describe en Poynard et al., Gastroenterol. 100:1397-1402, 1991, y el índice PGAA también puede determinarse mediante métodos bien conocidos, tal como se describe en Naveau et al., Dig. Dis. Sci. 39: 2426-2432, 1994).
Los recuentos de plaquetas, recuentos de linfocitos, volumen corpuscular medio y variables asociadas pueden determinarse mediante una diversidad de metodologías utilizando, por ejemplo, un analizador Bayer-Technicon H2 (Bayer-Technicon Instruments, Tarrytown, NY). Los niveles de colesterol pueden determinarse mediante metodologías estándares, disponibles de, por ejemplo, Boehringer. De esta manera, resultará evidente para el experto en la materia que una diversidad de metodologías, incluyendo, aunque sin limitarse a las anteriormente indicadas, son bien conocidas de la técnica y pueden resultar útiles en los métodos diagnósticos de la invención.
Panel MG-a2/AH/YRL-40
También se da a conocer un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la detección de MG-a2 en una muestra, la detección de AH en una muestra, la detección de YKL40 en una muestra, y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basado en la presencia o nivel de MG-a2, AH y YKL-40. El método puede resultar útil, por ejemplo, para diferenciar una fibrosis hepática leve o la inexistencia de la misma (F0-F1), de la fibrosis hepática moderada a severa (F2-F4).
Se da a conocer un método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo mediante la determinación del nivel de proteína MG-a2 en una muestra del individuo; la determinación del nivel de AH en una muestra del individuo, la determinación del nivel de proteína YKL-40 en una muestra del individuo y el diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en el individuo basándose en los niveles de proteína
MG-a2, AH y proteína YKL-40. Si se desea, puede determinarse cada uno de los niveles de proteína MG-a2, AH y proteína YKL-40 utilizando un ensayo ligado a enzima.
De esta manera, se dan a conocer métodos diagnósticos que se basan, en parte, en la determinación de un nivel del marcador fibrótico YKL-40 en una muestra. YKL-40, también conocido como glucoproteína-39 de cartílago humano (gp-39 CH) obtiene su nombre de que presenta un peso molecular de 40 kDa y de la secuencia aminoterminal de la proteína, de tirosina-lisina-leucina (YKL). Esta glucoproteína, un miembro de mamífero de la familia de la quitinasa (18-glucosilhidrolasasa) es una lectina que se une a la heparina y a la quitina y que es producida por los condrocitos, las células sinoviales, los macrófagos activados, los neutrófilos y las células de osteosarcoma MG-63 (Hakala et al.,
J. Biol. Chem. 268:25803-15810, 1993; Nyirkos y Golds, Biochem. J. 268:265-268, 1990; Renkema et al., Eur. J. Biochem. 251:504-509, 1998; Volck et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 110:351-360, 1998, y Johansen et al., J. Bone Miner. Res. 7:501-511, 1992). El patrón de expresión de YKL-40 en el tejido normal y enfermo indica que esta glucoproteína puede funcionar en el remodelado de la matriz extracelular o en la inflamación del tejido (Nyirkos y Golds, supra, 1990; Renkema et al., supra, 1998, y Verheijden et al., Arthritis Rheum. 40:1115-1125, 1997). Además, el ARNm de YKL-40 se expresa en el hígado y los estudios iniciales han demostrado que la expresión de YKL-40 se encuentra elevada en pacientes con enfermedad hepática crónica y que los niveles incrementados de YKL-40 sérico pueden estar asociados a fibrosis y a fibrogénesis (Johansen et al., Scand. J. Gastroenterol. 32: 582590, 1997, y Johansen, J. Hepatol. 32:911-920, 2000).
Los métodos de determinación del nivel de YKL-40 en muestras tales como suero y líquido sinovial son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, un radioinmunoensayo para YKL-40 basado en un anticuerpo de conejo cultivado contra YKL-40 se describe en Johansen et al., Br. J. Rheumatology 32:949-955, 1993. Además, se encuentra disponible comercialmente de Metra Biosystems un inmunoensayo enzimático de tipo sándwich en un formato de tiras de pocillos de microlitros. En el ensayo de Metra Biosystems, el fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal anti-YKL-40 conjugado con biotina se une a estreptavidina en la tira y captura YKL-40 presente en la muestra. El antisuero policlonal anti-YKL-40 conjugado con fosfatasa alcalina se une al antígeno YKL-40 capturado y la actividad de fosfatasa alcalina se detecta con fosfato de p-nitrofenilo como indicación de la concentración de YKL
40. Se entiende que los métodos de la invención pueden ponerse en práctica con dichos ensayos o con otros ensayos rutinarios de detección o determinación del nivel de ARN o proteína YKL-40.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título ilustrativo, pero no limitativo, de la presente invención.
EJEMPLO I
PANELES DE MARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO NO INVASIVO DE LA FIBROSIS HEPÁTICA
El presente ejemplo demuestra que pueden combinarse varios marcadores séricos en un panel que resulta útil para diferenciar los estadios de fibrosis F2, F3 y F4 de los estadios F0 y F1 en pacientes infectados por VHC.
Se seleccionaron aleatoriamente de una biblioteca de suero existente muestras de suero procedentes de 194 pacientes de VHC positivos para el virus de la hepatitis C según análisis del ARN e inmunoanálisis, y que presentaban niveles elevados de alanina aminotransferasa (ALT). Cada uno de los pacientes había sido sometido a biopsia del hígado como parte de su régimen de cuidados. Se seleccionaron muestras de pacientes que permitiesen la comparación con otros marcadores sanguíneos rutinarios y los resultados del examen físico realizados durante el tratamiento médico rutinario, incluyendo la carga vírica de VHC.
Los criterios de inclusión en el estudio fueron que el paciente: 1) presentaba una infección confirmada de hepatitis C en el momento de la biopsia del hígado y extracción de suero, 2) había sido sometido a biopsia del hígado como parte de su régimen de cuidados médicos independientemente del estudio, y 3) había proporcionado previamente su consentimiento informado. Los pacientes que no proporcionaron su consentimiento informado o se encontraban en prisión fueron excluidos del estudio.
Las puntuaciones de fibrosis (estadio Metavir) de los 194 pacientes se establecieron mediante examen histopatológico de un espécimen de biopsia con aguja previamente a la terapia según los criterios indicados en el grupo cooperativo de estudio The French Metavir Cooperative Study Group, Hepatol. 20:15-20, 1994. Todas las puntuaciones Metavir de fibrosis fueron establecidas por el mismo patólogo. Para todos los análisis, las puntuaciones Metavir de F0 y F1 se agruparon como fibrosis "ausente/leve", mientras que las puntuaciones de F2, F3 y F4 se agruparon como fibrosis "moderada/severa". La prevalencia de la fibrosis en el grupo de 194 pacientes se determinó que era del 60% basándose en la proporción de puntuaciones F2-F4 en el grupo, tal como se muestra en la Tabla 2.
TABLA 2 COMPOSICIÓN DE LA POBLACIÓN DE ESTUDIO DE 194 PACIENTES DE VHC
SEGÚN ESTADIO DE FIBROSIS
Estadio de fibrosis
Número Total F0-F1 ó F2-F4
F0
38 F0-F1 = 78
F1
40
F2
40 F2-F4 = 116
F3
39
F4
37
Total
194 Prevalencia = 59,8%
Tal como se muestra en la Tabla, anteriormente, el panel de pacientes de VHC incluía 37 muestras con un estadio de fibrosis muy elevado (F4), 39 muestras de pacientes con estadio de fibrosis muy bajo o cero (F0), y 158 muestras de pacientes con estadio de fibrosis F1, F2 ó F3.
Se sometieron a ensayo muestras de suero para la presencia de varios marcadores putativos de fibrosis, incluyendo laminina, YKL-40, AH, TIMP-1, PIIINP, colágeno de tipo IV y MG-a2. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando kits comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante (ver la Tabla 3). Los resultados obtenidos para las 194 muestras analizadas para laminina, YKL-40, AH, TIMP-1, PIIINP, colágeno de tipo IV y MG-a2 se muestran en la Tabla 4.
TABLA 3 KITS DISPONIBLES COMERCIALMENTE PARA LA DETECCIÓN DE MARCADORES DE FIBROSIS
Marcador
Fabricante Tipo de ensayo Número de catálogo
Laminina
Chemicon Intl. (Temecula, CA) ELISA ECM310
YKL-40
Metra Biosystems (Mountain View, CA) ELISA 8020
HA
Corgenix (Westminster, CO) ELISA 029001
TIMP-1
Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ) ELISA RPN 2611
PIIINP
Orion Diagnostica (Espoo, Finlandia) RIA 05903
colágeno de tipo IV
Iatron Laboratories (Tokyo, Japón) RIA KCAD1
MG-a2
Beckman Coulter Nefelometría 449430
TABLE 4 DATOS BRUTOS DE 194 PACIENTES DE vh ANALIZADOS PARA LOS NIVELES DE LAMININA, YKL-40, AH, TIMP-1, PIIINP, COLÁGENO DE TIPO IV Y MG-a2
ID de
Paciente Laminina YKL-40 AH TIMP-1 PIIINP Col. IV MG-a2
muestra
(ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) (mg/ml)
100010
B-A 175,244 81,608 15,730 1308,802 2,288 1,737 3,03
100038
P-B 151,888 67,220 9,288 917,104 2,049 2,617 2,01
100044
C-B 187,811 60,757 44,127 1610,690 3,883 3,408 5,03
100059
T-B 232,082 51,002 22,583 1077,343 2,297 1,901 2,29
100069
N-C 285,269 131,726 73,851 2381,222 8,034 2,954 4,05
100077
H-C 268,685 47,709 18,066 1122,818 2,260 3,159 1,75
100090
B-C 263,426 26,370 47,339 1380,182 3,526 2,561 3,30
100127
D-D 279,580 166,113 105,505 1180,879 3,343 2,804 3,54
100167
G-F 274,533 482,708 341,132 2523,637 9,745 5,110 3,98
100175
B-G 266,903 95,808 27,721 1178,105 4,345 3,911 2,67
100178
M-G 211,613 159,040 25,669 1176,718 2,357 3,795 1,93
100182
T-G 246,686 55,391 8,889 1308,815 2,924 2,468 2,86
100198
A-G 226,372 48,441 13,901 1126,962 2,595 0,819 3,03
100209
J-G 288,524 83,925 5,051 1081,470 5,173 0,801 2,73
100229
S-H 253,561 110,020 46,568 1391,433 4,905 4,410 3,12
100238
T-J 229,781 38,076 29,516 1190,567 2,626 3,141 2,68
100245
D-K 279,768 270,250 171,481 2310,561 5,876 4,713 4,01
100247
C-K 244,559 131,482 10,219 1405,454 2,297 1,089 2,50
100250
J-K 262,136 101,729 54,821 1155,963 4,192 2,655 4,04
100252
J-K 260,998 61,366 57,275 1560,856 3,498 7,040 3,24
100253
E-K 292,189 173,917 168,768 1652,033 9,252 7,336 3,59
100254
W-K 288,551 477,560 102,775 1580,756 5,300 4,188 4,01
100271
M-L 278,201 89,900 69,651 1140,761 4,092 4,066 2,94
100276
V-L 257,309 176,112 12,196 1088,369 1,985 4,147 3,57
100284
M-L 224,339 130,263 31,822 1104,885 3,653 2,542 3,14
100290
D-L 199,542 541,552 50,429 1550,943 4,399 6,368 3,40
100294
TRL 281,501 217,328 200,436 2340,630 11,006 7,016 4,20
100301
P-M 285,543 430,475 29,772 1884,061 4,453 3,524 4,26
100313
J-M 301,751 188,062 45,539 1852,125 3,610 4,773 4,22
100323
M-M 223,002 626,140 144,334 2382,232 8,873 8,042 4,09
100334
K-R 173,320 63,317 38,516 1290,231 4,327 4,753 2,46
100339
S-M 184,085 36,125 12,049 1268,153 1,865 2,211 2,39
100340
K-M 206,582 57,496 22,015 974,475 2,315 0,819 2,80
100341
T-M 257,580 76,834 91,748 1492,882 3,976 4,793 3,00
100343
D-M 334,202 140,629 49,322 1098,199 4,092 2,412 3,12
100357
P-M 419,291 27,368 14,971 784,932 4,225 0,801 2,01
100374
K-N 300,366 28,231 36,608 1697,678 5,478 6,690 3,16
100379
T-O 233,496 75,711 26,906 1437,939 2,086 2,437 3,70
100382
C-P 206,796 44,461 6,034 989,007 2,214 4,409 2,14
100397
R-R 223,006 66,474 13,912 981,736 4,091 3,814 3,53
100410
R-S 224,775 36,605 37,499 1152,258 4,592 6,466 3,43
100438
D-Q 228,008 149,349 75,452 1682,636 7,734 7,039 3,89
100451
H-R 248,528 526,840 226,386 1961,029 10,505 7,113 3,36
100453
A-R 225,862 65,956 33,169 1421,632 2,786 3,465 3,79
100454
O-R 220,481 56,892 32,531 1125,960 3,003 7,014 3,68
100456
S-S 241,591 46,274 30,745 1337,355 5,182 2,411 2,81
100466
S-S 210,562 48,605 34,443 1482,475 4,286 4,754 3,27
100470
D-S 229,912 162,039 55,053 1684,159 6,806 3,640 3,10
100485
C-T 229,811 113,523 38,389 1247,547 3,901 3,291 4,11
100486
M-T 265,326 281,257 706,557 2716,589 15,362 11,975 2,82
100505
L-W 229,363 33,843 23,305 1149,367 3,397 2,889 3,29
100519
R-W 204,646 68,632 10,431 845,571 3,852 6,815 2,52
100547
S-G 223,959 75,711 8,257 1000,623 4,286 3,090 2,92
100638
J-P 265,819 264,250 68,361 2095,698 15,945 7,418 4,67
100640
M-V 170,293 93,770 17,728 1200,584 4,755 5,561 3,50
100006
L-A 135,628 75,349 79,430 1354,782 6,612 3,477 3,14
100009
R-A 157,239 72,429 21,947 932,635 2,080 3,050 1,96
100011
A-B 136,197 251,237 149,932 2004,294 7,600 4,853 3,57
100016
E-A 161,133 272,434 186,536 1900,341 9,341 9,071 3,08
100021
E-AV 184,000 537,630 102,420 2456,883 4,863 6,157 3,97
100023
C-B 126,346 194,523 47,976 1540,914 7,000 4,488 3,21
100027
D-B 133,660 75,820 33,912 1519,528 2,966 3,286 3,51
100030
R-B 140,584 50,007 153,135 1219,549 3,237 5,200 1,89
100035
K-B 124,645 37,383 60,934 1214,060 3,582 3,620 2,41
100036
G-B 152,864 87,596 369,681 1305,790 3,163 4,391 2,71
100041
M-B 168,422 42,376 143,372 1502,562 6,667 3,692 3,10
100042
M-B 138,754 211,387 266,568 2899,870 8,233 8,559 3,98
100043
C-B 111,743 30,883 17,447 1168,327 5,488 2,343 2,76
100045
V-B 164,940 241,063 221,249 2010,088 9,097 4,512 3,76
100051
K-B 154,743 222,409 131,122 1600,554 4,863 4,075 3,43
100055
D-B 146,817 110,018 84,447 1827,668 3,188 4,439 5,72
100065
G-B 134,349 72,429 112,148 1455,905 3,353 3,002 4,02
100071
R-C 135,011 74,407 30,352 1485,573 2,820 3,120 3,29
100073
G-C 146,785 63,761 43,312 1530,873 3,027 2,040 < 0,75
100074
L-C 151,514 80,248 49,917 1647,700 5,036 3,286 3,11
100078
R-C 163,144 213,365 45,839 1399,880 3,393 2,297 2,61
100081
A-C 147,915 45,862 56,686 1346,315 4,056 4,707 2,37
100084
G-C 144,665 43,130 116,238 1736,670 5,337 6,702 < 0,75
100091
P-C 171,782 215,249 33,321 1999,807 5,096 3,835 3,75
100093
M-C 133,786 35,499 105,726 1499,707 5,983 5,876 2,85
100099
S-C 174,239 49,159 28,163 1392,574 4,381 5,876 3,18
100100
D-C 181,284 68,095 82,324 1613,489 5,552 5,547 3,71
100103
J-C 151,396 74,849 55,720 1666,282 4,771 3,955 3,57
100104
C-C 128,182 38,890 13,719 1100,784 3,798 5,324 2,21
100106
S-C 170,685 41,811 37,449 1280,697 5,096 4,464 2,52
100107
J-C 103,835 27,397 32,334 1416,481 2,910 3,740 2,57
100108
J-C 148,294 145,629 52,822 1884,389 4,484 3,597 4,62
100115
S-DLT 134,784 108,134 96,415 1597,696 8,860 5,225 3,48
100121
R-D 149,335 74,878 34,109 1759,752 5,912 3,716 4,36
100124
R-D 134,766 130,367 35,486 1569,219 2,489 4,877 1,21
100125
B-D 170,790 67,078 97,770 2245,776 7,261 5,876 3,63
100126
D-D 134,313 117,116 65,560 1970,476 2,775 3,788 3,04
100129
E-D 159,707 60,388 28,962 1651,995 5,195 4,902 3,41
100131
J-D 155,166 119,774 31,852 1579,186 3,015 3,405 2,73
100133
M-D 146,280 24,371 75,729 2098,560 3,225 3,788 1,74
100135
H-E 167,472 41,600 66,767 1369,735 3,200 3,429 4,20
100137
D-E 158,406 25,104 68,740 1346,906 3,828 3,405 2,69
100139
S-E 139,877 38,484 42,708 1388,605 4,215 2,814 4,05
100140
L-E 158,942 30,695 181,056 1585,482 7,476 4,977 3,32
100141
W-E 136,761 185,300 179,774 2045,873 9,097 9,872 2,89
100142
R-E 119,383 62,037 16,170 888,744 3,286 2,673 2,07
100143
D-E 131,717 33,779 29,179 1072,170 2,978 3,144 1,91
100147
D-E 132,426 77,159 35,912 1285,138 3,515 2,696 2,12
100150
D-E 120,207 19,056 155,043 1488,729 2,298 4,196 3,66
100151
D-F 125,885 35,735 51,625 1243,711 3,447 3,525 3,05
100155
C-H 146,728 29,137 54,330 1242,340 4,733 3,573 3,15
100159
M-H 136,303 31,336 106,675 1567,716 4,151 3,525 3,51
100161
JF-F 155,052 1710,890 572,598 1966,460 6,226 4,634 4,27
100163
M-F 153,221 785,420 211,173 2167,501 8,269 5,698 3,57
100175a
B-G 148,403 55,347 130,093 1282,502 5,296 4,537 2,79
100181
M-G 137,986 69,735 31,119 1384,651 2,813 3,097 1,89
100183
D-G 168,842 181,909 58,358 1499,596 3,101 3,405 3,86
100186
M-G 184,148 2258,120 347,854 5271,196 11,670 7,756 3,82
100200
R-G 148,660 158,906 143,510 1939,499 5,530 6,080 4,02
100208
R-G 156,210 94,021 36,624 1379,174 5,339 4,366 < 0,75
100221
ND-H 117,196 38,393 88,913 1375,112 2,610 5,274 3,76
100222
J-H 106,131 34,544 31,603 1054,973 2,580 2,955 3,40
100229a
S-H 125,123 53,139 73,989 1567,731 3,828 3,788 2,78
100237
J-J 140,718 397,625 578,952 1824,407 11,836 6,675 2,46
100268
C-L 155,864 76,151 86,977 2060,140 10,963 6,310 3,66
100270
T-L 176,060 24,738 38,749 1579,990 2,549 2,625 3,35
100278
S-L 153,789 48,840 52,524 1367,051 3,039 3,167 1,91
100279
L-LG 163,352 139,202 39,492 1223,652 2,921 4,099 2,37
100287
R-L 164,414 636,110 232,253 3285,078 14,450 9,448 4,19
100291
MS-L 152,863 197,500 42,925 2144,445 2,180 1,993 3,78
100293
D-L 147,479 104,509 27,209 1559,538 3,151 2,696 1,83
100302
A-M 201,715 1021,070 159,330 3317,515 12,498 8,383 4,83
100306
JT-M 125,203 115,289 83,960 1722,987 3,842 2,413 4,16
100307
D-M 128,095 23,612 10,882 1378,118 3,339 3,382 1,42
100313a
J-McA 164,201 192,417 76,599 1966,287 3,828 5,523 3,89
100315
K-MF 153,427 113,449 112,430 2118,580 3,515 4,561 4,46
100317
M-McM 165,245 94,693 144,632 1611,495 4,588 3,215 1,84
100320
D-M 159,724 782,150 106,161 1581,345 13,215 5,597 2,33
100322
R-M 120,098 39,914 51,444 1443,789 2,809 3,644 3,21
100327
K-R 168,143 194,521 101,231 1738,827 4,295 3,835 4,35
100336
ES -M 165,374 135,711 36,329 1556,071 2,932 2,508 3,49
100347
E-M 173,070 69,889 16,945 1710,951 4,808 3,859 3,29
100348
A-M 207,186 75,06 301,583 1334,475 3,299 4,585 3,36
100350
J-M 154,867 4,418 22,250 1388,371 4,087 3,238 1,60
100358
A-M 140,022 15,549 88,786 1247,147 4,502 4,682 1,57
100365
A-M 96,324 26,329 43,344 1170,887 5,381 2,040 2,12
100367
B-M 161,274 30,273 46,174 1469,088 3,089 2,790 3,59
100388
A-P 230,782 275,681 938,015 4245,175 20,496 9,669 5,98
100395
D-R 125,908 24,226 15,309 1299,599 2,478 4,415 3,52
100397a
R-R 179,186 56,479 100,853 1455,947 9,769 4,172 3,62
100398
C-R 151,391 29,397 11,833 1100,156 2,652 2,932 2,28
100403
L-P 179,196 321,607 350,713 2061,218 8,938 4,977 2,28
100404
ML-P 179,163 1060,240 141,902 2248,495 5,959 4,123 4,07
100414
S-S 184,451 70,941 40,126 1048,761 2,549 3,026 3,18
100424
A-P 158,538 62,439 167,519 1320,841 5,509 5,448 3,88
100443
J-R 112,348 40,703 21,470 1045,054 2,663 5,647 4,34
100450
M-R 186,892 200,744 203,399 1287,107 2,586 4,040 3,77
100472
T-S 127,877 119,759 21,867 797,753 2,787 3,962 1,97
100474
J-S 118,319 55,427 19,699 939,914 2,287 3,524 3,15
100482
J-T 125,011 33,428 39,749 1099,832 5,159 4,386 2,56
100483
J-T 136,978 18,006 33,467 1003,831 2,586 4,485 2,06
100488
M-T 178,106 51,908 123,723 1345,743 4,464 6,053 3,84
100495
J-V 180,283 219,322 93,680 1734,925 8,387 4,064 3,82
100502
D-V 114,380 153,296 22,649 1136,728 2,774 4,757 4,47
100503
J-W 149,928 453,095 92,918 1422,332 5,581 4,114 3,15
100513
M-W 117,649 53,027 100,853 1335,730 5,092 4,757 3,74
100528
D-W 189,040 37,248 26,158 1103,495 4,642 3,215 2,90
100530
M-W 106,100 40,234 20,490 924,291 3,297 3,988 2,29
100534
D-A 135,702 37,357 91,410 1421,072 3,374 3,135 3,26
100539
M-DB 167,910 474,960 104,470 215,8,238 4,957 5,566 3,99
100540
A-B 135,980 54,815 183,589 1881,935 3,068 4,485 3,34
100546
D-F 113,363 75,942 47,682 1207,833 2,633 3,055 1,57
100557
T-L 121,746 58,286 27,704 1297,060 3,842 2,060 1,83
100560
C-N 194,265 142,696 91,041 2338,303 6,332 3,267 4,25
100564
D-R 169,241 250,713 65,865 2407,901 5,502 4,534 3,52
100569
J-DC 160,145 64,634 43,744 1349,485 5,962 3,421 3,78
100572
K-K 162,517 260,632 209,581 1729,746 9,292 6,191 2,70
100585
K-Z 171,277 162,336 126,433 2030,404 8,907 4,881 4,71
100594
R-M 119,193 216,295 42,261 1678,540 3,545 3,602 3,26
100603
M-S 119,071 61,460 34,332 1693,071 4,464 4,188 2,92
100611
P-F 178,856 269,956 92,721 896,077 3,960 3,524 3,96
100614
J-McA 204,794 245,159 322,970 3470,966 11,393 6,814 5,32
100617
C-W 159,292 51,343 38,850 1504,544 5,859 4,974 3,60
100630
E-AV 140,072 34,778 59,454 1091,420 1,969 3,161 3,34
100637
R-B 179,987 59,477 137,723 2077,095 4,726 3,002 4,24
101013
T-H 177,189 507,415 237,499 1556,336 9,381 8,910 3,36
101118
G-S 163,553 282,057 150,713 2348,845 6,231 7,161 3,93
101137
S-S 175,291 2049,970 715,601 3318,137 11,450 8,458 3,71
101257
M-F 155,324 40,730 49,441 1082,686 3,240 3,421 1,71
101275
J-C 121,598 143,292 45,227 1454,509 1,915 2,788 4,69
101284
R-F 123,312 16,825 42,048 1072,891 4,386 3,679 1,64
101321
H-P 180,159 180,091 367,681 2235,931 11,450 10,045 3,37
101322
A-P 133,640 269,262 244,520 2015,508 9,119 8,458 4,01
101335
L-S 164,947 64,238 208,719 2545,531 11,018 6,930 3,90
101336
L-S 156,847 741,300 72,664 1387,281 6,097 4,683 3,73
101351
P-F 128,701 12,461 99,050 1557,519 5,486 4,161 4,01
101441
R-H 104,993 176,909 354,512 1338,637 5,271 6,445 3,50
101478
G-S 142,642 63,543 149,266 1296,972 3,859 4,411 2,64
101565
D-A 132,117 74,355 187,250 1206,734 5,962 4,782 2,92
Se analizaron parámetros de rendimiento clínico para las combinaciones de marcadores que mejor podían diferenciar la presencia de fibrosis significativa (F2-F4) de la ausencia de fibrosis/fibrosis leve (F0-F1) utilizando diversos algoritmos estadísticos. Entre los algoritmos estadísticos analizados se incluyeron el análisis univariante, las curvas características del receptor-operador (ROC), la regresión logística, el análisis de función discriminante y la optimización del diseño factorial.
Los resultados del análisis ROC se muestran en la Tabla 5. Los valores del área bajo la curva (AUC) representan el valor diagnóstico reltaivo de un único marcador en el valor de corte indicado. Tal como puede observarse por los valores de AUC decrecientes, se demuestra que AH presenta el mejor valor diagnóstico al utilizarse solo en el valor de corte indicado, seguido de PIIINP, TIMP-1, MG-a2 y colágeno de tipo IV.
TABLA 5 ANÁLISIS ROC AUC Sensibilidad
Especificidad Valor de corte
AH
0,821 90,0% 62,0% 35,5 ng/ml
PIIINP
0,777 90,8% 39,2% 3,0 ng/ml
TIMP-1
0,773 90,8% 43,0% 1190,6 ng/ml
Macroglobulina-a2
0,722 90,5% 34,6% 2,4 mg/ml
Colágeno de tipo IV-7S
0,726 90,8% 24,1% 2,79 ng/ml
YKL-40
0,696 90,8% 19,0% 34,5 ng/ml
Laminina
0,524 90,7% 16,5% 125,2 ng/ml
Los parámetros de rendimiento clínico para diversas combinaciones de marcadores de fibrosis se muestran en la Tabla 6. Los mejores subconjuntos, incluyendo marcadores individuales, así como combinaciones de dos a cuatro marcadores y algoritmos para discriminar F0F1 de F2F4, se generaron mediante regresión logística. Entre los marcadores se incluían PIIINP, MG-a2, laminina y colágeno de tipo IV. Tal como se muestra en la Tabla 5, los parámetros de rendimiento diagnóstico (sensibilidad, específicidad, VPP y VPN) fueron similares para las combinaciones de dos, tres y cuatro marcadores identificados mediante regresión logística en la población de estudio, que presentaba una prevalencia de fibrosis de aproximadamente 60% (ver las líneas 2-4 y 6-9).
Tal como se muestra en la Tabla 6, línea 5, el análisis de función discriminante por etapas (SAS) resultó en la identificación del subconjunto de 3 marcadores (PIIINP, MG-a2 y laminina). El rendimiento clínico de esta
combinación fue similar al de las combinaciones de marcadores identificadas utilizando la regresión logística.
Se utilizó el software de diseño de experimentos (DOE KISS, compilación 8, Air Academy Associates) para optimizar simultáneamente los valores de corte de múltiples variables con el fin de obtener el mejor rendimiento del panel de ensayos en la predicción de la fibrosis. Mediante la utilización de DOE KISS, se generó un diseño compuesto central asistido por ordenador para una combinación de marcadores; esta matriz de diseño consistía de una serie de combinaciones de valores de corte para cada uno de los marcadores en la combinación. Los resultados de estos experimentos (sensibilidad, especificidad y exactitud) para diferenciar la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4 se registraron en la hoja de diseño en el ADE. Se llevó a cabo un análisis de regresión para cada uno de los parámetros (sensibilidad, especificidad y precisión), proporcionando valores de corte para cada una de las variables en la combinación, con el fin de conseguir el máximo rendimiento para cada parámetro.
Los cinco marcadores con el mejor rendimiento diagnóstico en el análisis ROC (AUC más alta) fueron AH, PIIINP, TIMP-1, MG-a2 y colágeno de tipo IV (ver la Tabla 5). Los valores de corte de cada uno de los marcadores en este panel de 5 marcadores se optimizaron para la máxima precisión. Los resultados mostrados en la Tabla 6, línea 10, indican que, a la precisión óptima (69,6%), la especificidad era excesivamente baja para resultar útil (32,9%), mientras que la sensibilidad era elevada (94,8%). Se obtuvieron resultados similares al optimizar los marcadores para sensibilidad o especificidad. El análisis de regresión mostró que TIMP-1 no presentaba un efecto significativo sobre la precisión, la sensibilidad o la especificidad de este panel de 5 marcadores.
Se analizó un panel similar de 4 marcadores mediante ADE, tal como se muestra en la Tabla 6, línea 11. Al excluir TIMP-1, el panel de cuatro marcadores fue optimizado para precisión (77,8%), proporcionando una sensibilidad y especificidad de 79,1% y 79,5%, respectivamente. Estos resultados demuestran que el panel de cuatro marcadores: AH, PIIINP, MG-a2 y colágeno de tipo IV, podía diferenciar mejor la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4 que un panel de cinco marcadores constituido por AH, PIIINP, MG-a2, colágeno de tipo IV y TIMP-1.
También se analizaron mediante ADE varios subconjuntos de tres marcadores del panel de cuatro marcadores. La línea 12 muestra los resultados obtenidos para la combinación de AH, colágeno y MG-a2, con los resultados optimizados para precisión. Este panel de tres marcadores proporcionó una especificidad muy baja, inferior al 30%. En contraste, al optimizar para la precisión un panel de tres marcadores constituido por AH, PIIINP y MG-a2, se observó que el rendimiento era similar al del panel de cuatro marcadores (comparar las líneas 13 y 11 de la Tabla 6).
Un análisis similar del panel de dos marcadores, AH y MG-a2, proporcionó los resultados mostrados en la línea 14 de la Tabla 6. Esta combinación proporcionó una mejora de la especificidad respecto al panel de tres marcadores, AH, PIIINP y MG-a2 (84,4% en comparación con 78,3%).
TIMP-1, la cual se observó que era un buen discriminador de fibrosis en el análisis univariante, fue añadido al panel de dos marcadores. Tal como se muestra en la línea 15, el rendimiento del panel de tres marcadores AH, MG-a2 y TIMP-1 fue similar al obtenido con el panel de dos marcadores, y se mejoró la sensibilidad en comparación con el panel de tres marcadores AH/PIIINP/MG-a2 (sensibilidad de 83,5% en comparación con 78,3%). Además, en el análisis preliminar de regresión, TIMP-1 contribuyó significativamente a la discriminación de la fibrosis en una población de estudio con una prevalencia elevada de fibrosis severa.
Otro panel de tres marcadores constituido por AH, MG-a2 y YKL-40 también se optimizó para precisión en la diferenciación de la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4. Tal como se muestra en la Tabla 6, línea 16, este panel de tres marcadores presentó un rendimiento similar al panel MG-a2/AH/TIMP-1.
En resumen, estos resultados indican que un panel MG-a2/AH/TIMP-1 ó MG-a2/AH/YKL-40 puede resultar útil en la diferenciación de la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4.
EJEMPLO II
ESTRATEGIA DE DOBLE OPTIMIZACIÓN PARA EL ANÁLISIS DEL PANEL DE TRES MARCADORES MG-a2/AH/TIMP
El presente ejemplo describe la utilización de múltiples valores de corte para MG-a2, AH y TIMP-1 para conseguir un grado relativamente elevado de precisión en un subconjunto de una población total de pacientes sometida a ensayo.
Mediante la utilización del panel de tres marcadores MG-a2/AH/TIMP-1 con valores de corte para MG-a2, AH y TIMP-1 fijados en 35 ng/ml, 2 mg/ml y 1.000 ng/ml, respectivamente, se determinó que las muestras eran positivas en el caso de que las tres variables presentasen valores superiores a los valores de corte, y por lo tanto se consideraron negativas en el caso de que uno o más de los niveles de MG-a2, AH o TIMP-1 fuera inferior al valor de corte asignado. Tal como se muestra en la Tabla 7, en la población de 194 pacientes, se observó un total de 72 resultados negativos, 15 de los cuales eran falsos negativos, proporcionando un valor predictivo negativo (VPN) de 79% en la prevalencia de estudio de aproximadamente 60% de fibrosis. A una prevalencia de 30%, que es la típica prevalencia en una clínica de hepatología, el valor predictivo negativo es superior al 92%, lo que resulta útil en el descarte de la presencia de fibrosis F2-F4 (cociente de probabilidades: 0,22).
Además, de los 122 positivos del ensayo utilizando los valores de corte de 35 ng/ml, 2 mg/ml y 1.000 ng/ml, 21 de los positivos del ensayo eran falsos, proporcionando un valor predictivo positivo (VPP) de 82,8%. Sin embrgo, a una prevalencia más típica de 30% de fibrosis, el valor predictivo positivo cae hasta aproximadamente 58% (ver la Tabla 7). De esta manera, en una población con una prevalencia típica, un resultado positivo no presentaría suficiente valor predictivo para resultar útil como diagnóstico.
Con el fin de incrementar el valor predictivo positivo para por lo menos un subconjunto de la población total de pacientes, se evaluaron para positividad de los tres marcadores las muestras positivas según el análisis primario, utilizando un segundo juego de valores de corte que eran superiores a los del primer juego. Mediante la evaluación de aquellas muestras que eran positivas según un análisis primario con los valores de corte más altos, pueden determinarse cuáles son las muestras de fibrosis severa en este grupo con un valor predictivo relativamente elevado. Aquellas muestras con resultado negativo según la evaluación secundaria se consideraron "indeterminadas" en el sentido de que su estatus de fibrosis no podía determinarse con un buen valor predictivo.
La Tabla 7 muestra el rendimiento del ensayo del panel MG-a2/AH/TIMP-1 con la estrategia de doble optimización. Los valores de corte primarios se fijaron en 2,0 mg/ml, 35 ng/ml y 1.000 ng/ml para conseguir una sensibilidad relativamente elevada en el análisis primario. Cualesquiera muestras que presentase los tres niveles, de MG-a2, AH
5 y TIMP-1, superiores a los valores de corte asignados se consideraban positivas. Los 122 positivos de ensayo obtenidos mediante el análisis primario se evaluaron nuevamente utilizando 2,0 mg/ml, 60 ng/ml y 1.575 ng/ml como los valores de corte de MG-a2, AH y TIMP-1 y los criterios de que las muestras debían presentar valores de MG-a2, AH y TIMP-1 superiores a los valores de corte asignados para ser positivas.
10 Mediante la utilización del segundo juego de valores de corte, se determinó que 54 de los 122 pacientes eran positivos, de los cuales sólo 1 era un falso positivo. El valor predictivo positivo era de 98,2% a una prevalencia de fibrosis de 59,8%, y era de 93,9% a la prevalencia de fibrosis más típica, de 30%. En resumen, de los 194 pacientes, 72 fueron clasificados como negativos y 54 se clasificaron como positivos, mientras que 68 muestras presentaron resultados indeterminados y no pudieron clasificarse definitivamente. Además, al excluir las muestras
15 indeterminadas, el ensayo de tres marcadores presentó un valor predictivo positivo de más de 93% y un valor predictivo negativo próximo a 93% en una población típica que presentaba una prevalencia de fibrosis de 30%.
La Tabla 8 muestra una comparación entre el rendimiento del panel de tres marcadores MG-a2/AH/TIMP-1 y el panel de seis marcadores descrito en Poynard et al., Lancet 357:1069, 2001.
TABLA 8
COMPARACIÓN ENTRE EL RENDIMIENTO DEL PANEL DE MG-a2/AH/TIMP-1 Y EL PANEL DE 6 MARCADORES DE POYNARD ET AL.
Prometheus
Poynard et al.
Biopsia
Biopsia
Fib +
Fib Fib + Fib
Ensayo +
53 1 54 Ensayo + (>0,08) 45 5 50
Ensayo
15 57 72 Ensayo - (<0,20) 13 106 119
Ambiguo
48 20 68 Ambiguo 80 90 170
Pop, total
116 78 194 Pop, total 138 201 339
Prevalencia
0,05979 Prevalencia 0,4071
Sensibilidad
0,7794 Sensibilidad 0,7759
Especificidad
0,9828 Especificidad 0,9550
VPP
0,9815 VPP 0,900
VPN
0,7917 VPN 0,8908
Precisión
0,8730 Precisión 0,8935
% Ambiguos Falsos pos,
0,03505 1 68/194 De 54 de ensayo + 1,85% % Ambiguos Falsos pos, 0,0515 5 170/339 De 50 de ensayo + 10,00%
Falsos neg,
15 de 72 de ensayo 20,83% Falsos neg, 13 de 119 de ensayo 10,92%
Fib +
Fib Fib + ·Fib
Ensayo +
186 8 194 Ensayo + (>0,08) 133 15 147
Ensayo -
53 433 486 Ensayo - (<0,20) 38 313 351
Ambiguo
168 152 320 Ambiguo 236 265 501
407
593 1000 Pop, total 407 593 1000
Prevalencia
0,4071 Prevalencia 0,4071
Sensibilidad
0,7794 Sensibilidad 0,7759
Especificidad
0,9828 Especificidad 0,9550
VPP
0,9607 VPP 0,9000
VPN
0,8917 VPN 0,8907
Precisión
0,09113 Precisión 0,8935
% pos, en ensayo
19,4% % pos, en ensayo 14,7%
% neg, en ensayo
48,6% % neg, en ensayo 35,1%
% Ambiguos
32,0 % Ambiguos 50,1%
Falsos pos,
8 De 194 de ensayo + 3,93% Falsos pos, 15 De 147 de ensayo + 10,00%
Falsos neg,
53 de 486 de ensayo 10,83% Falsos neg, 38 de 35 de ensayo - 10,93%
* macroglobulina-a2, globulina-a2, bilirrubina total, globulina-y, apoA1 y GGT
Estos resultados demuestran que el panel de tres marcadores MG-a2/AH/TIMP-1 puede resultar útil para diferenciar la fibrosis F0-F1 de la fibrosis F2-F4 con muy buena precisión. Estos resultados indican además que un ensayo de combinación de marcadores de fibrosis puede resultar útil para determinar el estatus de fibrosis de una parte de los pacientes sometidos a ensayo con muy buena precisión, mientras que los pacientes restantes son candidatos para biopsia.
EJEMPLO III
ENSAYO DE MACROGLOBULINA-a2, ÁCIDO HIALURÓNICO E INHIBIDOR TISULAR DE METALOPROTEINASA1
A. Cuantificación de la macroglobulina-a2 humana (MG-a2)
Se cuantificaron los niveles séricos de macroglobulina-a2 humana utilizando el sistema Beckman Array® 360 de la manera indicada a continuación, con el fin de determinar los niveles de MG-a2 en el intervalo de entre 0,75 y 270 mg/ml.
Se utilizó el sistema Beckman Array® 360 para la determinación de las concentraciones de MG-a2. Este sistema utiliza un nefelómetro, que mide la tasa de formación de luz dispersada resultante de una reacción de inmunoprecipitación entre el antígeno MG-a2 en una muestra con el anticuerpo contra la MG-a2 humana. Tras pasar un haz de luz por la solución en una celda de flujo, se detecta la intensidad de la luz dispersada por las partículas macromoleculares formadas de complejos insolubles en suspensión en la solución y es medida por el nefelómetro. El incremento de la dispersión de la luz resultante de la reacción de antígeno-anticuerpo se convierte en una señal de tasa máxima que es proporcional a la concentración de MG-a2 en la muestra. La formación de complejos resultantes y el cambio consecuente de intensidad de la luz dispersada se produce a una tasa que se incrementa gradualmente en un primer momento y que finalmente pasa una tasa máxima de cambio para el componente que se analiza.
Se extrajeron muestras de suero de individuos en ayuno y generalmente se separaron físicamente de las células dentro de las 2 primeras horas después del momento de la recolección, tal como se indica en la publicación del NCCLS nº H 18-A. Las muestras no sometidas a ensayo dentro de las primeras 72 horas se almacenaron congeladas a una temperatura de entre -15ºC y -20ºC. Las muestras congeladas se descongelaron como máximo en una ocasión. Se rechazaron los especímenes hemolizados, altamente lipémicos o turbios para el análisis posterior.
Se extrajeron los reactivos del almacenamiento a 4ºC y se utilizaron inmediatamente. Se mezclaron tampones y diluyentes por completo mediante inversión antes de añadirlos al instrumento. La preparación, purga y calibración se llevaron a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante con muestras diluidas 1:36. Generalmente se evitó utilizar muestras relativamente concentradas, tales como muestras no diluidas o diluciones 1:6. Las muestras muy lipémicas se diluyeron 1:2 con diluyente antes de someterlas a ensayo. Se evitaron las partículas de polvo u otras materias particuladas, las cuales pueden resultar en señales de dispersión lumínica extrañas, en la solución de reacción. Antes de someter a ensayo las muestras, se eliminaron cualesquiera burbujas de aire o espuma en los vasos para muestras y botella de reactivo mediante la utilización de una pipeta o punta de pipeta de transferencia desechable para aspirar las burbujas. Se evitó el uso de DTT en el área de trabajo.
Se analizaron las muestras para la concentración de MG-a2 de la manera siguiente. Se cargó la rueda de reactivos (rueda izquierda) en el instrumento con antisuero de AMG en el espacio nº 2-. Se cargaron los segmentos de dilución con 150 ml de control o muestra en los pocillos en el lado mayor de los segmentos en forma de abanico. Los segmentos y los vasos de control de dilución inicial/muestra se etiquetaron para su identificación. Se evitaron las burbujas durante la carga de los controles y muestras de suero.
Se introdujeron los niveles 1 y 3 (3 gotas) de control de proteína VigilTM en los vasos 1 y 3, respectivamente. Se introdujo el nivel 2 de control inmunológico Biorad LiquichekTM (150 ml) en el vaso 2. Se añadieron las muestras de paciente (150 ml) a los vasos en secuencia. Los segmentos se introdujeron en la rueda derecha que se inicia en la
posición nº 1. Se colocaron tapas de evaporación sobre las ruedas de reactivos y muestras.
En el menú de la pantalla maestra (MASTER SCREEN), se seleccionó la recuperación de resultados (RESULTS RECALL) (F3) antes de (F4) CLR CUR RUN. Tras volver a la MASTER SCREEN, se seleccionó el programa de muestras (SAMPLE PROGRAM) (F1). Se seleccionó ENTER al aparecer rueda de reactivos nº 1 y en cada número de vaso. Se introdujo el ID de control o el nº de acc. de muestra. Se seleccionó ensayo "2" y se seleccionó guardar vaso (SAVE CUP) (F1) para cada vaso. Se seleccionó Inicio (START) para iniciar el análisis. Al final de la operación, se seleccionó (Y) en respuesta a CLEAR CURRENT RUN & START NEXT RUN (borrar proceso actual e iniciar siguiente proceso).
El aparato Beckman Array® 360 proporcionó los resultados en mg/dl utilizando números enteros, en el sistema Pros. El instrumento diluyó rutinariamente 1:36 las muestras. Las muestras de concentración superior a 750 mg/dl fueron sometidas a ensayo a una dilución 1:216 por el instrumento. Las muestras que presentaban una concentración inferior a 75 mg/dl a una dilución 1:36 se informaron como <75 mg/dl. A las diluciones iniciales, el intervalo analítico Beckman era de entre 75 y 750 mg/dl, mientras que el intervalo extendido era de 75-27.000 mg/dl. El intervalo para los individuos normales, verificado en Prometheus Laboratories, era de 103 a 274 mg/dl.
Se llevó a cabo el control de calidad de la manera siguiente. Se utilizaron tres niveles de control: bajo, intermedio y alto. Los controles se encontraban a menos de 2 desviaciones estándares, excepto aquellos procesos aceptados con dos controles a menos de 2 desviaciones estándares y el tercer control, entre 2 y 3 desviaciones estándares. Los controles utilizados eran Beckman Vigil I y III, y Biorad Level II. Se sometieron a ensayo los controles con cada proceso de muestras.
Se calibró el ensayo cada 14 días y también en el caso de que se produjesen cambios en los lotes de reactivos o al producirse un cambio importante en el instrumento. Se confirmó la linealidad cada 6 meses con material de linealidad apropiado. Lo anterior se lleva a cabo para garantizar un rendimiento consistente en el tiempo y para satisfacer las normas estatales y nacionales.
Se llevó a cabo la calibración del ensayo cada 6 meses para certificar la consistencia en el tiempo. Cada 6 meses se evaluó un mínimo de cinco muestras de verificación, incluyendo concentraciones mínima, de punto intermedio y máxima. El coeficiente de variación (CV en %) de los resultados de la muestra de verificación debía ser inferior a 15% para informar de los resultados de las muestras de pacientes.
B. Cuantificación del ácido hialurónico (AH)
Se determinaron los niveles séricos de AH utilizando el kit de ensayo cuantitativo de ácido hialurónico (AH) (nº de catálogo 029001) de Corgenix, esencialmente de la manera siguiente.
Se almacenaron las muestras de suero a -70ºC. Se evitaron los ciclos múltiples de congelación/descongelación, con un máximo de 4 ciclos de congelación/descongelación por muestra. Los kits se almacenaron a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC.
Previamente a la utilización, el kit y las muestras de pacientes se equilibraron a la temperatura ambiente (entre 18ºC y 28ºC). La bolsa de tiras recubiertas también se equilibró a la temperatura ambiente antes de abrir. Se preparó solución de lavado (PBS 0,01 M, pH 7,35 ± 0,1) mediante dilución del concentrado 33X de lavado de PBS con agua destilada y el ajuste del pH de la solución final a pH 7,35 ± 0,1.
Todos los blancos, estándares, controles y muestras se sometieron a ensayo por duplicado. Se incluyó un blanco de agua para la calibración del espectrofotómetro con cada placa y siguió vacío hasta la adición de 200 ml de agua inmediatamente antes de la lectura. Se utilizó tampón de reacción sin muestra de suero para el blanco de reactivo, que representaba la solución de referencia de 0 ng/ml de AH, y se trató de la misma manera que las muestras de pacientes y las soluciones de referencia en las etapas de ensayo posteriores. Se procesaron con cada ensayo tres muestras de pacientes conocidas (baja, intermedia y alta). Además, se sometieron a ensayo soluciones de referencia de 50 ng/ml de AH, 100 ng/ml de AH, 200 ng/ml de AH, 500 ng/ml de AH y 800 ng/ml de AH con cada kit tal como se describe en mayor detalle posteriormente.
Se diluyeron 1:11 soluciones de referencia de AH y muestras de pacientes mediante la adición de 25 ml de solución de referencia o muestra a 250 ml de tampón de reacción y se mezclaron mediante agitación por vórtex suave. Las referencias diluidas, las muestras y los controles se añadieron (100 ml) a cada pocillo. El blanco de agua se dejó vacío. La placa se tapó y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Tras completar la incubación, se extrajo el contenido de los pocillos mediante aspiración. Las placas se lavaron cuatro veces con solución de lavado 1X, evitando que se secasen las placas entre lavados. La placa se secó vigorosamente sobre toallas de papel con el fin de eliminar el tampón residual tras el último lavado.
Se añadió solución de proteína ligante de AH conjugada con HRP (100 ml) a todos los pocillos excepto el blanco de agua antes de tapar la placa e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras completar la incubación, se lavó la placa cuatro veces tal como se ha indicado anteriormente. A continuación, se añadió solución de sustrato (100 ml de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y peróxido de hidrógeno, estabilizado) a cada pocillo excepto al blanco de agua. La placa tapada seguidamente se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se guardó la placa en la oscuridad.
Se determinó la DO650 del estándar de 800 ng/ml de AH. Con una DO inferior a 0,500, se continuó la incubación del sustrato y se realizó un seguimiento de la DO para determinar si la DO había alcanzado 0,500. Con una DO superior a 0,500 ó después de una hora de incubación del sustrato, incluso si la DO no había alcanzado 0,500, se terminaron las reacciones mediante la adición de 100 ml de solución de parada (ácido sulfúrico 0,36 N) a cada pocillo, excepto al blanco de agua. Se añadió solución de parada en el mismo orden y a aproximadamente la misma tasa que la adición de solución de sustrato. Antes de la lectura de las densidades óptimas, se añadieron 200 ml de agua destilada al blanco de agua. Se leyó la DO de cada pocillo a 450 nm (referencia: 650 nm) dentro de la hora posterior a la calibración a cero del lector de placas con el blanco de agua.
Se utilizaron los criterios siguientes para determinar si el ensayo era fiable. El valor medio de DO del blanco de reactivo (estándar cero) era inferior a 0,10. Las lecturas superiores a 0,10 se consideraron indicativas de posible contaminación de sustrato o reactivo y los resultados no se informaron bajo estas condiciones. El valor medio de DO de la referencia de 500 ng/ml de AH era de 0,800 ó superior. Los controles de las tres muestras de pacientes conocidas se encontraban comprendidas dentro de los intervalos siguientes: Control inferior: 78,6 a 117,2 ng/ml. Control intermedio: 148,5 a 214,1 ng/ml. Control superior: 297,8 a 460,7 ng/ml. Las muestras con concentraciones de AH superiores a 800 ng/ml se diluyeron adicionalmente y se sometieron a ensayo una segunda vez con el fin de obtener un resultado más preciso.
Los controles y muestras de pacientes conocidos se determinaron a partir de una curva estándar de 4 parámetros generada utilizando Softmax y se informan en ng/ml. Los valores de los pacientes no se informaron en el caso de que la concentración excediese la concentración del estándar más alto. Para valores de los pacientes superiores a la concentración del estándar más alto a una dilución 1:11, las muestras se sometieron a ensayo a una dilución 1:55 y, en caso necesario, a una dilución más alta.
El ensayo ELISA del AH se evaluó cada seis meses para garantizar un rendimiento consistente en el tiempo. Se evaluó un mínimo de cinco muestras con valores de AH previamente conocidos en modo ciego para el operador. Para que el rendimiento del ensayo se considerase aceptable, los resultados de las muestras negativas debían ser negativos, y los resultados de las muestras positivas debían ser positivos y proporcionar resultados dentro del 15% de los valores obtenidos previamente. En el caso de que más de 20% de las muestras de validación no cumpliese los criterios de rendimiento, se ponía en práctica el modo de resolución de problemas y no se utilizaba el ensayo para informar los datos de los pacientes hasta establecer nuevamente un rendimiento aceptable del ensayo.
C. Cuantificación del inhibidor tisular de las metaloproteinasa-1 (TIMP-1)
Se determinaron los niveles séricos de TIMP-1 utilizando el kit de ensayo BiotrakTM (nº de catálogo RPN2611) de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), esencialmente de la manera siguiente.
Se descongeló el contenido del kit y se equilibró a una temperatura de entre 20ºC y 25ºC. Las muestras de suero se almacenaron congeladas a -70ºC. Se minimizaron los ciclos repetidos de congelación-descongelación de las muestras, con un máximo de seis ciclos de congelación-descongelación.
Se prepararon reactivos de ensayo de la manera siguiente y se almacenaron a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC durante como máximo 7 días. Se preparó tampón de ensayo (tampón fosfato 0,1 M, pH 7,5, con cloruro sódico al 0,9% (p/v), BSA al 0,1% (p/v) y Tween-20 al 0,1%) mediante la adición de agua destilada al concentrado de tampón de ensayo y ajustando el volumen final a 100 ml.
Se preparó conjugado de anti-TIMP-1 con peroxidasa de rábano picante en tampón de ensayo 1 esencialmente de la manera siguiente. A la botella de solución madre que contenía conjugado liofilizado, se añadieron 11 ml de tampón de ensayo 1 diluido; se mezcló suavemente el contenido hasta la disolución completa, evitando la agitación vigorosa y la formación de espuma. Se preparó tampón de lavado (tampón fosfato 0,1 M, pH 7,5, que contenía Tween-20 al 0,05%) mediante la adición de agua destilada al concentrado de tampón de lavado y llevando el volumen final a 500 ml, seguido de la mezcla completa.
La solución madre de 100 ng/ml de TIMP-1 se preparó de la manera siguiente y se almacenó a una temperatura de entre 2ºC y 8ºC. El estándar de TIMP-1 liofilizado se reconstituyó en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,5, que contenía
cloruro sódico al 0,9% (p/v), albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v) y Tween-20 al 0,1%, preparando una solución madre estándar de TIMP-1 de 100 ng/ml. Se mezcló suavemente el contenido hasta la disolución completa evitando la agitación vigorosa y la formación de espuma. Se prepararon estándares adicionales (1,565, 3,13, 6,25, 12,5, 25 y 50 ng/ml) para la curva de estándares inmediatamente antes de cada ensayo mediante la dilución en serie de dos veces de la solución madre de 100 ng/ml en el tampón de ensayo 1 en tubos de dilución de 1,2 ml. Se preparó además un estándar cero (blanco).
La bolsa que contenía la placa de microtitulación se abrió tras el equilibrado a la temperatura ambiente. Todas las muestras y estándares se sometieron a ensayo por duplicado y los estándares para una curva de estándares se encontraban presentes en cada placa. En cada placa, se encontraban presentes siete estándares, dos controles y un máximo de 39 muestras diferentes por duplicado.
Las muestras se diliuyeron 1:120 en los tubos mediante la mezcla de 595 ml de tampón ensayo 1 con 5 ml de suero. Las diluciones se mezclaron mediante agitación con vórtex. Mediante la utilización de un pipeteador multicanal, se añadieron 100 ml de blanco, estándares y muestras diluidas a los pocillos individuales en una placa de microtitulación. Se tapó la placa con la tapa proporcionada y se incubó a temperatura ambiente durante exactamente dos horas. Tras la incubación de dos horas, se aspiró el contenido de los pocillos y se lavó cada pocillo cuatro veces con tampón de lavado, con rellenado y aspirado completos de los pocillos tras cada lavado. Tras el lavado final, las placas se secaron sobre toallas de papel para eliminar el tampón de lavado residual.
Se añadió conjugado de peroxidasas (100 ml) a cada pocillo utilizando un pipeteador multicanal y la placa tapada se incubó a temperatura ambiente durante exactamente dos horas. Tras la incubación, se aspiraron los pocillos y se lavaron tal como anteriormente. Inmediatamente después de acabar la incubación, se añadieron a cada pocillo 100 ml de sustrato TMB equilibrado a temperatura ambiente (3,3',5,5'-tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno en dimetilformamida al 20% (v/v)). Se taparon las placas y se incubaron durante exactamente 30 minutos a temperatura ambiente. En algunos casos, se realizó un seguimiento de las reacciones a 630 nm. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 100 1l de ácido sulfúrico 1 M a todos los pocillos. Se determinó la absorbancia a 450 nm en 30 minutos.
Se determinaron los valores de las muestras de control y de los pacientes utilizando una curva de estándares (ajuste a la curva de 4 parámetros) generada utilizando Softmax. Los valores de concentración de la curva de estándares se multiplicaron por el factor de dilución (120) con el fin de obtener las concentraciones, expresadas en ng/ml. Se confirmó la calidad del ensayo utilizando muestras de suero conocidas. El control inferior se encontraba comprendido en el intervalo de entre 668,1 y 979,9 ng/ml. El control superior se encontraba comprendido en el intervalo de entre 2.677,9 y 3.300,2 ng/ml. Los valores de los pacientes generalmente no excedieron la concentración en ng/ml del estándar más alto. En el caso de que el valor del paciente fuese superior a la concentración del estándar más alto a una dilución 1:120, se informó del resultado como superior en 120 veces a la concentración del estándar más alto.
El ensayo ELISA de TIMP-1 se validó cada seis meses para garantizar un rendimiento consistente en el tiempo. Se evaluó un mínimo de cinco muestras con valores previamente conocidos en modo ciego para el operador. Los resultados de las muestras negativas debían ser negativos. Los resultados de las muestras positivas debían ser positivos y debían proporcionar resultados dentro del 15% de los valores previamente obtenidos. En el caso de que más de 20% de las muestras de validación no cumpliese los criterios de rendimiento, se puso en práctica el modo de resolución de problemas. No se informó de datos adicionales de los pacientes hasta establecer nuevamente un rendimiento aceptable del ensayo.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Prometheus Laboratories, Inc. Rose, Steven L. Oh, Esther H. Walsh, Michael J.
<120> Métodos de diagnóstico de la fibrosis hepática
<130> FP-PM 5505
<150> US 10/087,188
<151> 2002-02-28
<160> 4
<170> FastSEQ for Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 2041 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
CDS 10 <222> (1)...(1932)
<400> 1
<210> 2
<211> 643
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<213> Homo sapiens
<220>
<221>
CDS 10 <222> (63)... (683)
<400> 3 <210> 4
<213> Homo sapiens
<400> 4

Claims (46)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método de diagnóstico de la presencia o severidad de la fibrosis hepática en un individuo, que comprende las etapas de:
    (a)
    detectar macroglobulina-a2 en una muestra de dicho individuo,
    (b)
    detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho individuo,
    (c)
    detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho individuo, y
    (d) diagnosticar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho individuo basándose en la presencia o 10 nivel de MG-a2, AH y TIMP-1.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1, que comprende detectar como máximo tres marcadores de fibrosis.
  3. 3.
    Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en una muestra de dicho individuo por lo
    15 menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.
  4. 4.
    Método según la reivindicación 3, en el que dicho marcador es YKL-40.
  5. 5.
    Método según la reivindicación 1, que comprende además detectar en una muestra de dicho individuo dos o más marcadores seleccionados de entre el grupo que consiste de PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.
  6. 6.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta hepatitis vírica.
  7. 7.
    Método según la reivindicación 6, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis C.
    30 8. Método según la reivindicación 6, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis B.
  8. 9.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática autoinmunológica.
  9. 10.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática alcohólica.
  10. 11.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática grasa.
  11. 12.
    Método según la reivindicación 1, en el que dicho individuo presenta una enfermedad hepática inducida por medicamentos.
  12. 13. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2 en dicha muestra.
  13. 14. Método según la reivindicación 13, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más 45 agentes de unión específicos de MG-a2.
  14. 15. Método según la reivindicación 14, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-MG-a2.
    50 16. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de actividad de MG-a2.
  15. 17. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH en dicha muestra.
  16. 18. Método según la reivindicación 17, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión 55 específicos de AH.
  17. 19. Método según la reivindicación 18, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión a AH.
    60 20. Método según la reivindicación 18, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-AH.
  18. 21. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1 en
    dicha muestra.
  19. 22.
    Método según la reivindicación 21, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más agentes de unión específicos de TIMP-1.
  20. 23.
    Método según la reivindicación 22, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-TIMP-1.
  21. 24.
    Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de actividad de TIMP-1.
  22. 25.
    Método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH, y en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1.
  23. 26.
    Método según la reivindicación 25, en el que el nivel de cada uno de proteína MG-a2, AH y proteína TIMP-1 se determina utilizando un ensayo ligado a enzima.
  24. 27.
    Método según la reivindicación 1, en el que se obtiene una sola muestra de dicho individuo.
  25. 28.
    Método según la reivindicación 27, en el que dicha muestra se selecciona de entre el grupo que consiste de sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático.
  26. 29.
    Método según la reivindicación 28, en el que dicha muestra es una muestra de suero.
  27. 30.
    Método según la reivindicación 1, que comprende diferenciar la fibrosis hepática leve o la ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada a severa.
  28. 31.
    Método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o la ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada a severa en un individuo, que comprende las etapas de:
    (a)
    poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con anticuerpo anti-MG-a2 bajo condiciones adecuadas para formar un primer complejo de MG-a2 y anticuerpo anti-MG-a2,
    (b)
    lavar dicho primer complejo para eliminar las moléculas no unidas,
    (c)
    determinar la cantidad de primer complejo que contiene MG-a2,
    (d)
    poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con una proteína de unión a AH (PUAH) bajo condiciones adecuadas para formar un segundo complejo de AH y PUAH,
    (e)
    lavar dicho segundo complejo para eliminar las moléculas no unidas,
    (f)
    determinar la cantidad de segundo complejo que contiene AH,
    (g)
    poner en contacto una dilución apropiada de una muestra de dicho individuo con anticuerpo anti-TIMP-1 bajo condiciones adecuadas para formar un tercer complejo de TIMP-1 y anticuerpo anti-TIMP-1,
    (h)
    lavar dicho tercer complejo para eliminar las moléculas no unidas,
    (i)
    determinar la cantidad de tercer complejo que contiene TIMP-1, y
    (j)
    diferenciar la fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática moderada/severa en dicho individuo basándose en las cantidades de complejos que contienen MG-a2, AH y TIMP-1.
  29. 32.
    Método de seguimiento de la eficacia de la terapia antifibrótica en un paciente, que comprende las etapas de:
    (a)
    detectar macroglobulina-a2 en una muestra de un paciente en el que se ha administrado una terapia antifibrótica,
    (b)
    detectar ácido hialurónico (AH) en una muestra de dicho paciente,
    (c)
    detectar inhibidor tisular de metaloproteinasa-1 (TIMP-1) en una muestra de dicho paciente, y
    (d)
    determinar la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho paciente basándose en la presencia o nivel de MG-a2, AH y TIMP-1, realizando un seguimiento de esta manera de la eficacia de la terapia antifibrótica.
  30. 33.
    Método según la reivindicación 32, que comprende además comparar la presencia o la severidad de la fibrosis hepática determinada en la etapa
    (d) con la presencia o severidad de la fibrosis hepática en dicho paciente en un tiempo anterior.
  31. 34.
    Método según la reivindicación 32, que comprende detectar como máximo tres marcadores de fibrosis.
  32. 35.
    Método según la reivindicación 32, que comprende además detectar en una muestra de dicho paciente por lo menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste de: PIIINP, laminina, tenascina, colágeno de tipo IV, colágeno de tipo VI, YKL-40, MMP-3, MMP-2, complejo MMP-9/TIMP-1, ligando sFas, TGF-�1, IL-10, apoA1, apoA2 y apoB.
  33. 36.
    Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (a) comprende determinar el nivel de proteína MG-a2 en dicha muestra.
    5 37. Método según la reivindicación 36, en el que el nivel de proteína MG-a2 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-MG-a2.
  34. 38. Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (b) comprende determinar el nivel de AH en dicha muestra.
    10 39. Método según la reivindicación 38, en el que el nivel de AH se determina utilizando uno o más agentes de unión a AH.
  35. 40.
    Método según la reivindicación 32, en el que la etapa (c) comprende determinar el nivel de proteína TIMP-1 en dicha muestra.
  36. 41.
    Método según la reivindicación 40, en el que el nivel de proteína TIMP-1 se determina utilizando uno o más anticuerpos anti-TIMP-1.
  37. 42. Método de diferenciación de la fibrosis hepática leve o ausencia de fibrosis de la fibrosis hepática 20 moderada/severa en un individuo, que comprende las etapas de:
    (a)
    determinar un nivel de MG-a2 en una muestra de dicho individuo,(b) determinar un nivel de AH en una muestra de dicho individuo,
    (c)
    determinar un nivel de TIMP-1 en una muestra de dicho individuo, y
    25 (d) diagnosticar que dicho individuo presenta fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis en el caso de que dicho nivel de MG-a2 es inferior a un valor de corte de MG-a2 X1, dicho nivel de AH es inferior al valor de corte de AH Y1 ó dicho nivel de TIMP-1 es inferior al valor de corte Z1 de TIMP-1,
    diagnosticar que dicho individuo presenta fibrosis hepática leve/ausencia de fibrosis en el caso de que dicho nivel de
    30 MG-a2 es superior a un valor de corte de MG-a2 X2, dicho nivel de AH es superior al valor de corte de AH Y2 y dicho nivel de TIMP-1 es superior al valor de corte Z2 de TIMP-1, y diagnosticar los individuos restantes como de estatus indeterminado.
  38. 43. Método según la reivindicación 42, en el que dicho individuo presenta un trastorno seleccionado de entre el
    35 grupo que consiste de hepatitis vírica, enfermedad hepática autoinmunológica, enfermedad hepática alcohólica, enfermedad hepática grasa y enfermedad hepática inducida por medicamentos.
  39. 44. Método según la reivindicación 43, en el que dicho individuo se encuentra infectado por virus de la hepatitis C.
    40 45. Método según la reivindicación 42, en el que dichas muestras se seleccionan de entre el grupo que consiste de sangre, suero, plasma, orina, saliva y tejido hepático.
  40. 46. Método según la reivindicación 45, en el que se determinan en una muestra de suero cada uno de dichos niveles de MG-a2, de AH y de TIMP-1.
  41. 47. Método según la reivindicación 46, en el que X1 es un valor entre 1,8 y 2,2 mg/ml, en el que Y1 es un valor entre 31 y 39 ng/ml, en el que Z1 es un valor entre 900 y 1.100 ng/ml,
    50 en el que X2 es un valor entre 1,8 y 2,2 mg/ml, en el que Y2 es un valor entre 54 y 66 ng/ml, y en el que Z2 es un valor entre 1.415 y 1.735 ng/ml.
  42. 48. Método según la reivindicación 47,
    55 en el que X1=2,0 mg/ml, en el que Y1=35 ng/ml, en el que Z1=1.000 ng/ml, en el que Y2=60 ng/ml, y en el que Z2=1.575 ng/ml.
  43. 49. Método según la reivindicación 47, en el que X1=2,0 mg/ml, en el que Y1=37 ng/ml,
    en el que Z1=1.100 ng/ml, en el que X2=2,0 mg/ml, en el que Y2=60 ng/ml, y en el que Z2=1.575 ng/ml.
  44. 50. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 80%.
    10 51. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%.
  45. 52. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis
    15 hepática de hasta 30%, por lo menos 65% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con un valor predictivo positivo de por lo menos 90% y un valor predictivo negativo de por lo menos 90%.
  46. 53. Método según la reivindicación 42, en el que, en una población que presenta una prevalencia de fibrosis
    20 hepática de hasta 10%, por lo menos 70% de los individuos en dicha población son diagnosticados con fibrosis leve/ausencia de fibrosis o fibrosis moderada/severa con una precisión de por lo menos 90%.
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