ES2402208T3

ES2402208T3 - Método para la purificación de alfa-1-antitripsina

Info

Publication number: ES2402208T3
Application number: ES06808708T
Authority: ES
Inventors: Peter Kumpalume; Adrian Podmore; Joan Dalton
Original assignee: Bio Products Laboratory Ltd
Current assignee: Bio Products Laboratory Ltd
Priority date: 2005-11-30
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2013-04-29
Anticipated expiration: 2026-11-29
Also published as: BRPI0619230B1; US20090292114A1; EP1973563B1; US8580931B2; AU2006321447B2; EP1973563A1; CA2631524C; GB0524432D0; DK1973563T3; BRPI0619230A2; WO2007063299A1; BRPI0619230B8; AU2006321447A1; CA2631524A1; PL1973563T3

Abstract

Un método para el aislamiento de α1-antitripUn método para el aislamiento de α1-antitripsina (AAT) a partir de una disolución que contienesina (AAT) a partir de una disolución que contiene albúmina y AAT, que comprende las etapas de: (a) albúmina y AAT, que comprende las etapas de: (a) cargar la disolución sobre un primer sustrato de ccargar la disolución sobre un primer sustrato de cromatografía de quelatos metálicos en condiciones romatografía de quelatos metálicos en condiciones en las que se retenga la AAT sobre el sustrato y nen las que se retenga la AAT sobre el sustrato y no la albúmina; (b) lavar el sustrato para retirar o la albúmina; (b) lavar el sustrato para retirar las proteínas no unidas o débilmente unidas y eluilas proteínas no unidas o débilmente unidas y eluir entonces selectivamente la AAT desde el sustrator entonces selectivamente la AAT desde el sustrato; (c) cargar el eluido de AAT obtenido en la etapa; (c) cargar el eluido de AAT obtenido en la etapa (b) sobre un segundo sustrato de cromatografía de (b) sobre un segundo sustrato de cromatografía de quelatos metálicos en condiciones en la que la AA quelatos metálicos en condiciones en la que la AAT permanezca en disolución y no se retenga sobre eT permanezca en disolución y no se retenga sobre el sustrato; (d) recoger la disolución de AAT de lal sustrato; (d) recoger la disolución de AAT de la etapa (c); y (e) llevar a cabo opcionalmente una etapa (c); y (e) llevar a cabo opcionalmente una o más etapas de purificación cromatográfica compleo más etapas de purificación cromatográfica complementarias de la disolución de AAT. mentarias de la disolución de AAT.

Description

Metodo para la purificaci6n de a-1-antitripsina

La presente invenci6n se refiere a metodos para la purificaci6n de a-1-antitripsina.

La a-1-antitripsina (AAT), tambien conocida como inhibidor de a-1-proteasa, es un inhibidor de proteasa esencial

5 encontrado principalmente en la sangre. La AAT protege normalmente al tejido conectivo, tal como los tejidos elasticos de los pulmones, de la degradaci6n por elastasa, una enzima liberada por neutr6filos en sitios de inflamaci6n.

El enfisema hereditario es una enfermedad resultante de una deficiencia genetica de AAT. El enfisema hereditario puede afectar tanto a la estructura como a la funci6n de los pulmones y puede conducir a enfisema cr6nico y muerte

10 prematura si se deja sin tratar. Se cree que la elast6lisis sin control es el mecanismo mediante el que el enfisema se desarrolla en estos individuos, y por tanto la administraci6n intravenosa de AAT purificada es el tratamiento estandar para la deficiencia de AAT. La fibrosis quistica es otra patologia en la que el desequilibrio cr6nico de elastasa y AAT da como resultado el dano de tejido. Se usa el tratamiento con AAT para contrarrestar este desequilibrio y evitar el dano de tejido.

15 Los intentos tempranos de purificar grandes cantidades de AAT a partir de plasma se centraron en el uso de fracciones secundarias de procesos de fraccionamiento con etanol frio. El precipitado de la fracci6n de Cohn IV-1, una fracci6n de desecho en la fabricaci6n de albumina, ha sido el mas frecuentemente seleccionado.

El documento EP-A 0067293 describe un metodo de purificaci6n de AAT a partir de la fracci6n de Cohn IV-1 en que las proteinas del precipitado de la fracci6n de Cohn IV-1 se desestabilizan por exposici6n a agentes reductores que 20 rompen los enlaces disulfuro. Se precipitan entonces las proteinas desestabilizadas (precipitaci6n salina) usando altas concentraciones salinas. Puesto que la AAT no esta estabilizada mediante puentes disulfuro, no se desestabiliza por los agentes reductores y por lo tanto puede recuperarse del sobrenadante mediante cromatografia.

Los documentos US 4.379.087 y US 4.439.358 usaban metodos mas convencionales para aislar AAT a partir de la fracci6n de Cohn IV-1. En los metodos de estas patentes, se usa PEG para retirar las impurezas de alto peso

25 molecular y desnaturalizadas del material de partida mediante precipitaci6n. Esto es seguido de cromatografia de intercambio ani6nico para reducir la albumina y otros contaminantes de menor peso molecular. Sin embargo, los rendimientos eran extremadamente bajos con estos metodos.

El documento US 4.656.254 sugiere que los metodos de los documentos US 4.379.087 y US 4.439.358 podian conseguir un rendimiento del recipiente final de solo 4 a 6% cuando se usaba plasma combinado. El documento US

30 4.656.254 da a conocer que pueden conseguirse rendimientos aumentados de hasta 500 veces aumentando el volumen de la muestra de fracci6n de Cohn IV-1 en 24 volumenes y aumentando el pH a entre pH 9-10 antes de efectuar los metodos descritos en los documentos US 4.379.087 y US 4.439.358.

Se ha mostrado que otros metodos, tales como los del documento W02005/027821, consiguen un producto de mayor pureza a partir de la fracci6n de Cohn IV-1. El metodo del documento W02005/027821 usa una etapa de

35 precipitaci6n seguida de una cascada por etapas de cromatografia de intercambio ani6nico, intercambio cati6nico y un segundo intercambio ani6nico.

Se han reconocido las limitaciones de la fracci6n de Cohn IV-1 como fuente de AAT y se han usado fracciones de Cohn alternativas tales como sobrenadantes de la fracci6n de Cohn II y III (tambien conocido como sobrenadante A en el metodo de fraccionamiento de Cohn modificado descrito por Kistler y Nitschmann, 1962, Vox Sang, 7, pag. 414

40 a 424). Segun la bibliografia, el sobrenadante de la fracci6n de Cohn II y III contiene 2 o 3 veces mas AAT activa que la fracci6n de Cohn IV-1.

Puede prepararse sobrenadante A+1 como se muestra en la Figura 4. Sin embargo, purificar AAT a partir del sobrenadante A+1 tiene sus propias desventajas en comparaci6n con usar la fracci6n de Cohn IV-1. En primer lugar, contiene enormes cantidades de albumina que deben retirarse de la corriente de procesamiento. En segundo lugar,

45 esta albumina es un producto esencial por si mismo y por tanto cualquier proceso comercialmente util debe permitir tambien la copurificaci6n de la albumina. Por tanto, solo deberian emplearse metodos que no destruyan la estructura terciaria de la albumina. Para ser comercialmente util, cualquier metodo para la purificaci6n de AAT que use el sobrenadante A+1 como material de partida debe poder proporcionar una producci6n econ6mica de albumina y AAT, y potencialmente tambien otras proteinas plasmaticas de interes.

50 Los documentos. US 4.697.003 y EP-A 0282363 retiran el etanol del sobrenadante A mediante diafiltraci6n o filtraci6n en gel. Sin embargo, la retirada del etanol del sobrenadante A mediante diafiltraci6n o filtraci6n en gel se vuelve cara y consume mucho tiempo cuando se usan grandes volumenes de material de partida. Oespues de la retirada del etanol, se someten tanto albumina como AAT a cromatografia de intercambio ani6nico en la que tanto AAT como albumina estan unidas a un soporte s6lido. En el documento EP-A 0282363, se mejora la pureza de la

55 AAT eluyendo primero la albumina y aumentando entonces los niveles de acetato de sodio para eluir la AAT. En el documento US 4.697.003, se eluye la AAT sin eluir primero la albumina. Los metodos tanto del documento US

4.697.003 como EP-A 0282363 describen etapas de purificaci6n suplementarias despues de la etapa de cromatografia de intercambio ani6nico. El documento EP-A 0282363 describe filtraci6n en gel, mientras que el documento US 4.697.003 usa precipitaci6n con PEG. El metodo del documento EP-A 0282363 consigue un 80-90% de pureza y un 65-75% de rendimiento. Esto es equivalente a un 50-60% de recuperaci6n de la AAT plasmatica.

Es el objetivo de la presente invenci6n mejorar lo actualmente disponible para el aislamiento de AAT en uno o mas de los siguientes aspectos: rendimiento y/o pureza de AAT y reproducibilidad de la misma, simplicidad del proceso e idoneidad para uso a gran escala y/o comercial o proporcionar al menos un metodo alternativo para el aislamiento de AAT.

Se ha encontrado ahora que la AAT puede aislarse a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT usando al menos dos etapas de cromatografia de quelatos metalicos separadas. Este metodo sencillo da como resultado rendimientos altos y reproducibles de AAT, puede usarse econ6micamente a gran escala y puede proporcionar AAT suficientemente pura para aplicaciones terapeuticas. La cromatografia de quelatos metalicos es tambien conocida como cromatografia de afinidad por iones metalicos inmovilizados (IMAC).

El uso de la cromatografia de quelatos metalicos (IMAC) para fraccionar proteinas plasmaticas se describi6 originalmente por Porath (Porath, J. et al., Nature 258: 598-599 (1975)). Su uso como etapa de un proceso multietapa para fraccionar proteinas a partir de suero de cabra se describe en Jain y Gupta, Applied Biochemistry and Biotechnology, 2005, vol. 125, 53-62. Kurecki (Kurecki, T. et al., Anal. Biochem. 99: 415420 (1979)) usaron un quelato de Zn para la purificaci6n de a2-macroglobulina y AAT a partir de una fracci6n plasmatica con sulfato de amonio, pero la AAT requeria purificaci6n suplementaria mediante cromatografia de intercambio ani6nico. En el documento W095/35306, se us6 un quelato de Cu o Zn como etapa de refinado, posterior a la precipitaci6n con PEG y cromatografia de intercambio ani6nico. En el documento W097/09350, se us6 un quelato de Ni como quinta etapa en un proceso multietapa para purificar AAT a partir de leche de oveja transgenica. Al contrario que estos metodos de la tecnica anterior, en la presente invenci6n se usa la cromatografia de quelatos metalicos como etapa de purificaci6n principal, permitiendo un proceso sencillo y escalable para la purificaci6n a gran escala de AAT.

En un aspecto, la presente invenci6n proporciona por lo tanto un primer metodo para el aislamiento de a1antitripsina (AAT) a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, que comprende las etapas de:

(a): cargar la disoluci6n sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que se retenga la AAT sobre el sustrato y no la albumina;

(b): lavar el sustrato para retirar las proteinas no unidas o debilmente unidas y eluir entonces selectivamentela AAT del sustrato;

(c): cargar el eluido de AAT obtenido en la etapa (b) en un segundo sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en la que la AAT permanezca en disoluci6n y no se retenga sobre el sustrato;

(d): recoger la disoluci6n de AAT de la etapa (c); y

(e): llevar a cabo opcionalmente una o mas etapas de purificaci6n cromatografica suplementarias de la disoluci6n de AAT, por ejemplo, una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico.

En el primer metodo, puede estar opcionalmente presente tambien una etapa de purificaci6n cromatografica adicional entre las etapas (b) y (c). Por ejemplo, puede estar presente una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico. Sin embargo, preferiblemente la etapa (c) sigue directamente a la etapa (b).

En otro aspecto, la invenci6n proporciona un segundo metodo para el aislamiento de a1-antitripsina (AAT) a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, que comprende las etapas de:

(a1) retirar la albumina de la disoluci6n;

(b1) cargar la disoluci6n desprovista de albumina sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en la que la AAT permanezca en disoluci6n y no se retenga sobre el sustrato;

(c1) recoger la disoluci6n que contiene AAT;

(d1) cargar la disoluci6n obtenida en la etapa (c1) sobre un segundo sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT se retenga sobre el sustrato; y

(e1) eluir selectivamente la AAT del segundo sustrato.

Aunque se prefiere el orden anterior de etapas en el segundo metodo, el orden de las etapas puede intercambiarse de tal modo que las etapas (d) y (e) sean antes que las etapas (b) y (c). Por tanto, la presente invenci6n proporciona tambien un tercer metodo para el aislamiento de a1-antitripsina (AAT) a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, que comprende las etapas de:

(a2) retirar la albumina de la disoluci6n;

(b2) cargar la disoluci6n desprovista de albumina sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT se retenga sobre el sustrato;

(c2) eluir selectivamente la AAT del sustrato;

(d2) cargar la disoluci6n obtenida en la etapa (c2) sobre un segundo sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT permanezca en disoluci6n y no retenga sobre el sustrato; y

(e2) recoger la disoluci6n que contiene AAT.

Se entiende por �aislamiento� que preferiblemente al menos un 50% de la AAT presente en la muestra de partida este presente en el producto de los metodos de la invenci6n. Preferiblemente, al menos un 65% y lo mas preferiblemente al menos un 80% de la AAT presente en la muestra de partida esta presente en el producto. La AAT obtenida usando los metodos de la invenci6n sera preferiblemente al menos un 70% pura, mas preferiblemente al menos un 80% pura y lo mas preferiblemente un 90% pura. La AAT obtenida usando los metodos de la invenci6n sera preferiblemente al menos un 75% activa, mas preferiblemente al menos un 85% activa y lo mas preferiblemente un 95% activa, medido por ejemplo mediante la actividad de uni6n de elastasa. Oeberia observarse que, como todos los procedimientos de aislamiento, los aumentos de pureza estan a menudo asociados a reducciones del rendimiento. Tambien las etapas anadidas para asegurar la seguridad virica pueden reducir la recuperaci6n global.

El experto en la materia estara al tanto de las tecnicas mediante las que pueden determinarse la pureza, rendimiento y/o actividad de un aislamiento de AAT de la invenci6n. Por ejemplo, la pureza puede determinarse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SOS (PAGE-SOS). La actividad puede determinarse mediante un ensayo de inhibici6n de elastasa (Fujita et al., Am. J. �espir. Crit. Care Med., v160, n� 3, sept. de 1999, 802-807). El rendimiento puede determinarse comparando la actividad total del producto final con la actividad total del material de partida.

Preferiblemente, la �disoluci6n que contiene albumina y AAT� es plasma, o una fracci6n plasmatica. Se entiende por �fracci6n plasmatica� una disoluci6n que se ha obtenido fraccionando plasma. Son procesos de fraccionamiento de plasma comunes el metodo de fraccionamiento de Cohn (Cohn et al., 1946, J. Am. Chem. Soc., 68: 459) y sus modificaciones (por ejemplo, Kistler y Nitschmann, 1962, Vox Sang, 7: 414-424). Este proceso empieza con una crioprecipitaci6n para retirar algunos de los factores de coagulaci6n. El conjunto de plasma desprovisto de crioprecipitado resultante se trata para precipitar la fracci6n de IgG (la fracci6n 1 segun el metodo de Kistler y Nitschmann a 19% de etanol, pH 5,85 y -5�C; o la fracci6n II + III equivalente segun el metodo de Cohn a 25% de etanol, pH 6,9 y -5�C). Se retiran las impurezas restantes mediante la precipitaci6n de la fracci6n IV a 40% de etanol a pH 5,85 y -5�C segun el metodo de Kistler y Nitschmann o un proceso en dos etapas segun Cohn (Fr IV-1 a 18% de etanol, pH 5,2, -5�C seguido de Fr IV-4 a 40% de etanol, pH 5,8, -5�C). �educir el pH del sobrenadante de la fracci6n IV a 4,8 y bajar entonces la temperatura de -5�C (�1�C) a -10�C (+3�C), manteniendo la concentraci6n de etanol al 40%, causa la precipitaci6n de la fracci6n de Cohn V. Cualquiera de las fracciones obtenidas en los procesos de fraccionamiento anteriores que contienen tanto albumina como AAT son utilizables como materiales de partida para los metodos de la presente invenci6n.

El sobrenadante de la fracci6n A+1 de Kistler y Nitschmann es particularmente adecuado para uso como material de partida en la presente invenci6n. El sobrenadante A+1 deriva de plasma del que se ha retirado fibrin6geno, factores de coagulaci6n e inmunoglobulinas, y comprende principalmente AAT, glucoproteina acida a1 (AAG), transferrina, haptoglobina (Hp), glucoproteina a2-HS, hemopexina, a2-macroglobulina, a1-antiquimotripsina y albumina. Se prepara mediante una modificaci6n del metodo de Kistler y Nitschmann en que el plasma de partida se trata con Celite seguido de fraccionamiento con 19% de etanol, pH 5,85 a -5�C, conduciendo a una combinaci6n de la fracci6n 1 con el sobrenadante A del metodo de Kistler y Nitschmann. Cualquier fracci6n equivalente en terminos de composici6n a las fracciones mencionadas anteriormente obtenida de manera alternativa o conocida por una terminologia alternativa es considerada un material de partida adecuado para los metodos de la invenci6n. Cualquier subfracci6n de las fracciones anteriormente mencionadas que comprenda AAT y albumina es tambien utilizable como material de partida.

Se entiende tambien por �fracci6n plasmatica� cualquier disoluci6n que contenga albumina y AAT obtenida retirando uno o mas componentes plasmaticos del plasma. El metodo de retirada del componente plasmatico es irrelevante y puede ser, por ejemplo, cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio ani6nico, cromatografia de exclusi6n por tamano o metodos de precipitaci6n. Los componentes retirados seran preferiblemente inmunoglobulinas, factores de coagulaci6n tales como factor VIII y/o fibrin6geno. Un experto en la materia seria capaz de retirar estos y otros componentes plasmaticos del plasma sin excesivos problemas.

El plasma usado en los metodos de la invenci6n y el plasma usado para fraccionamiento o para obtener fracciones plasmaticas puede ser de cualquier fuente adecuada, aunque se prefiere plasma de sangre de mamifero. Es mas preferido el plasma de sangre humana. Por consiguiente, la AAT purificada mediante los metodos de la invenci6n es preferiblemente AAT de mamifero y lo mas preferiblemente AAT humana. Sin embargo, la AAT purificada mediante los metodos de la invenci6n podria ser AAT de una especie diferente de la especie de la que deriva la disoluci6n que

contiene albumina y AAT, en otras palabras, puede purificarse una AAT ex6gena expresada artificialmente en un hospedador (por ejemplo, un animal transgenico) a partir de disoluciones que contienen albumina y AAT derivadas de ese hospedador. Convenientemente, el hospedador sera un animal mamifero que sea transgenico de AAT de una especie de interes (por ejemplo, AAT humana) y el producto de expresi6n transgenica AAT se encuentra en uno

o mas de los fluidos corporales del animal que contienen albumina. Preferiblemente, el fluido corporal que contiene el producto de expresi6n transgenica AAT es el plasma del animal.

Preferiblemente, la mayoria de componentes proteicos presentes en el material de partida seran componentes proteicos derivados de plasma o una fracci6n plasmatica. Preferiblemente, los unicos componentes proteicos seran aquellos derivados de plasma o una fracci6n plasmatica.

Si es necesario, el pH de la disoluci6n de partida deberia ajustarse de tal modo que no ocurra un dano indebido en la AAT antes de purificar segun los metodos de la invenci6n. Se prefiere un intervalo de pH de entre 5 y 7. Es mas preferido un pH de entre 5,5 y 6,5 y lo mas preferible es un pH de aproximadamente 6,2. La AAT tiende tambien a desnaturalizarse si se deja en contacto con altas concentraciones de etanol durante cualquier periodo de tiempo. Si estan presentes altas concentraciones de etanol en una fracci6n plasmatica, entonces puede ser necesario diluir la fracci6n usando un tamp6n adecuado para reducir las concentraciones de etanol y por tanto conservar la actividad de AAT antes de llevar a cabo los metodos de la invenci6n. El hecho de que la AAT sea inestable es bien conocido en la bibliografia. Por ejemplo, una concentraci6n de etanol al 20% inactivara del orden del 75% la AAT presente al cabo de dos semanas.

Los sustratos de cromatografia de quelatos metalicos comprenden iones metalicos quelados con ligandos que estan enlazados con un soporte s6lido. Los sustratos usados mas habitualmente utilizan iones metalicos de transici6n divalentes tales como cinc (Zn2+), niquel (Ni2+) o cobre (Cu2+) para formar complejos estables con residuos de histidina, tript6fano y cisteina en las proteinas para purificar. Pueden usarse tambien iones de cadmio, mercurio, calcio, cobalto o Fe2+. La afinidad no es especifica de la secuencia aminoacidica de la proteina, sino que la cromatografia de quelatos metalicos puede aislar preferiblemente proteinas de uni6n a iones metalicos. Una vez unidas, las proteinas pueden eluirse selectivamente controlando el pH o usando moleculas competidoras tales como imidazol o aminoacidos en los tampones de eluci6n.

Un sustrato de cromatografia de quelatos metalicos preferido para uso en la presente invenci6n comprende acido nitrilotriacetico (NTA) como ligando quelante, por ejemplo ligado con agarosa como soporte s6lido. Esta disponible un producto adecuado con niquel como i6n metalico con el nombre comercial HisTrap Sepharose� (Amersham Biosciences). El niquel puede reemplazarse por otro cati6n mediante arrastre y recarga del sustrato segun las instrucciones del fabricante. 0tro sustrato de cromatografia de quelatos metalicos preferido comprende acido iminodiacetico como ligando quelante, por ejemplo, ligado con agarosa como soporte s6lido. Esta disponible un producto adecuado con el nombre comercial Chelating Sepharose� (Amersham Biosciences). Puede cargarse Chelating Sepharose� con cualquier i6n metalico adecuado.

Los sustratos de cromatografia de afinidad por quelato metalico de uso en la presente invenci6n se cargan con cationes de metales de transici6n divalentes o cationes de calcio divalentes, preferiblemente Zn2+, Ni2+, Cu2+, Co2+ o Fe2+, mas preferiblemente Ni2+, Cu2+ o Zn2+, y lo mas preferiblemente Cu2+. Un experto en la materia podria elegir los iones metalicos adecuados y las condiciones acompanantes para conseguir los perfiles de uni6n necesarios. Pueden usarse diferentes cationes metalicos en cada uno de los dos sustratos de cromatografia de afinidad por metales usados en los metodos de la invenci6n, pero preferiblemente se usara el mismo cati6n para minimizar el numero de posibles fuentes de contaminaci6n por iones metalicos en el producto final.

Es un sustrato preferido para permitir la uni6n de AAT y la circulaci6n de albumina el Chelating Sepharose (agarosa) cargado con iones Cu2+. Es un sustrato preferido para permitir circular AAT el de NTA-agarosa cargado con iones Cu2+

.

Por tanto, en realizaciones preferidas de los metodos de la invenci6n, el sustrato de cromatografia de quelatos metalicos usado en la etapa (c), la etapa (b1) o la etapa (d2) es el de NTA-agarosa, preferiblemente cargado con iones Cu2+, y el sustrato usado en la etapa (a), etapa (d1) o etapa (b2) es un sustrato Chelating Sepharose (agarosa), preferiblemente cargado con iones Cu2+.

La etapa (a) del primer metodo deberia retirar tambien el etanol de la disoluci6n de partida, ya que el etanol no se unira al sustrato de cromatografia de quelatos metalicos.

La retirada de la albumina en la etapa (a1) o etapa (a2) puede conseguirse mediante cualquier medio conveniente. Preferiblemente, se retira sustancialmente toda la albumina, por ejemplo al menos un 90% de la albumina (como se determina mediante el ensayo de Bradford y estimaciones de densitometria en PAGE-SOS). Si se usa el sobrenadante A+1 como material de partida, el componente principal sera normalmente albumina (por ejemplo, aproximadamente un 90% de la proteina total sera albumina). Un experto en la materia estaria al tanto de los medios adecuados para la retirada de albumina, aunque se mencionan como ejemplos cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia de quelatos metalicos, tecnicas de degradaci6n especificas o tecnicas de precipitaci6n. Se prefiere la cromatografia de intercambio ani6nico.

La cromatografia de intercambio ani6nico usa habitualmente sustratos tales como, pero sin limitaci6n, dextrano, celulosa y modificaciones de la misma que estan cargadas positivamente. Estos sustratos pueden comprender parte del soporte s6lido (por ejemplo, un recubrimiento) o pueden formar la totalidad del soporte s6lido. El soporte s6lido puede estar en forma particulada (por ejemplo, una resina), sin embargo pueden usarse soportes no particulados (por ejemplo, papeles de filtro o geles). Los sustratos particulados estan tipicamente, aunque no siempre, empaquetados en columnas.

Cuando se usa en la presente memoria el termino �sustrato�, deberia interpretarse que hace referencia a sustratos en una forma adecuada para uso en una etapa de cromatografia relevante, por ejemplo, una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico o de quelatos metalicos segun sea apropiado para el contexto en que se usa el termino. Por facilidad de procesamiento, los diferentes sustratos de cromatografia usados en los metodos de la invenci6n se empaquetan preferiblemente en columnas.

La muestra que va a experimentar cromatografia de intercambio ani6nico se aplica al sustrato de intercambio ani6nico. Basandose en las interacciones de carga, las moleculas (cargadas negativamente) en la muestra se unen al sustrato. El lavado del sustrato retira por lo tanto las moleculas no unidas o debilmente unidas. Puede conseguirse una eluci6n controlada/selectiva de las moleculas unidas pasando disoluciones de concentraci6n salina creciente por el sustrato, puesto que esto destruye las interacciones de carga entre el sustrato y las moleculas unidas. El pH de la disoluci6n de eluci6n puede alterarse tambien para inducir la eluci6n, puesto que esto alterara la carga presente en la molecula unida y el sustrato. Cuanto mas debil sea la interacci6n de carga entre la molecula y el sustrato, menor sera la concentraci6n salina necesaria para destruir la interacci6n y por tanto inducir la eluci6n de esa molecula desde el sustrato. Al controlar cuidadosamente la concentraci6n salina, puede conseguirse una eluci6n selectiva de las moleculas unidas.

Puede modificarse la fuerza de la interacci6n de carga mediante la elecci6n del material de soporte s6lido. Por ejemplo, �AE-Sephadex� o celulosa GE son sustratos de intercambio ani6nico fuertes y OEAE-celulosa y OEAESephadex� son sustratos de intercambio ani6nico debiles.

Un experto en la materia estara bien al tanto de las tecnicas y herramientas de intercambio ani6nico y seria capaz de concebir y efectuar un protocolo de intercambio ani6nico que retire sustancialmente toda la albumina de la muestra en la etapa (a1) o la etapa (a2). Convenientemente, el sustrato y las condiciones se seleccionaran de tal modo que la albumina circule por el sustrato y la AAT se retenga y entonces se eluya selectivamente. Esto es ventajoso cuando el material de partida contiene mayores cantidades de albumina que de AAT, que sera el caso si el material de partida es el sobrenadante A+1. Si se seleccionan condicionales tales que la albumina circule por el sustrato, se requiere un volumen menor de sustrato que el que se requeriria si toda la albumina se fuera a unir al sustrato.

Por tanto, en una realizaci6n preferida, la etapa (a1) en el segundo metodo de la invenci6n o la etapa (a2) en el tercer metodo de la invenci6n comprenden cargar la disoluci6n que contiene albumina y AAT sobre un sustrato de intercambio ani6nico en condiciones en las que se retenga la AAT sobre el sustrato y la mayoria de la albumina no; lavar el sustrato para retirar la albumina no unida y eluir entonces selectivamente la AAT desde el sustrato. Se retirara tambien cualquier etanol presente en la disoluci6n de partida, ya que no se retendra por el sustrato de intercambio ani6nico y por tanto puede retirarse por lavado.

Es de particular utilidad como sustrato de intercambio ani6nico en la etapa (a1) o la etapa (a2) la agarosa ligada con amino cuaternario, por ejemplo, Sepharose� ligada con amino cuaternario (Amersham Biosciences), en particular el sustrato comercializado con el nombre Capto �� (Amersham Biosciences). Capto �� es un intercambiador ani6nico (�) fuerte de amonio cuaternario de alta capacidad acoplado con una matriz de agarosa de alto flujo modificada quimicamente (recubierta con dextrano). El grupo amino cuaternario en Capto � es -N+(CH3)3. Sepharose� es el nombre comercial usado habitualmente para perlas de agarosa. 0tros sustratos de intercambio ani6nico adecuados incluyen perlas basadas en celulosa, dextrano y polimero.

Una ventaja de usar la cromatografia de intercambio ani6nico en la etapa (a1) o la etapa (a2) es que cualquier AAG presente en el material de partida tendera a unirse con el sustrato de intercambio ani6nico mas fuertemente que la AAT. Por lo tanto, puede eluirse selectivamente AAT desde el sustrato, dejando la AAG unida. Si se desea, la AAG puede eluirse selectivamente entonces despues de la AAT.

El primer metodo de la invenci6n puede comprender adicionalmente una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico efectuada en condiciones en las que la AAT se una al sustrato de intercambio ani6nico y se eluya selectivamente despues desde el mismo. Esta etapa adicional puede efectuarse convenientemente antes o despues de las etapas (c) y (d). La discusi6n de la cromatografia de intercambio ani6nico anterior se aplica, cambiando lo necesario, a este aspecto de la invenci6n. Como alternativa, pueden efectuarse otras etapas de purificaci6n cromatografica conocidas antes o despues de las etapas (c) y (d).

La siguiente discusi6n es aplicable a todos los metodos de la invenci6n a menos que se indique otra cosa.

Se preve que los metodos de la invenci6n puedan comprender una o mas etapas adicionales. Por ejemplo, pueden emplearse una o mas etapas de lavado en las etapas en que se retiene AAT sobre el sustrato de cromatografia para

reducir las moleculas indeseadas en el eluido de AAT. El objeto de una etapa de lavado es pasar un tamp6n adecuado a traves del sustrato que eluira las moleculas no unidas, o muy debilmente unidas, de la muestra (por ejemplo, albumina) sin inducir la eluci6n de la molecula diana (AAT). Lo mas habitualmente, se incluiran una o mas etapas de lavado entre la etapa de carga de la muestra sobre el sustrato de cromatografia y la etapa de eluci6n selectiva de AAT desde el mismo. Sin embargo, pueden incluirse etapas de lavado entre distintas etapas de eluci6n, especialmente si han de eluirse otras moleculas potencialmente utiles antes de la eluci6n de AAT.

Un experto en la materia estara al tanto de los tampones de carga, lavado y eluci6n adecuados y podra formular tampones adecuados (en terminos de constituyentes y sus concentraciones y pH) para conseguir la carga, lavado de AAT (u otras moleculas de interes) unida, o eluci6n selectiva de AAT (u otras moleculas de interes) desde el sustrato de cromatografia particular que se este usando. Un experto en la materia podra optimizar estos parametros sin excesivos problemas. Las condiciones de carga, lavado y eluci6n deberian seleccionarse de tal modo que no ocurra un dano innecesario en la AAT. Los tampones de carga, lavado y eluci6n tipicos comprenden un componente fosfato y una sal. Los componentes fosfato adecuados incluyen, pero sin limitaci6n, NaH2P04, Na2HP04, KH2P04 y K2HP04. Es un componente de tamp6n preferido una mezcla de Na2HP04 y NaH2P04. Las sales adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio y sulfato de sodio. Es una sal preferida el cloruro de sodio.

Oependiendo de los demas constituyentes presentes en la disoluci6n que se unen al sustrato de cromatografia, puede ser necesario llevar a cabo una eluci6n por etapas para obtener AAT con un alto grado de pureza. Los contaminantes que se unen al sustrato menos fuertemente que la AAT pueden eluirse primero mediante la elecci6n adecuada de las condiciones de eluci6n iniciales. Oe forma similar, el tamp6n de eluci6n usado para eluir la AAT deberia elegirse de tal modo que no retire los contaminantes que se unen al sustrato mas fuertemente que la AAT. Por ejemplo, la AAG se une a sustratos de intercambio ani6nico tales como Capto �� Sepharose� mas fuertemente que AAT, y la AAG puede permanecer unida a la columna despues de eluir la AAT. Si se desea, puede usarse para eluir la AAG un tamp6n de eluci6n de concentraci6n salina mayor que el usado para eluir la AAT despues de eluir la AAT.

Las condiciones de lavado y eluci6n para las etapas de cromatografia de quelatos metalicos pueden usar tambien compuestos competidores tales como aminoacidos o imidazol. Al optimizar la concentraci6n del compuesto competidor en un tamp6n de eluci6n, puede conseguirse la eluci6n selectiva de las sustancias unidas al sustrato de cromatografia. Por ejemplo, haptoglobina y transferrina se unen a agarosa ligada con NTA cargado con Cu2+ mas fuertemente que AAT y pueden permanecer unidas al sustrato despues de eluir la AAT. Puede usarse un tamp6n de eluci6n para eluir Hp y transferrina de mayor concentraci6n de imidazol que el usado para eluir la AAT. Oe forma similar, puede optimizarse la concentraci6n de molecula competidora en el tamp6n de carga para evitar la uni6n de AAT al sustrato de cromatografia de quelatos metalicos, asegurando por tanto su flujo eficaz cuando se requiera.

Un experto en la materia estara al tanto de las tecnicas para monitorizar el eluido para posibilitar seguir la progresi6n de la eluci6n y evaluar lo que se esta eluyendo en las diversas fracciones. Por ejemplo, la espectroscopia UV puede seguir la progresi6n de la eluci6n al momento. Pueden usarse tecnicas tales como HPLC SEC o PAGE-SOS para detectar la presencia e identidad de impurezas. Pueden usarse tambien espectrometria de masas por desorci6n laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALOI-T0F) de fracciones de HPLC o bandas de PAGE-SOS para identificar las proteinas presentes. Las proteinas conocidas pueden monitorizarse con metodos de detecci6n basados en anticuerpos (por ejemplo, el ensayo de inmunosorci6n ligado a enzima (ELISA), inmunodifusi6n radial (�IO) y determinaciones tubimetricas).

Los tampones de carga y lavado son a menudo iguales en terminos de constituyentes de tamp6n y cantidades de los mismos. Sin embargo, un experto en la materia podra concebir tampones de carga y lavado separados a partir de su conocimiento general comun en caso de que sea necesario.

Preferiblemente, todos los tampones usados en un solo metodo de la invenci6n usaran un componente de tamp6n identico y un tipo de sal identico, aunque a diferentes concentraciones para satisfacer los diversos requisitos funcionales de cada tamp6n. Esto minimiza el numero de contaminantes potenciales la AAT producto que surge del proceso. Lo mas preferiblemente, todos los tampones utilizables en la invenci6n comprenderan un componente de tamp6n fosfato y cloruro de sodio.

La conductividad de los tampones de carga y lavado es preferiblemente menor de 7 mS/cm, mas preferiblemente menor de 6 mS/cm y lo mas preferiblemente menor de 5,0 mS/cm. La conductividad esta preferiblemente entre 4,5 y 5 mS/cm para asegurar que la mayoria de la albumina circula pero la AAT sigue unida a cualquier matriz de intercambio ani6nico usada. La conductividad no deberia afectar a la uni6n a columnas de quelatos metalicos (por ejemplo, hasta NaCl 1 M (conductividad �80 mS/cm) es un aditivo recomendado en cromatografia de quelatos metalicos para evitar interacciones no especificas).

El pH de los tampones de carga, lavado y eluci6n es tambien importante. El pH de los tampones deberia mantenerse a un nivel que no dane sustancialmente la AAT. El pH deberia seleccionarse tambien cuidadosamente porque el pH puede afectar a la conductividad del tamp6n dependiendo de los constituyentes del tamp6n usados y puede inducir tambien la eluci6n o retenci6n (deseada o no) de la molecula diana desde el sustrato. Se prefiere un intervalo de pH entre 5 y 7. Es mas preferido un pH de entre 5,5 y 6,5 y lo mas preferible es un pH de

aproximadamente 6,2. Un experto en la materia estara al tanto de la relaci6n entre el pH y el grado de eluci6n y retenci6n, y podra seleccionar los intervalos de pH precisos que son apropiados para los tampones y sustratos que se estan usando y la funci6n que estan efectuando. El conocimiento general comun posibilitara la optimizaci6n de los parametros de tamp6n sin excesivos problemas.

Como se menciona anteriormente, es un sustrato de intercambio ani6nico preferido la agarosa ligada a amino cuaternario. La uni6n de AAT a este sustrato y la circulaci6n de albumina pueden conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato y cloruro de sodio, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 20 y 40 mM, preferiblemente entre 25 y 35 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 30 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2.

La eluci6n de AAT desde la agarosa ligada con amino cuaternario puede conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato y cloruro de sodio, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 140 y 200 mM, preferiblemente entre 155 y 185 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 170 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2.

La eluci6n de AAG desde la agarosa ligada a amino cuaternario puede conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato y cloruro de sodio, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 400 y 600 mM, preferiblemente entre 450 y 550 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 500 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2.

Pueden conseguirse la circulaci6n de AAT y la retenci6n de haptoglobina y transferrina sobre agarosa ligada con NTA cargado con Cu2+ con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato, cloruro de sodio e imidazol, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 20 y 40 mM, preferiblemente entre 25 y 35 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 30 mM, el imidazol esta entre 1,5 y 3,5 mM, preferiblemente entre 2, y 3 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 2,5 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2. La concentraci6n de imidazol u otras moleculas competidoras, si se usan, deberia seleccionarse cuidadosamente para asegurar que es suficiente para evitar la uni6n de AAT pero no para evitar la uni6n de haptoglobina o transferrina. La afinidad del imidazol por un i6n metalico depende de su concentraci6n. Por tanto, al elegir cuidadosamente la concentraci6n correcta, Hp tendra una mayor afinidad por el sustrato de cromatografia de quelatos metalicos que el imidazol, que a su vez tendra una mayor afinidad por el sustrato que AAT.

La eluci6n de haptoglobina y transferrina desde agarosa ligada con NTA cargado con Cu2+ puede conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato y cloruro de sodio, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 20 y 40 mM, preferiblemente entre 25 y 35 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 30 mM, el imidazol esta entre 15 y 25 mM, preferiblemente entre 17 y 23 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; y el pH esta entre 7 y 9, preferiblemente entre 7,5 y 8,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 8.

La circulaci6n de albumina y la retenci6n de AAT sobre agarosa ligada con acido iminodiacetico cargado con Cu2+ puede conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato, cloruro de sodio e imidazol, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 20 y 40 mM, preferiblemente entre 25 y 35 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 30 mM, el imidazol esta entre 1,5 y 3,5 mM, preferiblemente entre 2 y 3 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 2,5 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2.

La eluci6n de AAT desde agarosa ligada con acido iminodiacetico cargado con Cu2+ puede conseguirse con un tamp6n que comprende un componente de tamp6n fosfato, cloruro de sodio e imidazol, en el que el componente de tamp6n esta entre 10 y 30 mM, preferiblemente entre 15 y 25 mM, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 20 mM; el cloruro de sodio esta entre 20 y 40 mM, preferiblemente entre 25 y 35 mM y lo mas preferiblemente es de aproximadamente 30 mM, el imidazol esta entre 2,5 y 20 mM, preferiblemente entre 2,5 y 15 mM y lo mas preferiblemente entre 2,5 y 10 mM; y el pH esta entre 5 y 7, preferiblemente entre 6 y 6,5, lo mas preferiblemente es de aproximadamente 6,2.

Ha sido un grave problema de los metodos de la tecnica anterior para el aislamiento de AAT a partir de fracciones plasmaticas su inadaptaci6n para escalado a aislamiento a gran escala/comercial. Se ha encontrado ahora que los metodos que comprenden dos etapas de cromatografia de afinidad por quelatos metalicos pueden conseguir una preparaci6n de alto rendimiento y alta pureza de AAT a partir de disoluciones que comprenden plasma o fracciones de plasma sin necesidad de etapas de procesamiento suplementarias tales como diafiltraci6n o precipitaci6n con

PEG. Por tanto, los metodos de la invenci6n pueden utilizarse a gran escala/comercial y ser econ6micamente viables a esa escala.

Por �gran escala� se entiende que es conseguible el aislamiento a partir de volumenes de muestra de partida del orden de miles de litros. Considerado alternativamente, gran escala hace referencia a tamanos de lotes de plasma de partida de al menos 1000 litros, mas preferiblemente de al menos 3000 litros y lo mas preferiblemente de al menos 6000 litros.

Las realizaciones de la invenci6n preferidas anteriormente se aplican, cambiando lo necesario, a este aspecto de la invenci6n. Un experto en la materia podria aplicar las realizaciones discutidas anteriormente a la producci6n a gran escala sin excesivos problemas.

Los metodos basicos descritos anteriormente dan como resultado AAT de pureza y actividad significativas. Sin embargo, el producto directo de estos metodos basicos de la invenci6n puede someterse a procedimientos para purificarlo adicionalmente y/o concentrar la preparaci6n. Un experto en la materia sabria y podria aplicar procedimientos adecuados o concebir alternativas. Los ejemplos de procedimientos adecuados incluyen, pero sin limitaci6n, diafiltraci6n, ultrafiltraci6n, cromatografia de flujo, cromatografia de quelatos metalicos suplementaria, cromatografia de hidroxiapatito y procedimientos de inactivaci6n/reducci6n virica dedicados.

Si la AAT esta destinada a uso farmaceutico, la AAT aislada y/o purificada puede tener que experimentar un procesamiento suplementario para retirar cualquier contaminante biol6gico o quimico que pueda permanecer en la muestra. Oichos procedimientos son bien conocidos en la materia y un experto en la materia podria aplicar este conocimiento general comun para efectuar ensayos rutinarios para permitirle formular una AAT aislada/purificada que sea adecuada para uso farmaceutico.

Puede usarse diafiltraci6n para ajustar la concentraci6n salina o pH para que sea adecuado para uso farmaceutico.

Los contaminantes biol6gicos tales como virus o priones pueden inactivarse y/o retirarse mediante tecnicas de filtraci6n virica conocidas, mediante tecnicas de desinfecci6n quimica conocidas (inactivaci6n virica) y/o mediante tecnicas de pasteurizaci6n o tratamiento termico conocidas. Por ejemplo, es posible la inactivaci6n virica de una disoluci6n que contiene AAT usando tratamiento con disolvente-detergente como se expone en el documento EP-A 0131740, a condici6n de que la AAT se trate a un pH que no conduzca a la inactivaci6n de AAT, por ejemplo, un pH de al menos 6. Tambien es posible filtrar la AAT producida mediante los metodos descritos en la presente memoria a traves de uno o mas filtros viricos adecuados, por ejemplo, filtros con tamanos de poro de aproximadamente 20 nm, y por tanto asegurar te6ricamente la retirada de virus potencialmente pat6genos.

Si se usa el tratamiento con disolvente-detergente (OO) para inactivar virus, puede incluirse una etapa suplementaria en el metodo para retirar los reactivos disolventes-detergentes. Un experto en la materia estaria familiarizado con dichos metodos. A modo de ejemplo, puede usarse la cromatografia de intercambio ani6nico. Una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico adecuada seria igual que las que se discuten en la presente memoria. Sin embargo, puede usarse cualquier columna en la que se separen el OO o proteina de interes.

Si se usa la pasteurizaci6n o el tratamiento termico para inactivaci6n virica, se contempla el uso de estabilizantes. Los estabilizantes incluirian, pero sin limitaci6n, azucares, alcoholes de azucar, acido asc6rbico y aminoacidos. Los metodos para retirar estabilizantes, si son necesarios, son bien conocidos en la materia.

El orden particular de los procedimientos anteriormente mencionados no se considera importante, sin embargo, algunos 6rdenes particulares pueden ser mas ventajosos que otros en terminos de adecuaci6n y costes. Por ejemplo, puede se preferible efectuar la pasteurizaci6n con estabilizantes o efectuar una etapa de desinfecci6n quimica antes de la etapa de filtraci6n o dialisis, que podria disenarse para retirar los estabilizantes o el agente de desinfecci6n. Convenientemente, la etapa de tratamiento con OO puede efectuarse entre dos de las etapas de los metodos basicos de la invenci6n. Lo mas convenientemente, la etapa de tratamiento con disolvente-detergente ocurrira antes de la etapa en la que se retiene la AAT sobre el sustrato de cromatografia, permitiendo asi que los reactivos disolventes-detergentes se retiren de la AAT en la circulaci6n o en una o mas etapas de lavado. Por ejemplo, en el primer metodo de la invenci6n, el tratamiento con disolvente-detergente puede llevarse a cabo despues de la etapa (d), y pueden retirarse entonces los reactivos en una etapa de purificaci6n suplementaria (e), por ejemplo una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico. Sin embargo, si se efectua el tratamiento con OO despues de la etapa en la que se retiene la AAT sobre el sustrato de cromatografia, puede requerirse una etapa suplementaria para retirar el OO del producto de AAT. Un experto en la materia estaria familiarizado con dichos metodos.

Un experto en la materia estaria al tanto de las ventajas y desventajas de efectuar un tratamiento de inactivaci6n virica en una etapa particular de los metodos de la invenci6n. Por ejemplo, efectuar un tratamiento de inactivaci6n virica temprano en el proceso asegura que mas proteinas viricas en el material de partida estan inactivadas, y asi pueden obtenerse facilmente otras proteinas viricas inactivadas usando los metodos de la invenci6n. Sin embargo, una vez se ha llevado a cabo una etapa de inactivaci6n virica, las etapas posteriores deberian efectuarse en zonas exentas de virus, reduciendo por tanto la conveniencia del proceso. Ademas, si se lleva a cabo una etapa de inactivaci6n virica temprano en el proceso, existe el riesgo de que pueda ocurrir una reinfecci6n durante las etapas

de proceso restantes. Por consiguiente, un experto en la materia podria efectuar el tratamiento de inactivaci6n virica en el punto de los metodos de la invenci6n que mejor se ajuste a sus necesidades.

Los productos sanguineos, incluyendo AAT, para uso como productos farmaceuticos experimentaran necesariamente al menos dos etapas de inactivaci6n/reducci6n virica.

La AAT producida segun los metodos de la invenci6n puede formularse posteriormente para uso clinico. En dicha formulaci6n de AAT, la AAT deberia estar sustancialmente exenta de contaminantes quimicos y biol6gicos, en la medida en que los niveles en la formulaci6n no fueran considerados daninos para un paciente. Idealmente, los niveles de cualquier contaminante seran sustancialmente menores que los niveles minimos requeridos por las autoridades reguladoras con relaci6n a productos farmaceuticos.

Se entiende por �contaminantes biol6gicos� entidades biol6gicas capaces de inducir patologias en un paciente. Oichas entidades incluyen, pero sin limitaci6n, virus, priones, bacterias, hongos, esporas y celulas.

Se entiende por �contaminantes quimicos� moleculas que inducirian reacciones adversas si se administrasen a pacientes.

Las formulaciones de AAT adecuadas para aplicaciones farmaceuticas pueden comprender uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Preferiblemente, la AAT se formula como disoluci6n, por ejemplo en una forma adecuada para administraci6n parenteral, particularmente administraci6n intravenosa, o en una forma adecuada para administraci6n por inhalaci6n. La AAT adecuada para aplicaciones farmaceuticas puede estar tambien en forma liofilizada que requiere la disoluci6n en un diluyente farmaceuticamente aceptable antes de la administraci6n.

Como se discute anteriormente, el aislamiento de AAT es el objetivo de la invenci6n. Los metodos de la invenci6n implican inevitablemente la separaci6n de AAT de los otros componentes del material de partida, en particular la albumina. Estos otros componentes pueden ser contaminantes que se han de desechar como producto de desecho,

o pueden ser moleculas utiles que podrian aislarse y purificarse si fuera necesario. Sin excesivos problemas, el experto en la materia seria capaz de ensayar los componentes retenidos sobre un sustrato y/o presentes en la circulaci6n cuando se retiene AAT e identificar los otros componentes que podrian aislarse. Una vez identificados, un experto en la materia adaptaria facilmente el metodo de la invenci6n para aislar estos componentes en formas utiles si se desea.

Breve descripci6n de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que exhibe una realizaci6n preferida del segundo metodo de la invenci6n. Los tampones A a E se describen en el Ejemplo 2.

La Figura 2 muestra un diagrama de flujo que exhibe una realizaci6n preferida del primer metodo de la invenci6n. Los tampones A a E se describen en el Ejemplo 2.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo que exhibe el aislamiento suplementario de albumina, AAG, haptoglobina y transferrina junto con el aislamiento de AAT segun una realizaci6n preferida del primer metodo de la invenci6n.

La Figura 4 muestra el proceso de fraccionamiento plasmatico que proporciona el material de partida preferido para los metodos de la invenci6n (sobrenadante A+1).

Como se muestra en la Figura 1, si se usa sobrenadante A+1 como material de partida en el segundo metodo de la invenci6n y se usa cromatografia de intercambio ani6nico (por ejemplo, en Capto �� Sepharose�) en la etapa (a1), pueden seleccionarse condiciones en que AAT, haptoglobina y AAG se unan al sustrato de cromatografia, mientras que la mayoria de la albumina no. La eluci6n de AAT y haptoglobina y la retenci6n de AAG pueden conseguirse con un tamp6n que contiene fosfato 20 mM y NaCl 170 mM a pH 6,2. La AAG puede aislarse entonces del sustrato de cromatografia con un tamp6n que contiene fosfato 20 mM y NaCl 500 mM a pH 6,2.

La haptoglobina puede separarse entonces de la AAT en la etapa (b1), ya que la haptoglobina se unira al sustrato de cromatografia de quelatos metalicos, mientras que la AAT no. Oespues de retirar por lavado la AAT del sustrato, la haptoglobina puede eluirse usando un tamp6n con una mayor concentraci6n de imidazol.

El tratamiento con disolvente-detergente puede llevarse a cabo en el producto de la primera etapa de cromatografia de quelatos metalicos. En la segunda etapa de cromatografia de quelatos metalicos, (etapa (d1)), la AAT se une al sustrato y cualquier albumina residual, junto con los reactivos disolventes detergentes, puede retirarse por lavado antes de eluir la AAT.

La Figura 2 ilustra una realizaci6n preferida del primer metodo de la invenci6n. Oe nuevo, el sobrenadante A+1 es el material de partida. Este se carga sobre el primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT se une pero albumina y AAG no. Albumina y AAG pueden retirarse mediante lavado antes de eluir la AAT del sustrato aumentando la concentraci6n salina del tamp6n.

Se carga entonces la AAT en un segundo sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT no se une al sustrato, pero haptoglobina y transferrina si. Se retira por lavado la AAT del sustrato, entonces pueden eluirse haptoglobina y transferrina aumentando el contenido de imidazol del tamp6n.

El tratamiento con disolvente-detergente puede llevarse a cabo en el producto de la segunda etapa de cromatografia de quelatos metalicos. En una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico final (etapa (e)), la AAT se une al sustrato y cualquier albumina residual, junto con los reactivos disolventes detergentes, puede retirarse mediante lavado antes de eluir la AAT. Pueden retirarse tambien otros contaminantes, por ejemplo proteinas de bajo peso molecular, mediante lavado o eluci6n selectiva.

La Figura 3 elabora adicionalmente una realizaci6n preferida del primer metodo de la invenci6n en la que el sobrenadante A+1 es el material de partida y se usa agarosa ligada con acido iminodiacetico cargado con Cu2+ como primera etapa de cromatografia (etapa (a)). Como puede observarse, este metodo de la invenci6n puede usarse para aislar albumina, AAG, haptoglobina y transferrina del sobrenadante A+1 ademas de AAT.

La primera etapa de cromatografia con agarosa ligada con acido iminodiacetico cargado con Cu2+ retiene AAT, haptoglobina y transferrina, mientras que albumina y AAG circulan. La circulaci6n puede recogerse y pueden separarse albumina y AAG mediante cromatografia de intercambio ani6nico (la albumina circulara mientras que la AAG esta unida). Se eluyen AAT, haptoglobina y transferrina retenidos en la agarosa ligada con acido iminodiacetico cargado con Cu2+ y se cargan sobre sustrato de agarosa ligado con NTA cargado con Cu2+ (etapa (b)). Esto permite que la AAT circule y haptoglobina y transferrina se retengan. La circulaci6n de AAT puede purificarse adicionalmente si es necesario, por ejemplo mediante cromatografia de intercambio ani6nico, para retirar la albumina residual. La haptoglobina y transferrina retenidas pueden eluirse posteriormente y separarse mediante intercambio ani6nico, ya que la haptoglobina se une facilmente a sustratos de intercambio ani6nico pero la transferrina no.

La Figura 4 muestra el proceso de fraccionamiento plasmatico que conduce al material de partida preferido de la invenci6n (sobrenadante A+1) y lo compara con el proceso de Kistler y Nitschmann (mostrado en el lado derecho). El precipitado de A+1 incluye la fracci6n 1 y el precipitado A del proceso de Kistler y Nitschmann.

Todas y cada una de las combinaciones de rasgos preferidos discutidas en la presente memoria estan englobadas por la invenci6n, incluso si no se dan a conocer explicitamente. Como se usa en la presente memoria, el termino �comprende� incluye los terminos �consiste esencialmente en� y �consiste en�.

La invenci6n se describira adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Preparaci6n de sobrenadante A+1

Se someti6 plasma a una descongelaci6n controlada de -0,5�C a 2�C durante la cual precipitaron algunas de las proteinas. Se recogi6 el sobrenadante, se trat6 con Celite y se filtr6 entonces para retirar otras proteinas indeseadas. Se ajust6 el sobrenadante resultante a un pH de 5,85 con tamp6n acetato y se anadi6 etanol al 17-21% v/v. Se control6 la temperatura durante la posterior precipitaci6n a entre -4 y -6�C. Estas condiciones son similares a las usadas en la segunda etapa del proceso de Kistler y Nitschmann (ibid.) y asi el precipitado incluye la fracci6n 1 y el precipitado A de ese proceso. El precipitado se designa como A+1 y el sobrenadante del mismo se usa como material de partida en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 2: Oisoluciones tamp6n

Tamp6n A: Tamp6n fosfato 20 mM que contiene NaCl 30 mM, pH 6,2 (el tamp6n fosfato se prepara mezclando Na2HP04 20 mM y NaH2P04 20 mM a una relaci6n volumetrica de aproximadamente 1:4, respectivamente).

Tamp6n B: Fosfato 20 mM que contiene NaCl 170 mM, pH 6,2.

Tamp6n C: Fosfato 20 mM que contiene NaCl 500 mM, pH 6,2.

Tamp6n O: Fosfato 20 mM que contiene NaCl 30 mM, imidazol 2,5 mM, pH 6,2.

Tamp6n E: Imidazol 20 mM, pH 8.

Ejemplo 3: Aislamiento de AAT usando intercambio ani6nico como primera etapa (segundo metodo de la invenci6n)

Se diluy6 el sobrenadante A+1 1:1 con NaH2P04 10 mM que contenia Na0H 10 mM, pH 11. Oiluir el sobrenadante A+1 reducia la concentraci6n de etanol, que es conocido que dana la AAT con el tiempo. El pH de la disoluci6n resultante estaba entre 6 y 7 y la conductividad era menor de 7 mS/cm. Justo antes de cargar en la columna de Capto � Sepharose, se redujo el pH a entre 5,5 y 6,5 con acido acetico diluido. Esto asegur6 que la mayoria de la albumina circulara por la columna mientras se retenia la AAT.

Se equilibr6 la columna con tamp6n A. Este tamp6n tiene una conductividad similar al sobrenadante A+1 diluido 1:1 con tamp6n que contiene NaH2P04 10 mM y Na0H 10 mM.

Se eluy6 entonces la fracci6n de AAT con tamp6n B. Algunas moleculas unidas estrechamente tales como glucoproteina acida a1 (AAG) permanecian en la columna a esta concentraci6n y se eluyeron con una concentraci6n mayor de NaCl (concretamente, tamp6n C).

Se anadi6 imidazol 2,5 mM a la fracci6n de AAT eluida de la columna de Capto �. Se carg6 entonces la fracci6n de AAT tratada con imidazol sobre una columna HisTrap desprovista de sus iones de niquel y recargada con cationes de cobre divalentes. A esta concentraci6n de imidazol, y usando este tipo de soporte s6lido quelante, algunos de los contaminantes se unieron al soporte s6lido, sin embargo la AAT no. La circulaci6n contenia tambien albumina residual que se uni6 a la columna de Capto � en la etapa anterior en lugar de circular.

Para reducir la carga virica de la fracci6n de AAT, se anadi6 una mezcla de polisorbato 20/fosfato de tri-n-butilo (TnBP) segun el documento EP-A 0131740. Se carg6 entonces la fracci6n de AAT tratada con disolvente-detergente (OO) sobre un soporte s6lido de Chelating Sepharose (ligando quelante acido iminodiacetico) cargado con cobre. En las condiciones de carga (imidazol 2,5 mM en tamp6n fosfato 20 mM que contenia NaCl 30 mM, pH 6,2), la AAT se unia al soporte s6lido, mientras que los contaminantes, principalmente albumina, no. Se eluy6 entonces la AAT con una disoluci6n de imidazol 10 mM.

Ejemplo 4: Aislamiento de AAT usando Chelating Sepharose como primera etapa (primer metodo de la invenci6n)

Se diluy6 el sobrenadante A+1 1:1 con NaH2P04 10 mM que contenia Na0H 10 mM, pH 11. El pH de la disoluci6n resultante estaba entre 6 y 7 y la conductividad era menor de 7 mS/cm. Justo antes de cargar sobre la columna de Chelating Sepharose, se redujo el pH a entre 6,0 y 6,5 con acido acetico diluido. Esto asegur6 que la mayoria de la albumina y otras proteinas circularan por la columna mientras que la AAT se retenia.

La Chelating Sepharose usada comprendia acido iminodiacetico con ligando quelante y se carg6 con cationes de cobre divalentes. Se anadi6 imidazol 2,5 mM al sobrenadante A+1 diluido 1:1 y se ajust6 el pH a 6,2. Se carg6 entonces este sobre una columna de Chelating Sepharose de cobre y se equilibr6 con tamp6n O. En estas condiciones, mas de un 90% de la proteina total del sobrenadante A+1 circul6 por el soporte s6lido y se uni6 menos de un 0,5% de la albumina. La circulaci6n era principalmente albumina, pero contenia tambien algo del dimero de haptoglobina que estaba presente en el material de partida.

Se eluyeron las proteinas unidas, incluyendo AAT, con una disoluci6n de imidazol 20 mM. Se diluy6 entonces el eluido 8 veces de modo que la concentraci6n de imidazol fuera 2,5 mM. Se carg6 esta mezcla de proteinas sobre una columna HisTrap sometida a arrastre cargada con cobre. En estas condiciones de carga, la fracci6n de AAT circul6 por la columna mientras que los contaminantes, principalmente haptoglobina y transferrina, estaban unidos. La fracci6n de AAT obtenida en esta etapa era al menos un 80% pura por PAGE-SOS, siendo los contaminantes principales albumina y proteinas de bajo peso molecular, posiblemente fragmentos de apolipoproteina A.

Se anadi6 polisorbato 20/TnBP (OO) a la disoluci6n de AAT segun el documento EP-A 0131740. Se carg6 la AAT tratada con OO sobre una columna de intercambio ani6nico de Capto � y se equilibr6 con tamp6n A. En estas condiciones de carga, el OO circul6 mientras que las proteinas estaban unidas.

Se eluy6 la AAT con tamp6n B. Se eluyeron las proteinas unidades usando una mayor concentraci6n salina (tamp6n C). La AAT obtenida en esta etapa era al menos un 90% pura y 95% activa por la actividad de uni6n a elastasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para el aislamiento de a1-antitripsina (AAT) a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, que comprende las etapas de:

(a) cargar la disoluci6n sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en 5 las que se retenga la AAT sobre el sustrato y no la albumina;

(b)

lavar el sustrato para retirar las proteinas no unidas o debilmente unidas y eluir entonces selectivamente la AAT desde el sustrato;

(c)

cargar el eluido de AAT obtenido en la etapa (b) sobre un segundo sustrato de cromatografia de

quelatos metalicos en condiciones en la que la AAT permanezca en disoluci6n y no se retenga sobre el 10 sustrato;

(d)

recoger la disoluci6n de AAT de la etapa (c); y

(e)

llevar a cabo opcionalmente una o mas etapas de purificaci6n cromatografica complementarias de la disoluci6n de AAT.
2.

Un metodo segun la reivindicaci6n 1, que comprende adicionalmente una etapa de purificaci6n 15 cromatografica adicional entre las etapas (b) y (c).
3. Un metodo segun la reivindicaci6n 1 o la reivindicaci6n 2, en el que la etapa de purificaci6n cromatografica complementaria y/o la etapa de purificaci6n cromatografica adicional es una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico.
4.

Un metodo para el aislamiento de AAT a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, 20 que comprende las etapas de:

(a1) retirar la albumina de la disoluci6n; (b1) cargar la disoluci6n desprovista de albumina sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en la que la AAT permanezca en disoluci6n y no se retenga sobre el sustrato;

(c1) recoger la disoluci6n que contiene AAT;

25 (d1) cargar la disoluci6n obtenida en la etapa (c1) sobre un segundo sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT se retenga sobre el sustrato; y (e1) eluir selectivamente la AAT del segundo sustrato.
5. Un metodo para el aislamiento de AAT a partir de una disoluci6n que contiene albumina y AAT, que comprende las etapas de:

30 (a2) retirar la albumina de la disoluci6n; (b2) cargar la disoluci6n exenta de albumina sobre un primer sustrato de cromatografia de quelatos metalicos en condiciones en las que la AAT se retenga sobre el sustrato;

(c2) eluir selectivamente la AAT del sustrato; (d2) cargar la disoluci6n obtenida en la etapa (c2) sobre un segundo sustrato de cromatografia de quelatos 35 metalicos en condiciones en las que la AAT permanezca en disoluci6n y no retenga sobre el sustrato; y (e2) recoger la disoluci6n que contiene AAT.
6. Un metodo segun la reivindicaci6n 4 o la reivindicaci6n 5, en el que la etapa de retirada de albumina de la disoluci6n es una etapa de cromatografia de intercambio ani6nico.
7.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el ligando quelante del primer y/o segundo 40 sustrato de cromatografia de quelatos metalicos es acido nitrilotriacetico (NTA) o acido iminodiacetico.
8.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el i6n metalico del sustrato de cromatografia de quelatos metalicos se selecciona del grupo consistente en Zn2+, Ni2+, Cu2+, Co2+ y Fe2+.
9.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el sustrato de cromatografia de quelatos metalicos sobre el que va a retenerse la AAT es agarosa con acido iminodiacetico cargado con iones Cu2+.
10.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que el sustrato de cromatografia de quelatos metalicos usado en la etapa de cromatografia de quelatos metalicos en el que la AAT permanece en disoluci6n es agarosa con NTA cargado con iones Cu2+.
11.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que la disoluci6n que contiene albumina y AAT 5 es plasma o una fracci6n plasmatica, preferiblemente plasma humano o una fracci6n plasmatica humana.
12.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, en el que la disoluci6n que contiene albumina y AAT comprende principalmente AAT, glucoproteina acida a1, transferrina, haptoglobina, glucoproteina a2 HS, hemopexina, a2-macroglobulina, a1-antiquimotripsina y albumina.
13.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, que comprende adicionalmente al menos una etapa

10 de concentraci6n y/o purificaci6n, preferiblemente seleccionada del grupo consistente en diafiltraci6n, ultrafiltraci6n, cromatografia de flujo, cromatografia de quelatos metalicos suplementaria y cromatografia de hidroxiapatito.
14. Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, que comprende adicionalmente al menos una etapa de retirada de contaminantes, preferiblemente una etapa de inactivaci6n o retirada virica.
15. Un metodo segun la reivindicaci6n 14, en el que la etapa de inactivaci6n o retirada virica comprende 15 tratamiento con disolvente-detergente y/o filtraci6n virica.
16.

Un metodo segun la reivindicaci6n 15, en el que la etapa de tratamiento con disolvente-detergente ocurre antes de la etapa en la que se retiene la AAT sobre un sustrato de cromatografia.
17.

Un metodo segun cualquier reivindicaci6n precedente, que comprende adicionalmente formular la AAT obtenida para uso farmaceutico.