ES2376734A1 - Improvements introduced in the object of the main patent no. P201000499 by "procedure to alter the development pattern, increase growth and accumulation of starch and alter the structure of starch in plants". (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) - Google Patents
Improvements introduced in the object of the main patent no. P201000499 by "procedure to alter the development pattern, increase growth and accumulation of starch and alter the structure of starch in plants". (Machine-translation by Google Translate, not legally binding) Download PDFInfo
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Abstract
Description
Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal nº P 201000499 por: "Procedimiento para alterar el patrón de desarrollo, y aumentar el crecimiento en plantas".Improvements introduced in the object of the patent Principal No. P 201000499 by: "Procedure to alter the development pattern, and increase plant growth. "
La presente solicitud de adición a la patente principal introduce mejoras en el procedimiento de la invención descrito en la solicitud de patente principal P201000499, perfeccionando la puesta en práctica del procedimiento de la invención referido al incremento del crecimiento de las plantas por acción de volátiles microbianos. Se delimitan los volátiles implicados en el aumento del crecimiento y en la inducción de la floración, mejorando la puesta en práctica del procedimiento de la invención referido al cultivo de plantas en presencia de una atmósfera en la que están presentes compuestos volátiles.The present application for addition to the patent main introduces improvements in the process of the invention described in the main patent application P201000499, perfecting the implementation of the procedure of the invention referred to the increase of plant growth by action of volatile microbial. Volatiles are delimited involved in increasing growth and inducing flowering, improving the implementation of the procedure of the invention relating to the cultivation of plants in the presence of a atmosphere in which volatile compounds are present.
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Hasta la divulgación de las enseñanzas de la solicitud de patente principal P201000499, se conocía poco sobre cómo pueden afectar las emisiones de volátiles microbianos a la fisiología de las plantas en ausencia de contacto físico. Se conocía, por una parte, que microorganismos tales como Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Botrytis cinerea y distintas trufas producen etileno (Splivallo et al., 2007b; New Phytologist 175, 417-424), una hormona gaseosa de plantas que juega importantes papeles en múltiples aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas, incluidos la germinación de semillas, alargamiento del hipocótilo, iniciación de las pilosidades radiculares, la senescencia de hojas y flores, la maduración de los frutos, la acumulación de almidón. Además, recientemente, Splivallo et al. (Splivallo et al. 2009: Plant Physiol. 150, 2018-2029) aportaron evidencias de que el etileno producido por las trufas induce alteraciones en el desarrollo de plantas de Arabidopsis, que presumiblemente van acompañadas por importantes cambios en el metabolismo.Until the dissemination of the teachings of the main patent application P201000499, little was known about how microbial volatile emissions can affect the physiology of plants in the absence of physical contact. It was known, on the one hand, that microorganisms such as Pseudomonas spp., Streptomyces spp., Botrytis cinerea and various truffles produce ethylene (Splivallo et al ., 2007b; New Phytologist 175, 417-424), a gaseous plant hormone that plays important roles in multiple aspects of plant growth and development, including seed germination, hypocotyl lengthening, initiation of root hairs, senescence of leaves and flowers, fruit ripening, starch accumulation. In addition, recently, Splivallo et al . (Splivallo et al . 2009: Plant Physiol. 150, 2018-2029) provided evidence that the ethylene produced by truffles induces alterations in the development of Arabidopsis plants, which are presumably accompanied by significant changes in metabolism.
En lo que se refiere a las bacterias, los escasos trabajos en los que se describía el efecto de volátiles microbianos sobre el crecimiento de plantas giran en torno a un número limitado de cepas especializadas de rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria). Se denomina rizobacterias a ciertas bacterias simbiontes que existen en el suelo y que colonizan las raíces de las plantas. La mayor parte de las cepas cuyo cultivo da lugar a un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas cultivadas en su presencia, sin necesidad de contacto físico, pertenecen al género Bacillus o un género estrechamente relacionado con éste, Paenibacillus, al cual pertenecen bacterias que en el pasado fueron clasificadas como pertenecientes al género Bacillus. Así, por ejemplo, se ha demostrado que volátiles emitidos por rizobacterias de cepas pertenecientes a las especies Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens o Bacillus cepacia promueven el crecimiento de plantas de Arabidopsis, facilitando la toma de nutrientes, la fotosíntesis y la respuesta de defensa, y disminuyendo la sensibilidad a la glucosa y los niveles de ácido abscísico (Ryu et al. 2003: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932; Ryu et al. 2004: Plant Phylio 134, 1017-1026; Vespermann et al. 2007; Appl. Environ. Microbiol. 73, 5639-5641, Xie et al. 2009: Plant Signal. Behav. 10, 948-953). En concreto, Ryu et al. (Ryu et al. 2003:: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932) describen que los volátiles orgánicos liberados por cepas específicas de PGPR, concretamente Bacillus subtilis GB03 y Bacillus amyloliquefaciens IN937a, son capaces de provocar un incremento del crecimiento de plántulas de Arabidopsis thaliana. El efecto se observa cuando las citadas cepas de bacterias son cultivadas en el medio rico en aminoácidos agar con tripticasa de soja, en esas condiciones, ambas bacterias liberan 3-hidroxi-2-butanona (acetoína) y 2,3-butanediol. Dichos compuestos parecen ser los responsables del efecto observado, porque no son emitidos por las otras PGPR ensayadas que no mostraban efectos sobre el crecimiento de las plantas, pero, sin embargo, sí son liberados por otras cepas bacterianas con capacidad de incrementar la germinación y el crecimiento de plantas. Tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis WG6-14, objeto de la solicitud de patente US 2008/0152684 A1, que produce los mismos volátiles y es capaz de incrementar el crecimiento y la germinación de plantas como Brassica oleraceo sin existir contacto físico entre planta y bacteria. Sin embargo, existen muchas bacterias liberadoras de estas mismas sustancias (algunas pertenecientes al género Bacillus) que no promueven el crecimiento de la planta.As far as bacteria are concerned, the scarce work in which the effect of microbial volatiles on plant growth was described revolves around a limited number of specialized strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR: plant growth promoting rhizobacteria ). Rhizobacteria are called certain symbiont bacteria that exist in the soil and colonize the roots of plants. Most of the strains whose cultivation gives rise to a positive effect on the growth of plants grown in their presence, without the need for physical contact, belong to the genus Bacillus or a genus closely related to it, Paenibacillus , to which bacteria belong. in the past they were classified as belonging to the genus Bacillus . Thus, for example, it has been shown that volatiles emitted by rhizobacteria from strains belonging to the species Bacillus subtilis , Bacillus amyloliquefaciens or Bacillus cepacia promote the growth of Arabidopsis plants, facilitating nutrient intake, photosynthesis and defense response, and decreasing glucose sensitivity and abscisic acid levels (Ryu et al . 2003: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932; Ryu et al . 2004: Plant Phylio 134, 1017-1026; Vespermann et al . 2007; Appl. Environ. Microbiol. 73, 5639-5641, Xie et al . 2009: Plant Signal. Behav. 10, 948-953). Specifically, Ryu et al . (Ryu et al . 2003 :: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4927-4932) describe that the volatile organic released by specific PGPR strains, namely Bacillus subtilis GB03 and Bacillus amyloliquefaciens IN937a, are capable of causing an increase of the growth of Arabidopsis thaliana seedlings. The effect is observed when the aforementioned bacterial strains are grown in the medium rich in agar amino acids with soy tripticase, under these conditions, both bacteria release 3-hydroxy-2-butanone (acetoin) and 2,3-butanediol. These compounds seem to be responsible for the observed effect, because they are not emitted by the other PGPRs tested that showed no effects on plant growth, but, nevertheless, they are released by other bacterial strains capable of increasing germination and plant growth Such is the case of the Bacillus subtilis strain WG6-14, object of the patent application US 2008/0152684 A1, which produces the same volatiles and is capable of increasing the growth and germination of plants such as Brassica oleraceo without physical contact between plant and bacteria. However, there are many bacteria that release these same substances (some belonging to the genus Bacillus ) that do not promote plant growth.
Se han descrito también otras cepas de los géneros Bacillus o Paenibacillus que emiten volátiles capaces de promover el crecimiento de distintas plantas pero, en estos casos, el efecto parece estar ligado principalmente a la capacidad de controlar el crecimiento de patógenos que están afectando a la planta. Tal es el caso, por ejemplo, del bacilo Kyu-W63 descrito en la patente japonesa JP10033064, cuyos volátiles son capaces de controlar la patopoyesis debida a la presencia de hongos del género Cercospora en hojas de pepino, facilitando con ello el crecimiento de la planta. La descripción sugiere que el efecto podría ser similar utilizando otras bacterias filamentosas, siempre y cuando el cultivo se produzca en un medio rico en azúcares tal como el agar PDA, medio que no se define con más detalle; tampoco se dan pruebas que demuestren la influencia del medio sugerido o la aplicabilidad del método para cualquier otra bacteria filamentosa.Other strains of the genera Bacillus or Paenibacillus that emit volatile capable of promoting the growth of different plants have been described but, in these cases, the effect seems to be mainly linked to the ability to control the growth of pathogens that are affecting the plant . Such is the case, for example, of the bacillus Kyu-W63 described in Japanese patent JP10033064, whose volatiles are capable of controlling pathopoiesis due to the presence of fungi of the Cercospora genus in cucumber leaves, thereby facilitating plant growth . The description suggests that the effect could be similar using other filamentous bacteria, as long as the culture occurs in a medium rich in sugars such as PDA agar, medium that is not defined in more detail; There is also no evidence to show the influence of the suggested medium or the applicability of the method to any other filamentous bacteria.
También el método para incrementar el crecimiento de plantas, basado en composiciones que comprenden un metabolito volátil producido por una bacteria, que se reivindica en la solicitud de patente coreana KR20090066412, alude de forma combinada a la inducción de protección contra enfermedades y el ataque de insectos y a la promoción del crecimiento de distintas plantas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Como ejemplos de posibles metabolitos útiles se citan 3-acetil-1-propanol, 3-metil-1-butanol, indol, acetato de isoamilo y acetato de butilo. El resumen menciona que los posibles microorganismos que dan lugar a un metabolito volátil con el efecto buscado comprenden bacterias pertenecientes a los géneros Bacillus o Paenibacillus, siendo una cepa de la especie Paenibacillus polymyxa el microorganismo preferido.Also the method for increasing plant growth, based on compositions comprising a volatile metabolite produced by a bacterium, which is claimed in the Korean patent application KR20090066412, alludes in combination to the induction of disease protection and insect attack. and to the promotion of the growth of different monocotyledonous and dicotyledonous plants. Examples of possible useful metabolites are 3-acetyl-1-propanol, 3-methyl-1-butanol, indole, isoamyl acetate and butyl acetate. The summary mentions that the possible microorganisms that give rise to a volatile metabolite with the desired effect include bacteria belonging to the Bacillus or Paenibacillus genera, with a strain of the species Paenibacillus polymyxa being the preferred microorganism.
En la solicitud de patente principal P201000499, se divulgaba el descubrimiento de que, al crecer plantas en presencia de cualquier tipo de microorganismo (bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, levaduras u hongos), los volátiles emitidos por el microorganismo dan lugar a que se produzca una alteración el patrón de desarrollo y un aumento en el crecimiento, la fertilidad y el peso seco de las plantas, que iba acompañado de un incremento en la acumulación de almidón en las mismas. Estos efectos se observan tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas (Arabidopsis, maíz, cebada, tabaco, patata...), y son independientes de que el microorganismo sea o no patógeno para la planta y de que pertenezca o no a una especie que no convive con la planta en condiciones naturales. Estos efectos se observan tanto si las plantas se cultivan in vitro como en tierra, siempre y cuando la planta se cultive en presencia de un cultivo de un microorganismo que emita volátiles o bien en presencia de los volátiles microbianos emitidos por el microorganismo y, preferiblemente, cuando el microorganismo se hacía crecer en un medio que carezca de compuestos orgánicos que presenten grupos amino, especialmente si el medio carece de aminoácidos, tal como los medios mínimos suplementados con al menos un compuesto orgánico como fuente de carbono. Dado que la aparición de los efectos descritos no requería de contacto físico entre la planta y el microorganismo, se concluía que los volátiles eran los responsables de los efectos observados.In the main patent application P201000499, the discovery was disclosed that, when growing plants in the presence of any type of microorganism (Gram-positive or Gram-negative bacteria, yeasts or fungi), the volatiles emitted by the microorganism give rise to there is an alteration in the development pattern and an increase in the growth, fertility and dry weight of the plants, which was accompanied by an increase in the accumulation of starch in them. These effects are observed in both monocotyledonous and dicotyledonous plants ( Arabidopsis , corn, barley, tobacco, potatoes ...), and are independent of whether or not the microorganism is pathogenic for the plant and whether or not it belongs to a species that does not coexists with the plant in natural conditions. These effects are observed whether the plants are grown in vitro or on land, as long as the plant is grown in the presence of a microorganism culture that emits volatile or in the presence of microbial volatiles emitted by the microorganism and, preferably, when the microorganism was grown in a medium that lacks organic compounds that have amino groups, especially if the medium lacks amino acids, such as the minimum media supplemented with at least one organic compound as a carbon source. Since the appearance of the described effects did not require physical contact between the plant and the microorganism, it was concluded that volatiles were responsible for the observed effects.
Por ello, entre otros aspectos, la solicitud P201000499 divulgaba un método para incrementar la biomasa de una planta caracterizado por que la planta se cultiva en una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles emitidos por un microorganismo, microorganismo que podía haber sido cultivado en un lugar diferente al lugar de cultivo de la planta, recogiéndose la mezcla de volátiles emitidos por el mismo y cultivándose la planta en una atmósfera en la que estuvieran presentes esos volátiles. Sin embargo, la solicitud de patente principal P201000499 no mencionaba si, entre todos los volátiles emitidos por los distintos microorganismos, existían volátiles que fueran responsables del efecto de aumento del crecimiento de las plantas y otros que fueran responsables del efecto de incremento del almidón acumulado por las mismas, o si ambos efectos eran debidos a los mismos volátiles. El cultivo de plantas en atmósferas en las que estén presentes volátiles producidos por microorganismos, en ausencia de dichos microorganismos, podría verse facilitado si se dilucidara si ambos efectos se deben o no a los mismos compuestos y cuáles son los compuestos concretos responsables de cada uno de los efectos. La presente solicitud de adición supone una mejora con respecto a la solicitud de patente principal, pues da una respuesta a este problema.Therefore, among other aspects, the request P201000499 disclosed a method to increase the biomass of a plant characterized by the fact that the plant is grown in an atmosphere in which volatile compounds emitted by a microorganism, microorganism that could have been grown in a different place to the plant cultivation place, collecting the mixture of volatiles emitted by it and growing the plant in an atmosphere where those volatiles were present. Without However, the main patent application P201000499 did not mention yes, among all the volatiles emitted by the different microorganisms, there were volatiles that were responsible for growth effect of plants and others that were responsible for the effect of increased starch accumulated by same, or if both effects were due to the same volatiles. He cultivation of plants in atmospheres in which they are present volatile produced by microorganisms, in the absence of such microorganisms, could be facilitated if elucidated if both effects are due or not to the same compounds and what are the specific compounds responsible for each of the effects. The This request for addition implies an improvement over the main patent application, as it gives an answer to this trouble.
La solicitud P201000499, además, divulgaba cuáles eran las modificaciones en el metabolismo de las plantas mediante las cuales los volátiles microbianos provocan el incremento de la acumulación de almidón. Aprovechando ese conocimiento, la solicitud P201000499 divulga un método alternativo para incrementar la acumulación de almidón en plantas, consistente en provocar la acumulación mediante el uso de plantas transgénicas, en las que el transgén o transgenes expresado(s) en sentido da(n) lugar a la sobreexpresión de alguna de las enzimas reguladas al alza por la exposición a los volátiles o en las que el transgén o transgenes expresado(s) en antisentido da(n) lugar a la reducción de la expresión de alguna de las enzimas reguladas a la baja por la exposición de los volátiles o en las que el transgén o trangenes consiste(n) en uno o más inhibidores de la actividad o de la expresión de alguna de las enzimas reguladas a la baja. Así, otro aspecto alternativo de la invención expuesta en la solicitud P201000499 es un método para incrementar incrementar la producción de almidón de una planta, caracterizado porque la planta es una planta transgénica en la que está presente al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado del grupo de: un| inhibidor de proteasas de plantas (tal como, por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank DQ16832), la enzima ramificante del almidón, un inhibidor de la invertasa ácida (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691928), un RNA antisentido dirigido contra la cisteína sintasa (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la cisteína sintasa de la planta de patata, con número de acceso en GenBank AB029512), un RNA antisentido dirigido contra la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa plastidial (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691929), un RNA antisentido dirigido contra la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa plastidial (que puede deducirse, por ejemplo, a partir de la secuencia correspondiente a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de patata, con número de acceso en GenBank X83923) o un RNA antisentido dirigido contra la nitrito reductasa (tal como por ejemplo, el que presenta el número de acceso en GenBank FN691930). Son realizaciones preferidas aquéllas en las que la planta expresa al menos un transgén cuya expresión da lugar a un producto seleccionado de grupo de: inhibidor de proteasas de plantas, un RNA antisentido dirigido contra la cisteína sintasa o un RNA antisentido dirigido contra la nitrito reductasa. Aunque se identifican perfectamente los genes preferidos para llevar a cabo ese aspecto de la invención, la solicitud de patente principal P201000499 no proporcionaba ejemplos de vectores con los que generar las plantas transgénicas. La presente solicitud de patente de adición aporta también una mejora en ese aspecto, pues proporciona plásmidos válidos para generar las plantas transgénicas indicadas.The application P201000499 also disclosed what were the changes in plant metabolism whereby the microbial volatiles cause the increase of the accumulation of starch. Taking advantage of that knowledge, the application P201000499 discloses an alternative method to increase the accumulation of starch in plants, consisting in causing the accumulation through the use of transgenic plants, in which the transgene or transgenes expressed (s) in the sense of (n) place to overexpression of some of the upregulated enzymes by exposure to volatiles or in which the transgene or transgenes expressed in antisense gives rise to the reduction of the expression of some of the enzymes regulated to the low by exposure of volatiles or in which the transgene or trangenes consists of one or more inhibitors of the activity or expression of any of the enzymes regulated to the low. Thus, another alternative aspect of the invention set forth in the application P201000499 is a method to increase increase the starch production of a plant, characterized in that the plant it is a transgenic plant in which at least one transgene whose expression gives rise to a product selected from group of: a | plant protease inhibitor (such as, by example, the one that presents the access number in GenBank DQ16832), the branching starch enzyme, an acid invertase inhibitor (such as the one that presents the access number in GenBank FN691928), an antisense RNA directed against cysteine synthase (which can be deduced, for example, from the sequence corresponding to the cysteine synthase of the potato plant, with GenBank accession number AB029512), a targeted antisense RNA against glyceraldehyde-3-phosphate plastidial dehydrogenase (such as, for example, the one presenting the GenBank accession number FN691929), a targeted antisense RNA against glucose-6-phosphate plastidial dehydrogenase (which can be deduced, for example, from from the sequence corresponding to the glucose-6-phosphate dehydrogenase potato, with access number in GenBank X83923) or an antisense RNA directed against nitrite reductase (such as for example, which presents the access number in GenBank FN691930). Are realizations preferred those in which the plant expresses at least one transgene whose expression gives rise to a product selected from group of: plant protease inhibitor, a targeted antisense RNA against cysteine synthase or an antisense RNA directed against nitrite reductase Although genes are perfectly identified preferred for carrying out that aspect of the invention, the main patent application P201000499 did not provide examples of vectors with which to generate transgenic plants. The This application for an addition patent also provides an improvement in that regard, it provides valid plasmids to generate the Transgenic plants indicated.
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Las mejoras de la presente solicitud de adición
están relacionadas, en un primer aspecto, con el descubrimiento de
que no todos los volátiles producidos por los microorganismos tienen
capacidad de influir sobre el incremento de la biomasa y la
acumulación de almidón observada en las plantas que crecen en
atmósferas en las que estén presentes dichos volátiles. En la
presente solicitud de adición, se describe, además, que algunos
volátiles que eran conocidos en el estado de la técnica como
compuestos capaces de promover el crecimiento de las plantas, no
afectan al contenido de almidón acumulado por las mismas. Sin
embargo, se identifican otros compuestos volátiles, tales como el
ácido propiónico, el ácido acético, el acetaldehído, el ácido
fórmico y el ácido butírico, que tienen un efecto positivo sobre la
acumulación de almidón, y que parecen tenerlo igualmente sobre el
crecimiento, la biomasa y la inducción de la floración: ése es el
caso, por ejemplo, del ácido fórmico, para el cual se muestran
ensayos que demuestran su capacidad de incrementar la acumulación
de almidón y, también, el crecimiento de la planta. Además, se
aportan datos que indican que su efecto es dependiente de dosis.
Esto permite perfeccionar el método de incremento de la cantidad de
almidón acumulada por una planta al crecerla en presencia de
volátiles microbianos, identificando volátiles concretos que son
capaces de producir ese efecto, así como el método para incrementar
el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo en
el que la planta se cultiva en presencia de volátiles emitidos por
un microorganismo, creando igualmente ejemplos de compuestos
volátiles que puedan dar lugar a ese efecto, compuestos que son los
mismos que los compuestos volátiles válidos para dar lugar al
aumento de la acumulación de almidón en una planta completa. De esta
manera, la aplicación de cualquiera de estos métodos de la invención
no necesita la presencia de un cultivo de un microorganismo en el
lugar de cultivo de la planta, sino que es posible elegir uno o más
compuestos volátiles que no necesariamente tienen que haber sido
emitidos por un microorganismo, sino que puede tener otro origen y
puede hacerse presente en la atmósfera de cultivo de la planta por
otros diversos medios, desde la presencia en el lugar de cultivo de
una disolución desde la cual se evapora el compuesto o por
insuflarse al lugar de cultivo la atmósfera desde el exterior de
dicho lugar de cultivo, conteniendo ya el compuesto volátil como
parte de la atmósfera insuflada, o porque el propio compuesto
volátil se administre a la atmósfera del lugar de cultivo de la
planta desde el
exterior.The improvements of the present application for addition are related, in a first aspect, to the discovery that not all volatiles produced by microorganisms have the capacity to influence the increase in biomass and the accumulation of starch observed in growing plants in atmospheres in which these volatiles are present. In the present application for addition, it is further described that some volatiles that were known in the state of the art as compounds capable of promoting plant growth do not affect the starch content accumulated by them. However, other volatile compounds are identified, such as propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid, which have a positive effect on the accumulation of starch, and which also seem to have it on growth, biomass and the induction of flowering: this is the case, for example, of formic acid, for which tests are shown that demonstrate its ability to increase the accumulation of starch and, also, the growth of the plant. In addition, data are provided indicating that its effect is dose dependent. This makes it possible to improve the method of increasing the amount of starch accumulated by a plant by growing it in the presence of microbial volatiles, identifying specific volatiles that are capable of producing that effect, as well as the method to increase the growth of a plant and / or alter its development pattern in which the plant is grown in the presence of volatile emitted by a microorganism, also creating examples of volatile compounds that can give rise to that effect, compounds that are the same as the volatile compounds valid to give rise to the increase in Starch accumulation in a complete plant. Thus, the application of any of these methods of the invention does not require the presence of a culture of a microorganism at the plant's cultivation site, but it is possible to choose one or more volatile compounds that do not necessarily have to have been emitted by a microorganism, but may have another origin and may be present in the plant's culture atmosphere by various other means, from the presence at the place of cultivation of a solution from which the compound evaporates or by insufflation. place of cultivation the atmosphere from the outside of said place of cultivation, already containing the volatile compound as part of the insufflated atmosphere, or because the volatile compound itself is administered to the atmosphere of the plant cultivation place from the
Exterior.
Así, en un primer aspecto, las mejoras de la presente solicitud de adición se refieren a un método para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo caracterizado por que la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos un compuesto volátil que se selecciona entre ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico y ácido butírico. De entre ellos, se tiene especial preferencia por el ácido fórmico. En una posible realización de este aspecto de las mejoras de la invención, el compuesto volátil está presente en la atmósfera por evaporación de una disolución que lo contiene que se encuentra en el lugar de cultivo de la planta. En otra posible realización, el compuesto volátil se suministra a la atmósfera de cultivo. En cualquiera de los casos, como se describía en la solicitud de patente principal P201000499, el incremento del crecimiento puede manifestarse en aumento de la longitud de la planta y/o en aumento del tamaño de las hojas, y la alteración del patrón de crecimiento puede manifestarse en incremento del número de hojas, incremento del número de ramas y/o del número de flores y semillas de plantas angiospermas, en la inducción de la floración, o en combinaciones de los anteriores.Thus, in a first aspect, the improvements of the present request for addition refer to a method for increase the growth of a plant and / or alter its pattern of development characterized by the fact that the plant is grown in a atmosphere in which at least one volatile compound is present that is selected from propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid. Among them, you have special preference for formic acid. In a possible embodiment of this aspect of the improvements of the invention, the volatile compound is present in the atmosphere by evaporation of a solution that It contains that it is in the place of cultivation of the plant. In Another possible embodiment, the volatile compound is supplied to the cultivation atmosphere In either case, as described in the main patent application P201000499, the increase in growth may manifest itself in increasing the length of the plant and / or increasing the size of the leaves, and the alteration of the growth pattern may manifest itself in increasing the number of leaves, increase in the number of branches and / or the number of flowers and angiosperm plant seeds, in the induction of flowering, or in combinations of the above.
En un segundo aspecto, las mejoras se refieren a un método para incrementar la cantidad de almidón acumulado en una planta, caracterizado porque la planta se cultiva en una atmósfera en la que está presente al menos un compuesto volátil que se selecciona entre ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico y ácido butírico. Como en el caso anterior, en una posible realización de este aspecto de las mejoras de la invención, el compuesto volátil está presente en la atmósfera por evaporación de una disolución que lo contiene que se encuentra en el lugar de cultivo de la planta. En otra posible realización, el compuesto volátil se suministra a la atmósfera de cultivo.In a second aspect, the improvements refer to a method to increase the amount of starch accumulated in a plant, characterized in that the plant is grown in an atmosphere in which at least one volatile compound is present which is select from propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid. As in the previous case, in a possible realization of this aspect of the improvements of the invention, the volatile compound is present in the atmosphere by evaporation of a solution that contains it that is in the place of plant cultivation In another possible embodiment, the compound Volatile is supplied to the culture atmosphere.
Por otra parte, la presente solicitud de adición a patente principal proporciona plásmidos adecuados para generar las plantas transgénicas propuestas en la solicitud de patente principal P201000499. Así, en un aspecto más, las mejoras de la invención se refieren a un método para incrementar la producción de almidón en una planta, caracterizado por que el método incluye una etapa en el que se introduce un transgén en una planta mediante un plásmido que comprende al menos una secuencia que se selecciona entre las representadas por SEQ ID NO:1 (secuencia codificante del inhibidor de proteinasas, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de forma que su expresión se produzca en el sentido que da lugar a la proteína natural), SEQ ID NO:3 (secuencia codificante de la nitrito reductasa, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de tal forma que su expresión se produzca en antisentido) y SEQ ID NO: 5 (secuencia codificante de la cisteína sintasa, secuencia que debe ir unida operativamente a un promotor de tal forma que su expresión se produzca en antisentido). El plásmido puede ser utilizado para transformación biolística de las plantas o mediante Agrobacterium tumefaciens. Se prefiere particularmente que el plásmido contenga secuencias Tnos. En otra posible realización del método de incremento de la acumulación de almidón mediante el uso de plantas transgénicas, la secuencia codificante representada por SEQ ID NO:1, la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:3 o la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:5 está unida operativamente al promotor constitutivo S35 del virus del mosaico de la colifor (CaMV). Se prefiere que el plásmido comprenda al menos un marcador de selección, que puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, tal como kanamicina, cloranfenicol, ampiclina, zeomicina o higromicina y, más preferiblemente, que comprende al menos dos marcadores de selección, tales como, por ejemplo, un gen que confiere resistencia a kanacimina y un gen que confiere resistencia a higromicina. Una posible realización del método de incremento de la producción mediante el uso de plantas transgénicas consistiría en utilizar al menos uno de los plásmidos cuyo proceso de obtención se describe en el Ejemplo 4 de la presente invención, es decir, un plásmido que comprende la secuencia representada por SEQ ID NO:1, la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:3 ó la secuencia antisentido a la representada por SEQ ID NO:5, operativamente unida al promotor 35S de CaMV, que adicionalmente comprende secuencias Tnos de Agrobacterium tumefaciens, un gen de resistencia a kanamicina y un gen de resistencia a higromicina.On the other hand, the present application for addition to the main patent provides suitable plasmids to generate the transgenic plants proposed in the main patent application P201000499. Thus, in a further aspect, the improvements of the invention refer to a method for increasing the production of starch in a plant, characterized in that the method includes a stage in which a transgene is introduced into a plant by means of a plasmid comprising at least one sequence that is selected from those represented by SEQ ID NO: 1 (coding sequence of the proteinase inhibitor, sequence that must be operatively linked to a promoter so that its expression occurs in the sense that gives rise to the natural protein ), SEQ ID NO: 3 (sequence coding for nitrite reductase, sequence that must be operatively linked to a promoter so that its expression occurs in antisense) and SEQ ID NO: 5 (sequence coding for cysteine synthase, sequence which must be operatively linked to a promoter so that its expression occurs in antisense). The plasmid can be used for biolistic transformation of plants or by Agrobacterium tumefaciens . It is particularly preferred that the plasmid contains T nos sequences. In another possible embodiment of the method of increasing starch accumulation through the use of transgenic plants, the coding sequence represented by SEQ ID NO: 1, the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 3 or the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 5 is operatively linked to the constitutive promoter S35 of the cauliflower mosaic virus (CaMV). It is preferred that the plasmid comprises at least one selection marker, which may be an antibiotic resistance gene, such as kanamycin, chloramphenicol, ampicline, zeomycin or hygromycin and, more preferably, comprising at least two selection markers, such as, for example, a gene that confers resistance to kanacimine and a gene that confers resistance to hygromycin. A possible embodiment of the method of increasing production through the use of transgenic plants would be to use at least one of the plasmids whose production process is described in Example 4 of the present invention, that is, a plasmid comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1, the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 3 or the antisense sequence to that represented by SEQ ID NO: 5, operably linked to the 35S promoter of CaMV, which additionally comprises T nos sequences of Agrobacterium tumefaciens , a kanamycin resistance gene and a hygromycin resistance gene.
Por último, merece mencionarse que la presente solicitud de adición a patente principal divulga ensayos en los que se demuestra que el amonio, cuando las plantas se cultivan en una atmósfera en la que dicho compuesto está presente, es responsable de la despigmentación de las plantas y de la inhibición de su crecimiento. Este resultado refuerza la idea, expuesta en la solicitud de patente principal P201000499, de que los microorganismos cultivados en medios ricos en aminoácidos (y, en general, de compuestos orgánicos que presenten grupos amino), producen volátiles (amonio) que inhiben el crecimiento; tales compuestos, sin embargo, no se producen cuando los microorganismos son cultivados en medios mínimos tales como el M9 o MOPS, que carecen de aminoácidos. Este hallazgo refuerza la utilidad de ciertas realizaciones del método de la invención para incrementar el crecimiento de una planta y/o alterar su patrón de desarrollo en el que la planta se cultiva en presencia de un cultivo de un microorganismo que produce compuestos volátiles, sin que exista contacto entre la planta y el microorganismo: aquellas realizaciones en las que el crecimiento del microorganismo se produce en un medio que carece compuestos orgánicos que presenten grupos amino, particularmente aminoácidos y/o proteínas, especialmente cuando el crecimiento del microorganismo se produce en un medio mínimo suplementado con un compuesto orgánico como fuente de carbono.Finally, it is worth mentioning that this application for addition to main patent discloses trials in which it is shown that ammonium, when plants are grown in a atmosphere in which said compound is present, is responsible for depigmentation of plants and inhibition of their increase. This result reinforces the idea, set out in the main patent application P201000499, that the microorganisms grown in amino acid-rich media (and, in in general, of organic compounds having amino groups), produce volatiles (ammonium) that inhibit growth; such Compounds, however, do not occur when microorganisms they are grown in minimal media such as M9 or MOPS, which They lack amino acids. This finding reinforces the usefulness of certain embodiments of the method of the invention to increase the plant growth and / or alter its development pattern in the that the plant is grown in the presence of a crop of a microorganism that produces volatile compounds, without existing contact between the plant and the microorganism: those embodiments in which the growth of the microorganism occurs in a medium lacking organic compounds that have amino groups, particularly amino acids and / or proteins, especially when the microorganism growth occurs in a minimal medium supplemented with an organic compound as a carbon source.
Las mejoras de la invención se describen ahora con más detalle por medio de las Figuras y Ejemplos que se presentan a continuación.The improvements of the invention are now described. in more detail through the Figures and Examples presented then.
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Fig. 1: Cuantificación del almidón obtenido de plantas de Arabidopsis thaliana incubadas en presencia de distintos compuestos volátiles:Fig. 1: Quantification of starch obtained from Arabidopsis thaliana plants incubated in the presence of different volatile compounds:
- Panel A: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles que se indican bajo cada una de las barras (indol, DTT (ditiotreitol), NAA (ácido 1-naftalenoacético), \beta-mercaptoetanol, ácido salicílico, ácido jasmónico, cisteína, acetoína, etileno, etanol, metanol, \beta-hidroxibutirato, butanediol, ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico o ácido butírico), por evaporación de una disolución que los contiene.- Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which the volatile compounds indicated under each of the bars (indole, DTT (dithiothreitol), NAA (1-naphthalenoacetic acid) are present ), β-mercaptoethanol, salicylic acid, jasmonic acid, cysteine, acetoin, ethylene, ethanol, methanol, β-hydroxybutyrate, butanediol, propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid or butyric acid), by evaporation of a solution that contains them.
- Panel B: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en una atmósfera en la que están presentes los compuestos volátiles que se indican bajo cada grupo de barras (ácido propiónico, ácido acético, ácido fórmico, ácido butírico), por evaporación de una disolución que los contiene en el porcentaje, expresado en volumen/volumen, que se indica mediante un número bajo cada una de las barras.- Panel B: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which the volatile compounds indicated under each group of bars are present (propionic acid, acetic acid, formic acid, butyric acid), by evaporation of a solution that contains them in the percentage, expressed in volume / volume, which is indicated by a number under each of the bars.
En ambos casos, el almidón se expresa como micromoles (\mumol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW).In both cases, starch is expressed as micromoles (µm) of glucose per gram of fresh weight (FW).
Fig. 2: Fotografía de plantas de Arabidopsis control y plantas cultivadas durante 4 días en MS sólido dentro de una caja de plástico de 500 centímetros cúbicos junto a una disolución de 2 centímetros cúbicos al 0,2% de ácido fórmico. Claramente, la presencia de ácido fórmico promueve el crecimiento de la planta y la floración.Fig. 2: Photograph of control Arabidopsis plants and plants grown for 4 days in solid MS inside a 500 cubic centimeter plastic box next to a solution of 2 cubic centimeters at 0.2% formic acid. Clearly, the presence of formic acid promotes plant growth and flowering.
Fig. 3: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis, cultivadas en una atmósfera en la que están presentes o ausentes (control) los compuestos volátiles producidos por un cultivo de Escherichia coli existente en la misma caja sellada, sin que exista contacto físico con la planta, dependiendo de si el cultivo de Escherichia coli es de tipo silvestre (barras con la leyenda WT) o un mutante con una deleción en el gen de la piruvato quinasa F (barras con la leyenda \DeltapykF). El almidón se expresa como micromoles (\mumol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW).Fig. 3: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis plants, grown in an atmosphere in which volatile compounds produced by an existing Escherichia coli culture in the same sealed box are present or absent (control), without existing physical contact with the plant, depending on whether the culture of Escherichia coli is wild type (bars with the legend WT) or a mutant with a deletion in the pyruvate kinase F gene (bars with the legend Δ pykF ). Starch is expressed as micromoles (µmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).
Fig. 4: Cinética de la acumulación de almidón y del balance entre la concentración de ácido 3-fosfoglicérico (3PGA) y ortofosfato (Pi) en plantas de Arabidopsis thaliana.Fig. 4: Kinetics of starch accumulation and balance between the concentration of 3-phosphoglyceric acid (3PGA) and orthophosphate (Pi) in Arabidopsis thaliana plants.
- Panel A: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luz o a la oscuridad y ausencia o presencia de volátiles fúngicos. La barra blanca bajo el gráfico indica período de luz (16 primeras horas), mientras que la barra con relleno oscuro indica período de oscuridad (6 horas siguientes). El almidón se expresa como micromoles (\mumol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW).- Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa, exposure to light or darkness and absence or presence of fungal volatiles. The white bar below the graph indicates light period (first 16 hours), while the dark filled bar indicates darkness period (next 6 hours). Starch is expressed as micromoles (µmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).
- Panel B: relación entre la concentración de ácido 3-fosfoglicérico (3PGA) y ácido fosfórico (Pi) según las horas de cultivo transcurridas.- Panel B: relationship between the concentration of 3-phosphoglyceric acid (3PGA) and phosphoric acid (Pi) according to the hours of cultivation elapsed.
En ambos paneles, los símbolos situados sobre cada una de las curvas indican las condiciones de cultivo, de la siguiente manera: Círculos negros: cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante todo el día (las 16 horas de luz y las 8 horas de oscuridad); círculos sin relleno: cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante las 16 horas de luz; ausencia de volátiles fúngicos durante las 8 horas de oscuridad; cuadrados con relleno oscuro: cultivo sin volátiles, incluso durante el período de luz; triángulos con relleno oscuro: cultivo con volátiles, en ausencia de luz durante las 24 horas de cultivo.On both panels, the symbols located above each of the curves indicates the growing conditions of the next way: Black circles: cultivation in the presence of volatiles fungal throughout the day (16 hours of light and 8 hours of darkness); unfilled circles: culture in the presence of volatiles fungal during the 16 hours of light; absence of fungal volatiles during the 8 hours of darkness; squares with dark fill: culture without volatiles, even during the light period; triangles with dark fill: volatile culture, in the absence of light during the 24 hours of cultivation.
Fig. 5: Cinética de la acumulación de almidón y de la actividad de la enzima sacarosa sintasa (SuSy) en plantas de patata.Fig. 5: Kinetics of starch accumulation and of the activity of sucrose synthase enzyme (SuSy) in plants potato.
- Panel A: cuantificación del contenido de almidón en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luz y a volátiles fúngicos producidos por un cultivo de Alternaria alternata. El almidón se expresa como micromoles (\mumol) de glucosa por gramo de peso fresco (FW).- Panel A: quantification of starch content in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa, exposure to light and fungal volatiles produced by a culture of Alternaria alternata . Starch is expressed as micromoles (µmol) of glucose per gram of fresh weight (FW).
- Panel B: cuantificación de la actividad de la enzima sacarosa sintasa (SuSy), expresada en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco (FW), detectada en hojas de plantas de Arabidopsis thaliana según el tiempo transcurrido, expresado en horas en abscisas, de exposición a la luz y a volátiles fúngicos producidos por un cultivo de Alternaria alternata.- Panel B: quantification of the activity of sucrose synthase enzyme (SuSy), expressed in milliunits (mU) per gram of fresh weight (FW), detected in leaves of Arabidopsis thaliana plants according to the elapsed time, expressed in hours in abscissa , exposure to light and volatile fungi produced by a culture of Alternaria alternata .
Fig. 6: Cinética de acumulación de almidón en hojas cortadas de Arabidopsis incubadas en placas de Petri con MS sólido con 90 mM sacarosa y en presencia o ausencia de 50 \muM de cicloheximida (Sigma) o 200 \muM de cordicepina (Sigma). Las placas fueron depositadas en una caja de 500 centímetros cúbicos en la que previamente se había introducido un cultivo de A. alternata.Fig. 6: Starch accumulation kinetics in cut Arabidopsis leaves incubated in Petri dishes with solid MS with 90 mM sucrose and in the presence or absence of 50 µM cycloheximide (Sigma) or 200 µM cordicepine (Sigma). The plates were deposited in a box of 500 cubic centimeters in which a culture of A. alternata had previously been introduced.
Fig. 7: Proceso de obtención de plásmidos útiles para la transformación de plantas mediante la tecnología Gateway, que contienen las secuencias codificantes que se indican en la parte superior izquierda de los esquemas, a partir de productos de PCR que incorporan las secuencias de reconocimiento de recombinasa attB1 y attB2. Panel A: inhibidor de proteasas; Panel B: nitrito reductasa en antisentido; Panel C: cisteína sintasa en antisentido.Fig. 7: Process for obtaining useful plasmids for plant transformation using Gateway technology, containing the coding sequences indicated in the part upper left of the schemes, from PCR products which incorporate the attB1 recombinase recognition sequences and attB2. Panel A: protease inhibitor; Panel B: nitrite reductase in antisense; Panel C: cysteine synthase in antisense.
Fig. 8: Fotografías de plantas de Arabidopsis cultivadas durante 4 días en MS sólido dentro de una caja de plástico de 500 centímetros cúbicos junto a 2 centímetros cúbicos de agua (fotografía superior, marcada como 0%) o 2 centímetros cúbicos de una disolución acuosa de amoníaco al 2% (fotografía intermedia) o al 5% (fotografía inferior), v/v.. Claramente, la presencia de amoníaco conlleva a una despigmentación de las hojas e inhibe el crecimiento de las plantas.Fig. 8: Photographs of Arabidopsis plants grown for 4 days in solid MS in a plastic box of 500 cubic centimeters next to 2 cubic centimeters of water (top photograph, marked 0%) or 2 cubic centimeters of an aqueous solution 2% ammonia (intermediate photo) or 5% (lower photo), v / v .. Clearly, the presence of ammonia leads to depigmentation of the leaves and inhibits plant growth.
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- Ejemplo 1- Example one
Con el fin de dilucidar si las mezclas de volátiles producidos por microorganismos contenían compuestos específicos responsables del aumento del crecimiento y compuestos responsables del incremento de la acumulación de almidón, o si existían compuestos capaces de producir ambos efectos, se llevaron a cabo ensayos de cultivos de plantas de Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) similares a los que se llevaron a cabo en la solicitud de patente principal, aunque sustituyendo los cultivos microbianos por disoluciones de los volátiles a ensayar. Para ello, las plantas se cultivaron en placas Petri que contenían medio MS sólido con sacarosa 90 mM. Las plantas germinaron y se hicieron crecer durante dos semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 16 h de luz (300 \mumol fotones s^{-1} m^{-2}) y a una temperatura constante de 24ºC.In order to elucidate whether the volatile mixtures produced by microorganisms contained specific compounds responsible for growth growth and compounds responsible for the increase in starch accumulation, or if there were compounds capable of producing both effects, culture tests were carried out. Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) plants similar to those carried out in the main patent application, although replacing microbial cultures with solutions of the volatiles to be tested. For this, the plants were grown in Petri dishes containing solid MS medium with 90 mM sucrose. The plants germinated and were grown for two weeks in growth chambers with a photoperiod of 16 h of light (300 µm photons s -1 m -2) and at a constant temperature of 24 ° C.
Las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladas se colocaron en cajas de cultivo de 500 centímetro cúbicos idénticas a las utilizadas en la solicitud de patente principal, con la diferencia de que en dichas cajas, en lugar de cultivos microbianos, se introdujeron, en cada caso, placas de petri que contenían 2 centímetros cúbicos de disoluciones acuosas al 5% de uno de los siguientes compuestos: indol, DTT (ditiotreitol), NAA (ácido 1-naftalenoacético), \beta-mercaptoetanol, ácido salicílico, ácido jasmónico, cisteína, acetoína, etanol, metanol, \beta-hidroxibutirato, butanediol, ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído, ácido fórmico o ácido butírico, sin que existiera contacto físico entre la planta y la disolución. El etileno se aportó en forma de polvos de etefón. Las cajas se sellaron y las hojas se recogieron tras dos días de incubación para realizar el análisis del contenido de almidón. Las hojas se recogieron al final de período de luz. Como control negativo, las placas Petri que contenían plantas completamente desarrolladas se cultivaron durante dos días en cajas de plástico selladas junto con una placa de Petri que contenía 2 centímetros cúbicos de agua en ausencia de cualquiera de los compuestos volátiles ensayados.Petri dishes containing plants Fully developed were placed in 500 culture boxes cubic centimeters identical to those used in the application for main patent, with the difference that in these boxes, in instead of microbial cultures, plates were introduced in each case petri dishes containing 2 cubic centimeters of aqueous solutions 5% of one of the following compounds: indole, DTT (dithiothreitol), NAA (1-naphthalenoacetic acid), β-mercaptoethanol, salicylic acid, acid jasmonic, cysteine, acetoin, ethanol, methanol, β-hydroxybutyrate, butanediol, acid propionic, acetic acid, acetaldehyde, formic acid or acid butyric, without physical contact between the plant and the dissolution. Ethylene was supplied as ethephon powders. The boxes were sealed and the leaves were collected after two days of incubation to perform the analysis of starch content. The Leaves were collected at the end of the light period. As control negative, the Petri dishes that contained plants completely developed were grown for two days in plastic boxes sealed together with a petri dish containing 2 centimeters cubic of water in the absence of any of the compounds volatile tested.
El almidón se midió utilizando un kit de ensayo basado en la amiloglucosidasa (Boehringer Mannheim, Alemania).Starch was measured using an assay kit based on amyloglucosidase (Boehringer Mannheim, Germany).
Los resultados obtenido se muestran en la Fig. 1A.The results obtained are shown in Fig. 1A.
Tal como se ilustra en la misma, ni la acetoína ni el butanediol, compuestos previamente implicados en aumento del crecimiento de las plantas, están implicados en MIVOISAP ( mi crobial vo látiles induced s tarch a ccumulation p rocess: proceso de acumulación de almidón inducido por volátiles microbianos). Como se comentó previamente, ambas sustancias volátiles son emitidas por algunos aislados del género Bacillus y ambas están implicadas en la promoción del crecimiento de las plantas ejercido por estos microorganismos. Esto demuestra que MIVOISAP no tiene nada que ver con la promoción del crecimiento por productos neutros, tales como la acetoína y el butanediol, que son producidos por algunos microorganismos a partir del ácido pirúvico como alternativa a las vías de metabolización de este compuesto, sino que está determinado por algunas sustancias ácidas procedentes también de la metabolización del ácido pirúvico siguiendo rutas metabólicas diferentes tales como acetato, ácido fórmico, etc.As illustrated therein, nor acetoin and butanediol, compounds previously implicated in increased plant growth, they are involved in MIVOISAP (I vo crobial látiles i nduced s TARCH to ccumulation P rocess: process starch accumulation induced by volatile microbials). As previously mentioned, both volatile substances are emitted by some isolates of the genus Bacillus and both are involved in promoting the growth of plants exerted by these microorganisms. This shows that MIVOISAP has nothing to do with the promotion of growth by neutral products, such as acetoin and butanediol, which are produced by some microorganisms from pyruvic acid as an alternative to the metabolic pathways of this compound, but that It is determined by some acidic substances also from the metabolism of pyruvic acid following different metabolic pathways such as acetate, formic acid, etc.
De todas las sustancias volátiles analizadas, sólo el ácido propiónico, el ácido acético, el acetaldehído, el ácido fórmico y el ácido butírico promueven la sobreacumulación del almidón. Además, disoluciones al 0.2% de ácido fórmico promueven el crecimiento y floración de la planta (Fig. 2), lo cual indica fuertemente que el efecto MIVOISAP divulgado en la patente principal P201000499 (consistente en el incremento de la acumulación de almidón, incremento del crecimiento y modificaciones en el patrón de crecimiento entre las que se incluye la inducción de la floración) es debido la liberación de pequeñas cantidades de estas sustancias ácidas por parte de los microorganismos.Of all the volatile substances analyzed, only propionic acid, acetic acid, acetaldehyde, formic acid and butyric acid promote over-accumulation of starch. In addition, 0.2% solutions of formic acid promote plant growth and flowering (Fig. 2), which indicates strongly that the MIVOISAP effect disclosed in the patent main P201000499 (consisting of the accumulation increase of starch, growth increase and changes in growth pattern, including induction of flowering) is due to the release of small amounts of these acidic substances by microorganisms.
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Para demostrar si este efecto era dependiente de la dosis del compuesto, se repitió el ensayo del apartado anterior, creciendo las plantas en presencia de disoluciones acuosas de 2 centímetros cúbicos de ácido propiónico, ácido acético, acetaldehído o ácido butírico, ensayando para cada uno de ellos tres concentraciones diferentes, cada uno en distintas cajas: al 1%, 2% ó 5% (v/v).To demonstrate whether this effect was dependent on the dose of the compound, the test of the previous section was repeated, growing plants in the presence of aqueous solutions of 2 cubic centimeters of propionic acid, acetic acid, acetaldehyde or butyric acid, testing for each of them three different concentrations, each in different boxes: 1%, 2% or 5% (v / v).
Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 1B. El ensayo corrobora el efecto positivo sobre la acumulación de almidón de estos compuestos y, además, demuestra que el efecto es dependiente de la dosis del compuesto volátil presente.The results obtained are shown in Fig. 1 B. The trial corroborates the positive effect on the accumulation of starch of these compounds and also demonstrates that the effect is dose dependent of the volatile compound present.
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- Ejemplo 2- Example 2
Tal como se divulga en la solicitud de patente principal P201000499, el incremento en la acumulación de almidón se observa cuando las plantas se cultivan en presencia de distintos microorganismos capaces de producir volátiles: bacterias, levaduras y mohos. Entre ellos, el cultivo de plantas de Arabidopsis thaliana en presencia de un cultivo de la bacteria Escherichia coli BW25113 mostraba igualmente el efecto de incremento de acumulación del almidón, cuando dicha bacteria se cultivó en placas Petri que contenían medio mínimo M9 sólido (95 mM Na_{2}HPO_{4}/44 mM KH_{2}PO_{4}/17 mM NaCl/37 mM NH_{4}Cl/0,1 mM CaCl_{2}/2 mM MgSO_{4}, agar bacteriológico al 1,5%) suplementado con glucosa 50 mM.As disclosed in the main patent application P201000499, the increase in starch accumulation is observed when plants are grown in the presence of different microorganisms capable of producing volatiles: bacteria, yeasts and molds. Among them, the cultivation of Arabidopsis thaliana plants in the presence of a culture of the Escherichia coli BW25113 bacterium also showed the effect of increasing starch accumulation, when said bacterium was cultured in Petri dishes containing minimum solid M9 medium (95 mM Na_ {2} HPO 4/44 mM KH 2 PO 4/17 mM NaCl / 37 mM NH 4 Cl / 0.1 mM CaCl 2/2 mM MgSO 4, bacteriological agar 1.5%) supplemented with 50 mM glucose.
Para corroborar los resultados obtenidos en el
Ejemplo 1 de la presente solicitud de adición a la patente
principal P201000499, se procedió a repetir el ensayo de medida de
la acumulación de almidón por mezclas de volátiles producidos por
microorganismos, utilizando una cepa mutante de Escherichia
coli, E. coli \DeltapykF (Baba, T., Ara, T.,
Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K. A.,
Tomita, M., Wanner, B. L. and Mori, H. (2006) Construction of
Escherichia coli K-12 in frame,
single-gene knockout mutants: the Keio collection.
Mol. Syst. Biol. doi; 10.1038/msb4100050), que es mutante en el gen
pykF que codifica para la piruvato quinasa y que, debido a
ello, produce menos cantidades de piruvato y, en consecuencia,
también menor cantidad de sustancias tales como ácido fórmico, ácido
acético, ácido propiónico, ácido láctico y acetaldehído que las
cepas silvestres de
E. coli.In order to corroborate the results obtained in Example 1 of the present application for addition to the main patent P201000499, the test for measuring the accumulation of starch by mixtures of volatiles produced by microorganisms was repeated, using a mutant strain of Escherichia coli , E. coli ? PykF (Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL and Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. Doi; 10.1038 / msb4100050), which is mutant in the pykF gene that codes for Pyruvate kinase and that, because of this, produces fewer amounts of pyruvate and, consequently, also a smaller amount of substances such as formic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid and acetaldehyde than the wild strains of
E. coli .
Así, se repitió el ensayo del Ejemplo 1 anterior, aunque en este caso las plantas se colocaron en cajas de plástico estériles de 500 centímetros cúbicos que contenían cultivos microbianos de Escherichia coli BW25113 (control de cepa silvestre) o bien de Escherichia coli \DeltapykF.Thus, the test of Example 1 above was repeated, although in this case the plants were placed in sterile 500 cubic centimeter plastic boxes containing microbial cultures of Escherichia coli BW25113 (wild strain control) or Escherichia coli \ Delta pykF .
Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 3. En la misma se demuestra que este mutante, con defectos en la síntesis de ácido pirúvico y compuestos derivados de su metabolismo tales como el ácido acético, el ácido fórmico, el ácido propiónico o el acetaldehído, ejerce un efecto parcial en MIVOISAP.The results obtained are shown in Fig. 3. It shows that this mutant, with defects in the synthesis of pyruvic acid and compounds derived from its metabolism such as acetic acid, formic acid, propionic acid or Acetaldehyde exerts a partial effect on MIVOISAP.
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- Ejemplo 3- Example 3
Para investigar (a) cómo se producía la
acumulación de almidón a lo largo del tiempo desde el momento de
exposición a los volátiles microbianos, (b) la posible implicación
de mecanismos de regulación a nivel transcripcional y
post-transcripcional del proceso y (c) la influencia
que la luz pudiera tener en la acumulación, se realizaron ensayos de
cinética de acumulación de almidón en dos plantas diferentes:
Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) y patata (Solanum
tuberosum L. cv Desirée). Como en el Ejemplo 1, las plantas se
cultivaron en placas Petri que contenían medio MS sólido con
sacarosa 90 mM, Las plantas se hicieron crecer en cámaras de
crecimiento con un fotoperíodo de 16 h de luz (300 \mumol fotones
s^{-1} m^{-2}), 8 horas de oscuridad y a una temperatura
constante de 24ºC. Tras aproximadamente 2 semanas de crecimiento
después del momento de la germinación, las plantas se colocaron en
cajas de plástico de 500 centímetros cúbicos en las que previamente
se había introducido cultivos de Alternaria alternata en
placas Petri que contenían medio MS sólido suplementado con sacarosa
90 mM. A los tiempos indicados en las Figs. 4 y 5 se recolectaron
las hojas para posteriores análisis del contenido de almidón, 3PGA,
Pi y actividad
SuSy.To investigate (a) how starch accumulation occurred over time from the time of exposure to microbial volatiles, (b) the possible involvement of regulatory mechanisms at the transcriptional and post-transcriptional level of the process and (c) the influence that light could have on the accumulation, tests of starch accumulation kinetics were carried out in two different plants: Arabidopsis thaliana (cv. Columbia) and potato ( Solanum tuberosum L. cv Desirée). As in Example 1, the plants were grown on Petri dishes containing solid MS medium with 90 mM sucrose. The plants were grown in growth chambers with a 16 h photoperiod of light (300 µm photons s -1 m -2), 8 hours of darkness and at a constant temperature of 24 ° C. After approximately 2 weeks of growth after germination, the plants were placed in plastic boxes of 500 cubic centimeters in which previously Alternaria alternata cultures had been introduced in Petri dishes containing solid MS medium supplemented with 90 mM sucrose. At the times indicated in Figs. 4 and 5 the leaves were collected for subsequent analysis of starch content, 3PGA, Pi and activity
Suy
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Se llevó a cabo la incubación de las plantas de Arabidopsis thaliana como se ha comentado en la introducción, con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad (salvo en uno de los ensayos en los que el paso de la luz fue evitado envolviendo la caja de plástico con papel de aluminio), utilizando varias condiciones de presencia o ausencia de cultivo Alternaria alternata y, por tanto, de presencia o ausencia de volátiles microbianos, dando lugar a los gráficos que se representan en la Fig. 4. Las condiciones fueron las siguientes:The incubation of Arabidopsis thaliana plants was carried out as mentioned in the introduction, with 16 hours of light and 8 hours of darkness (except in one of the trials in which the passage of light was avoided by wrapping the box of plastic with aluminum foil), using various conditions of presence or absence of Alternaria alternata culture and, therefore, of presence or absence of microbial volatiles, giving rise to the graphs shown in Fig. 4. The conditions were following:
- --
- Cultivo en presencia de volátiles fúngico durante todo el día (las 16 horas de luz y las 8 horas de oscuridad) (curva con círculos negros en el gráfico).Cultivation in the presence of volatiles fungal throughout the day (16 hours of light and 8 hours of darkness) (curve with black circles on the graph).
- --
- Cultivo en presencia de volátiles fúngicos durante las 16 horas de luz; ausencia de volátiles fúngicos durante las 8 horas de oscuridad (curva con círculos sin relleno en el gráfico).Cultivation in the presence of volatiles fungal during the 16 hours of light; absence of fungal volatiles during the 8 hours of darkness (curve with unfilled circles in the graphic).
- --
- Cultivo sin volátiles, incluso durante el período de luz (curva con cuadrados rellenos en el gráfico).Cultivation without volatiles, even during the light period (curve with filled squares in the graphic).
- --
- Cultivo con volátiles, en ausencia de luz durante las 16 primeras horas de cultivo. Aunque el cultivo tuvo lugar durante el período de 16 horas de iluminación, la caja de plástico fue envuelta en papel de aluminio, evitando así el contacto con la luz.Cultivation with volatiles, in the absence of light during the first 16 hours of cultivation. Although the crop had place during the period of 16 hours of lighting, the box plastic was wrapped in foil, thus avoiding contact with the light.
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Los resultados obtenidos al evaluar el almidón
acumulado (Fig. 4A) muestran que en ausencia de luz, incluso en
presencia de volátiles y sacarosa en el medio de cultivo de la
planta, no hay síntesis de almidón. En presencia de luz sin
volátiles microbianos la tasa de acumulación de almidón es de
aproximadamente 8 nanomoles de glucosa transferida al almidón por
gramo de peso fresco y minuto. En presencia de luz y volátiles
microbianos, durante las 2 primeras horas de cultivo la tasa de
acumulación de almidón es de aproximadamente 100 nanomoles de
glucosa transferida al almidón por gramo de peso fresco y minuto.
Tras 2 horas de incubación de las hojas en presencia de volátiles
microbianos, la tasa de acumulación de almidón es de aproximadamente
500 nanomoles de glucosa transferida al almidón por gramo de peso
fresco y minuto. Concluidas las 16 horas de luz, la ausencia de la
misma hace disminuir el almidón
acumulado.The results obtained when evaluating the accumulated starch (Fig. 4A) show that in the absence of light, even in the presence of volatiles and sucrose in the plant's culture medium, there is no starch synthesis. In the presence of light without microbial volatiles, the starch accumulation rate is approximately 8 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. In the presence of light and volatile microbials, during the first 2 hours of cultivation the starch accumulation rate is approximately 100 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. After 2 hours of incubation of the leaves in the presence of microbial volatiles, the starch accumulation rate is approximately 500 nanomoles of glucose transferred to the starch per gram of fresh weight and minute. Concluded the 16 hours of light, the absence of it reduces starch
accumulated.
Los resultados demuestran la conexión existente entre los procesos metabólicos implicados en MIVOISAP y la luz.The results demonstrate the existing connection between the metabolic processes involved in MIVOISAP and light.
Adicionalmente, haciendo uso de las plantas
cultivadas en las mismas condiciones, se comprobó el balance
3PGA/
Pi según se describe en Muñoz et al., 2005:
Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376.
3-PGA (ácido 3-fosfoglicérico) es un
activador alostérico de la ADPglucosa pirofosforilasa, mientras que
el ortofosfato (Pi) es un regulador negativo de esta enzima
implicada en la producción plastidial de ADPglucosa. Los resultados
se muestran en la Fig. 4B, en la que puede observarse que la
relación 3PGA/Pi se incrementa en el caso de plantas cultivadas en
presencia de luz con volátiles fúngicos; la curva parece indicar,
además, una relación entre el incremento de almidón y el incremento
con el tiempo del valor obtenido de esta relación. En cambio, en
ausencia de volátiles y presencia de luz, o en presencia de
volátiles y ausencia de luz, los valores obtenidos a lo largo de
tiempo vienen a ser similares para los dos tipos de condiciones de
cultivo, con pequeñas oscilaciones a lo largo del tiempo. Los
resultados presentados en la Fig. 4B parecen indicar que MIVOISAP es
debido, al menos en parte, a mecanismos de regulación
post-transcripcional tales como la activación
alostérica de la ADPglucosa pirofosforilasa.Additionally, using the cultivated plants under the same conditions, the 3PGA / balance was checked
Pi as described in Muñoz et al ., 2005: Plant Cell Physiol. 46: 1366-1376. 3-PGA (3-phosphoglyceric acid) is an allosteric activator of ADPglucose pyrophosphorylase, while orthophosphate (Pi) is a negative regulator of this enzyme involved in the plastidial production of ADPglucose. The results are shown in Fig. 4B, in which it can be seen that the 3PGA / Pi ratio is increased in the case of plants grown in the presence of light with fungal volatiles; The curve also seems to indicate a relationship between the increase in starch and the increase in time of the value obtained from this relationship. In contrast, in the absence of volatiles and presence of light, or in the presence of volatiles and absence of light, the values obtained over time become similar for the two types of growing conditions, with small oscillations along the weather. The results presented in Fig. 4B seem to indicate that MIVOISAP is due, at least in part, to post-transcriptional regulation mechanisms such as the allosteric activation of ADPglucose pyrophosphorylase.
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Se repitió el experimento del apartado 3.1., utilizando en este caso plantas de patata. En este caso, se midió la acumulación de almidón durante las 16 horas de luz y, adicionalmente, se comprobó también la actividad de la enzima sacarosa sintasa (Susy).The experiment in section 3.1 was repeated., using in this case potato plants. In this case, the starch accumulation during the 16 hours of light and, additionally, the activity of the enzyme was also checked sucrose synthase (Susy).
La medida de la actividad de la enzima SuSy se realizó de forma idéntica a la descrita en la solicitud de patente principal. Brevemente, 1 g de polvo congelado de hoja se resuspendió a 4ºC en 5 ml de HEPES 100 mM (pH 7,5) y EDTA 2 mM. La suspensión se desaló y se ensayó en ella la actividad enzimática, tal como ha sido descrito por Baroja-Fernández et al. (Baroja Fernández et al., 2009: Plant Cell Physiol. 50: 1651-1662).The measurement of the activity of the SuSy enzyme was performed identically to that described in the main patent application. Briefly, 1 g of frozen leaf powder was resuspended at 4 ° C in 5 ml of 100 mM HEPES (pH 7.5) and 2 mM EDTA. The suspension was desalted and enzyme activity was tested therein, as described by Baroja-Fernández et al . (Baroja Fernández et al ., 2009: Plant Cell Physiol. 50: 1651-1662).
Los resultados se representan en la Fig. 5, en la que aparecen sólo los datos correspondientes a plantas incubadas en presencia de luz y de volátiles fúngicos. El panel A corresponde a la acumulación de almidón y el panel B a la actividad de SuSy.The results are represented in Fig. 5, in which only the data corresponding to incubated plants appear in the presence of light and fungal volatiles. Panel A corresponds to the accumulation of starch and panel B to the activity of SuSy.
Los datos obtenidos demuestran que existen mecanismos transcripcionales (incremento de la expresión de SuSy) que regulan MIVOISAP.The data obtained show that there are transcriptional mechanisms (increased expression of SuSy) that regulate MIVOISAP.
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Se repitió el experimento del apartado 3.1, utilizando en este caso hojas cortadas de Arabidopsis incubadas en placas de Petri con medio MS sólido suplementado con 90 mM sacarosa y, en su caso, con 50 micromolar (\muM) del inhibidor de traducción cicloheximida (Sigma) y 200 micromolar (\muM) del inhibidor de transcripción cordicepina (Sigma) (Fritz, C.C. et al., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4458-4462; Hayashi, T. and Takagi, S., 2003; Plant Cell Physiol. 44: 1027-1036; Dhonukshe et al., 2006: Developmental Cell 10: 137-150). Las placas fueron depositadas en cajas de 500 centímetros cúbicos en las que previamente se habían depositado cultivos de Alternaria alternata. Los resultados presentados en la Fig. 6 según los cuales ambas sustancias inhiben fuertemente la acumulación de almidón a partir de las 2 horas de incubación en presencia de volátiles fúngicos emitidos por Alternaria alternata sugieren aún más que MIVOISAP está regulado, al menos en parte, transcripcionalmente.The experiment in section 3.1 was repeated, using in this case cut sheets of Arabidopsis incubated in Petri dishes with solid MS medium supplemented with 90 mM sucrose and, where appropriate, with 50 micromolar (µM) of the cycloheximide translation inhibitor (Sigma ) and 200 micromolar (µM) of the cordicepine transcription inhibitor (Sigma) (Fritz, CC et al ., 1991: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4458-4462; Hayashi, T. and Takagi, S. , 2003; Plant Cell Physiol. 44: 1027-1036; Dhonukshe et al ., 2006: Developmental Cell 10: 137-150). The plates were deposited in boxes of 500 cubic centimeters in which previously Alternaria alternata cultures had been deposited. The results presented in Fig. 6 according to which both substances strongly inhibit the accumulation of starch after 2 hours of incubation in the presence of fungal volatiles emitted by Alternaria alternata further suggest that MIVOISAP is regulated, at least in part, transcriptionally .
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- Ejemplo 4- Example 4
MIVOISAP está regulado transcripcionalmente. Por lo tanto, tal como se ha comentado previamente, la reproducción mediante transgénesis de los cambios metabólicos inducidos por MIVOISAP debería dar lugar a plantas transgénicas en las que la acumulación de almidón se incrementara con respecto a las plantas de tipo silvestre de la misma especie. Para producir esas plantas, ese necesario contar con vectores adecuados.MIVOISAP is transcriptionally regulated. By therefore, as previously mentioned, the reproduction by transgenesis of metabolic changes induced by MIVOISAP should lead to transgenic plants in which the Starch accumulation will increase with respect to the plants of wild type of the same species. To produce those plants, that It is necessary to have adequate vectors.
Para ello, se recurrió al protocolo Gateway de
construcciones de vectores para la transformación de plantas
(Nakagawa et al., 2007: Journal of Bioscience and
Bioingeneering 104: 34-41), que se basa en la
inserción de fragmentos de secuencias de ADN bicatenario en sitios
específicos de vectores, aprovechando las propiedades específicas de
sitio del bacteriófago lambda, el uso de recombinasas y en la
presencia de secuencias de reconocimiento para las mismas tanto en
el fragmento a insertar, como en los vectores en los que desea
insertarse. El proceso requiere la presencia de secuencias de
recombinación de ADN del fago lambda (sitios att) flanqueando, por
una parte, el fragmento que se quiere insertar, y por otra, la
presencia de las secuencias att complementarias en el vector en el
que se desee insertar dicho fragmento de ADN. El proceso requiere,
necesaria, la presencia de la recombinasa capaz de reconocer las
secuencias att del fragmento que se quiere insertar (attB: attB1 y
attB2, equivalentes a los sitios que se encuentran de manera natural
en el genoma de E. coli) y las correspondientes secuencias
en el vector en el que se desean insertar (attP: attP1 y attP2,
respectivamente, correspondientes a las secuencias presentes en el
bacteriófago lambda). La recombinasa reconocerá ambos pares de
secuencias y producirá la inserción del fragmento de ADN en el
vector, entre las secuencias attP1 y attP2; el empalme se produce de
tal forma que desaparecen en las secuencias attB y attP, generándose
en el vector recombinante secuencias attL (attL1 y attL2); este paso
sería el equivalente a la inserción del bacteriófago lambda en el
genoma de la bacteria. Si estas secuencias, a su vez, son
reconocidas por una segunda recombinasa, una segunda reacción de
recombinación en presencia de un vector que poseyera la pareja
complementaria de sitios att reconocidos por esa segunda recombinasa
(attR: attR1 y attR2), permitiría un segundo evento de
recombinación.For this, the Gateway protocol of vector constructs for plant transformation was used (Nakagawa et al ., 2007: Journal of Bioscience and Bioingeneering 104: 34-41), which is based on the insertion of double stranded DNA sequence fragments at specific vector sites, taking advantage of the specific site properties of the bacteriophage lambda, the use of recombinases and in the presence of recognition sequences for them both in the fragment to be inserted, and in the vectors in which it wishes to be inserted. The process requires the presence of recombination sequences of lambda phage DNA (att sites) flanking, on the one hand, the fragment to be inserted, and on the other, the presence of complementary att sequences in the vector in which it is desired insert said DNA fragment. The process requires, necessarily, the presence of the recombinase capable of recognizing the att sequences of the fragment to be inserted (attB: attB1 and attB2, equivalent to the sites that are naturally found in the E. coli genome) and corresponding sequences in the vector in which they wish to be inserted (attP: attP1 and attP2, respectively, corresponding to the sequences present in the bacteriophage lambda). The recombinase will recognize both pairs of sequences and will produce the insertion of the DNA fragment into the vector, between the attP1 and attP2 sequences; splicing occurs in such a way that they disappear in the attB and attP sequences, generating attL sequences (attL1 and attL2) in the recombinant vector; This step would be the equivalent to the insertion of the bacteriophage lambda into the genome of the bacterium. If these sequences, in turn, are recognized by a second recombinase, a second recombination reaction in the presence of a vector possessing the complementary pair of att sites recognized by that second recombinase (attR: attR1 and attR2), would allow a second event from
recombination
En el presente ejemplo, se recurrió al uso de la tecnología Gateway, de Invitrogen, siguiendo las instrucciones del fabricante (protocolo de Gateway® Technology: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/Gateway-Cloning/GatewayC-Misc/Protocols.html#bp). Para producir las construcciones necesarias para expresar en antisentido la nitrito reductasa y la cisteína sintasa plastidial, se partió del vector comercial pDONR/Zeo, de Invitrogen, que posee las secuencias de recombinación attP1 y attP2, y de productos de PCR que poseían, en 5', una secuencia attB2 y en 3' una secuencia attB1, tal como puede observarse en las Fig. 7B (nitrito reductasa en antisentido) y 7C (cisteína sintasa en antisentido). En el caso de la construcción necesaria para expresar el inhibidor de la proteasa, el producto de PCR poseía en el extremo 5' una secuencia attB1 y en el extremo 3' una secuencia attB2 (Fig. 7A). Estos productos de PCR se obtienen realizando las reacciones de PCR con cebadores attB: Los cebadores attB se diseñan con la siguiente disposición:In the present example, the use of Invitrogen Gateway technology was used, following the manufacturer's instructions (Gateway® Technology protocol: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and -Services / Applications / Cloning / Gateway-Cloning / GatewayC-Misc / Protocols.html # bp ). In order to produce the constructions necessary to express nitrite reductase and plastidial cysteine synthase in antisense, the commercial vector pDONR / Zeo, from Invitrogen, which possesses the attP1 and attP2 recombination sequences, and PCR products that possessed, in 5 ', an attB2 sequence and in 3' an attB1 sequence, as can be seen in Fig. 7B (antisense nitrite reductase) and 7C (antisense cysteine synthase). In the case of the construction necessary to express the protease inhibitor, the PCR product possessed at the 5 'end an attB1 sequence and at the 3' end an attB2 sequence (Fig. 7A). These PCR products are obtained by performing the PCR reactions with attB primers: The attB primers are designed with the following arrangement:
Cebador para la inserción de la secuencia attB1:Primer for sequence insertion attB1:
- 5'-GGG-ACA-AGT-TTG-TAC- AAA-AAA -GCA-GGC-TNN- (secuencia específica para el molde de ADN a amplificar)-3'5'-GGG- ACA-AGT-TTG-TAC- AAA-AAA -GCA-GGC-T NN- (specific sequence for the DNA template to be amplified) -3 '
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Cebador para la inserción de la secuencia attB2:Primer for sequence insertion attB2:
- 5'-GGGG-AC-CAC- TTT-GTA -CAA-GAA-AGC-TGG-GTN- (secuencia específica para el molde de ADN a amplificar)-3'5'-GGGG- AC-CAC- TTT-GTA -CAA-GAA-AGC-TGG-GT N- (specific sequence for the DNA template to be amplified) -3 '
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En ambos casos, el fragmento subrayado representa a las secuencias attB1 y attB2 propiamente dichas y N representa cualquier nucleótido.In both cases, the underlined fragment represents the sequences attB1 and attB2 proper and N It represents any nucleotide.
Esta misma estrategia se siguió para la amplificación de los fragmentos de ADN codificantes correspondientes a los genes de la planta de patata (Solanum tuberosum) del inhibidor de proteasas (SEQ ID NO:1), nitrito reductasa en antisentido (SEQ ID NO:3) y cisteína sintasa en antisentido (SEQ ID NO:5). Los cebadores específicos utilizados en cada caso fueron los siguientes:This same strategy was followed for the amplification of the coding DNA fragments corresponding to the genes of the potato plant ( Solanum tuberosum ) of the protease inhibitor (SEQ ID NO: 1), nitrite reductase in antisense (SEQ ID NO: 3) and cysteine synthase in antisense (SEQ ID NO: 5). The specific primers used in each case were the following:
Los fragmentos de las secuencias en negrita son los correspondientes a los genes amplificados, mientras que las partes subrayadas corresponden a las secuencias attB1 (secuencias con número de orden impar) o a las secuencias attB2 (secuencias con número de orden par).The fragments of the sequences in bold are those corresponding to the amplified genes, while the underlined parts correspond to the attB1 sequences (sequences with odd order number) or attB2 sequences (sequences with even order number).
De esta forma, se amplificaron las secuencias bicatenarias representadas por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5. Las secuencias que codifican para la nitrito reductasa y la cisteína sintasa (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:5, respectivamente), presentaban en su extremo 5' una secuencia attB2 y en su extremo 3' una secuencia attB1, mientras que la secuencia que codifica para al inhibidor de proteasas presentaba en su extremo 5' una secuencia attB1 y en su extremo 3' una secuencia attB2.In this way, the sequences were amplified double-stranded represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5. The sequences encoding nitrite reductase and the cysteine synthase (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, respectively), presented at its 5 'end an attB2 sequence and at its 3' end an attB1 sequence, while the sequence coding for the protease inhibitor presented at its 5 'end a sequence attB1 and at its 3 'end an attB2 sequence.
El protocolo de inserción de estos fragmentos en plásmidos Gateway se basa en llevar a cabo dos reacciones de recombinación sucesivas; reacciónBP (para producir el vector de introducción) y reacción LR (que da lugar al vector de expresión) siguiendo las instrucciones del fabricante, Invitrogen). Para ello, se partió en todos los casos del vector comercial pDON/Zeo (Invitrogen; estructura. Pág. 50 del Protocolo de Gateway® Technology), que contiene entre los sitios de recombinación attP un gen de resistencia a cloranfenicol (Cm^{R}) y la secuencia del gen ccdB. Fuera de la región de recombinación presenta un gen de resistencia a zeocina (Zeo^{R}), bajo el control del promotor de EM7 que permite la selección de las bacterias transformadas con este vector. La incubación de las secuencias bicatenarias representadas por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 ó SEQ ID NO:5, flanqueadas por las correspondientes secuencias attB, con dicho factor pDON/Zeo, en presencia de la BP Clonasa® de Invitrogen, siguiendo las indicaciones del fabricante (pág. 22 del Protocolo de Gateway® Technology) dio lugar a un vector de recombinación en el que el fragmento de ADN bicatenario deseado había quedado insertado entre las secuencias attP1 y attP2 del plásmido, generando secuencias attL1 y attL2 y haciendo desaparecer el fragmento en el que se encontraban los genes de resistencia a cloranfenicol y el gen ccdB (plásmidos: pDONR Prot-Inhb, pDONR NR y pDONR Cys-Synth, respectivamente). Cada uno de estos plásmidos se amplificó tras su transformación en células competentes E. coli TOP 10, seleccionando las transformantes mediante el uso de la resistencia a zeocina conferida por el plásmido.The protocol for inserting these fragments into Gateway plasmids is based on carrying out two successive recombination reactions; BP reaction (to produce the introduction vector) and LR reaction (which gives rise to the expression vector) following the manufacturer's instructions, Invitrogen). To this end, the commercial vector pDON / Zeo (Invitrogen; structure. Page 50 of the Gateway® Technology Protocol) was split in all cases, which contains a chloramphenicol resistance gene (Cm R between the attP recombination sites) }) and the ccd B sequence. Outside the recombination region it has a zeocin resistance gene (ZeoR), under the control of the EM7 promoter that allows the selection of bacteria transformed with this vector. The incubation of the double stranded sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, flanked by the corresponding attB sequences, with said pDON / Zeo factor, in the presence of Invitrogen BP Clonasa®, Following the manufacturer's instructions (page 22 of the Gateway® Technology Protocol) it resulted in a recombination vector in which the desired double stranded DNA fragment had been inserted between the attP1 and attP2 sequences of the plasmid, generating attL1 and attL2 sequences and disappearing the fragment in which the chloramphenicol resistance genes and ccd B gene were found (plasmids: pDONR Prot-Inhb, pDONR NR and pDONR Cys-Synth, respectively). Each of these plasmids was amplified after transformation into competent E. coli TOP 10 cells, selecting the transformants by using the zeocin resistance conferred by the plasmid.
Una vez amplificado el plásmido recombinante, se llevó a cabo su inserción en el plásmido pGWB2 (Nakagawa T, Kurose T, Hiño T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K, Matsuoka K, Jinbo T, Kimura T. 2007 Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusión genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104(1): 34-41), que contiene las secuencias de recombinación attR1 y attR2, que permiten la inserción entre las mismas de un fragmento flanqueado por secuencias attL1 y attL2 en presencia de la recombinasa LR Clonase® (Invitrogen). Este vector permite la expresión constitutiva de secuencias codificantes mediante el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). Este vector posee dos marcadores de selección de plantas transformadas: el gen de la higromicina fosfotransferasa (Hyg) bajo el control del promotor 35S de CaMV, y un gen de resistencia a kanamicina (Kan) bajo el control del promotor Nos. Las secuencias attR1 y attR2 flanquean un fragmento del vector en el que se encuentran los genes ccdB y cat, que serán reemplazados por los genes de interés después de la reacción de recombinación llevada a cabo por la recombinasa LR. La reacción de recombinación da lugar a la inserción del gen de interés entre las secuencias attR1 y attR2, regenerándose las secuencias attB1 y attB2 flanqueando los extremos del gen de interés y perdiéndose los genes ccdB y cat, pero manteniendo el plásmido final el gen de resistencia a kanamicina (Kan) y el gen de la higromicina fosfotransferasa (Hyg). Cuando Agrobacterium tumefaciens transforma una célula vegetal va a transferir al genoma de la planta un fragmento de ADN del plásmido pGBW2 comprendido entre las secuencias denominadas LB (left border) y RB (right border), el cual incluye los genes de resistencia a kanamicina e higromicina y el gen de interés.Once the recombinant plasmid was amplified, its insertion into the plasmid pGWB2 was carried out (Nakagawa T, Kurose T, Hiño T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K, Matsuoka K, Jinbo T, Kimura T. 2007 Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J. Biosci. Bioeng. 104 (1): 34-41), which contains the attR1 and attR2 recombination sequences, which allow insertion among them of a fragment flanked by attL1 and attL2 sequences in the presence of the LR Clonase® recombinase (Invitrogen). This vector allows the constitutive expression of coding sequences by means of the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV). This vector has two selection markers for transformed plants: the hygromycin phosphotransferase (Hyg) gene under the control of the CaMV 35S promoter, and a kanamycin resistance (Kan) gene under the control of the Nos. Promoter. The attR1 and attR2 flank a fragment of the vector in which the ccd B and cat genes are found, which will be replaced by the genes of interest after the recombination reaction carried out by the LR recombinase. The recombination reaction results in the insertion of the gene of interest between the attR1 and attR2 sequences, the attB1 and attB2 sequences being regenerated flanking the ends of the gene of interest and losing the ccd B and cat genes, but maintaining the final plasmid the gene of Kanamycin resistance (Kan) and the hygromycin phosphotransferase (Hyg) gene. When Agrobacterium tumefaciens transforms a plant cell, it will transfer to the plant genome a DNA fragment of plasmid pGBW2 between the sequences called LB (left border) and RB (right border), which includes the kanamycin and hygromycin resistance genes and the gene of interest.
Estos plásmidos serían adecuados para la generación de plantas transgénicas que expresaran al menos una secuencia nucleotídica seleccionada entre el gen que codifica para un inhibidor de proteasas y los antisentidos de los genes que codifican para la nitrito reductasa plastidial y la cisteína sintasa, lo que permitiría utilizar dichas plantas para obtener un incremento en la acumulación de almidón.These plasmids would be suitable for generation of transgenic plants that will express at least one nucleotide sequence selected from the gene that codes for a protease inhibitor and antisense genes that encode for plastidial nitrite reductase and cysteine synthase, which would allow these plants to be used to obtain a increase in starch accumulation.
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- Ejemplo 5- Example 5
Con el fin de obtener más información sobre la teoría, expuesta en la solicitud de patente principal, de que los microorganismos que crecen en medios ricos en compuestos que presentan grupos amino, especialmente si son medios ricos en aminoácidos, producen volátiles que afectan negativamente al crecimiento y el desarrollo de las plantas, volátiles que no se producen cuando los microorganismos se hacen crecer en medios mínimos que carecen de aminoácidos, se repitió el ensayo de los apartados 1.1 y 1.2. del Ejemplo 1, creciendo las plantas en presencia de disoluciones acuosas de 2 centímetros cúbicos de amoníaco, ensayando dos concentraciones diferentes, cada una en distintas cajas: al 2% ó 5% (v/v). Se incluyó también un control en el que las plantas crecieron en presencia de agua a la que no se le había añadido otro compuesto.In order to get more information about the theory, set out in the main patent application, that microorganisms that grow in media rich in compounds that they have amino groups, especially if they are rich media in amino acids, produce volatiles that negatively affect the plant growth and development, volatile that is not produced when microorganisms are grown in media minimums that lack amino acids, the test of the Sections 1.1 and 1.2. of Example 1, growing the plants in presence of aqueous solutions of 2 cubic centimeters of ammonia, testing two different concentrations, each in different boxes: 2% or 5% (v / v). A control was also included in that the plants grew in the presence of water that was not I had added another compound.
Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 8. Se observa que la presencia de amoníaco en la atmósfera de crecimiento da lugar a despigmentación de las plantas e inhibición del crecimiento, efectos que son más acusados en el caso de las plantas que se crecieron en presencia de mayor concentración de amoníaco y que no se observan en ausencia de este compuesto (fotografías marcadas con la leyenda "0%"), pues las plantas control presentaban color verde y mayor tamaño que las crecidas en presencia de amonio.The results obtained are shown in Fig. 8. It is observed that the presence of ammonia in the atmosphere of growth results in depigmentation of plants and inhibition of growth, effects that are more pronounced in the case of plants that were grown in the presence of higher concentration of ammonia and that are not observed in the absence of this compound (photographs marked with the legend "0%"), because the plants control were green and larger than those grown in presence of ammonium
Este resultado, como se comentó previamente, constituye una prueba importante de que los microorganismos cultivados en medios ricos en aminoácidos producen volátiles, tales como el amoníaco, que inhiben el crecimiento y afectan negativamente el color; tales compuestos, sin embargo, no se producen cuando los microorganismos son cultivados en medios mínimos que carecen de aminoácidos.This result, as previously commented, It is an important proof that microorganisms grown in amino acid-rich media produce volatile, such such as ammonia, which inhibit growth and negatively affect the color; such compounds, however, do not occur when microorganisms are grown in minimal media that lack amino acids.
<110> IDEN BIOTECHNOLOGY, S.L.<110> IDEN BIOTECHNOLOGY, S.L.
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<120> MEJORAS INTRODUCIDAS EN EL OBJETO DE LA PATENTE PRINCIPAL Nº P2010004 99 POR PROCEDIMIENTO PARA ALTERAR EL PATRÓN DE DESARROLLO, AUMENTAR EL CRECIMIENTO Y LA ACUMULACIÓN DE ALMIDÓN Y ALTERAR LA ESTRUCTURA DEL ALMIDÓN EN PLANTAS<120> IMPROVEMENTS INTRODUCED IN THE OBJECT OF THE MAIN PATENT No. P2010004 99 BY ALTERATION PROCEDURE THE PATTERN OF DEVELOPMENT, INCREASE THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ALMIDÓN AND ALTER THE STRUCTURE OF ALMIDÓN IN PLANTS
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<130> CO-32622<130> CO-32622
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<223> Secuencia codificante del Inhibidor de proteasas de patata<223> Inhibitor coding sequence of potato proteases
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<223> Secuencia codificante de la nitrito reductasa de patata<223> Nitrite coding sequence potato reductase
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<223> Secuencia codificante de la cisteína sintasa de patata<223> Cysteine coding sequence potato synthase
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<223> Cebador de PCR para el inhibidor de proteasas de patata<223> PCR primer for the inhibitor of potato proteases
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<223> secuencia complementaria al gen del inhibidor de proteasas de patata<223> sequence complementary to the gene of potato protease inhibitor
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<223> secuencia complementaria al gen del inhibidor de proteasas de patata<223> sequence complementary to the gene of potato protease inhibitor
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<223> secuencia complementaria al gen de la nitrito reductasa de patata<223> sequence complementary to the gene of potato nitrite reductase
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<223> secuencia complementaria al gen de la cisteína sintaza de patata<223> sequence complementary to the gene of potato cysteine synthase
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<223> Cebador de PCR para nitrito reductasa de patata<223> PCR primer for nitrite potato reductase
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<220><220>
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<221> misc_feature<221> misc_feature
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<222> (1)..(29)<222> (1) .. (29)
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<223> secuencia attB2<223> sequence attB2
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<220><220>
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<221> misc_feature<221> misc_feature
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<222> (31)..(53)<222> (31) .. (53)
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<223> secuencia complementaria al gen de la cisteína sintasa de patata<223> sequence complementary to the gene of potato cysteine synthase
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WALLACE, J.M., ET AL. Adverse synergistic effects between acetic, propionic, butyric and valeric acids on the growth of wheat seedling roots. 1980. Soil Biol. Biochem., páginas 445 y 446. * |
Also Published As
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|---|---|
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