ES2402942T3

ES2402942T3 - Combinación de marcadores de células aviarias

Info

Publication number: ES2402942T3
Application number: ES07727052T
Authority: ES
Inventors: Bertrand Pain; Fabrice Lavial; Elodie Bachelard; Guillaume Montillet; Jacques Samarut
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Ecole Normale Superieure de Lyon; Ecole Normale Superierure de Lyon
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2013-05-10
Anticipated expiration: 2027-03-19
Also published as: FR2898909A1; JP2009529900A; EP2007902A2; EP2007902B1; WO2007110343A2; WO2007110343A3; AU2007229558A1; CA2647556A1; US20090311682A1

Abstract

Combinación de marcadores que permite caracterizar unas células aviarias de tipo StX (blastodermo de fase X) ounas células madre aviarias, que comprende por lo menos dos marcadores, caracterizada porque uno de losmarcadores es específico del gen 1p06 y el otro marcador se selecciona de entre: a. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genessiguientes: 2contig58, 60S-L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16(FLJ10374), CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2), Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa,N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C delinfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o b. un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre losgenes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps),GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.

Description

Combinación de marcadores de células aviarias.

La presente invención se refiere a una nueva combinación de marcadores de células aviarias que permiten caracterizar dichas células según su fenotipo, ya se trate de células StX o de células madre. La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de caracterización de células aviarias con dichos marcadores, así como a un procedimiento de cultivo de células aviarias, en el que se caracterizan las células mediante el procedimiento según la invención.

El objetivo de la invención es identificar y utilizar una combinación única de genes susceptibles de ser utilizados como marcadores para definir, modificar, controlar de manera positiva o negativa la competencia germinal de una célula madre aviar de cualquier naturaleza embrionaria, germinal o adulta que sea.

Una célula madre es una célula pluripotente o multipotente de origen embrionario o adulto, que presenta una capacidad de auto-renovación y que es capaz de dar unas células diferenciadas especializadas. En otras palabras, una célula madre es una célula no cancerosa capaz de dividirse indefinidamente en cultivo y de dar una célula hija que presenta la misma capacidad de proliferación y de diferenciación que la célula madre de la cual procede.

Diferentes clases de células madre se han aislado según su origen embrionario o adulto y su origen tisular somático

o germinal. Se ha mostrado que las células cepas embrionarias de ratones (MESC) eran capaces de contribuir al linaje germinal cuando eran reintroducidas en un embrión. Los mecanismos moleculares que controlan esta competencia germinal no están completamente identificados.

Las células madre son unas células que tienen la prodigiosa propiedad de auto-renovarse al mismo tiempo in vivo, en el que aseguran el mantenimiento y la renovación de los tejidos, e in vitro, en el que pueden ser mantenidas con unas condiciones definidas de cultivo.

En función de su origen tisular y de su potencialidad de diferenciación, se distinguen las células madre embrionarias (ESC), células pluripotentes de origen embrionario, las células madre germinales (EGC) y las células madre somáticas o adultas de origen tisular (ASC). Estas últimas presentan una cierta plasticidad en su potencialidad de diferenciación al mismo tiempo in vitro e in vivo.

Células madre embrionarias (ESC)

Células MESC

Las células madre embrionarias (células ESC) se han aislado e identificado en el ratón en los años 80 (Martin, 1981; Evans & Kaufman., 1981) y su aislamiento está inscrito en la continuidad de los numerosos estudios realizados antes con las células de carcinoma embrionario (o células EC) (para revisión, Chambers & Smith, 2004). Estas células ESC de ratón (MESC) se han obtenido a partir de la puesta en cultivo in vitro de blastocitos de ratones 129/SV según diferentes protocolos descritos (Robertson, 1987, Hogan et al., 1994). Los blastocitos de ratones antes de la gastrulación presentan una masa celular interna o ICM de 50 a 100 células, cuya caracterización molecular está todavía en curso. El devenir de estas células no es idéntico in vivo e in vitro.

In vivo, las células del epiblasto darán los tejidos embrionarios, y las células germinales se forman en el epiblasto proximal bajo la inducción de la ectodermis extra-embrionaria. Las células germinales aparecen así dentro de un nicho bajo la influencia de diferentes factores y citoquinas. Los mecanismos moleculares complejos responsables de esta inducción apenas empiezan a ser identificados en el ratón (Saitou et al., 2003).

In vitro, la puesta en cultivo de los blastocitos conduce a la eclosión de éste, a la adhesión y a la proliferación de las células de la ICM que, en condiciones de cultivo apropiadas, dan lugar a las células MESC. Estas condiciones de cultivo in vitro están, a partir de entonces, relativamente bien identificadas y estandarizadas, en particular por la adición en el medio de cultivo de por lo menos una citoquina de la familia del LIF (Yoshida et al., 1994). Nuevas vías de señalización parecen estar implicadas también en el mantenimiento del fenotipo de pluripotencia de las células MESC (Dani et al., 1998). Se han publicado numerosos trabajos sobre los mecanismos moleculares que controlan la pluripotencia de las células MESC. En este modelo, diferentes enfoques moleculares y funcionales han permitido poner en evidencia el papel clave de los genes oct-3/4 (Niwa et al., 2000; Niwa et al., 2002), nanog (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003) y stat3 (Niwa et al., 1998; Matsuda et al., 1999). Un esquema de consenso coloca el LIF y el BMP en el centro de la señal mitótica, y los genes Oct/nanog y stat3 como reguladores y efectores del equilibrio proliferación-diferenciación de las células ES (Ying et al., 2003; Chambers et al., 2004). Uno de los efectores aguas abajo sería el proto-oncogén c-myc directamente regulado por STAT3 (Cartwright et al., 2005). Están implicados otros actores, como la proteína P53 que parece controlar el nivel de expresión de nanog (Lin et al., 2005). La proteína OCT-3/4 controlaría su transcripción a nivel de su propio promotor en asociación con unas proteínas de la familia de los HMG como SOX-2 y/o SOX-3 (Okomura et al., 2005). En particular, la restricción de la expresión del gen Oct-3/4 en el linaje germinal del ratón estaría bajo la acción represiva del GCNF (Furhmann et al., 2001). El receptor Irh-1 estaría implicado por su parte en el mantenimiento en una fase más precoz del desarrollo, como en las células del epiblasto (Gu et al., 2005). Por lo menos en el ratón, una competencia germinal parece por lo tanto requerir, entre otros, un fuerte nivel de GCNF y un nivel relativamente bajo de OCT-3/4, incluso si la expresión de este gen oct-3/4 es indispensable para el linaje germinal (Kehler et al.; 2004). La existencia de numerosas interacciones entre unos actores de diferentes redes de señalización es una realidad que no está todavía completamente formulada para comprender el mantenimiento de la pluripotencia de las células MESC.

Se observará que el éxito del establecimiento de las células MESC depende asimismo de la cepa de ratones utilizada, con una facilidad de establecimiento a partir del fondo genético 129SV. La identificación molecular de esta limitación no ha sido documentada.

Células PESC y HESC

A nivel de los primates, las primeras células ESC de simio (PESC) fueron aisladas por J. Thomson de la universidad de Madison (WS) (Thomson et al., 1995) a partir de blastocistos. Desde entonces, otros laboratorios han aislado nuevos linajes de células de simio a partir de diferentes especies. La caracterización de estas células ha sido también el objeto de numerosas publicaciones al mismo tiempo a nivel de los caracteres bioquímicos (AP, telomerasa, antígenos de superficie, etc.) y a nivel de los genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia.

A nivel humano, se han obtenido unas células ESC (HESC) in vitro a partir de la puesta en cultivo de blastocistos (Thomson et al., 1998). Estas células presentan numerosas similitudes con las células MESC, pero también grandes diferencias como unas sensibilidades a factores de crecimiento diferentes.

A nivel de los mecanismos implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células PESC y HESC, los genes identificados en el ratón parecen también implicados, pero la situación parece más compleja. A título de ejemplo, la sensibilidad de las células PESC y HESC al LIF y la activación de la vía Jak/stat no parecen ser tan críticas como las de las células murinas (Raz et al., 1999; Sumi et al., 2004; Humphrey et al., 2004). Estas células no son así exclusivamente dependientes de esta única citoquina, lo cual hace el análisis de la señal de proliferación más complejo. Incluso si se encuentra la expresión de los actores principales oct-3/4, nanog y stat3, así como otros como rex1, foxD3, etc. en las células ESC de primates, el papel de estos genes no podría no ser tan determinante y se considera la existencia de vías alternativas.

Células CESC

Las células madre embrionarias de pollo (CESC) se han aislado mediante la puesta en cultivo de células de blastodermo de pollo en la etapa X (Pain et al., 1996; solicitud de patente n° FR94/12 598). Estas células CESC presentan todas las características de células madre embrionarias (ESC), incluida la colonización somática y germinal. Sin embargo, esta colonización germinal parece difícil de mantener después de algunos pasos por cultivo in vitro, al contrario que las células ES murinas. En la etapa de extracción y de puesta en cultivo de las células CES, el embrión de pollo está considerado como una blástula ya constituida de 50000 a 60000 células, organizadas en dos hojas embrionarias, el epiblasto y el hipoblasto. Los únicos criterios de morfología, de distribución tridimensional y de disposición de las células no permiten una identificación específica de diferentes sub-tipos celulares de manera segura, en particular las células que presentan una competencia germinal (Petitte et al., 1990; Carsience et al., 1993; Thoraval et al., 1994). La detección de células positivas para la proteína VASA en el embrión de pollo muy precoz (etapa III-IV Eg&K) ha relanzado la hipótesis de la preformación del linaje germinal en el pollo. Las células estarían individualizadas en el linaje germinal a partir de las primeras divisiones del embrión (Tsukenawa et al., 2000) en un modelo más próximo al de la drosophila que al modelo de inducción observado en el ratón (Extavour et al., 2003; Saitou et al., 2002). Estas células persistirían entonces durante las divisiones sucesivas hasta la fase X.

Para las células CESC de pollo, no hay ningún dato disponible en cuanto a los genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia y de la emergencia del linaje germinal en el embrión de pollo. El perfil de expresión de la mayoría de los genes identificados en las otras especies así como su regulación son completamente desconocidos.

Las células madres adultas (células ASC)

Unas células que presentan unas propiedades de autorrenovación y de diferenciación in vitro e in vivo se han aislado a partir de tejidos y se denominan ASC quot;Adult Stem Cellsquot; (Wagers y Weissman, 2004). Estas células se han aislado en diferentes especies, principalmente mamíferas a partir de diferentes tejidos, en particular el tejido hematopoyético (HSC hemopoietic Stem Cells) y el tejido nervioso (NSC Neural Stem Cells). Una bibliografía muy completa ilustra y pretende caracterizar estas células (para revisión, Shizuru et al., 2005, Mayhall et al., 2004). Otros numerosos tipos celulares se han identificado y presentan parcialmente las propiedades de células madre. Se pueden citar:

-: las células mesenquimales (MSC) (Hamada et al., 2005)

-: las células satélites musculares (Charge y Rudnicki, 2004; Seale et al.; 2004)

-: los precursores multipotentes quot;MAPCquot; (Jiang et al., 2002)

-: las células mesangioblastos (Cossu y Bianco, 2003; Minasi et al., 2002).

Su gran plasticidad de diferenciación observada permite considerar las células madre adultas como unas células susceptibles de cambiar su determinismo de diferenciación según el contexto, el lugar y las señales que reciben (Lakshmipathy, 2005, Galli et al., 2000). El vínculo que existe, por lo menos in vitro entre una célula ESC y una célula ASC, puede aparecer como un continuum de etapas de diferenciación limitada. En efecto, se pueden reproducir in vitro unas secuencias de diferenciación completa a partir de células ESC en tal o cual vía específica de diferenciación. El control de estos mecanismos complejos de inducción de las vías de diferenciación reviste una gran importancia en la comprensión del determinismo de estas células.

Células madre germinales (células EGC) y competencia germinal

A diferencia de las células ESC, derivadas directamente a partir de un embrión obtenido antes de la fase de gastrulación, las células madre embrionarias germinales (células EGC) se obtienen a partir de las crestas genitales ya constituidas en el embrión, crestas que han sido colonizadas por los precursores germinales. Durante la emergencia del linaje germinal y según las especies, las células precursoras se individualizan en diferentes territorios del embrión. El ejemplo más estudiado y que empieza a estar mejor descifrado a nivel molecular es el del linaje germinal del ratón.

Las células EG de ratón (MEGC) presentan numerosas similitudes con las células MESC, pero una de las diferencias esenciales se refiere al estatus epigenético de ciertos genes (Shiota et al., 2002, Reik et al. 2001, Tada et al., 1998). Por estatus epigenético, se entiende el grado de modificación directa del ADN y de las proteínas asociadas como las histonas. Este estatus determina, para una buena parte, la actividad transcripcional del ADN que corresponde a la eucromatina o a unos dominios de heterocromatina, que son transcripcionalmente inactivos. Intervienen numerosas moléculas para modificar y controlar este estatus, en particular algunas metiltransferasas, como los genes dnmt, cuyo efecto sobre las células ESC y durante el desarrollo empieza a ser estudiado (Gaudet et al., 2004, Biniszkiewicz et al., 2002, Hattori et al., 2002).

Por competencia germinal, se entiende la capacidad de una célula para producir una célula diferenciada precursora de una célula sexual funcional. Una célula primordial germinal da así unas células del linaje macho (espermatogonias) o hembra (ovocito), capaz de dar respectivamente unos espermatozoides maduros y unos ovocitos maduros.

Esta competencia germinal se puede observar in vivo o in vitro.

In vivo, según las especies, las células germinales se individualizan según un proceso de inducción por los tejidos y las células próximas a un nicho. Los ejemplos más estudiados son los de la drosophila D. melanogaster y del nematodo C. elegans, especie para la cual se han obtenido numerosos mutantes. Este proceso empieza a ser descrito a nivel molecular en el ratón (Saitou et al., 2002, Ohinata et al., 2005), para el cual se ha propuesto un primer modelo de inducción. Hace intervenir la noción de nicho específico en el que se individualizan las células germinales. La inducción está controlada por las células próximas a través de los factores BMP-4 y BMP-8, que modifican el nivel transcripcional de genes claves como oct-3/4, blimp-1, los marcadores stella, fragilis, etc.

En otras especies, la individualización del linaje germinal tendría una fuerte componente maternal. Las proteínas de unión al ARN desempeñarían entonces un papel esencial en el establecimiento de un gradiente de ciertos componentes (proteínas y ARN) en el embrión no segmentado, que inducirían así un quot;secuestroquot; de estas proteínas y/o ARN mensajeros capaces de inducir la identidad de las células germinales en un sitio definido del embrión. Los genes implicados en esta compartimentalización empiezan a ser particularmente estudiados en los organismos modelos como D. melanogaster y C. elegans (Extavour et al., 2003, Blackwell, 2004). La descripción, el número y la implicación de los diferentes genes en estos determinismos están documentados en particular a través de revistas científicas y de diferentes sitios accesibles como http://germonline.igh.cnrs.fr/index.php.

In vitro, unos ejemplos recientes muestran que es posible obtener la reproducción parcial de unas condiciones de diferenciación de células madre embrionarias de ratón (MESC) en células germinales competentes. Este proceso está bajo la dependencia experimental de factores de crecimiento y de condiciones tridimensionales particulares. Se encuentran los factores BMP-4 y BMP-8, así como unas hormonas como los estrógenos y la FSH para la obtención de células germinales a partir de MESC (Hubner et al., 2003; Geijsen et al., 2004).

Se conocen diferentes procedimientos de cultivo de células aviarias, células del blastodermo de fase X (StX), células madre o células germinales, en particular para la replicación del virus o también para la producción de proteínas heterólogas y, llegado el caso, la producción de vacunas. Dichos procedimientos están descritos en particular en las solicitudes de patente y en las patentes siguientes: WO 03/043415, WO2005/007840, WO 03/076601, WO 01/85938, WO 96/12793, EP 1 149 899, US 2002-192815 o US nº 6.500.668.

Se conocen diferentes medios para diferenciar las diferentes formas de células anteriores. Sin embargo, es La solicitud de patente WO 98/38283 describe los epítopos EMA-1 y SSEA-1, específicos de las células germinales de pollo en la fase X. El artículo de Jung et al., publicado en 2005 en quot;Stem cellsquot;, describe unos marcadores para la caracterización de las células germinales primordiales (PGC) del pollo: los marcadores SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, EMA-1 están expresados específicamente sobre estas células PGC.

Se han identificado unos genes como que están expresados o bien en las células madre embrionarias de pollo (CESC) o bien en las células madre germinales de pollo (CEGC). La comparación de los niveles relativos de expresión de estos diferentes actores permite proponer una combinación específica y original que define el perfil molecular de cada una de estas células, así como las modificaciones necesarias para la obtención de una competencia germinal segura de las células CESC.

La combinación de marcadores y el procedimiento según la invención permiten en particular asegurar un mejor seguimiento de las líneas celulares aviarias, pero también asegurar una buena estabilidad en el tiempo de los linajes celulares cultivados.

-: Por célula madre, se entiende cualquier célula capaz de auto-renovarse in vitro y capaz de dar unas células diferenciadas especializadas.

-: Por célula germinal, se entiende cualquier célula capaz de dar unos precursores o unas células diferenciadas sexuadas del linaje macho o hembra.

-: Por célula del blastodermo de fase X, también designada quot;célula StXquot;, se entienden las células del blastodermo obtenidas por disociación del embrión de un huevo fecundado recién puesto y cuya fase de desarrollo corresponde a una fase X según la tabla EG & K (Eyal Giladi & Kovak, 1976).

-: Por chip de ADN, se entiende un conjunto de genes, de fragmentos de genes, de oligonucleótidos depositados sobre un soporte (lámina de vidrio, membrana de nylon, etc.) con una alta densidad.

-: Por meiosis, se entiende el proceso biológico que conduce a una célula diploide a reducir su patrimonio genético a un nivel haploide. Este proceso está acompañado de por lo menos una división celular.

-: Por célula sexual funcional, se entiende una célula haploide capaz de fusionar o aportar un juego de cromosomas a otra célula haploide para formar, en caso de fecundación de un huevo, una célula diploide capaz de desarrollarse en embrión.

La invención se refiere por lo tanto a una combinación de marcadores que permite caracterizar unas células aviarias de tipo StX (blastodermo de fase X) o unas células madre aviarias, que comprenden por lo menos dos marcadores, caracterizada porque uno de los marcadores es específico del gen 1p06, y el otro marcador se selecciona de entre:

a.: un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genes siguientes: 2contig58, 60S-L14, ATM, Síndrome de Bloom, BTEB4, CD9, helicasa CHD, Clock, cwf16 (FLJ10374), CXCR4, Dnmt2, enx1 (ho-zeste 2), eomes, EWS, FGF-4, GATA-5, HOJ-1, N-AGN6P desacetilasa, N-Cor1, NF2, p53, pml, rbm6, SA-2, SA-3, SARA, SCYE1, SEF, sf-1, SnoN, SOCS13, SSB-1, TC87479, T-cell APP 2C, TGF-beta2, WD40/FYVE-d protein 2, WD-RP3, Zan75, ZPC,

b.: un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre los genes siguientes: 1P08-A09, activina RIIB, astacina, Claudina3, dapper-1, Dorfin, FPP synthase (fps), GalNAc-T3, gcnf, HSPb7, IRX4, LMX, pax-6, Slc38a2, sox-3, tral gp96, wnt-10a, Wnt-11.

Una lista de los genes diana expresados preferentemente en las células StX, y las células madre, se da en las figuras 1 a 2 respectivamente, con los cebadores empleados para aislarlos por PCR.

De manera preferida, el marcador de un gen expresado preferentemente en las células StX se selecciona entre los marcadores de los genes siguientes: ATM, CXCR4, eomes, FGF-4, GATA-5, NF2, SOCS13, SSB-1, TC87479, T-cell APP 2C, TGF-beta2, WD-RP3, ZPC. Más preferentemente, la combinación según la invención comprende por lo menos un marcador del gen ZPC.

Según otro modo preferido de realización de la invención, el marcador de un gen expresado preferentemente en las células madre se selecciona de entre los marcadores de los genes siguientes: activina RIIB, astacina, Claudina3, dapper-1, FPP synthase (fps), GalNAc-T3, gcnf, LMX, pax-6, tra1 gp96, wnt-10a. Más preferentemente, la combinación según la invención comprende por lo menos un marcador de los genes 1P06 y tra-1.

Según el modo preferido de realización de la invención, la combinación comprende la combinación de marcadores Por quot;marcadorquot; se entiende según la invención cualquier medio, biológico, químico o físico, que permite identificar y, llegado el caso, cuantificar la expresión de un gen diana en una célula, célula aviar según la invención. Dichos marcadores son bien conocidos por el experto en la materia. Su composición dependerá en particular del gen diana y del método de detección de la expresión de dicho gen diana. Se citarán en particular los métodos que emplean los pares anticuerpo/antígeno, llegando el anticuerpo a unirse de manera específica al antígeno, estando este último constituido por el producto de expresión de un gen identificado anteriormente, ARNm o ADNc o polipéptido, o un fragmento de estos últimos. Se citarán también los fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridarse de manera específica a los ARNm expresados por dichos genes o a los ADNc correspondientes, o unos fragmentos de estos últimos.

Los diferentes tipos de marcadores pueden, evidentemente, estar combinados en la combinación según la invención.

De manera ventajosa, los marcadores según la invención son unas secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridarse a los ARN o a los ADNc, productos de expresión de los genes diana identificados anteriormente.

Entre estas secuencias de ácidos nucleicos, se podrán citar las secuencias particulares de cebadores identificadas en las figuras 1 a 3.

Según un modo más particular de realización de la invención, la combinación de los marcadores está ensamblada sobre un mismo soporte, preferentemente un soporte normalizado. El experto en la materia conoce estos diferentes soportes, cuyas dimensiones varían según el tipo de marcadores y de equipos susceptibles de ser empleados para detectar la expresión del o de los genes diana.

De manera ventajosa, la combinación de marcadores según la invención se presenta en forma de una matriz de ADN, que comprende un soporte sobre el cual están dispuestos, preferentemente de manera normalizada, los fragmentos de ácido nucleico susceptibles de hibridarse con los genes diana. Las dimensiones de dichos soportes pueden variar según las tecnologías de preparación y detección empleadas. Dichos soportes de dimensiones reducidas se denominan asimismo chips de ADN.

De manera ventajosa, la combinación de marcadores según la invención está dispuesta sobre un chip de ADN. El chip de ADN que comprende la combinación de marcadores según la invención forma parte asimismo de la invención.

Según un modo particular de realización de la invención, la combinación de marcadores puede comprender además por lo menos un marcador de un gen que se expresa en dos grupos de células, las células StX y las células madre.

Dichos genes están identificados en las figuras 4 a 6 respectivamente con los quot;cebadoresquot; correspondientes.

Los medios de detección de las interacciones quot;producto de expresiónquot;/marcador son bien conocidos por el experto en la materia. Numerosas referencias de publicaciones científicas sobre la preparación y la utilización de chips de ADN, con relación a unos organismos académicos de búsqueda o de empresas que comercializan los medios de preparación y de utilización de los chips de ADN (aparatos de lectura, programas de tratamientos de señal, bases de datos, etc.) se prorporcionan en particular en los sitios web www.gene-chips.com, www.deathstramic.com/science/biology/chips.html o http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html, cuyo contenido, y el de las referencias citadas, se incorpora en la presente memoria como referencia.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de caracterización de una célula aviar que comprende el análisis de la expresión de los genes expresados en dicha célula por medio de una combinación de marcadores tal como se ha definido anteriormente y en los ejemplos, y la caracterización del fenotipo de las células analizadas. Los métodos particulares de análisis de la expresión de genes dependerán de los marcadores empleados en la combinación según la invención definida anteriormente y en los ejemplos.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de cultivo de células aviarias que comprende el cultivo de células previamente caracterizadas en un medio de cultivo apropiado, siendo su caracterización realizada por medio de un procedimiento según la invención, con una combinación de marcadores según la invención tales como se han definido anteriormente y en los ejemplos. El procedimiento de cultivo según la invención comprende una etapa de aislamiento de las células seleccionadas de entre las células StX, y las células madre-aviarias.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de cultivo de células aviarias mediante el cual se obtienen unas células germinales aviarias a partir de células StX. El procedimiento según la invención se distingue de los procedimientos de la técnica anterior que no permiten dicha transformación, por el hecho de que las células StX están cultivadas en un medio de cultivo apropiado sin adición de capa alimentadora quot;feederquot; inactiva.

Las características de la quot;feederquot; son bien conocidas por el experto en la materia, y descritas en particular en Robertson et al., 1987, karagenc et al., 2000 cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.

Otras características de la invención aparecerán a partir de la lectura de los ejemplos presentados a continuación.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: tabla de los genes expresados en las células StX. Figura 2: tabla de los genes expresados en las células madre. Figura 3: tabla de los genes expresados en las células germinales. Figura 4: tabla de los genes expresados en las células StX y en las células madre. Figura 5: tabla de los genes expresados en las células madre y en las células germinales. Figura 6: tabla de los genes expresados en las células germinales y en las células de fase X. Figura 7: curva de crecimiento de las células GF58. Figura 8: Nivel de expresión de algunos genes en las células GF58 (p7). Figura 9: análisis de la expresión de genes en las fracciones p3g y p4g con respecto al nivel observado en las

gónadas (=1). Una proporción gt; 1 sugiere que el gen está más expresado en la fracción ensayada que en la gónada embrionaria completa, y a la inversa. Figura 10: distribución por clase de los genes ensayados. Figura 11: variación del nivel de expresión de los genes de clase 1 durante la inducción de la diferenciación. Figura 12: variación del nivel de expresión de los genes de clase 2 durante la inducción de la diferenciación.

Figura 13: variación del nivel de expresión de los genes de clase 3 durante la inducción de la diferenciación. Figura 14: comparación de los perfiles de expresión entre las células del blastodermo de fase X, las células CESC y las células CEGC.

Figura 15: comparación de los perfiles de expresión entre las células CESC, las células del blastodermo de fase

X y las células CEGC. Figura 16: comparación de los perfiles de expresión entre las células CEGC, las células del blastodermo de fase X y las células CESC.

Figura 17: secuencia de la proteína y del ADNc del gen nanog de pollo.

Figura 18: secuencia de la proteína y del ADNc del gen gcnf de pollo. Ejemplos de realización Ejemplo 1: Obtención de células madre embrionarias in vitro, Las células madre embrionarias de pollo se obtienen in vitro a partir de huevos embrionados. Se utilizan dos enfoques para obtener unas poblaciones de células madre embrionarias en proliferación in vitro.

En un primer aspecto, las células se obtienen en unas condiciones similares a las anteriormente descritas (Pain et al., 1996). Brevemente, los huevos embrionados no incubados son limpiados y cascados. La yema se separa de la clara y el embrión se extrae con la ayuda de una pipeta Pasteur o de un anillo de papel tal como describe Carscience et al., 1993. Las células así obtenidas se depositan sobre una capa alimentadora inactivada en un medio de proliferación que contiene los elementos esenciales para la proliferación de las células, como el suero de ternera fetal, unos aminoácidos y unas citoquinas y factores de crecimiento.

Después de algunos días, las células madre embrionarias forman pequeños montones compactos que son disociados con la ayuda de enzimas proteolíticas y se inoculan en nuevas cajas de cultivo para una amplificación in vitro.

Después de algunos pases, el cultivo se vuelve más homogéneo y el tipo celular preponderante es la célula madre embrionaria de pollo (CESC). Estas células CESC están caracterizadas por los diferentes marcadores descritos previamente, en particular la presencia de la actividad alcalina fosfatasa, la actividad telomerasa endógena y su reactividad frente a anticuerpos específicos (Pain et al., 1996).

Con el fin de caracterizar las células CESC obtenidas en cultivo, se ha realizado una observación en microscopioelectrónico. Ésta indica que las células aisladas presentan numerosas microvellosidades en su superficie, lo cual no se ha presentado o descrito jamás para una célula CESC. Que éstas desaparecen a partir del momento en el que las células se amontonan o interactúan con otras células homólogas o heterólogas (células de la quot;feederquot;). Que las diferentes estructuras y ultraestructuras reconocidas por ME indican un metabolismo importante (ribosomas, retículo, mitocondrias numerosas), una fuerte actividad transcripcional por la presencia de un nucléolo importante. Que estas células CESC presentan unas dimensiones de 7 a 15 µm de media con un núcleo relativamente homogéneo en tamaño más o menos esférico de 4 a 8 µm de media. El espacio intracelular de las células amontonadas es muy restringido, ya que las células están particularmente unidas.

Ejemplo 2: Obtención de células germinales in vitro

En el pájaro, los actores moleculares del determinismo de las células germinales no están todavía bien identificados. Este determinismo sigue siendo un proceso relativamente poco documentado. La fase de desarrollo del embrión en el momento de la puesta es la fase IX-XI según la tabla de desarrollo propuesta por Eyal Giladi & Kovak (1976). En esta fase, el embrión comprende ya de 40000 a 60000 células según las estimaciones, y está compuesto por dos hojas, el epiblasto y el hipoblasto. En esta fase, la presencia de células positivas para el gen vasa (Tsukenawa et al., 2000) indica que ya están determinadas unas células germinales. Diferentes publicaciones mencionan la obtención in vitro de células madre germinales (EG) a partir de la puesta en cultivo de las células de la cresta germinal del embrión de pollo. Se pueden citar en particular los trabajos de Ha et al., 2002; Park et al., 2003 a partir de embrión de fase 28 según la tabla de desarrollo propuesta por Hamburger & Hamilton (1951) que corresponde a aproximadamente 5-6 días de desarrollo.

En otro aspecto de la invención, las células del embrión se extraen como se describe en el ejemplo 1, pero se inoculan en una caja de cultivo sin capa alimentadora. La caja de cultivo se ha tratado previamente por lo menos durante 1 hora o más con una disolución de clara de huevo o de otra disolución rica en proteína sérica, como albúmina sérica. Esta disolución de clara puede ser una clara de huevo directamente extraída o diluida con PBS. Preferentemente, se utiliza una disolución diluida entre 5 y 10 veces. La disolución contiene por lo tanto los componentes principales del albumen del huevo, como la ovoalbúmina, la conalbúmina, los ovomucoides, la ovomucina y la lisozima, así como los otros componentes más minoritarios. Se puede utilizar asimismo una disolución de ovoalbúmina o de conalbúmina purificada.

En un aspecto de la invención, se inoculan unas células del blastodermo de fase IX-XIII en caja de cultivo en unas condiciones de cultivo que favorecen la multiplicación de las células germinales quot;vasaquot; positivas. Así, las cajas se han tratado con suero para realizar un quot;coatingquot; equivalente a una matriz extracelular destinada a favorecer la adhesión y la no diferenciación de las células pero sin adición de capa alimentadora quot;feederquot; inactiva. Después de algunos días, aparecen unos focos de células que presentan una proliferación lenta. Este proceso perduró y las células denominadas GF58 han continuado proliferando durante por lo menos 200 días. Esta proliferación, aunque particularmente lenta, es sin embargo continua en forma de algunos focos compactos de células. Los pases son delicados, ya que es difícil disociar las células. Se ha realizado una quot;curvaquot; de crecimiento (figura 7), basada en los coeficientes de dilución durante unos pases de las células, ya que parece imposible calcular las células individualmente en cada (raro) pase.

Estas células presentan una morfología particular y proliferan en pequeños montones en el centro del foco de células adherentes y pavimentosas, de núcleo grueso. El tamaño de los focos se ensancha muy lentamente.

Unos ensayos para volver a poner las células en presencia de la quot;feederquot;·han parecido catastróficos, las células no resisten a este entorno. Unos ensayos de adición de BMP-4, FGF-4 en el medio de cultivo no han tenido efectos negativos sobre la proliferación y no han conllevado ninguna modificación morfológica mayor. Se observa una baja estimulación.

En el pase 7 (después de 79 días de cultivo), las células presentan una fuerte actividad alcalina fosfatasa endógena Este importante resultado soporta la idea del mantenimiento de células germinales vasa positivas después de 80 días de cultivos, obtenidas a partir de la puesta en cultivo de células del blastodermo de fase X. Estas células son unas células germinales mantenidas in vitro.

Ejemplo 3: Obtención de células germinales por clasificación celular de gónadas embrionarias

Con el fin de obtener unas células germinales purificadas en cantidad utilizable para un análisis molecular, se inicia un enfoque de clasificación por FACS. El enfoque se basa en la presencia de una proteína membranaria, el receptor ABC vehículo Bcrp1/ABCG2, cuya expresión se ha identificado inicialmente en las células madre hetamopoyéticas (Goodell et al., 1997). Esta molécula está descrita como un marcador de células madre hematopoyéticas. Esta molécula parece asegurar un papel fisilógico de desintoxicación y es responsable del transporte activo de Hoëchst fuera de la célula, cuando este fármaco se pone en presencia de la célula. Esta propiedad parece específica de las células madre y se aprovecha actualmente para identificar unas quot;SP cellsquot; o quot;side populationquot;, según su característica durante una clasificación celular de diferentes tejidos (Zhou et al., 2001). De manera interesante, las células germinales de ratones parecen presentar esta propiedad (Lassalle et al., 2004).

Como primer enfoque, el nivel de expresión del mensajero bcrp1 es más elevado en las células germinales de pollo que en las células madre CESC (véase anteriormente). Este gen se vuelve también un marcador suplementario para identificar una célula madre en el pollo y una célula germinal.

Con el fin de ensayar el papel de esta molécula como marcador en las células CESC y en las células germinales de pollo, se han empezado unos estudios de fraccionamiento de gónadas embrionarias de pollo. Las gónadas embrionarias de embriones machos de 15 a 21 días de desarrollo se extraen después de la decapitación del embrión y se colocan en hielo. Las gónadas están dispuestas en un medio HBSS 1X (GIBCO ref. 14175-046) completo que contiene 20 mM de Hepes pH 7,2, 1,2 mM de MgSO4 7H2O, 1,3 mM de CaCl2 2H2O, 6,6 mM de piruvato sódico, el 0,05% de lactato y el 1% de la mezcla de antibiótico penicilline Streptamycine. Las gónadas son disociadas mecánicamente por paso sucesivo en una aguja de 18G1/2 y después 20G1/2 hasta la obtención de una suspensión monocelular que se filtra entonces sobre una membrana de nylon 100 µm (Falcon 352360), calculada por numeración celular con azul tripán y centrifugada durante 10 minutos a 400 g a 4ºC. El residuo se recoge en un medio HBSS completo.

Una parte de las células (de 105 a 2x106 células) se somete en HBSS completo a un tratamiento con Vérapamil (V4629 SIGMA) o al fármaco Ko143 (Lassalle et al., 2004, Allen et al. 2002) a las concentraciones respectivas de 75 µg/ml y de 200 nM/ml final. Las células son colocadas durante 20 min. en la incubadora a 37,5°C 7,5% de CO2. Al final de esta incubación, las células son aclaradas con PBS IX, centrifugadas durante 10 min. a 400 g y el residuo se recoge en 1 ml de HBSS completo. Las células control no tratadas con Vérapamil o con Ko143 son colocadas en hielo.

Las células tratadas con Vérapamil, con Ko143 o no tratadas, se recogen en HBSS completo a la concentración de 1 a 2·106 células/ml y después se incuban con Hoechst 33342 (ref. B2261, Sigma) a la concentración de 5 µg/ml final durante 45 min. en una incubadora a 37,5°C 7,5% de CO2. Al final de esta incubación, las células son aclaradas con PBS 1X, centrifugadas durante 10 min. a 400 g y el residuo se recoge en 1 ml de HBSS completo adicionado con el 0,5% de SVF. El conjunto se coloca entonces en hielo. El yoduro de propidio se añade extemporáneamente a la concentración de 2 µg /ml antes del análisis FACS.

Un perfil de distribución en FACS muestra la presencia de diferentes poblaciones de células en presencia o en ausencia de los diferentes fármacos. Se pueden definir así dos poblaciones principales, p3g (R1) y p4g (R2). La población denominada p3g es la más sensible a la acción de los fármacos conocidos para inhibir el canal abcg2, en particular el Ko143.

Las poblaciones p3g y p4g se han clasificado por FACS y los ARN de estas células se han analizado en Q-PCR (figura 9). En algunos de los genes ensayados, es posible identificar la fracción p3g como enriquecida en células germinales, ya que sólo esta fracción está enriquecida en bcrp-1 (abcg2); por el contrario, la fracción p4g se distingue por un enriquecimiento en dmrt-1 y gata-4, marcadores característicos de las células de sostenimiento.

La detección de marcadores de células germinales más expresados en esta sub-población p3g confirma el interés de este método de enriquecimiento para obtener unas células germinales purificadas.

Ejemplo 4: Identificación de los genes implicados en la pluripotencia de las células madre embrionarias aviarias (CESC).

Con el fin de identificar los genes implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de las células CES, diferentes estrategias complementarias de cribado permiten caracterizar, a nivel transcripcional, las células CESC. Entre los enfoques, se puede citar el cribado diferencial de bancos de expresión, el cribado in silico de los bancos de datos, el cribado de chips de ADN específicos del pollo y el cribado de bancos SAGE. Utilizando estos diferentes enfoques, se define una lista de genes candidatos. El nivel de expresión de estos genes se ensaya mediante un enfoque de PCR semi-cuantitativa y cuantitativa. Los 800 diferentes genes ensayados se reparten en diferentes clases (figura 10).

Los mensajeros (ARNm) son extraídos de las células CESC en proliferación con la ayuda del kit RNA-Easy (Qiagen, Ref. 74104). Al final de la preparación sobre columna, los ARN son recuperados en 50 ul de agua RNase free, dosificados y conservados, precipitados en etanol a -80ºC. Una reacción de transcripción inversa con un cebador oligodT 3' se realiza con la transcripata inversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad) a 42ºC, durante 1 hora con 2 µg de ARN totales procedentes de células CESC indiferenciadas en proliferación. El producto de RT se diluye 100 veces en agua Millipore y una reacción de PCR cuantitativa se puso en marcha en una placa con el aparato Mx3500P (Stratagene). La mezcla de reacción de 25 µl en agua comprende 2 µl del producto de RT diluido, 12,5 µl del Mix Quantitect SYBRGreen (Qiagen, ref. 204245), y 10 pM de cada cebador. Después de una desnaturalización de 15 minutos, la mezcla se somete a 40 ciclos compuestos de 30 s de una fase de desnaturalización a 95ºC, de 30 s de una fase de hibridación a 55ºC y de 30 s de una fase de elongación a 72ºC. Se realizan dos o tres ensayos independientes para cada gen, y la media se considera como valor relativo de expresión.

Con el fin de validar los datos obtenidos en PCR cuantitativa, se utilizan dos métodos complementarios, la curva de disociación (melting curve) y el cálculo de la eficacia de la PCR mediante el método del estándar interno. Este último análisis permite evaluar si cada molécula de ADN está bien amplificada específicamente en cada ciclo de PCR. La curva de disociación informa sobre el número de amplicones de naturaleza diferente presentes en los tubos al final de la amplificación, y permite ensayar la especificidad del par de cebadores utilizado, para el cual se debe formar un solo amplicón. Esta curva permite detectar también una eventual contaminación por ADN genómico, con la condición de que los cebadores sean seleccionados de entre dos exones de un gen. Esta curva se realiza al final de los 40 ciclos de PCR cuantitativa por un último ciclo que comprende una desnaturalización de 1 minuto a 95ºC, una hibridación de 1 minuto a 55ºC y después una subida de la temperatura de 55ºC a 95ºC con una lectura de la fluorescencia cada 0,2 s. Así, a 55ºC, los fragmentos de ADN amplificados durante los 40 ciclos de PCR se hibridan y la fluorescencia medida estará entonces en su máximo. Aumentando la temperatura muy progresivamente, la temperatura a la que las dos hebras de ADN se separan se mide muy precisamente, lo cual provoca una caída de la fluorescencia, siendo el fluorocromo incorporado sólo en el ADN bicatenario. Esta temperatura está en función del tamaño y de la composición de base del amplicón. Si está presente un producto no específico, la caída de la fluorescencia presentará 2 niveles, que corresponden cada uno a un amplicón. Sólo se validan los pares de cebadores y los experimentos que presentan un solo nivel. En paralelo, una reacción de transcripción inversa (RT) se realiza sobre 2 ug de ARN con el fin de validar la eficacia de la PCR según las condiciones descritas anteriormente. Se realiza un intervalo de dilución en serie de este producto de RT y las cantidades arbitrarias se llevan a las tablas de datos propuestas por el programa de análisis proporcionado con el aparato de PCR cuantitativa (Stratagène, MP 3500). Para cada dilución, se realiza una PCR cuantitativa con el par de cebador a ensayar y el principio de la amplificación exponencial del amplicón se obtiene en un ciclo particular de la PCR. Este valor Ct obtenido para cada dilución permite obtener una recta Y = aX + b, en la que Y es el valor de Ct para un punto dado, X es la cantidad inicial de material para cada dilución y a representa la pendiente de la recta. La eficacia E de la PCR se da entonces mediante la fórmula E = 10(1/-a). Esta eficacia debe estar comprendida entre 1,8 y 2,2, para que el par de cebador y las condiciones de PCR sean validados. Un valor de 2 corresponde a una amplificación del 100%.

Con el fin de permitir una comparación de las variaciones de los niveles de expresión de los diferentes genes, es necesario comparar estos niveles al de un gen expresado de manera constante entre las muestras y las condiciones experimentales. El gen seleccionado en la mayoría de los experimentos dirigidos es el gen RS17 (X07257), gen que codifica para una proteína ribosómica. En efecto, se ha mostrado que el nivel de expresión de este gen varía sólo un poco o nada en función del estado de las diferentes células estudiadas. Así, el diferencial observado entre dos valores Ct demuestra una modulación del nivel de expresión del gen de interés y no se debe a una variación en la cantidad de material de partida. El cálculo del nivel relativo se da mediante la fórmula: D = 2^((CtX1-CtX2)/(CtR1-CtR2)), en la que:

CtX1 representa el Ct del gen X para el tipo celular 1

CtX2 representa el Ct del gen X para el tipo celular 2

CtR1 representa el Ct del gen control RS17 para el tipo celular 1

CtR2 representa el Ct del gen control RS17 para el tipo celular 2.

El nivel de expresión relativo de los genes con respecto a su nivel de expresión en un fibroblasto embrionario pone en evidencia 3 categorías de genes según la intensidad de la expresión. Se pueden identificar unos genes sobreexpresados a niveles muy importantes y cuyo nivel relativo de expresión con respecto a unos fibroblastos embrionarios es superior a 100 veces. Estos genes podrían ser considerados como quot;específicosquot; de las células CESC. La clase de los genes cuyo nivel relativo de expresión está comprendido entre 10 y 100 comprende actualmente una docena de genes. Por último, se puede distinguir la clase de los genes cuyo nivel relativo de

Ejemplo 5: Seguimiento de la expresión de genes durante la diferenciación de las células CESC

Algunos de los genes identificados durante el cribado parecen presentar una expresión específica de las células CESC. El diferencial de expresión entre los fibroblastos embrionarios, las células CESC y las células CEGC indica que el nivel de expresión de los genes varía en función del tipo celular. Parece también esencial caracterizar las variaciones de niveles de expresión durante la diferenciación de las células CESC.

Se han realizado unos experimentos de cinéticas de inducción, en particular mediante inoculación de las células en el medio de diferenciación sin factores de crecimiento ni citoquinas, en presencia o en ausencia de inductor como el ácido retinoico a 10-7 M. Las células estimuladas son extraídas en diferentes etapas y los niveles de expresión de los genes son analizados mediante QRT-PCR, como se ha descrito anteriormente (véase el ejemplo 4). El análisis de las variaciones de la expresión de algunos genes revela unas cinéticas diferentes según los genes.

Se pueden distinguir 3 grandes clases de genes según la cinética de las variaciones de su nivel de expresión. En la clase 1, se encuentran los genes para los cuales el nivel de expresión es máximo antes de la inducción y que se hunde muy rápidamente con la adición de ácido retinoico en el medio de cultivo (figura 11). En esta clase, se encuentran los genes sox-2, cripto, AP, eomes, oct-6, genf, sox-3, 1P06, GTT3, RARg2, BMP-8, gata-4, etc.

En la clase 2, se encuentran los genes para los cuales el nivel óptimo de expresión se alcanza entre 4 y 8 horas después de la inducción de la diferenciación (figura 12) como los genes fFGF-8, nanog, nodal, cdx-2, RARb1, RARa, piwi, TERT, etc.

En la clase 3, se encuentran los genes para los cuales el nivel máximo de inducción se obtiene a partir de 24 horas después del comienzo de la inducción de la diferenciación (figura 13), en particular los genes piwi, p53, TERT, RXRa, Oct-2, RARb, gata-2, pax-6, etc.

En estas sucesiones de variaciones y de inducción, se observará asimismo la rapidez de variación de algunos de estos actores como los genes cripto/.nodal y FGF-8/BMP-8 cuyas variaciones son opuestas.

Ejemplo 6: Identificación de los genes expresados en las células del blastodermo de fase IX-XII

Las células del blastodermo de fase IX a XII son extraídas como se ha descrito anteriormente (Pain et al., 1996 FR nº). Respecto a la presencia de yema de huevo residual, incluso después de la preparación y de lavados extensivos de los embriones, se realiza un doble método de preparación de los ARN a partir del residuo de estas células del blastodermo. El residuo celular se congela y los ARN son extraídos en una primera etapa mediante un método de Trizol (Tri Reagent (Invitrogen cat 15596-018), a razón de 5 ml por 1 x 106 células aproximadamente. Después de una homogeneización con pipeta, la mezcla se centrifuga durante 10 minutos con 400 g a 4ºC y después se añaden 200 µl de cloroformo para 1 ml de disolución. El conjunto se emulsiona, se aclara a temperatura ambiente y se repite la operación varias veces. La mezcla se centrifuga entonces durante 15 minutos con 400 g a 4ºC y la fase acuosa se transfiere en un nuevo tubo. Se añaden 500 µl de isopropanol por ml de mezcla. El conjunto se precipita entonces mediante centrifugación durante 15 minutos con 400 g a 4ºC, el residuo se lava con etanol a 70ºC, se seca y se recoge en 200 a 400 µl de tampón de lisis del kit de extracción ARN kit de Quiagen. Esta segunda etapa de preparación/purificación de los ARN se sigue entonces según las instrucciones del fabricante. Esta doble extracción da mejores resultados de reproductibilidad en el análisis por QRT-PCR del nivel de expresión de los genes.

Las condiciones de detección por QRT-PCR son idénticas a las descritas anteriormente (véase el ejemplo 4).

El nivel relativo de expresión de los genes en las células del blastodermo de fase X indica que algunos genes están asimismo muy fuertemente expresados en estas células comparativamente con los fibroblastos embrionarios.

Ejemplo 7: Identificación de los genes implicados en la fisiología de las células germinales aviarias (CGSC).

Con el fin de identificar los genes implicados en la emergencia y el mantenimiento de las células germinales del pollo, las estrategias de cribado utilizadas para las células CESC también se han aplicado a nivel de las células de gónadas embrionarias de pollo.

De manera análoga al enfoque utilizado para el estudio de los genes de las células CESC, el nivel de expresión de los genes se ha analizado en las células germinales aviarias. La lista de los genes expresados en estas células permite poner en evidencia unos genes expresados muy fuertemente en estas células (proporción de sobreexpresión relativa superior a 100 y unos genes cuyo nivel de expresión relativa está comprendido entre 100 y

10. Una gran parte de los genes presenta una expresión más modesta con una proporción comprendida entre 2 y

10.

Comparando los niveles relativos de expresión entre las células CESC, las células CEGC y las células del blastodermo de fase IX-XII, se pueden obtener diferentes listas de genes que aparecen como unos genes marcadores característicos de los diferentes tipos celulares. (los resultados en bruto se proporcionan en anexo).

8.1 Con las células del blastodermo de fase IX-XII

Combinando los resultados anteriores de los diferentes perfiles de expresión, se puede definir una combinatoria de expresión propia a cada tipo celular. Así, comparando los niveles de expresión entre las células del blastodermo de la fase X con las células CESC in vitro, las células del blastodermo de fase X sobreexpresan (figura 14):

-: los factores de crecimiento como fgf-8, tgf-b2, fgf-4, wnt-14,

-: los actores de la señalización como smad-9, cis-1, smad-7, id2, smad-4,

-: los factores de transcripción como sf-1, gata-5, sox-9, sox-2,

-: unos genes de estructura como WD40, WDRP-3, el transportador abcg2,

-: unos genes reguladores como N-myc2, poz-3, atm. -otros genes menos caracterizados como la fosfatasa T-cell APP2C, ssb-1, nf-2,

-: el gen zpc que parece muy específico de esta fase de desarrollo

Esta misma comparación entre las células del blastodermo de fase X y las células CEGC de gónadas embrionarias indican una sobre-expresión (figura 14):

-: de los factores de crecimiento como fgf-8, fgf-4, wnt-3a, wnt-11, tgf-b2,

-: de los actores de la señalización como id2, smad-9, socs-1, cis-1, smad-7,

-: de los factores de transcripción como eomes, sox-3, sox-2, 1P06, gata-2, gata-5, pax-6, fbx-15b, sox-9,

-: de los genes de estructura como WD40, la claudina-1, la astacina, WDRP-3, abcg2,

-: de los genes reguladores como atm, N-myc-2, poz-2, poz-3,

-: de otros genes menos caracterizados como ens-1, la fosfatasa T-cell APP2C, TC893, nf-2, ssb-1, TC823

-: del gen zpc que parece muy específico de esta fase de desarrollo.

Así, la combinatoria que permite definir mejor la fase X comprende los genes más expresados entre las dos situaciones:

-: _fgf-4, tgf-b2,

-id-2, smad-7, smad-9, snoN, SOCS13,

-Cxcr-4,

-gata-5, N-Cor1,

-: atm, síndrome de Bloom, enx-1, rad54b, rbm6, ssb-1,

-nf-2, N-myc2, pml, T-cell APP2C, WDRP-3,

-: cpe1738, cwf16, TC82325, TC87, zan75,

-: Zpc.

Para las células del blastodermo de fase X, se puede así observar la presencia de numerosos actores de señalización como los factores fgf-4 y fgf-8, los genes id-2, SOCS13, diferentes miembros de la familia smad, incluyendo snoN, que actúan para transmitir las señales intracelulares. Incluso fuerte, la presencia de estos actores no es exclusivamente específica.

8.2 Las células CESC

De manera idéntica, las células CESC sobreexpresan con respecto a las células del blastodermo de fase X (figura 15)

-: los factores de crecimiento como wnt-10, bmp-5, dapper-1,

-: los actores de la señalización como brap, TGF-RII,

-: los factores de transcripción como gcnf, TR-a, pax-6, 1P06, irx-4,

-: unos genes de estructura como la emerina, la astacina, la claudina-3, la LAMP lectina, svap-1, dorfin,

-: unos genes marcadores como tra-1, ch-tog, musashi, -otros genes menos caracterizados como FTT sintasa, CG182, la maturasa K, ARN ciclasa, FMRPI182

Y con respecto a las células de gónadas embrionarias CEGC (figura 15):

-: los factores de crecimiento como wnt-3a, wnt-10, fgf-8, bmp-8, wnt-11, fgf-4, dapper-2,

-: los actores de la señalización como activina RII, brap,

-: los factores de la transcripción como nanog, eomes, sox-3, 1P06, pax-6, gcnf, sox-2, gata-2, fbx-15b, irx-4,

-: unos genes de estructura como la astacina, la claudina-3, la claudina-1,

-: unos genes marcadores como tra-1, ens-1, -otros genes menos caracterizados como TC896, la maturasa K, ARN ciclasa, FMRPI182.

Así, la combinatoria que permite definir mejor las células CESC en proliferación comprende los genes:

-: wnt-10a, wnt-11, dapper-1,

-: 1P06, pax-6, gcnf, irx-4, sox-3,

-: la astacina, la claudina-3,

-: tra-1,

-: 1P08-A09, slc38a, FMRPI182.

Para las células CESC en proliferación, se puede mencionar la fuerte proporción de factores de transcripción en la lista característica de estas células. En particular, los genes nanog, 1P06 (oct-3/4- véase anteriormente) y gcnf, han sido aislados, clonados y estudiados en el pollo por la primera vez durante este estudio.

Nuevos genes han sido también identificados como la maturasa, el gen de función desconocida FMRPl182, cuya expresión está relacionada con la proliferación, el gen slc38-2 (sin duda un miembro de la familia de los transportadores de solutos), 1P08-A09, etc.

4.3 Las células CEGC

Las células de gónadas embrionarias, con la excepción de la utilización del tejido entero (véase anteriormente), sobre-expresan con respecto a las células del blastodermo de fase X, los genes (figura 16):

-: los factores de crecimiento como bmp-5, dkk-3,

-: los actores de la señalización como el receptor endoglina, TGF-RII, FGF-R, pten, wisp-1, smad-3, FGF-R, smarcd-3,

-: los factores de transcripción como pax-2,

-: unos genes de estructura como la emerina, VE-caderina-2, HSPb7,

-: unos genes marcadores como tie-2, piwi, musashi,

-: otros genes menos caracterizados como CG1182, samsn-1, flj00188 Y con respecto a las células CESC en proliferación, los genes (figura 16):

-: los factores de crecimiento como wnt-14, bmp-5, dkk-3,

-: los actores de la señalización como el receptor endoglina, PRL-Rbox1, wisp-1, pten, cis-1, smad-7, smad-9, smad-4, TGF-RII, c-ski, smarcd-3,

-: los factores de transcripción como lhx-9, sf-1, gata-4, pax-2, dax-1, sox-9,

-: unos genes de estructura como abcg-2, VE-caderina-2,

-: unos genes marcadores como tie-2, dmrt-1, piwi, -otros genes menos caracterizados como TC95, KHKoc-1, flj00188, tep12, samsn-1,

-: unos genes marcadores de las células germinales como vasa, piwi. Así, la combinatoria que permite definir mejor las células CEGC de gónadas embrionarias comprende los genes:

-: BMP-21K, BMP-5, dkk3,

-: Endoglina, FGF R, TGF RII, Wisp-1,

-: Gata-4, lhx-9,

-: Rab40B, smad3, Smarcd3,

-: TC95408, TC97694, FLJ00188,

-: tie2, tob. Estas combinatorias son sólo indicativas y pocos genes parecen muy específicos de un solo tipo celular. Algunos de los genes identificados presentan unos homólogos en otras especies cuyos perfiles de expresión están

restringidos a los tejidos reproductores como deadend, vasa, wisp-1, tep12, etc. Comparando los perfiles de expresión comunes ente las células del blastodermo de fase X y las células CEGC (dos tipos celulares con una competencia germinal), se puede identificar una combinatoria de genes cuya expresión es baja, incluso casi ausente, de las células CESC. Esta pérdida o esta fuerte disminución de marcadores de células germinales podría ser una consecuencia de la puesta en cultivo de las células del blastodermo de fase X. Pero ninguna indicación es posible en cuanto a la expresión de estos genes para una condición necesaria y/o suficiente de una competencia germinal. Los genes son:

-wnt-14,

-: Brinp, cis-1, c-ski, pr1-Rboxl1, pten, sef, smad-4, smad-5,

-: Abcg2, clock, dmrt-1, lfng, morf,

-Dax-1, pax-2, sf-1, sox-9,

-: Deadend, poz-3, slug, Ve-caderina-2,

-Emx-2, fragilis4, TC136, tep12, tsc-22,

-: Tudor, vasa.

De manera análoga, incluso con variaciones en su nivel de expresión, unos genes son comunes a las células CESC y CEGC con la exclusión relativa de las células del blastodermo de fase X; Estos genes son:

-: cripto, BRAP, TGF RIII,

-: CGI82, ch-tog, ddx-25, Dorfina, emerina,

-ERCC-2, KHKoc1, LAMP lectina,

-: Maturasa, musashi, piwi, SAMSN-1, SVAP-1, TC86990,

-TR-alfa.

Se realiza también el mismo análisis para los genes expresados de manera común entre las células CESC y las células del blastodermo de fase X, con la exclusión relativa de las células CEGC/ Estos genes son:

-: nodal, wnt-3a, wnt-11

-: de tipo Ras

-drg-1, ens-1, ews-1

-: Eomes, Fbx15b, gata-2, jsd3, pax-6, sox-2, sox-3

-Ddx-28, Mago, nestina, POZ2

-: Arg NmetilASA, PP2447, ARN ciclasa

-: A14TS, CES-c32, TC893, Translina

-: Claudina1, sintaxina 16, WD40, WDFYP-2.

Un análisis de los diferentes genes que aparecen sobre-expresados en una u otra situación permite proponer diferentes modelos para el mantenimiento de la pluripotencia in vitro, el control de la competencia germinal in vivo e in vitro, así como el impacto de las condiciones de cultivo sobre el nivel de expresión de genes particulares.

Citoesqueleto

A nivel de los genes del citoesqueleto y que aseguran el mantenimiento de la morfogénesis de las células CESC, sólo un número restringido de genes presentan un diferencial de expresión importante interesante. En particular, un gen que presenta una unidad WD, el gen WDRP-2 (TC190198) cuya unidad implicada en las interacciones proteínas-proteínas a nivel del citoesqueleto está más expresada en las células CESC que en las CEGC. El gen WD40 (TC189537) parece bastante específico de las células del blastodermo de fase IX-XII. Se observará que el gen de la beta-catenina está fuertemente expresado en los dos sistemas, lo cual sugiere que su regulación está efectuada más probablemente a nivel proteico. A la inversa, el gen Claudina-1 (TC189974) implicado en los quot;gap junctionquot; y el mantenimiento de fuertes asociaciones células-células está fuertemente expresado en las células CESC. Esta observación confirma el análisis realizado por microscopía electrónica de las células CESC para las cuales las uniones intra-celulares son particularmente importantes y están bien estructuradas. Se detecta asimismo la astacina (TC221952), enzima metaloproteasa que interviene en el control de la matriz extracelular de las células, que permite su movimiento y las interacciones potenciales con su entorno.

Factores de crecimiento

Las células CESC y las células GESC expresan a niveles variables diferentes miembros de grandes familias de factores de crecimiento y de citoquinas. Así, numerosos factores de crecimiento de las familias TGF/BMP, de la familia de FGF, de la familia de los factores de receptores tirosina quinasa, de la familia de las citoquinas cuya señal está transmitida por la vía gp130 y de la familia wnt están expresados de manera específica o bien en las células CESC, o bien en las células GESC.

Entre los diferentes actores ensayados, las células CESC expresan así los factores nodal, FGF-8, wnt-3a, wnt-10a, BMP-8 y FGF-4 mucho más fuertemente que las células CEGC. Estas últimas están en particular caracterizadas por Se observará que la expresión de nodal se ha implicado en un conjunto de regulación compleja de la pluripotencia, como el mencionado para las células ES murinas y humanas (Besser, 2004, Vallier et al., 2004).

El gen cripto, encontrado al mismo tiempo en las células GESC y las células CESC se menciona como un elemento esencial y una quot;firmaquot; de las células ES humanas (Bhattacharya et al., 2004).

A nivel del ratón, la expresión de FGF-8 se ha implicado en la proliferación de PGC, cuando éstas han aparecido después de su migración en las gónadas (Kawase et al., 2004). La fuerte expresión de FGF-8 en las células CESC podría ser un buen indicador de una quot;naturalezaquot; PGC de estas células, pero el nivel mucho más elevado que en las células GESC podría ser la señal de un desajuste de la vía de activación de este factor. De la misma manera, el FGF-4 parece ser expresado aproximadamente 5x más en las células CESC que en las células GESC. Se observará que el FGF-4 se ha identificado en el ratón como una diana privilegiada del factor de transcripción Oct-3/4 (Dailey et al., 1994; Ambrosetti et al., 2000) y es un actor esencial en las células MESC al mismo tiempo in vitro e in vivo (Yuan et al., 1995, Feldman et al., 1995, Wilder et al., 1997).

La situación de los dos factores BMP es asimismo particular, especialmente por la fuerte implicación de los factores BMP-4 y BMP-8 en el control de la pluripotencia de las células MESC (Ying et al., 2001) y en la emergencia y el mantenimiento de las células germinales murinas in vitro (Hubner et al., 2003; Geijsen et al., 2004) e in vivo (Saitou et al., 2002). La destrucción de la expresión de BMP-4 por pérdida de función en el ratón lleva a la muerte precoz del embrión (8-9 días de desarrollo) por la ausencia de formación de los derivados mesodérmicos (Winnier et al., 1995). En estos embriones, no se detecta ningún PGC (Lawson et al., 1999). Esta ausencia no se puede compensar por el BMP-8. El BMP-4 es necesario a su vez para la inducción precoz a partir del epiblasto. La destrucción de la expresión del gen BMP-8b tiene como consecuencia una disminución de la proliferación de las células germinales y una disminución de la entrada de las células en meiosis (Zhao et al., 1996, Zhao et al., 1998).

Para el gen sdf-1, la expresión del mensajero de este factor está correlacionada con la de su receptor, CXCR4, también detectado de manera específica en las gónadas, incluso si las células positivas en el conjunto del tejido no están identificadas. Las células CESC no presentan esta propiedad de expresar el factor o el receptor que asegura el guiado de las células germinales, ya que estos dos actores están fuertemente implicados en el control de la migración de las células germinales, como ya se ha mostrado al mismo tiempo en el pez cebra (Doitsidou et al., 2002, Knaut et al., 2003), el ratón (Ara et al., 2003) y más recientemente en el pollo (Stebler et al., 2004). Sería así posible modificar el tropismo de las células CESC expresando por ejemplo el receptor CXCR4 en las células CESC para obtener una colonización gónadica más eficaz. La fuerte expresión de CXCR-4 en las células del blastodermo de fase IX-XII es un elemento importante en el control de la migración de las células en el embrión precoz.

Otro actor importante es el gen deadend, implicado en este proceso de colonización germinal (Weidinger et al., 2003) y cuya mutación ter compromete el desarrollo de las células germinales (Youngren et al., 2005). Este gen está más expresado en las células de gónadas que en las células CESC.

Los niveles de expresión de los otros factores y receptores ensayados no son tan específicos de las únicas células CESC o de las células GESC.

Receptores membranarios

Los mensajeros de los receptores a los TGFb/BMP y a los FGF están detectados en el conjunto de los tipos celulares ensayados, incluso los CEF. Si la importancia fisiológica de estas variaciones no es conocida, no parece, en un primer enfoque, que un déficit real de señalización sea observable a nivel de estos receptores, con la condición de que el nivel de los ARN detectados sea un buen indicador del nivel proteico. Se detecta sin embargo en las células CESC el receptor de la activina IIB (U31223) fuertemente expresado, sin duda en relación con la fuerte expresión de nodal y de cripto en estas células.

Las células CEGC expresan los receptores FGF-R (U48395), TGF-RII (AF202991) y TGF-RIII (L01121) en fuertes proporciones comparativamente con las células CESC. Los perfiles de expresión de los diferentes genes de las familias de los receptores tirosina quinasa no parecen ser muy variables, incluso si el número de genes analizados no es exhaustivo.

De manera notable, los niveles de expresión de c-kit, receptor del SCF, es muy baja en las células CESC, lo cual contrasta con la expresión observada en las células de las gónadas embrionarias. Ahora bien, la importancia de SCF en el mantenimiento de la línea germinal está asimismo demostrada. Este nivel de c-kit sería así un buen indicador de la naturaleza germinal de las células, incluso si el receptor c-kit está expresado en otros numerosos tejidos (hematopoiesis, células nerviosas, etc.).

A nivel de la vía de señalización del LIF, se encuentran expresados el receptor LIF-R y la proteína gp130, éstos son asimismo detectados en los fibroblastos (Duong et al., 2002; Geissen et al., 1998). El factor LIF aviar, recientemente Señalización

A nivel de las vías de señalización, la mayoría de los actores de las vías de activación de los receptores tirosina quinasa, de los receptores TGFb/BMP y de la vía gp130 jak/STAT son expresados de manera generalmente ubicua sin gran variación entre los diferentes tipos celulares. Sin embargo, se deben hacer algunas observaciones. El gen PTEN (BM486819) se encuentra fuertemente expresado en las células CEGC así como los genes de la familia con dominio POZ, como POZ3 (TC216137). Unos genes como CIS-1 (TC216000), SSB-1 (TC210358), SOCS13 (TC217588), etc.; están implicados en las señalizaciones mediante los diferentes receptores así como numerosos genes implicados en la vía de las GTPasas. Los genes Smad-3 (TC187835), Smad-6 y smad-7 (TC194136), conocidos por su acción reguladora de la acción de los TGF/BMP están asimismo más expresados en las células CEGC que en las células CESC, incluso si se encuentra una fuerte expresión en CEF. Los genes Smad-1 (Tremblay et al., 2001) y Smad-5 (TC209770) (Chang et al., 2001) conocidos por estar fuertemente implicados en el determinismo de las células germinales en el ratón están respectivamente más expresados en las células CESC y en CEGC. Una expresión en los fibroblastos es asimismo detectada. El gen Smad-4 (TC207213) está expresado preferentemente en las CEGC, y no es, o lo es poco, detectable en las CESC y en las CEF. El gen Smad-4 aparece en muchas situaciones como un gen clave de la señalización de los miembros de la familia TGFb/BMP, ya que es indispensable en el control transcripcional de los genes dependientes de estos factores. Entre los numerosos defectos relacionados con la inactivación del gen smad-4 en el ratón, se encuentra una ausencia de formación de PGC (Chu et al., 2004) muy similar a la observada en los mutantes BMP-4 (Lawson et al., 1999) y BMP-8b (Ying et al., 2000; Loebel et al., 2003). Los genes c-ski (TC219247) y SNoN (TC215069) presentan asimismo unos diferenciales de expresión específicos y participan en estos controles de proliferación y de diferenciación de estas células en la vía germinal. Los niveles de expresión de estos diferentes factores de la transmisión de la señal de la familia TGF/BMP pueden representar unos indicadores preciosos de la naturaleza quot;célula madrequot; o quot;célula germinalquot; de las células estudiadas. Cualquier variación en los niveles de expresión podrá ser aprovechada para discernir mejor las evoluciones inducidas por las diferentes manipulaciones de los genes candidatos. Estos mismos diferentes genes, en particular Smad-4, son unos candidatos muy importantes en el control del potencial germinal de una célula CES. Sería por lo tanto particularmente juicioso ensayar el efecto o la destrucción de estos diferentes genes al mismo tiempo in vitro e in vivo.

El gen de tipo ras (TC201177) presenta asimismo una expresión más específica en las células CESC que en las células CEGC así como en las células del blastodermo de fase IX-XII. El gen ortólogo murino se ha identificado recientemente como un factor mayor de la proliferación de las células MESC (Takahashi et al., 2003) y podría ser responsable del carácter quot;tumorígenoquot; de ciertos linajes celulares por la vía P13 quinasa. Pero las células MESC mutantes para este gen son capaces de colonizar el linaje germinal y no se manifiesta por ahora ninguna consecuencia sobre la descendencia. El nivel de expresión en las células germinales no está documentado y una inhibición de expresión en las células MESC tiene un efecto negativo sobre la velocidad de proliferación. Una hipótesis podría ser que la disminución necesaria de la velocidad de proliferación (a través de la inhibición de este gen) fuese un requisito previo a la diferenciación de PGC.

Los otros genes ensayados no parecen presentar un desequilibrio mayor en su nivel de expresión. La regulación de la actividad de otros actores de la señalización como las proteínas Stat, MAP quinasa, erk, etc. se efectúa sin duda más a nivel proteico, en particular por los mecanismos de activación relacionados con las fosforilaciones/desfosforilaciones. Esto se ha demostrado para la proteína STAT-3 en las células MESC.

A nivel de los factores de las proteínas nucleares, la situación parece compleja, frente al número importante de genes candidatos. Para los factores de transcripción, esquemáticamente, diferentes familias de genes parecen particularmente implicadas, como la de los receptores nucleares de hormonas (HNR), la de los genes sox y de los genes gata.

La implicación de algunos genes está directamente relacionada con el control epigenético de la expresión de los genes. El conocimiento de los mecanismos epigenéticos durante el desarrollo del pollo o en el modelo aviar se limita a los descubrimientos pioneros de los mecanismos de expresión de los genes de globina, incluyendo la identificación de secuencias aisladoras (Felsenfeld, 1993) y a unos estudios sobre el control transcripcional del gen de la lisosima (Kontaraki et al., 2000). Por analogía con los otros sistemas mamíferos o eucariotas inferiores, se han identificado diferentes genes de pollo implicados en el control epigenético de la expresión de los genes. Entre aquéllos para los cuales se observa un diferencial fuerte de expresión, se encuentra más fuertemente expresado el gen dmrt-1 en las gónadas embrionarias y los genes DCSM, enx-1 más expresados en las células del blastodermo. La expresión del gen dmrt-1 podría ser específica de las células de Sertoli como en el modelo murino (Lei et al., 2004), pero la detección de este gen en las fracciones de las células germinales adapta el comentario. Otros genes presentan unos perfiles de expresión interesantes pero son también expresados en los fibroblastos.

Las células madre y las células madre embrionarias presentan una actividad telomerasa intrínseca, en particular las células CESC (Pain et al., 1996). El gen de la telomerasa de pollo acaba de ser clonado (Delany et al., 2004; Swanberg et al., 2004) y el nivel de expresión en las células CESC parece importante.

Genes de la familia sox

Para los genes sox, la expresión del gen sox-9 (U12533) es más específica de las células CEGC, lo cual parece estar de acuerdo con la importancia del papel de este gen en la formulación testicular del ratón (Chaboissier et al., 2004, Vidal et al., 2001), pero podría ser expresado preferentemente en las células de sostenimiento. La conservación del papel de este gen entre los mamíferos y los pájaros está ya evocada (Morais da Silva et al., 1996) y este gen sería una diana directa del receptor nuclear sf-1 (Sekido et al., 2004) (NM 205077), actor asimismo encontrado fuertemente expresado en los CEGC en presencia de Dax-1 (AF202991).

Entre los genes más específicos de las células CESC, se mencionarán los dos genes sox-2 (U12532) y sox-3 (U12467). Se han demostrado fuertes asociaciones de las protéinas SOX-2 y OCT-3/4 en el ratón a nivel de algunos promotores (Miyagi et al., 2004; Nishimoto et al., 1999), en particular a nivel del promotor del FGF-4 (Dailey et al., 1994; Ambrosetti et al., 2000). El gen 1P06, homólogo aviar del gen Oct-3/4 de mamífero (véase el ejemplo 9 anterior) está expresado muy fuertemente en las células CESC y aparece como uno de los mejores marcadores de estas células.

Genes de la familia gata

Los genes gata muestran también unos perfiles de expresión particulares. El gen gata-4 (U11887) está expresado de manera preferida en las células de gónada embrionarias, expresión que se puede relacionar con la presencia de las células Sertoli (Imai et al., 2004, Lavoie et al., 2004). Los genes gata-2 (X56930) y gata-5 (U11888) están más expresados en las células CESC, en particular con una fuerte sobre-expresión del gen gata-5 en las células del blastodermo. El mensajero del gen gata-2 se ha detectado en las células germinales (Siggers et al., 2002) y a nivel del embrión precoz de pollo (Sheng et al., 1999). La acción pleiotrópica de los genes gata está modulada y controlada por la asociación con diferentes parejas privilegiadas a nivel de los elementos de respuesta próximos y/o comunes a los promotores de los genes diana. Así, si una de las parejas privilegiadas en el sistema hematopoyético es uno de los genes de la familia ets, las combinaciones son diferentes en otros sistemas de proliferación y de diferenciación. Así, unos elementos de respuesta a los genes gata son identificados con unos elementos de respuesta a las BMP (los elementos BRE) en el promotor del gen smad-7 (Benchabane et al., 2004). Este gen smad7 está asimismo más expresado en las células de gónada embrionarias que en las células CESC.

Los genes de la familia Id aparecen como unos actores ineludibles del control de la acción de las BMP. El gen Id2 aparece más expresado en las células de gónadas embrionarias y sobre todo en las células del blastodermo que en las células CESC. Este gen podría estar en el centro de la regulación de la proliferación/diferenciación de las células CESC, en un enfoque similar al modelo murino (Ying et al., 2003, Kowanetz et al., 2004).

En estos diferentes procesos descritos en la bibliografía, se encuentra frecuentemente la pareja YY1 (Kurisaki et al., 2003) (encontrada asimismo fuertemente expresada en las células CESC, pero cuyo nivel de expresión es relativamente ubicuo) y un actor de la familia NKx como en el caso de la diferenciación cardiaca (Lee et al., 2004). Ahora bien, el gen nanog, actualmente identificado exclusivamente en los mamíferos pertenece a esta familia de gen Nkx (Chambers et al., 2003). Por búsqueda de homología a nivel de la secuencia publicada del genoma de pollo, se ha identificado el gen nanog (figura 17). La función de este actor es todavía ampliamente desconocida en el sistema del ratón. La proteína ENS-1, identificada en el enfoque de la captura del gen (Acloque et al., 2004) presenta también un perfil de expresión particularmente interesante con una sobreexpresión muy fuerte en las células CESC y una desaparición rápida de su mensajero cuando las células son inducidas a diferenciarse (Acloque et al., 2001).

Si el homólogo del gen utf-1 conocido por ser una diana del complejo Oct-3/4/sox-2 (Nishimoto et al., 1999) no se ha identificado aún en el pollo, se mencionará que en unos experimentos de transfección, los promotores de los genes oct-3/4, sox-2 y utf-1 de ratón son específicamente activados en las células CESC, lo cual sugiere que se conservan los mecanismos de regulación de la expresión de estos diferentes actores y son funcionales en las células aviarias CESC (véase el ejemplo 12). Esta transactivación no se detecta en un fibroblasto embrionario de pollo.

Receptores nucleares de hormonas

Para los receptores nucleares de hormonas, el gen dax-1 aparece sobreexpresado muy fuertemente en las células del blastodermo. Este gen se conoce por tener un papel negativo (Swain et al., 1998) pero esencial (Meeks et al., 2003) sobre la diferenciación germinal, en particular por su acción antagonista sobre la del gen sf-1 (Crawford et al., 1998). Este gen dax-1 podría estar controlado a su vez positivamente por sf-1 y negativamente por COUP-TF (Yu et al., 1998). La expresión de dax-1 sería asimismo dependiente en algunos sistemas de la activación por wnt-4 (Mizusaki et al., 2003). Ahora bien, wnt-4 es uno de los factores encontrados más expresado en las gónadas que en El gen gcnf del que se ha determinado la totalidad de la secuencia (figura 18) se encuentra expresado muy fuertemente y específicamente en las células CESC, y su acción antagonista de sf-1 a nivel del promotor del gen Oct-3/4 está documentada en el ratón (Furhmann et al., 2001).

El gen sf-1 se encuentra prácticamente exclusivamente expresado en las células de gónadas embrionarias gónadas. Ahora bien, sf-1 y lrh son dos homólogos de FTZ-F1, cuyo papel en el determinismo de las gónadas y en el desarrollo precoz está documentado (Kudo et al., 1997; Fayard et al., 2004). A través de la sumoilación, se podría realizar un nivel de regulación suplementario y un vínculo posible entre las acciones de los receptores nucleares de hormonas y las otras parejas, (como sox-9 por ejemplo). La importancia de esta modificación post-traduccional en el control de la transcripción y de la integridad del genoma no para de crecer (Muller et al., 2004; Seeler et al., 2003). La sumoilación modifica al mismo tiempo la distribución celular y las interacciones entre los factores (Chen et al., 2004; Komatsu et al., 2004). Otros receptores conocidos por estar implicados en el determinismo de las células germinales de ratones como ERR (Mitsunaga et al., 2004) no parecen presentar en el sistema estudiado fuertes variaciones de su nivel de expresión.

Los receptores RAR, RXR, TR, están más particularmente implicados durante la diferenciación de las células. Su cinética de expresión y las variaciones de su nivel de expresión se han analizado en el ejemplo 5.

Proteínas de unión al ARN

Entre las proteínas implicadas en el control de la transcripción de genes en las células germinales, se encuentran unas proteínas que fijan los ARN, las quot;RNA binding proteinsquot;. Estas proteínas se han identificado en particular en la drosophila e intervienen en el control de la polaridad de los embriones (Huynh et al., 2004a) y del determinismo de las células germinales. En otra especie modelo, C. elegans, la hipótesis de la preformación de las células germinales se basa asimismo y esquemáticamente sobre la existencia y el papel de estas proteínas. Pero, en estos dos modelos, el control de la activación por fosforilación de la ARN polimerasa II, activación necesaria para la transcripción, no está realizado por estas quot;RNA binding proteinsquot; (Seydoux et al., 1997). A nivel de los mamíferos, se ha mostrado que algunos de estos genes son asimismo esenciales para el mantenimiento del linaje germinal en el ratón (Wang et al., 2004; Tsuda et al., 2003; Tanaka et al., 2000). Pero el origen de las células germinales murinas parece estar más relacionado con un fenómeno de inducción por diferentes actores relacionados con el entorno celular tridimensional y con la acción de factores como los BMP-4 y BMP-8. El conjunto de estas inducciones controla al final los niveles de expresión de diferentes actores principales como Oct-3/4 (Saitou et al., 2003). Este origen inductivo parece reforzado por la obtención in vitro de células germinales a partir de la diferenciación de células MESC de ratones (Hubner et al., 2003, Geijsen, et al., 2004, Toyooka et al., 2003).

A nivel del pollo, la teoría de la preformación se ha revivificado por la identificación de células vasa positivas a partir de las fases precoces del embrión de pollo (Extavour et al., 2003; Tsukenawa et al., 2000). En esta hipótesis, el papel de algunas quot;RNA binding proteinsquot; podría ser primordial.

En la sesentena de los genes de esta familia cuyo nivel de expresión se ha ensayado, se detectan los genes bruno (AB050497), tudor (TC213378), nanos (TC223629), vasa (AB004836) como mucho más fuertemente expresados en las células CEGC que en las CESC, pero también en las células del blastodermo, que corresponde sin duda a la presencia de células competentes a nivel germinal en estas células. Las células CESC son positivas para el gen vasa, pero presentan una contribución muy baja al linaje germinal a partir del momento en el que se mantienen en cultivo. Asimismo, el nivel de expresión relativo parece ser un elemento esencial para esta competencia germinal. Algunos, como el gen nanos, presenta una especificidad de expresión cuasi exclusiva para las células CEGC. El gen mago presenta una expresión más importante en las células del blastodermo comparativamente con dos tipos celulares CESC y CEGC. Se mencionarán asimismo los genes caracterizados por una quot;dead boxquot;, unidad característica de las proteínas ARN helicasa capaces de unir los ARN (Rocak et al., 2004). El gen de ddx 28 (TC211748) está bien expresado en las células CESC así como el homólogo de la ARN ciclasa (TC214888). Están todavía por identificar nuevas moléculas homólogas de proteínas de drosophila y/o de C. elegans, en particular los homólogos de oskar, pumilio, aubergine, maelstrom, etc. A nivel de los mamíferos, el papel de estas quot;RNA binding proteinsquot; en el control de la naturaleza de las células germinales no es conocido, pero parece, según los resultados obtenidos en la drosophila, que cualquier perturbación de la actividad de estos genes conduce a una pérdida del linaje germinal. Las proteínas parecen actuar sobre el control de la localización citoplasma/núcleo de los mensajeros que reconocen y por lo tanto sobre la eficacia de traducción de estos mensajeros diana (Huynh et al., 2004; Yano et al., 2004; Hachet et al., 2004, Palacios et al., 2004). Los mecanismos de acción de estas proteínas y de su ARN no paran de complicarse, en particular por una regulación posible del nivel de expresión de estos mensajeros por los ARNi y el complejo RISC quot;RNA-induced Silencing complexquot; Tomari et al., 2004).

El gen piwi, implicado en las divisiones asimétricas y en el mantenimiento del linaje germinal de numerosas especies (Cox et al., 1998; Kuromochi et al., 2004) está más expresado en las células CEGC que en las CESC. Las células del blastodermo parecen expresar menos piwi que las células CESC y CEGS. Este gen piwi pertenece a la familia de las proteínas Argonauta y es uno de los componentes esenciales del complejo RISC. Contiene un dominio PAZ que podría unir los ARN y actuar como una endonucleasa a nivel de los ARNm en el dúplex de degradación ARNsi/ARNm (Song et al., 2004; Tahbaz et al., 2004). Por otra parte, el nivel de expresión del gen dicer, que asegura la producción de los ARNsi y que también se ha identificado en el pollo (Fukagawa et al., 2004) parece equivalente en las células CESC y CEGC.

Otros genes

Entre los otros genes que presentan fuertes diferenciales de expresiones según los tipos celulares comparados, se puede observar la presencia de tra-1 (NM 204289), específico de las células CESC y de las células del blastodermo, el gen ens-1, descrito anteriormente (Acloque et al.; 2001), como un marcador de células CESC, el gen fbx15 y fbx15b (Tokuzawa et al.; 2003), genes de caja T-box implicados en la fisiología de las células MESC, pero cuyo papel sigue siendo desconocido, el gen de homeobox iroquois IRX4, de la familia de los factores de transcripción Nkx (Houweling et al., 2001). Otros numerosos genes presentan un diferencial de expresión.

Genes desconocidos

Unos genes cuya función es ahora completamente desconocida presentan un diferencial de expresión entre los diferentes tipos celulares ensayados. Se mencionarán así los genes TC976 (TC227369), TC954 (TC203410), FLJ00188 (TC 196697) sobre-expresados en las células CEGC, los genes TC869 (TC192927), 1P08-A09 (TC189639), TC823 (TC209084), slc38a2 (TC187360), TC896 (TC196399), FPPsintasa (TC211235), TC874 (TC193590) y CES-c32 (TC83694) sobre-expresados en las células CESC. Se mencionarán los genes CPE1738 (TC214741) más expresados en las células del blastodermo. El gen TC976 presenta una homología parcial con la proteína ASB-6 de ratón que contiene una unidad ankyrin y una caja SOCS (Suppressor of Cytokine signaling) (Wilcox et al., 2004, Kim et al., 2004). Estos genes ASB están frecuentemente expresados en las células germinales y el gen ASB14 se encuentra expresado preferentemente en las células CESC y en las células CEGC, pero poco en las células del blastodermo. Una de las hipótesis de la función de estos genes es que el dominio SOCS intervendría en la compartimentación germinal específica de algunos mensajeros y favorecería su degradación en el soma, (DeRenzo et al., 2003). Este mecanismo existiría en paralelo y puede estar de manera complementaria al ejercido por las quot;RNA binding proteinquot;.

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Listado de secuencias

lt;110gt; INRA, CNRS, ENS Lyon, Vivalis

lt;120gt; Combinación de marcadores de células aviares

lt;130gt; 242486 D23927

lt;150gt; FR 06/02592 2006-03-24

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lt;170gt; PatentIn versión 3.3

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lt;213gt; Gallus gallus

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lt;213gt; Gallus gallus

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lt;213gt; Gallus gallus

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acat gt gccc tcttattgca c 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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aaact ccaca ccatcatcag c 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 7

atctttctgc ccgt aggt gt t 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 8 tgctgcccac ttctcatttat 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 9 at cct t ccca caccagagac t 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 10 gagct cat gt cagct t cat c c 21

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lt;211gt; 21

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lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 224 gcatcttctggtgttgtccat 21

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lt;211gt; 21

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lt;220gt;

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tgcatcacactgttctcaagg 21

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tccattttgc tctgaactgc t 21

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lt;220gt;

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ctctgtttct gcggatagcacc 21

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lt;211gt; 21

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lt;220gt;

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taaagaacct gaaggggagg a 21

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lt;211gt; 21

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lt;220gt;

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ctcttctattcgtcgccactg 21

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lt;210gt; 21

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lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 22 tcagctcctgtaggttctcc a 21

lt;210gt; 23

lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;211gt; 20

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 25

ttggcattcc caattctagg 20

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lt;211gt; 20

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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gaaaggcccc ttttggtaag 20

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aacaggtttc ctggatgtcg 20

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tttggatccc tctctggatg 20

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lt;213gt; Artificial

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lt;400gt; 29

acacttgttc gcagagcagt t 21

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lt;213gt; Artificial

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tgtagggaat gttgaggttg c 21

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lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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agccctgatc atcctcttga t 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 302

cctggtcctc agtctttacc c 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

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gcatttcttt gcttgtgctt t 21

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lt;213gt; Artificial

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lt;223gt; Cebador PCR

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cctggggtcg tatttttctt c 21

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lt;223gt; Cebador PCR

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tctacaaacc gtgcttcgtcc t 21

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tcctccttca cctccttctt c 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

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lt;223gt; Cebador PCR

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tgaacgaaga catccgtatc c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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ctccagaagt gctcaaggat g 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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cccaactaaa accaacgttc a 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

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lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;220gt;

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 322

cacctcccac agcacataac t 21

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lt;213gt; Artificial

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lt;223gt; Cebador PCR

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accgcttgt caccagttac 20

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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ggcaacgcag gaatttatgt 20

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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tgtctgcata gactgcacca c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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tagtgtgcac atgcctacag c 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;220gt;

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ggaccaataa gatggctctgc c 21

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atgagcgtgt cctcatacag g 21

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lt;223gt; Cebador PCR

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acctggagat cttccccaac 20

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lt;211gt; 20

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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cccttgtgag cttcttcgac 20

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 337

atgaacatgt cctacgccaa c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 338 gaggttggat tgcccataga t 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;400gt; 344

tccaatacgc cagtttggta g 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

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lt;400gt; 345

gacttcctta tgctccccat c 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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ggaaaaggta gcttccctcc t 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

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lt;400gt; 347

tagagcagag atggtggcac t 21

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lt;211gt; 21

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lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 348

aagttgtggg tgtgagtgag g 21

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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aatccctttg tgaccaattc c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 356

tctactccaa ggaggggaaa a 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 357

gtcggctgta ctctgtccaa g 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 358

cgacttgatg aagatggggt a 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 359

actggaaagg gctctaagct g 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

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lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 362 tccaggaact gctcaagaag a 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 364 gtgctccagc aggtacatca t 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

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lt;223gt; Cebador PCR

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lt;210gt; 366

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 366

tctagggttc tcgcttcctt c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 367

ctccatgcac tctctctacg g 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 368

tcaccaggaa atatgctacc g 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 369

ggcatttctc catttctttc c 21

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lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 370

agctccttga tctgctcctt c 21

lt;210gt; 371

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 371

gactcctgag gctgtgctat g 21

lt;210gt; 372

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 372

gatccatgtt tgggaaatcc t 21

lt;210gt; 373

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 373

tcctggtatg caagatcaag g 21

lt;210gt; 374

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 374

agagcgtcct ttgagaactc c 21

lt;210gt; 375

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 375

agcagctgaa gcagaagtac g 21

lt;210gt; 376

lt;211gt; 21

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador PCR

lt;400gt; 376

gctcatcaga caaaagcttg g 21

Claims

REIVINDICACIONES

1. Combinación de marcadores que permite caracterizar unas células aviarias de tipo StX (blastodermo de fase X) o unas células madre aviarias, que comprende por lo menos dos marcadores, caracterizada porque uno de los marcadores es específico del gen 1p06 y el otro marcador se selecciona de entre:

a.

un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genes siguientes: 2contig58, 60S-L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16 (FLJ10374), CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2), Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa, N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o

b.

un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre los genes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps), GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.
2.

Combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque el otro marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX (de blastodermo de fase X) se selecciona de entre los marcadores de los genes siguientes: Atm, CXCR4, Eomes, Fgf4, Gata5, N-AGN6P desacetilasa, NF2, Socs13, Sssbl, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD-RP3, ZPC, y sus combinaciones.
3.

Combinación según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque comprende por lo menos un marcador del gen 1p06 y un marcador del gen ZPC.
4.

Combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque el otro marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre se selecciona de entre los marcadores de los genes siguientes: Activina RIIB, Aastacina, Claudina3, Dapper1, FPP sintasa (Fps), GalNAc-T3, Gcnf, Lmx, Pax, Ttral gp96, Wnt10a y sus combinaciones.
5.

Combinación según la reivindicación 4, caracterizada porque comprende por lo menos un marcador del gen 1P06 y un marcador del gen Tra1.
6.

Combinación según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque los marcadores se seleccionan de entre los anticuerpos que se unirán de manera específica a los productos de expresión de un gen diana, ARNm, ADNc o polipéptido, o un fragmento de estos últimos, y los fragmentos de ácido nucleico capaces de hibridarse de manera específica a los ARNm expresados por dichos genes diana o a los ADNc correspondientes, o unos fragmentos de estos últimos.
7.

Combinación según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está ensamblada sobre un mismo soporte, preferentemente un soporte normalizado.
8.

Combinación según la reivindicación 7, caracterizada porque se presenta en forma de una matriz de ADN, que comprende un soporte sobre el cual están dispuestos, preferentemente de manera normalizada, los fragmentos de ácido nucleico susceptibles de hibridarse con los genes diana.
9.

Combinación según la reivindicación 8, caracterizada porque está dispuesta sobre un chip de ADN.
10.

Chip de ADN, caracterizado porque comprende una combinación de marcadores según una de las reivindicaciones 1 a 9.
11.

Procedimiento de caracterización de una célula aviar que comprende las etapas siguientes:

-

el análisis de la expresión de los genes expresados en dicha célula, comparando los niveles relativos de expresión de por lo menos dos marcadores, siendo uno específico del gen 1P06 y siendo el otro seleccionado de entre:

a.

un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células StX seleccionado de entre los genes siguientes: 2contig58, 60S-L14, ATM, Síndrome de Bloom, Bteb4, CD9, CHD Helicasa, Clock, Cwf16 (FLJ10374), CXCR4, Dnmt2, Enx1 (Ho-zeste 2), Eomes, EWS, Fgf4, Gata55, Hoj1, N-AGN6P desacetilasa, N-Cor1, NF2, p53, Pml, Rbm6, Sa2, Sa3, Sara, Scye1, Sef, S1, SnoN, Socs13, Ssb1, TC87479, APP 2C de linfocitos T, TGF-beta2, WD40/FYVE-D proteína 2, WD-RP3, Zan75, Zpc, o

b.

un marcador de un gen diana expresado preferentemente en las células madre seleccionado de entre los genes siguientes: 1P08-A09, Activina RIIB. Astacina, Claudina3, Dapper1, Dorfina, FPP sintasa (Fps), GalNAc-T3, Gcnf, Hspb7, Irx4, Lmx, Pax6, Slc38a2, Sox3, Ttralgp96, Wnt10a, Wwnt11.

-

la caracterización del fenotipo de las células analizadas entre los dos tipos siguientes: células aviarias de tipo StX o células madre aviarias.

5 12. Procedimiento de cultivo de células aviarias que comprende el cultivo de células StX o de células madre aviarias previamente caracterizadas por medio de un procedimiento según la reivindicación 11 y aisladas, en un medio de cultivo apropiado.
13. Procedimiento de obtención de células germinales aviarias, caracterizado porque comprende una etapa de

10 cultivo de células StX obtenidas según la reivindicación 12, en un medio de cultivo apropiado sin adición de capa alimentadora quot;feederquot; inactivada.