NANOLlPOSOMAS FUNCIONALlZADOS CON PÉPTIDOS La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina, de la 5 química, la bioquímica y la inmunología, y se refiere al uso de nanoliposomas funcional izados con péptidos en su superficie que permiten la identificación de tejidos y/o células diana y la liberación de fármacos de forma selectiva, y en particular, a la funcionalización de nanoliposomas con el péptido VIP. La presente invención también se refiere a las composiciones, al procedimiento de 10 preparación ya los usos de dichos nanoliposomas. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR Existe un creciente interés por los efectos biológicos de las nanopartículas, de 15 su toxicidad y su alcance en función del medio (M. Tsoli et al. 2005. Small (2005); 1 :841), por ejemplo, su uso potencial como herramienta terapéutica en tratamientos de cáncer (EI-Sayed et al., 2005. Nano Letters Vo1.5, 5. 829-834). Gracias al enorme interés de esos nano-bioconjugados se han desarrollado un 20 amplio rango de aplicaciones tales como distribución de fármacos, marcadores moleculares, análisis bioquímicos ultrasensibles, desarrollo de dispositivos "Iab-on-a-chip", construcción de nanocomponentes electrónicos, motores nano-moleculares ... etc [C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin Eds. Nanobiotechnology, Wiley-VCH 2004] 25 Entre los diferentes tipos de nanopartículas, los nanoliposomas son de especial relevancia debido a que son los sistemas nanométricos mejor establecidos clínicamente para el transporte y envío de fármacos gracias a que no son citotóxicos, son biocompatibles y biodegradables, y además su síntesis es 30 relativamente barata y de fácil escalado en procesos industriales. Los liposomas en general se han utilizado en terapias para el tratamiento de cáncer durante más de una década ya que han demostrado reducir de forma sistémica
los efectos secundarios, la toxicidad y facilitando la eliminación del fármaco.( Torchlin, 2005. Nat Rev. Drug Discovery 4, 145). Los nanoliposomas se pueden utilizar como transportadores de diversas 5 sustancias tanto en su exterior como en su interior y para una variedad de aplicaciones biomédicas como terapia génica o para el envío de fármacos, de forma que los ácidos nucleicos o el fármaco vayan protegidos en su interior evitando su degradación enzimática y su contacto directo con otras células sanas. Por otra parte permiten el envío de moléculas biológicamente activas de 10 carácter lipófilo y tamaños superiores a los 500 Da, dos de los problemas más importantes que puede presentar una molécula activa para terminar como principio activo de un medicamento. Los nanoliposomas de diversos tamaños, normalmente menores de 400 nm 15 pueden entrar en las zonas en las que existen tumores de forma rápida ya que la pared del endotelio vascular se encuentra fenestrada. Por el contrario, los nanoliposomas permanecen en el torrente sanguíneo del tejido sano mediante la pared del endotelio vascular no fenestrado. 20 Además, la funcionalización de los nanoliposomas con péptidos que reconocieran con mayor selectividad las dianas terapéuticas, permitiendo el direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que dichas dianas sobreexpresan los receptores que reconocen dichos pépidos. 25 Actualmente existen liposomas funcionalizados con péptidos en su superficie. Por ejemplo, los liposomas funcionalizados con tuftsina han permitido aumentar la eficacia de estibogluconato sódico (Agrawal & Gupta, 2000. Adv. Drug Deliv. Rev. 41: 135-146;, Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304) Y 30 anfotericina B (Gupta & Haq, 2005. Methods Enzymol. 391: 291-304, Agrawal et al., 2002. J. Drug Target. 10: 41-45). Sin embargo, aún no se conocen nanoliposomas funcional izados con neropéptidos, y una de las limitaciones para el uso clínico de los neuropéptidos en general, y del VIP en particular, ha
sido siempre su corta vida media en circulación. Esto implica la necesidad de administrar crónicamente dicho péptido, aumentando los costes económicos y dificultando su posología en pacientes. Además, el proceso de funcionalización de nanoliposomas con VIP se enfrenta al problema añadido de diseñar un 5 procedimiento en el que quede el extremo carboxilo terminal de VIP libre, ya que es por este extremo por el que interacciona con sus receptores específicos de membrana. Es necesario, por tanto, desarrollar un procedimiento de funcionalización de nanoliposomas con péptidos, dejando el extremo carboxilo terminal de dicho péptido libre para interaccionar con su receptor. 10 DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Los autores de la presente invención han desarrollado nanoliposomas 15 funcionalizados con péptidos en su superficie, estables, no tóxicos, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos, y un procedimiento para su obtención, que son útiles para vehiculizar principios activos y/o composiciones farmacéuticas. Además, han demostrado que la funcionalización de VIP en la superficie del nanoliposoma, optimizando su síntesis a un tamaño de 100 nm 20 se maximiza su entrada en las zonas con tumores debido al endotelio vascular fenestrado, y a la vez se permite su direccionamiento de forma específica en aquellos caso en los que se conoce que las células cancerosas sobreexpresan los receptores de la familia de VIP del tipo siete dominios transmembrana acoplados a proteínas G, como es el caso del cáncer de próstata. Además de 25 permitir que VIP actúe como agente terapéutico sobre células diana o como modo de liberación de fármacos sobre células que sobreexpresan receptores VIP, aumenta la vida media de la molécula unida a la misma, ya que dificulta el ataque proteolítico. 30 Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un nanoliposoma funcionalizado con un péptido en su superficie, de ahora en adelante, nanoliposoma de la invención. En una realización preferida, el extremo carboxilo-terminal del péptido queda libre, pudiendo interaccionar con su
receptor mediante su extremo carboxilo-terminal. En otra realización preferida, el péptido se selecciona de la lista que comprende: glucagon, GIP (gastric inhibitory polypeptide), secretina, hormona de crecimiento, somatoliberina, somatotropina, péptido PHI (peptide histidine isoleucine), péptido PHM (Peptide 5 Histidine-Methionine), PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptides), adrenomedulina, corticostatina y VIP(vasoactive intestinal peptide). Una de las limitaciones para el uso clínico de los péptidos en general, fundamentalmente de los neuropéptidos, y del VIP en particular, es su corta 10 vida media en circulación, lo que haría necesaria la administración crónica del mismo, aumentando los costes económicos y dificultando su posología al paciente. La unión de los péptidos a los nanoliposomas, yen concreto de VIP, aumenta la vida media de las moléculas unidas a los mismos, ya que dificulta el ataque proteolítico. 15 Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, el péptido es un neuropéptido, y más preferiblemente, es el péptido intestinal vasoactivo (VIP). 20 Tal como se entiende en esa memoria, un neuropéptido se refiere a pequeñas moléculas parecidas a proteínas de un enlace peptídico de dos o más aminoácidos y que se diferencian de proteínas por su longitud, y porque se originan por transducción sináptica cerebral. Su dimensión puede variar desde dos aminoácidos, como la carnosina, hasta más de 40 como la CRH 25 (Corticotropin-releasing hormone u hormona liberadora de corticotropina). Tienen función cerebral tanto estimulante como inhibidora, produciendo efectos como la analgesia, apetito, sueño, etcétera. En esta memoria se entiende como péptido intestinal vasoactivo (VIP por sus 30 siglas en inglés vasoactive intestinal peptide), es una hormona polipeptídica formada por 28 residuos de aminoácidos y es producida por muchas estructuras del cuerpo humano como el aparato digestivo, el páncreas y el núcleo supraquiasmático del hipotálamo en el cerebro. Se caracteriza por su
propiedad vasodilatadora y su actividad en el sistema nervioso periférico (por ejemplo, el VIP relaja los pulmones, la traquea y la musculatura gástrica). Inhibe la secreción de enzimas gástricas y estimula la secreción de glucagón, insulina y somatostatina, aumenta la adenilciclasa, así como la secreción biliar 5 en el hígado. 10 El VIP, o "vasoactive intestinal peptide", también denominada como PHM27 ó MGC13587. Está codificado por un gen que se encuentra en el cromosoma 6 (6q25). Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEO ID NO: 1. En el contexto de la presente invención, VIP se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 1, Y que comprendería diversas variantes procedentes de: 15 a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria hibrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) 20 debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 1, Y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las 25 características estructurales el péptido VIP. Los nanoliposomas de diversos tamaños, normalmente menores de 400 nm pueden entrar en las zonas en las que existen tumores de forma rápida ya que la pared del endotelio vascular se encuentra fenestrada. Por el contrario, los 30 nanoliposomas permanecen en el torrente sanguíneo del tejido sano mediante la pared del endotelio vascular no fenestrado. En otra realización preferida de la invención, el nanoliposoma comprende:
5 10 15 (a) 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC, fórmula 1), (b) 1 ,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC, fórmula 11), y al menos un fosfolípido pegilado. (1) (11) o cualquiera de sus sales, derivados o análogos, o cualquiera de sus 20 combinaciones, de los compuestos de fórmula (1) y (11). En otra realización preferida, el fosfolípido pegilado es:
combinaciones, de los compuestos de fórmula (I) y (II).En otra realización preferida, el fosfolípido pegilado es:5a.1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilen glicol-Maleimida(DSPE-PEG-Maleimida), b.1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol (DSPE-PEG), o una combinación de ambos.10En otra realización preferida, el nanoliposoma se obtiene por un procedimiento que comprende:a.formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende 1,2-distearoil-sn-glicero-3-15fosfocolina(DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina(DPPC)y al menos un fosfolípido pegilado,b.añadirel solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente un ratio de volumen deaproximadamente 4:1 (fase orgánica:faseacuosa),20c.someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase,todo el solvente orgánico mediante unrotavapor hasta obtener una fase de gel,d.convertirel gel en una suspensión acuosa,dondese han formado los liposomas25e.convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante sonicación, hasta un tamaño medio menor de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de400 nm o menor,y máspreferiblemente de un tamaño medio menor de 200nm,f.purifica los nanoliposomasmediante una columna de Sephadex, 30preferiblemente G-50,
durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante 24 horas. Más preferiblemente, se obtiene por un procedimiento donde el DPPC y el 5 DSPC se encuentran en una relación de masa de aproximadamente 6:4. Aún más preferiblemente el DSPE-PEG y el DSPE-PEG-Maleimida se encuentran a una concentración final del 5 y 10%, respectivamente. Más preferiblemente, el solvente orgánico que consiste en una mezcla de di-etil-éter y cloroformo a aproximadamente el 50%. Más preferiblemente, el ratio en volumen fase 10 orgánica: fase acuosa es de aproximadamente 4:1. Más preferiblemente, el sonicado del paso (c) se hace en un baño sonicador hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, preferiblemente durante 3 a 5 minutos. Aún más preferiblemente, la evaporación de todo el solvente orgánico mediante el rotavapor del paso (d) hasta alcanzar una fase de gel, se realiza a una 15 temperatura de netre 35 y 55 oC, y más preferiblemente de 40°C y a una rotación de entre 100 Y 150 rpm, y más preferiblemente de 120 rpm. Más preferiblemente la sonicación de la muestra del paso (f) se realiza en un baño sonicador a temperatura superior a la de su fase de transición, y preferiblemente a más de 60°C, para controlar el tamaño del nanoliposoma. 20 Más preferiblemente, el nanoliposoma se ajusta a un tamaño medio del el tamaño medio es de entre 75 y 125 nm, preferiblemente de entre 85 y 115 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 95-105 nm. En otra realización preferida, la funcionalización de los nanoliposomas con el 25 péptido se realiza mediante la adición de al menos 100 )lg del péptido, más preferiblemene 125 )lg del péptido, y aún mucho más preferiblemene de al menos 150 )lg del péptido modificado a la muestra de nanoliposomas y manteniéndolo en agitación ya temperatura ambiente más de 10 horas, y más preferiblemente entre 12 y16 horas. Más preferiblemente, el péptido es un 30 neuropéptido, y aún más preferiblemente, el neuropéptido es el VIP. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del nanoliposoma de la invención, para la vehiculización de principios activos.
Se conocen tres receptores de VIP denominados VPAC1, VPAC2 y PAC1. El receptor VPAC1 se expresa en neoplasmas epiteliales malignos, cáncer de pulmón y otros cánceres como son los de estómago, colon, mama, próstata, 5 hígado y vejiga urinaria, mientras que VPAC2 solo se ha encontrado en unos pocos tumores [8]. PAC1, por el contrario, se expresa fundamentalmente en tumores originados en los sistemas neuronales y endocrinos, como pueden ser por ejemplo los tumores gliales (glioblastomas, neuroblastomas, astrocinomas, etc.), o adenomas pituitarios. 10 Por otro lado, los efectos biológicos del neuropéptido VIP tienen un interés creciente por su capacidad moduladora en patologías en las que hay un componente inflamatorio y/o autoinmunitario [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171,4990-4994; Pozo, D. (2003) TrendsMol. Med. 9,211-217; 15 Ganea, D., and Delgado, M. (2002). Grit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003). Trends Immunol. 24,221-224; Pozo et al. (2009). J Immuno/183,4346-4359]. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el 20 principio activo tiene actividad antitumoral. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el principio activo tiene actividad antiinflamatoria. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del nanoliposoma de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que 25 cursan con proliferación celular. En una realización preferida, el nanoliposoma tiene un principio activo, preferiblemente de actividad antitumoral. En otra realización preferida la enfermedad que cursa con proliferación celular se selecciona de la lista que comprende: neoplasmas epiteliales malignos, cáncer de pulmón y otros cánceres como son los de estómago, colon, mama, próstata, 30 hígado y vejiga urinaria. En una realización más preferida, la enfermedad que cursa con proliferación celular es el cáncer de próstata.
Adicionalmente, la funcionalización de nanoliposomas con VIP se enfrenta al problema de diseñar un método eficaz por el que se pueda sintetizar de forma que su extremo carboxilo-terminal quede libre, ya que es por éste extremo por donde interacciona con sus receptores específicos de membrana. Los autores 5 de la presente invención han desarrollado también un procedimiento que permite la funcionalización de VIP en nanoliposomas dejando intacta su capacidad de interacción con sus receptores específicos, lo que permitirá formular estrategias de detección y liberación selectiva in vivo de fármacos sobre células que interese eliminar (caso por ejemplo de las tumorales), o bien 10 expandir (mediante la administración de factores tróficos) en función de la patología que se pretenda abordar. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de nanoliposomas funcional izado con fármacos, que comprende las 15 etapas de: 20 25 30 a. formar un film de lípidos mediante evaporación de fase reversa de un compuesto que comprende ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 11,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y al menos un fosfolípido pegilado, b. añadir el solvente orgánico y la fase acuosa quedando finalmente un ratio de volumen de aproximadamente 4:1 (fase orgánica:fase acuosa), c. someter el sistema de dos fases a sonicación hasta que la muestra aparece dispersa en una sola fase, d. evaporar todo el solvente orgánico mediante un rotavapor hasta obtener una fase de gel, e. convertir el gel en una suspensión acuosa, donde se han formado los I iposomas f. convertir los liposomas de (e) en nanoliposomas mediante sonicación, hasta un tamaño medio menor de 500 nm, preferiblemente de un tamaño medio de 400 nm o menor, y más preferiblemente de un tamaño medio menor de 200 nm,
5 10 g. purifica los nanoliposomas mediante una columna de Sephadex, preferiblemente G-50, h. añadir el péptido a los nanoliposomas del paso (g) y mantener en agitación y temperatura ambiente al menos 10 horas, y preferiblemente entre 12 y 16 horas, y i. purificar la mezcla resultante del paso (h) mediante diálisis frente a agua desionizada durante al menos 15 horas, preferiblemente durante al menos 20 horas, 22 horas, y mucho más preferiblemente, durante 24 horas. Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente 15 proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma 20 modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la 25 técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en disolución acuosa estéril o en fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes 30 antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o
gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz, etc. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, 5 incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral, intranasal o dérmico. 10 La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia, ... del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de principio activo, o de sus sales, profármacos, derivados o análogos, o de sus 15 combinaciones, que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos profármacos, derivados o análogos y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "veh ículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los 20 técnicos en la materia. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción, distribución o acción de cualquiera de los principios activos de la presente invención, estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a la preparación 25 del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función 30 de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
5 10 15 El término excipiente "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Además, el excipiente debe ser farmacéuticamente adecuado, es decir, un excipiente que permita la actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de la presente invención. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a los principios activos 20 de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente. 25 A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y 30 en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: Estructura del neuropéptido péptido intestinal vasoactivo (VIP). 5 Figura 2: Determinación de péptido VIP en la superficie del nanoliposoma cargado con una sustancia biológicamente relevante, en este caso doxorrubicina. Figura 3: Caracterización del tamaño de los naoliposomas mediante Dynamic 10 Light Scattering (DLS). 15 Figura 4: Caracterización funcional de la interacción con receptores VPAC (producción de AMPc, segundo mensajero intracelular del sistema efector/receptor de VIP sobre líneas tumorales de cáncer de próstata. EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los 20 nanoliposomas funcionalizados con VIP en el reconocimiento específico de las células que expresan sus receptores. La producción de AMPc se ha medido mediante un ensayo de bioluminiscencia utilizando el ensayo de Promega cAMP-GLO ™ según las instrucciones del fabricante. Este ensayo está basado en la disminución de la producción de luz 25 acoplado a luciferasa cuando las concentraciones aumentadas de AMPc producen una activación de la proteína kinasa A y una disminución concomitante del ATP disponible para la reacción de detección antes indicada. La gráfica (Fig. 4) de los resultados obtenidos en células DU145 (n=4) (línea 30 celular humana de cáncer de próstata) demuestra una producción de AMPc incrementada específicamente tras estimulación de las mismas durante 30
minutos con nanoliposomas de VIP a una concentración efectiva funcionarizada de VIP de 10-7M.