JP2009529900A - 鳥類の細胞のマーカーの組み合わせ - Google Patents
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Abstract
Description
MESC細胞
胚性幹細胞(ESC細胞)は80年代にマウスで単離、同定され(Martin,1981、Evans&Kaufman.,1981)、それらの単離は、それ以前に胚性癌腫細胞(すなわちEC細胞)を用いて行われてきた、一連の多くの研究の一環をなしている(Chambers&Smith,2004参照)。これらマウスのESC細胞(MESC)は、記載されているさまざまな手順(Robertson,1987、Hogan et al.,1994)にしたがって、129/SVマウスの胚盤胞をインビトロで培養することで得られた。原腸形成前のマウスの胚盤胞は、50から100個の細胞からなる内部細胞塊すなわちICMを有しており、該ICMの分子の特徴付けはまだ進行中である。これらの細胞の生物学的宿命は、インビボとインビトロで同一ではない。
霊長類では、はじめて猿のESC細胞(PESC)が、マディソン大学(WS)のJ.Thomsonによって胚盤胞から単離された(Thomson et al.,1995)。それ以降、その他の研究所もさまざまな種から猿の新しい細胞系を単離してきている。生化学的特徴のレベル(AP、テロメラーゼ、表面抗原など)と同時に、多能性の維持に関与する遺伝子のレベルでの、これらの細胞の特徴付けもまた、多くの研究発表の対象となってきた。
ニワトリの胚性幹細胞(CESC)は、ステージXのニワトリの胚盤葉細胞を培養することによって単離された(Pain et al.,1996、仏国特許出願公開第94/12598号明細書)。これらCESC細胞は、体細胞性および生殖性のコロニー形成を含む、胚性幹細胞(ESC)のあらゆる特徴を有している。しかし、この生殖性のコロニー形成は、マウスのES細胞とは逆に、インビトロでの数代の継代培養の後の維持が難しいと考えられる。CES細胞の採取段階および培養段階では、ニワトリの胚は、既に50000から60000個の細胞で構成される胞胚だと考えられ、該胞胚は、二つの胚葉、すなわち胚盤葉上層と胚盤葉下層で組織されている。細胞の三次元分布と配置という形態的な基準だけでは、さまざまな細胞の亜型、とりわけ生殖能力を有する細胞の亜型を確実に、特異的に同定することができない(Petitte et al.,1990、Carsience et al.,1993、Thoraval et al.,1994)。非常に早期(Eg&KのステージIII−IV)のニワトリの胚でVASAタンパク質についての陽性細胞が検出されたことで、ニワトリにおける生殖系の前成説が提示された。細胞は、マウスで観察される誘導モデル(Extavour et al.,2003、Saitou et al.,2002)よりもショウジョウバエのモデルにより近いモデルにおいて、胚の最初の分裂後すぐに生殖系における特徴を与えられる(Tsukenawa et al.,2000)。これらの細胞は、連続する分裂の過程で、ステージXまで存続することになる。
インビトロおよびインビボでの自己再生と分化の特性を有する細胞が組織から単離され、ASC「成体幹細胞」(Adult Stem Cells)と呼ばれている(Wagers and Weissman,2004)。これらの細胞は、主に哺乳類であるさまざまな種において、さまざまな組織、とりわけ造血組織(HSC、 Hemopoietic Stem Cells、造血幹細胞)および神経組織(NSC、 Neural Stem Cells、神経幹細胞)から単離された。非常に多くの文献がこれらの細胞を説明し、特徴付けることを目的としている(Shizuru et al.,2005、Mayhall et al.,2004参照)。幹細胞の特性を部分的に有するその他の多くの細胞型が同定された。
−間葉細胞(MSC)(Hamada et al.,2005)、
−筋衛星細胞(Charge and Rudnicki,2004、Seale et al.,2004)、
−多能性前駆細胞「MAPC」(Jiang et al.,2002)、
−中胚葉性血管芽細胞(Cossu and Bianco,2003、Minasi et al,2002)、
を挙げることができる。
原腸形成段階の前に得られる胚に直接由来するESC細胞とは異なり、生殖性の胚性幹細胞(EGC細胞)は、胚内で既に形成されている生殖隆起から得られるものであり、該隆起は生殖性の前駆細胞がコロニー形成したものである。生殖系の出現の過程で、かつ種にしたがって、前駆細胞は胚のさまざまな領域における特徴を与えられる。もっともよく研究され、分子レベルでもっともよく解明されはじめている例は、マウスの生殖系の例である。
−幹細胞とは、インビトロで自己再生する能力を有し、特化した分化細胞を生み出す能力を有するあらゆる細胞を意味する。
−生殖細胞とは、前駆細胞または雄性あるいは雌性の性分化した細胞を生み出す能力を有するあらゆる細胞を意味する。
−「StX細胞」とも呼ばれるステージXの胚盤葉細胞とは、産卵されたばかりの受精卵から胚を分離することで得られ、発生段階がEG&K(Eyal Giladi & Kovak,1976)の表にしたがったステージXに対応する、胚盤葉細胞を意味する。
−DNAチップとは、高濃度で担体(ガラス片、ナイロン膜など)に置かれた遺伝子の集合、遺伝子断片の集合、オリゴヌクレオチドの集合を意味する。
−減数分裂とは、二倍体細胞の遺伝物質を半数体レベルになるまで減らす生物学的プロセスを意味する。このプロセスは少なくとも一回の細胞分裂を伴う。
−機能的な性細胞とは、一組の染色体をもう一方の半数体細胞に融合するか、または与えることで、受精の際に、胚で発生する能力を有する2倍体細胞である卵を形成する能力を有する半数体細胞を意味する。
a. 1P06、2contig58、60S−L14、ATM、ブルーム症候群、BTEB4、CD9、CHDヘリカーゼ、Clock、cwf16(FLJ10374)、CXCR4、Dnmt2、enx1(ho−zeste2)、eomes、EWS、FGF−4、GATA−5、HOJ−1、N−AGN6Pデアセチラーゼ、N−Cor1、NF2、p53、pml、rbm6、SA−2、SA−3、SARA、SCYE1、SEF、sf−1、SnoN、SOCS13、SSB−1、TC87479、T細胞 APP 2C、TGF−beta2、WD40/FYVE−dタンパク質2、WD−RP3、Zan75、ZPCという遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、StX細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、ならびに/または、
b. 1P06、1P08−A09、アクチビンRIIB、アスタシン、Claudin−3、dapper−1、Dorfin、FPPシンターゼ(fps)、GalNAc−T3、gcnf、HSPb7、IRX4、LMX、pax−6、Slc38a2、sox−3、tra1 gp96、wnt−10a、wnt−11という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、幹細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、ならびに/または、
c. アディポネクチン、BMP−2IK、bruno like、CD34、CDK5アクチベーター1、dkk1、dkk3、DMRT1、emx2、エンドグリン、FAST−1、FGF R、FLJ00188、flk−1、gata−4、gcl、LHX9、NOSタイプIII、plzf、PRL−R box1l、PTEN、SAMSN−1、slug、smad3、Smarcd3、sox−9、Strat8、TACC2、TC95408、TC97694、TGF RII、TGF RIII、tie2、tie−2、TR−alpha、VE−カドヘリン、vera、Wisp−1という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子の、少なくとも一つのマーカー、
を含んでいる。
図2:幹細胞で発現する遺伝子の表。
図3:生殖細胞で発現する遺伝子の表。
図4:StX細胞および幹細胞で発現する遺伝子の表。
図5:幹細胞および生殖細胞で発現する遺伝子の表。
図6:生殖細胞およびステージXの細胞で発現する遺伝子の表。
図7:GF58細胞の成長曲線。
図8:GF58細胞におけるいくつかの遺伝子の発現レベル(p7)。
図9:性腺で観察されたレベル(=1)と比較した、p3g画分とp4g画分における遺伝子発現の分析。>1という比率は、遺伝子が、胚の性腺全体におけるよりも試験した画分においてより多く発現したこと、またその逆であることを示している。
図10:試験した遺伝子クラスの分類。
図11:分化誘導過程における、クラス1遺伝子の発現レベルの変動。
図12:分化誘導過程における、クラス2遺伝子の発現レベルの変動。
図13:分化誘導過程における、クラス3遺伝子の発現レベルの変動。
図14:ステージXの胚盤葉細胞、CESC細胞およびCEGC細胞間の、発現プロファイルの比較。
図15:CESC細胞、ステージXの胚盤葉細胞およびCEGC細胞間の発現プロファイルの比較。
図16:CEGC細胞、ステージXの胚盤葉細胞およびCESC細胞間の発現プロファイルの比較。
図17:ニワトリのnanog遺伝子のタンパク質配列とcDNA配列。
図18:ニワトリのgcnf遺伝子のタンパク質配列とcDNA配列。
ニワトリの胚性幹細胞を孵化卵からインビトロで得た。インビトロで増殖中の胚性幹細胞の集団を得るために二つのアプローチを用いた。
鳥において、生殖細胞の決定論の分子アクターは未だ同定されていない。この決定論は依然として比較的記録の少ないプロセスである。産卵時の胚の発生段階は、Eyal Giladi & Kovak(1976)によって提案された発生の表によるとステージIX〜XIである。このステージで、胚は既に推定40000〜60000個の細胞を有し、二つの葉層、すなわち胚盤葉上層と胚盤葉下層で構成されている。この段階では、vasa遺伝子についての陽性細胞の存在(Tsukenawa et al.,2000)は、生殖細胞が既に決定されていることを示している。さまざまな刊行物が、ニワトリの胚の生殖隆起の細胞を培養することによる、生殖幹細胞(EG)のインビトロでの取得を記載している。とりわけ、発生のおよそ5〜6日目に対応する、Hamburger&Hamilton(1951)によって提案された発生の表によるステージ28の胚に基づいた、Ha et al.,2002、Park et al.,2003の研究を挙げることができる。
分子分析に利用可能な量の精製した生殖細胞を得るために、FACSによる選別アプローチを開始した。選別アプローチは、膜タンパク質、すなわちABCトランスポーターBcrp1/ABCG2の受容体の存在に依存するものであり、その発現は最初に、造血幹細胞で同定されている(Goodell et al.,1997)。この分子は造血幹細胞のマーカーとして記載されている。この分子は、解毒という生理学的役割を保証すると考えられ、ヘキストが細胞に導入されたとき、該薬品を細胞外に運ぶ能動輸送の役割を負っている。この特性は幹細胞に特異的であると考えられ、現状では、さまざまな組織における細胞選別の際の特徴付けにしたがって「SP細胞」すなわち「side population」を同定するために利用されている(Zhou et al.,2001)。興味深いことに、マウスの生殖細胞がこの特性を有すると考えられている(Lassalle et al.,2004)。
CES細胞の多能性の維持に関与する遺伝子を同定するためには、さまざまな相補的なスクリーニング戦略によって、転写レベルでCESC細胞を特徴付けることが可能である。アプローチのうち、発現ライブラリーのディファレンシャルスクリーニング、データバンクのインシリコでのスクリーニング、ニワトリの特異的DNAチップのスクリーニング、およびSAGEライブラリーのスクリーニングを挙げることができる。これらさまざまなアプローチを用いて、候補となる遺伝子のリストを決定した。これらの遺伝子の発現レベルを半定量PCRおよび定量PCRのアプローチでテストした。テストした800の異なる遺伝子はさまざまなクラスに分類された(図10)。
CtX1は細胞型1についての遺伝子XのCtを表し、
CtX2は細胞型2についての遺伝子XのCtを表し、
CtR1は細胞型1についての対照RS17遺伝子のCtを表し、
CtR2は細胞型2についての対照RS17遺伝子のCtを表している。
スクリーニングの過程で同定された遺伝子の中には、CESC細胞に特異的な発現を示すと考えられるものがある。胚線維芽細胞、CESC細胞、およびCEGC細胞の間における発現の差異は、遺伝子の発現レベルが細胞型によって変動することを示している。また、CESC細胞の分化過程における発現レベルの変動を特徴付けることが不可欠であると考えられる。
ステージXI−XIIの胚盤葉細胞を先行研究に記載されているように採取した(Pain et al.,1996、仏国特許第)。胚の調製と広範囲の洗浄の後でも残留卵黄があることを考え、これら胚盤葉細胞の沈渣物からのRNAの二重調製法を行った。細胞の沈渣物を冷凍し、まず、およそ1×106個の細胞に対して5mlの割合でTrizol(Tri Reagent(Invitrogen cat 15596−018))を用いた方法によってRNAを抽出した。ピペットによる均質化の後、混合物を4℃、400gで10分間遠心分離し、そして1mlの溶液あたり200μlのクロロホルムを添加した。全体を乳化し、室温で上澄みを静かに移し取り、この操作を数回繰り返した。混合物を4℃、400gで15分間遠心分離し、水相を新たな試験管に移した。混合物mlあたり500μlのイソプロパノールを添加した。それから、全体を、4℃、400gで15分間遠心分離することで沈殿させ、沈渣物を70℃のエタノールで洗浄し、乾燥させ、そしてQuiagenキットのRNA抽出キットの、200μl〜400μlの溶解緩衝液に回収した。このRNAの調製/精製の第二の過程を製造者の指示にしたがって続けた。この二重の抽出によって、遺伝子の発現レベルのQRT−PCRによる分析における最も良好な再現性の結果が得られた。
ニワトリの生殖細胞の出現および維持に関与する遺伝子を同定するために、CESC細胞に対して用いたスクリーニング戦略を、ニワトリの胚の性腺細胞にも適用した。
CESC細胞、CEGC細胞およびステージIX−XIIの胚盤葉細胞の間における相対的発現レベルを比較することで、さまざまな細胞型の特徴的なマーカー遺伝子として現れる遺伝子のさまざまなリストが得られた(素点を添付書類に示している)。
さまざまな発現プロファイルの先行結果を組み合わせることで、各細胞型に固有の発現の組み合わせを決定することができる。ステージXの胚盤葉細胞とCESC細胞の発現レベルをインビトロで比較すると、ステージXの胚盤葉細胞は、
−fgf−8、fgf−b2、fgf−4、wnt−14のような成長因子、
−smad−9、cis−1、smad−7、id2、smad−4のようなシグナル伝達アクター、
−sf−1、gata−5、sox−9、sox−2のような転写因子、
−WD40、WDRP−3、abcg2輸送体のような構造遺伝子、
−N−myc2、poz−3、atmのような調節遺伝子、
−T細胞APP2Cホスファターゼ、ssb−1、nf−2のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−この発生段階で非常に特異的に現れるzpc遺伝子、
を過剰発現した(図14)。
−fgf−8、fgf−4、wnt−3a、wnt−11、tgf−b2のような成長因子、
−id2、smad−9、socs−1、cis−1、smad−7のようなシグナル伝達アクター、
−eomes、sox−3、sox−2、1P06、gata−2、gata−5、pax−6、fbx−15b、sox−9のような転写因子、
−WD40、claudin−1、アスタシン、WDRP−3、abcg2のような構造遺伝子、
−atm、N−myc−2、poz−2、poz−3のような調節遺伝子、
−ens−1、T細胞APP2Cホスファターゼ、TC893、nf−2、ssb−1、TC823のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−この発生段階で非常に特異的に現れるzpc遺伝子、
の過剰発現を示した(図14)。
−_fgf−4、tgf−b2、
−id−2、smad−7、smad−9、snoN、SOCS13、
−Cxcr−4、
−gata−5、N−Cor1、
−atm、ブルーム症候群、enx−1、rad54b、rbm6、ssb−1、
−nf−2、N−myc2、pml、T細胞APP2C、WDRP−3、
−cpe1738、cwf16、TC82325、TC87、zan75、
−Zpc、
という遺伝子を含んでいる。
同様に、ステージXの胚盤葉細胞と比べて、CESC細胞は、
−wnt−10、bmp−5、dapper−1のような成長因子、
−brap、TGF−RIIのようなシグナル伝達アクター、
−gcnf、TR−a、pax−6、1P06、irx−4のような転写因子、
−エメリン、アスタシン、claudin−3、LAMPレクチン、svap−1、dorfinのような構造遺伝子、
−tra−1、ch−tog、musashiのようなマーカー遺伝子、
−FTTシンターゼ、CG182、maturase K、RNAシクラーゼ、FMRPI182のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
を過剰発現する(図15)。
−wnt−3a、wnt−10、fgf−8、bmp−8、wnt−11、fgf−4、dapper−2のような成長因子、
−RIIアクチビン、brapのようなシグナル伝達アクター、
−nanog、eomes、sox−3、1P06、pax−6、gcnf、sox−2、gata−2、fbx−15b、irx−4のような転写因子、
−アスタシン、claudin−3、claudin−1のような構造遺伝子、
−tra−1、ens−1のようなマーカー遺伝子、
−TC896、maturase K、RNAシクラーゼ、FMRPI182のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
を過剰発現する(図15)。
−wnt−10a、wnt−11、dapper−1、
−1P06、pax−6、gcnf、irx−4、sox−3、
−アスタシン、claudin−3、
−tra−1、
−1P08−A09、slc38a、FMRPI182、
という遺伝子を含む。
胚の性腺細胞は、全組織の利用ストック(上記参照)を用いたところ、ステージXの胚盤葉細胞と比べて、
−bmp−5、dkk−3のような成長因子、
−エンドグリン受容体、TGF−RII、FGF−R、pten、wisp−1、smad−3、FGF−R、smarcd−3のようなシグナル伝達アクター、
−pax−2のような転写因子、
−エメリン、VE−カドヘリン−2、HSPb7のような構造遺伝子、
−tie−2、piwi、musashiのようなマーカー遺伝子、
−CGI182、samsn−1、flj00188のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
という遺伝子を過剰発現した(図16)。
−wnt−14、bmp−5、dkk−3のような成長因子、
−エンドグリン受容体、RPL−Rbox1、wisp−1、pten、cis−1、smad−7、smad−9、smad−4、TGF−RII、c−ski、smarcd−3のようなシグナル伝達アクター、
−Ihx−9、sf−1、gata−4、pax−2、dax−1、sox−9のような転写因子、
−abcg−2、VE−カドヘリン−2のような構造遺伝子
−tie−2、dmrt−1、piwiのようなマーカー遺伝子、
−TC95、KHKoc−1、flj00188、tep12、samsn−1のようなあまり特徴付けされていないその他の遺伝子、
−vasa、piwiのような生殖細胞のマーカー遺伝子、
という遺伝子を過剰発現した(図16)。
−BMP−2IK、BMP−5、dkk3、
−エンドグリン、FGF−R、TGF−RII、Wisp−1、
−Gata−4、Ihx−9、
−Rab40B、smad3、smarcd3、
−TC95408、TC97694、FLJ00188、
−tie2、tob、
という遺伝子を含む。
−wnt−14、
−Brinp、cis−1、c−ski、prl−Rbox1l、pten、sef、smad−4、smad−5、
−Abcg2、clock、dmrt−1、lfng、morf、
−Dax−1、pax−2、sf−1、sox−9、
−Deadend、poz−3、slug、Ve−カドヘリン−2、
−Emx−2、fragilis4、TC136、tep12、tsc−22、
−Tudor、vasa、
である。
−cripto、BRAP、TGF RIII、
−CGI82、ch−tog、ddx−25、Dorfin、エメリン、
−ERCC−2、KHKoc1、LAMPレクチン、
−maturase、musashi、piwi、SAMSN−1、SVAP−1、TC86990、
−TR−alpha、
である。
−nodal、wnt−3a、wnt−11、
−Ras like、
−drg−1、ens−1、ews−1、
−Eomes、Fbx15b、gata−2、jsd3、pax−6、sox−2、sox−3、
−Ddx−28、Mago、ネスチン、POZ2、
−Arg NmethylASE、PP2447、RNAシクラーゼ、
−A14TS、CES−c32、TC893、トランスリン、
−Claudin−1、syntaxin 16、WD40、WDFYP−2、である。
CESC細胞の形態形成の維持を保証する細胞骨格の遺伝子のレベルでは、限られた数の遺伝子のみが、有用で重要な発現の差異を示した。とりわけ、WDモチーフを有する遺伝子、すなわち細胞骨格レベルでのタンパク質間の相互作用に関与するモチーフがCEGCよりもCESC細胞でより多く発現するWDRP−2遺伝子(TC190198)である。WD−40遺伝子(TC189537)はステージIX−XIIの胚盤葉細胞にかなり特異的であると考えられる。ベータ・カテニン遺伝子が二つの系で強く発現することに注目すべきであり、このことは、該遺伝子の調節がタンパク質レベルで実際に行われることを示唆している。逆に、「ギャップ結合」と細胞間の強力な関連の維持に関与するClaudin−1遺伝子(TC189974)はCESC細胞で強く発現した。この観察結果は、電子顕微鏡によって行った、細胞内結合が特に重要でありうまく構造化されていたCESC細胞の分析と合致するものである。また、細胞の移動と、周囲との潜在的な相互作用を可能にする、細胞の細胞外基質の制御に介入するメタロプロテアーゼという酵素であるアスタシン(TC221952)も検出された。
CESC細胞とGESC細胞は、さまざまなレベルで、成長因子とサイトカインの大きなファミリーのさまざまなメンバーを発現した。また、TGF/BMPファミリー、FGFファミリー、チロシンキナーゼ受容体因子のファミリー、シグナルがgp130という経路によって伝達されるサイトカインのファミリー、およびwntファミリーの多くの成長因子が、CESC細胞あるいはGESC細胞で特異的に発現した。
TGFb/BMPおよびFGFに対する受容体のメッセンジャーが、CEFを含む、試験した細胞型の全体で検出された。これらの変動の生理学的重要性が知られていないとき、検出されたRNAのレベルがタンパク質レベルの良好な指標であれば、第一にシグナル伝達の実際の欠如がこれらの受容体レベルで観察されるとは考えられない。しかし、CESC細胞におけるアクチビンIIB(U31223)受容体の強い発現が観察され、該発現はおそらく、これらの細胞におけるnodalとcriptoの強い発現と関係している。
シグナル伝達経路においては、チロシンキナーゼ受容体とTGFb/BMP受容体の活性化経路およびgp130jak/STATの経路の大半のアクターは、概して偏在的に、さまざまな細胞型の間で大差なく発現した。しかし、いくつかの観察を行う必要がある。PTEN遺伝子(BM486819)ならびにPOZ3(TC216137)のようなPOZドメインにあるファミリーの遺伝子がCEGC細胞で強く発現した。CIS−1(TC216000)、SSB−1(TC210358)、SOCS13(TC217588)などのような遺伝子は、さまざまな受容体によるシグナル伝達に関与し、また多くの遺伝子がGTPasesの経路に関与する。TGF/BMPの作用を調節する作用で知られる、Smad−3(TC187835)、Smad−6およびSmad−7(TC194136)遺伝子もまた、CEFでの強い発現が見られても、CESC細胞よりもCEGC細胞で多く発現した。マウスにおける生殖細胞の決定論に強く関与することで知られるSmad−1遺伝子(Tremblay et al.,2001)とSmad−5遺伝子(TC209770)(Chang et al.,2001)はそれぞれ、CESC細胞とCEGC細胞でより多く発現した。線維芽細胞での発現も検出された。Smad−4遺伝子(TC207213)は、CEGCで好適に発現したが、CESCとCEFでは検出されないか、あるいはほとんど検出されなかった。このSmad−4遺伝子は多くの状況で、TGFb/BMPファミリーのメンバーのシグナル伝達の鍵遺伝子として現れる。なぜなら、該遺伝子は、これらの因子に依存する遺伝子の転写制御に不可欠だからである。マウスにおけるsmad−4遺伝子の不活性化に関連する多くの欠点のうち、BMP−4突然変異体(Lawson et al.,1999)およびMBP−8b突然変異体(Ying et al.,2000、Loebel et al.,2003)で観察されるものに非常に類似したPGCの形成の不在が観察された(Chu et al.,2004)。c−ski遺伝子(TC219247)およびSNoN遺伝子(TC215069)も特異的な発現の差異を有しており、生殖経路におけるこれらの細胞の増殖と分化の制御に参与している。TGF/BMPファミリーのシグナルの伝達のこれらさまざまなアクターの発現レベルは、研究した細胞の「幹細胞」または「生殖細胞」としての性質の主要な指標に相当すると考えることができる。発現レベルのあらゆる変動は、候補遺伝子のさまざまな操作によって誘導される変化をより良く画定するために利用することができる。これらのさまざまな遺伝子自体、とりわけSmad−4も、CES細胞の生殖能力の制御において非常に重要な候補である。したがって、これらのさまざまな遺伝子の効果または破壊をインビトロとインビボの両方でテストすることが特に適切だと考えられる。
幹細胞および胚性幹細胞、特にCESC細胞は固有のテロメラーゼ活性を有する(Pain et al.,1996)。ニワトリのテロメラーゼ遺伝子はクローニングされたばかりであり(Delany et al.,2004、Swanberg et al.,2004)、CESC細胞での発現レベルは高いと考えられる。
sox遺伝子については、sox−9遺伝子(U12533)の発現がCEGC細胞に、より特異的であり、このことは、マウスの精巣形成におけるこの遺伝子の役割の重要性に合致していると考えられるが(Chaboissier et al.,2004、Vidal et al.,2001)、該遺伝子は好適には支持細胞で発現すると考えられる。哺乳類と鳥類の間でのこの遺伝子の役割の保存が考えられ(Morais da Silva et al.,1996)、この遺伝子は、Dax−1(AF202991)の存在下でCEGC細胞においてもまた強い発現が見られるアクターである、核受容体sf−1(Sekido et al.,2004)(NM205077)の直接的な標的である。
また、gata遺伝子も特徴的な発現プロファイルを示した。gata−4遺伝子(U11887)は、胚の性腺細胞で好適に発現し、発現はセルトリ細胞の存在に関連していると考えられる(Imai et al.,2004、Lavoie et al.,2004)。gata−2遺伝子(X56930)とgata−5遺伝子(U11888)は、CESC細胞でより多く発現し、とりわけ、胚盤葉細胞ではgata−5遺伝子が強く過剰発現する。gata−2遺伝子のメッセンジャーは、生殖細胞(Siggers et al.,2002)およびニワトリの早期胚(Sheng et al.,1999)で検出されている。gata遺伝子の多面的な作用は、標的遺伝子のプロモーターにおける類似のおよび/または共通の応答エレメントのレベルでさまざまなパートナーと関連することで変調、制御される。したがって、造血系に優先的なパートナーの一つがetsファミリーの遺伝子の一つであれば、その他の系における増殖および分化の組み合わせは異なる。gata遺伝子に対する応答エレメントは、smad−7遺伝子のプロモーターにおけるBMPに対する応答エレメント(BREエレメント)を用いて同定される(Benchabane et al.,2004)。このsmad−7遺伝子はまた、CESC細胞よりも胚の性腺細胞でより多く発現した。
ホルモンの核受容体については、dax−1遺伝子が胚盤葉細胞で非常に強く過剰発現すると考えられる。この遺伝子は、とりわけsf−1遺伝子の作用に対する拮抗作用による(Crawford et al.,1998)、生殖性の分化に対してマイナスではあるが(Swain et al.,1998)不可欠の役割を持つこと(Meeks et al.,2003)で知られている。このdax−1遺伝子はそれ自身がsf−1によってプラスに制御され、COUP−TFによってマイナスに制御されうる(Yu et al.,1998)。また、dax−1の発現はwnt−4による特定の活性化系に依存している(Mizusaki et al.,2003)。ところが、wnt−4はCESC細胞よりも性腺でより多く発現が観察される因子の一つである。また、N−Corl遺伝子(TC201157)のような、HNRと関連するタンパク質をコードする遺伝子も存在し、特徴的な差異を示した。
生殖細胞での遺伝子の転写制御に関与するタンパク質のうち、RNAを固定するタンパク質、すなわち「RNA結合タンパク質」が見られた。これらのタンパク質はとりわけショウジョウバエで同定されており、胚の極性の制御(Huynh et al.,2004a)と生殖細胞の決定論の制御に介入するものである。もう一つのモデル種、C.elegansでは、生殖細胞の前成説は、同様に、また概略的には、これらのタンパク質の存在と役割に基づいている。しかし、これら二つのモデルにおいて、転写に必要な活性化であるRNAポリメラーゼIIのリン酸化による活性化の制御は、これら「RNA結合タンパク質」によっては行われない(Seydoux et al.,1997)。哺乳類においては、これらの遺伝子のうちいくつかがマウスにおける生殖系の維持にも不可欠であることが示されている(Wang et al.,2004、Tsuda et al.,2003、Tanaka et al.,2000)。しかし、マウスの生殖細胞の由来は、三次元的な細胞環境と、BMP−4やBMP−8のような因子の作用とに関連した、さまざまなアクターによる誘導現象に、より関連していると考えられる。これらの誘導全体が最終的に、Oct−3/4のようなさまざまな主要なアクターの発現レベルを制御する(Saitou et al.,2003)。この誘導の由来は、マウスのMESC細胞の分化から生殖細胞をインビトロで得ることによって強化されると考えられる(Hubner et al.,2003、Geijsen et al.,2004、Toyooka et al.,2003)。
比較した細胞型によって発現で大きな差異を示すその他の遺伝子のうち、CESC細胞と胚盤葉細胞に特異的なtra−1(NM204289)、先行研究でCESC細胞のマーカーとして記載されている(Acloque et al.,2001)ens−1遺伝子、MESC細胞の生理に関与するT−boxというボックス遺伝子であるがその役割は分かっていないfbx15遺伝子とfbx15b遺伝子(Tokuzawa et al.,2003)、Nkx転写因子ファミリーのiroquoisホメオボックス遺伝子IRX4(Houweling et al.,2001)の存在を挙げることができる。その他の多くの遺伝子が発現の差異を示した。
機能が現状では完全に未知である遺伝子は、試験したさまざまな細胞型の間で発現の差異を示した。たとえば、CEGC細胞で過剰発現した遺伝子TC976(TC227369)、TC954(TC203410)およびFLJ00188(TC196697)と、CESC細胞で過発現した遺伝子TC869(TC192927)、1P08−A09(TC189639)、TC823(TC209084)、slc38a2(TC187360)、TC896(TC196399)、FPPシンターゼ(TC211235)、TC874(TC193590)およびCES−c32(TC83694)とを挙げることができる。胚盤葉細胞でより多く発現した遺伝子CPE1738(TC214741)を指摘することができる。TC976遺伝子は、アンキリン・モチーフとSOCSボックス(Suppressor of Cytokine signaling、サイトカインシグナル伝達の抑制遺伝子)を含んだ、マウスのASB−6タンパク質との部分的な相同性を有している(Wilcox et al.,2004、Kim et al.,2004)。これらのASB遺伝子は生殖細胞で発現することが多く、ASB14遺伝子は、CESC細胞とCEGC細胞で好適な発現が見られたが、胚盤葉細胞ではほとんど見られなかった。これらの遺伝子の機能の仮説の一つは、SOCSドメインが特定のメッセンジャーに特異的な生殖細胞の区画化に介入し、体細胞でのそれらの分解を促進させるというものである(DeRenzo et al.,2003)。このメカニズムは同時に存在し、「RNA結合タンパク質」によって行われるメカニズムに相補的であると考えられる。
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Claims (16)
- StX型、幹細胞型または生殖細胞型の鳥類の細胞を特徴付けることを可能にするマーカーの組み合わせであり、同じグループ、あるいは異なる二つのグループから選択される少なくとも二つのマーカーを含む組み合わせであって、該グループが、
a. 1P06、2contig58、60S−L14、ATM、ブルーム症候群、BTEB4、CD9、CHDヘリカーゼ、Clock、cwf16(FLJ10374)、CXCR4、Dnmt2、enx1(ho−zeste2)、eomes、EWS、FGF−4、GATA−5、HOJ−1、N−AGN6Pデアセチラーゼ、N−Cor1、NF2、p53、pml、rbm6、SA−2、SA−3、SARA、SCYE1、SEF、sf−1、SnoN、SOCS13、SSB−1、TC87479、T細胞APP2C、TGF−beta2、WD40/FYVE−dタンパク質2、WD−RP3、Zan75、ZPCという遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、StX細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、ならびに/または、
b. 1P06、1P08−A09、アクチビンRIIB、アスタシン、Claudin−3、dapper−1、Dorfin、FPPシンターゼ(fps)、GalNAc−T3、gcnf、HSPb7、IRX4、LMX、pax−6、Slc38a2、sox−3、tra1 gp96、wnt−10a、wnt−11という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、幹細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、ならびに/または、
c. アディポネクチン、BMP−2IK、bruno like、CD34、CDK5アクチベーター1、dkk1、dkk3、DMRT1、emx2、エンドグリン、FAST−1、FGF R、FLJ00188、flk−1、gata−4、gcl、LHX9、NOSタイプIII、plzf、PRL−R box1l、PTEN、SAMSN−1、slug、smad3、Smarcd3、sox−9、Strat8、TACC2、TC95408、TC97694、TGF RII、TGF RIII、tie2、tie−2、TR−alpha、vasa、VE−Cadherin、vera、Wisp−1という遺伝子およびこれらの組み合わせから選択される、生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子の一つのマーカー、
である、マーカーの組み合わせ。 - StX細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、1P06、ATM、CXCR4、eomes、FGF−4、GATA−5、NF2、SOCS13、SSB−1、TC87479、T細胞APP2C、TGF−beta2、WD−RP3、ZPCという遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の組み合わせ。
- ZPC遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項1または請求項2に記載の組み合わせ。
- 幹細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、1P06、アクチビンRIIB、アスタシン、Claudin−3、dapper−1、FPPシンターゼ(fps)、GalNAc−T3、gcnf、LMX、pax−6、tra1 gp96、wnt−10aという遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項1〜請求項3のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- 1P06遺伝子とtra−1遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項1〜請求項4のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- 生殖細胞で好適に発現する標的遺伝子のマーカーが、アディポネクチン、DMRT1、エンドグリン、FAST−1、FGF R、FLJ00188、gata−4、LHX9、plzf、PRL−R、box1l、PTEN、Strat8、TGF RIII、vasa、Wisp−1という遺伝子およびこれらの組み合わせのマーカーから選択されることを特徴とする、請求項1〜請求項5のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- DMRT1遺伝子およびvasa遺伝子のマーカーを少なくとも一つ含むことを特徴とする、請求項1〜請求項6のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- マーカーが、標的遺伝子の発現産物、すなわちmRNA、cDNAもしくはポリペプチドまたはこれらの断片に特異的に結合する抗体と、前記標的遺伝子によって発現するmRNAもしくは対応するcDNAまたはこれらの断片に特異的にハイブリダイズする能力を有する核酸断片とから選択されることを特徴とする、請求項1〜請求項7のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- 同一の担体、好ましくは標準的な担体上にまとめられることを特徴とする、請求項1〜請求項8のいずれか一つに記載の組み合わせ。
- 標的遺伝子とハイブリダイズすることのできる核酸断片が好ましくは標準的な形で置かれている担体を含む、鋳型DNAの形であることを特徴とする、請求項9に記載の組み合わせ。
- DNAチップ上に置かれることを特徴とする、請求項10に記載の組み合わせ。
- 請求項1〜請求項11のいずれか一つに記載のマーカーの組み合わせを含むことを特徴とするDNAチップ。
- 鳥類細胞を特徴付ける方法であり、請求項1〜請求項11のいずれか一つに記載のマーカーの組み合わせを用いて前記細胞で発現する遺伝子の発現を分析することと、分析された細胞の表現型を特徴づけることを含む、鳥類細胞の特徴付けの方法。
- 鳥類細胞の培養方法であり、適切な培地での細胞の培養と、請求項13に記載の方法を用いた該細胞の特徴付けを含む、鳥類細胞の培養方法。
- StX細胞、幹細胞および生殖細胞から選択される細胞を単離することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 不活性化された支持細胞層「フィーダー」を添加していない適切な培地で培養されたStX細胞から生殖細胞を得ることを特徴とする、請求項14または請求項15に記載の方法。
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