ES2375952T3 - Nuevos métodos para construir bibliotecas que comprenden miembros presentados y/o expresados en una familia diversa de péptidos, polipéptidos o prote�?nas y las nuevas bibliotecas. - Google Patents

Abstract

Un método para producir una población o biblioteca de genes de inmunoglobulina que comprende las etapas de: (i) introducir diversidad sintética en al menos uno de VH CDR1 o VH CDR2 de estos genes; y (ii) combinar la diversidad de la etapa (i) con diversidad en VH CDR3 capturada de células B.

Description

Nuevos métodos para construir bibliotecas que comprenden miembros presentados y/o expresados de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y las nuevas bibliotecas

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud provisional de los Estados Unidos 60/198,069, presentada el 17 de abril, 2000, una continuación en parte de la solicitud de patente de los Estados Unidos 09/837,306, presentada el 17 de abril, 2001, una continuación en parte de la solicitud PCT PCT/US01/12454, presentada el 17 de abril, 2001, una continuación en parte de la solicitud de los Estados Unidos 10/000,516, presentada el 24 de octubre, 2001 y una continuación en parte de la solicitud de los Estados Unidos 10/045,674, presentada el 25 de octubre, 2001.

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Así, se refiere a un método para producir una población o biblioteca de genes de inmunoglobulina que comprende las etapas de:

(i)

introducir diversidad sintética en al menos uno de VH CDR1 o VH CDR2 de estos genes; y

(ii)

combinar la diversidad de la etapa (i) con diversidad en VH CDR3 capturada de células B.

La presente invención también se refiere a una biblioteca que comprende una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, estando codificados los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados por secuencias de ADN que comprenden secuencias que codifican

(a)

una VH CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula -X1-Y-X2-M-X3-, en la que X1, X2, y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y;

(b)

una VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X4-I-X5-X6-S-G-G-X7-T-X8-Y-AD-S-V-K-G-, en la que X4 y X5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en Y, R, W, V, G, y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en P y S, y X7 y X8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; y

(c)

una secuencia que codifica una VH CDR3, en la que dicha VH CDR3 es una VH CDR3 capturada de la región VH CDR3 de un gen de inmunoglobulina de una célula B.

En una realización preferida, los paquetes genéticos son fagos filamentosos o fagémidos.

La presente descripción se refiere además a vectores para presentar y/o expresar una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas.

La presente descripción se refiere además a métodos de cribado de las bibliotecas de la invención y a los péptidos, polipéptidos y proteínas identificados por dicho cribado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente es una práctica común en la técnica preparar bibliotecas de paquetes genéticos que presentan, expresan o comprenden un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan, expresan o comprenden colectivamente al menos una parte de la diversidad de la familia. En muchas bibliotecas comunes, los péptidos, polipéptidos o proteínas están relacionados con anticuerpos. Frecuentemente, son Fabs o anticuerpos de cadena única.

En general, los ADN que codifican los miembros de las familias que se van a presentar y/o expresar deben amplificarse antes de que sean clonados y usados para presentar y/o expresar el miembro deseado. Dicha amplificación usa típicamente cebadores directos e inversos.

Dichos cebadores pueden ser complementarios a secuencias nativas del ADN que se va a amplificar o complementarios a oligonucleótidos unidos a los extremos 5' ó 3' de ese ADN. Los cebadores que son complementarios a secuencias nativas del ADN que se va a amplificar presentan desventajas porque sesgan los miembros de las familias que se van a presentar. Sólo se amplificarán aquellos miembros que contienen una secuencia en el ADN nativo que es sustancialmente complementaria al cebador. Aquellos que no la tengan estarán ausentes de la familia. Para aquellos miembros que se amplifican, se suprimirá cualquier diversidad en la región del cebador.

Por ejemplo, en la patente Europea 368,684 B1, el cebador que se usa está en el extremo 5' de la región VH de un gen de anticuerpo. Hibrida con una región de secuencia en el ADN nativo que se dice que está "suficientemente bien conservada" en una única especie. Dicho cebador sesgará los miembros amplificados favoreciendo a aquellos que tienen esta región "conservada". Se suprime cualquier diversidad en esta región.

Se admite generalmente que los genes de los anticuerpos humanos surgen mediante un proceso que implica una selección combinatoria de V y J o V, D, y J seguido de mutaciones somáticas. Aunque la mayor parte de la diversidad se produce en las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR), la diversidad también se produce en las regiones más conservadas, Regiones Marco (FR) y al menos parte de esta diversidad confiere o incrementa la unión específica a antígenos (Ag). Consecuentemente, las bibliotecas deberían contener tanta diversidad en CDR y FR como fuera posible.

Para clonar los ADN amplificados de los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican para presentación en un paquete genético y/o para expresión, los ADN deben escindirse para producir extremos apropiados para ligación en un vector. Dicha escisión se efectúa generalmente usando sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción portados por los cebadores. Cuando los cebadores están en el extremo 5' del ADN producido por transcripción inversa de ARN, dicha restricción deja regiones no traducidas 5' perjudiciales en el ADN amplificado. Estas regiones interfieren con la expresión de los genes clonados y así la presentación de los péptidos, polipéptidos y proteínas codificados por éstos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de esta invención proporcionar un método para producir una población o biblioteca de genes de inmunoglobulina que comprende las etapas de:

(i)

introducir diversidad sintética en al menos uno de VH CDR1 o VH CDR2 de estos genes; y

(ii)

combinar la diversidad de la etapa (i) con diversidad en VH CDR3 capturada de células B.

Estos métodos no están sesgados a favor de los ADN que contienen secuencias nativas que son complementarias a los cebadores usados para la amplificación. También permiten eliminar cualquier secuencia del ADN amplificado que puede ser perjudicial para la expresión antes de la clonación y presentación y/o expresión.

Los objetos adicionales de la invención están reflejados en las reivindicaciones 3 a 14. Cada una de estas reivindicaciones está incorporada específicamente por referencia en esta especificación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un esquema de los diferentes métodos que pueden emplearse para amplificar genes VH sin el uso de

cebadores específicos para secuencias VH. La FIG. 2 es un esquema de los diferentes métodos que pueden emplearse para amplificar genes VL sin el uso de cebadores específicos para secuencias VL.

La FIG. 3 es un esquema de amplificación RACE de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo.

La FIG. 4 muestra el análisis por gel de los productos de amplificación obtenidos después de la reacción de PCR primaria de 4 muestras de pacientes diferentes. La FIG. 5 muestra el análisis por gel del ADN kappa escindido del Ejemplo 2. La FIG. 6 muestra el análisis por gel del extensor-ADN kappa escindido del Ejemplo 2. La FIG. 7 muestra el análisis por gel del producto de PCR de la amplificación extensor-kappa del Ejemplo 2. La FIG. 8 muestra el análisis por gel del producto de PCR purificado de la amplificación extensor-kappa del Ejemplo 2. La FIG. 9 muestra el análisis por gel de las cadenas ligeras kappa escindidas y ligadas del Ejemplo 2. La FIG. 10 es un esquema del diseño para la diversidad sintética de CDR1 y CDR2. La FIG. 11 es un esquema del programa de clonación para la construcción del repertorio de cadena pesada. La FIG. 12 es un esquema de la escisión y ligación de la cadena ligera de anticuerpo. La FIG. 13 muestra el análisis por gel de las cadenas ligeras lambda escindidas y ligadas del Ejemplo 4. La FIG. 14 es un esquema de la escisión y ligación de la cadena pesada de anticuerpo. La FIG. 15 muestra el análisis por gel de las cadenas ligeras lambda escindidas y ligadas del Ejemplo 5. La FIG. 16 es un esquema de un vector de presentación en fago. La FIG. 17 es un esquema de un casete Fab. La FIG. 18 es un esquema de un proceso para incorporar residuos FR1 fijos en una secuencia lambda de anticuerpo.

La FIG. 19 es un esquema de un proceso para incorporar residuos FR1 fijos en una secuencia kappa de anticuerpo.

La FIG. 20 es un esquema de un proceso para incorporar residuos FR1 fijos en una secuencia de cadena pesada de anticuerpo.

TÉRMINOS

En esta solicitud, se usan los términos y abreviaturas siguientes:

Cadena con sentido

Cadena antisentido

Cebador directo

Cebador inverso

Bases

Sv Ap

R

ap

RERS RE UREFuncionalmente complementario

AA PCR GLG Ab

Fab

ScFv

w.t. HCLCVK VH VL

La cadena superior de los ADN ds como se escribe habitualmente. En la cadena con sentido, 5'-ATG-3' codifica Met.

La cadena inferior de los ADN ds como se escribe habitualmente. En la cadena antisentido, 3'-TAC-5' correspondería a un codón Met en la cadena con sentido.

Un cebador "directo" es complementario a una parte de la cadena con sentido y ceba la síntesis de una nueva molécula de cadena antisentido. "Cebador directo" y "cebador de la cadena inferior" son equivalentes.

Un cebador "inverso" es complementario a una parte de la cadena antisentido y ceba la síntesis de una nueva molécula de cadena con sentido. "Cebador inverso" y "cebador de la cadena superior" son equivalentes.

Las bases se especifican bien por su posición en un vector o gen como su posición en un gen por codón y base. Por ejemplo, "89.1" es la primera base del codón 89,

89.2 es la segunda base del codón 89. Estreptavidina Ampicilina Un gen que confiere resistencia a ampicilina. Sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Endonucleasa de restricción - escinde preferentemente en RERS Endonucleasa de restricción universal Dos secuencias son suficientemente complementarias como para hibridar bajo las

condiciones elegidas. Aminoácido Reacción de polimerización en cadena Genes de la línea germinal Anticuerpo: una inmunoglobulina. El término también engloba cualquier proteína que

tiene un dominio de unión que es homólogo a un dominio de unión de una inmunoglobulina. Algunos ejemplos de anticuerpos incluidos en esta definición son, entre otros, isotipos de inmunoglobulina y los fragmentos Fab, F(ab1)2, scfv, Fv, dAb y Fd.

Molécula de dos cadenas que comprende una cadena ligera de Ab y parte de una cadena pesada. Un Ab de una única cadena bien VH::conector::VL o VL::conector::VH Tipo salvaje Cadena pesada Cadena ligera Un dominio variable de una cadena ligera Kappa. Un dominio variable de una cadena pesada. Un dominio variable de una cadena ligera lambda.

En esta solicitud cuando se dice que los ácidos nucleicos se esciden solamente en el sitio de escisión de una endonucleasa de restricción, debe entenderse que puede ocurrir una escisión menor en sitios aleatorios, por ejemplo, no específicos distintos del sitio de escisión específico que es característico de la endonucleasa de restricción. El experto en la técnica reconocerá que dicha escisión no específica, aleatoria es algo que ocurre de forma habitual. De acuerdo con esto, "solamente en el sitio de escisión" de una endonucleasa de restricción significa que la escisión ocurre preferentemente en el sitio característico de esa endonucleasa.

Tal y como se usa en esta solicitud y reivindicaciones, el término "sitio de escisión formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido" incluye los sitios de escisión formados por la parte monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario que forma un dúplex con el ADN monocatenario, sitios de escisión en la parte bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario, y sitios de escisión introducidos por el cebador de amplificación usado para amplificar la combinación de ADN monocatenario-oligonucleótido parcialmente bicatenario.

En los dos métodos de esta invención para preparar secuencias de ácido nucleico monocatenarias, se prefiere el primero de estos sitios de escisión. En los métodos de esta invención para capturar diversidad y clonar una familia de diversas secuencias de ácido nucleico, se prefieren los últimos dos sitios de escisión.

En esta solicitud, todas las referencias a las que se hace referencia se incorporan específicamente por referencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Las secuencias de ácido nucleico que son útiles en los métodos de esta invención, es decir, aquellas que codifican al menos en parte los péptidos, polipéptidos y proteínas individuales presentados, o expresados en o que comprenden las bibliotecas de esta invención, pueden ser nativas, sintéticas o una combinación de éstas. Pueden ser ARNm, ADN o ADNc. En la realización preferida, los ácidos nucleicos codifican anticuerpos. Lo más preferiblemente, codifican Fabs.

Los ácidos nucleicos útiles en esta invención pueden ser naturalmente diversos, la diversidad sintética puede introducirse en aquellos miembros naturalmente diversos o la diversidad puede ser completamente sintética. Por ejemplo, la diversidad sintética puede introducirse en una o más CDR de los genes de anticuerpo. Preferiblemente, se introduce en CDR1 y CDR2 de inmunoglobulinas. Preferiblemente, la diversidad natural se captura en las regiones CDR3 de los genes de inmunoglobulina de esta invención a partir de células B. Lo más preferiblemente, los ácidos nucleicos de esta invención comprenden una población de genes de inmunoglobulina que comprenden diversidad sintética en al menos una, y más preferiblemente las dos de CDR1 y CDR2 y diversidad en CDR3 capturada de células

B.

La diversidad sintética puede crearse, por ejemplo, mediante el uso de tecnología TRIM (U.S. 5.869.644). La tecnología TRIM permite el control sobre exactamente qué tipos de aminoácidos se permiten en posiciones variegadas y en qué proporciones. En la tecnología TRIM, los codones que se van a diversificar se sintetizan usando mezclas de trinucleótidos. Esto permite incluir cualquier conjunto de tipos de aminoácidos en cualquier proporción.

Otra alternativa que puede usarse para generar ADN diversificado es síntesis de mezclas de oligonucleótidos. Con la tecnología TRIM, se podría permitir Ala y Trp. Con la síntesis de mezclas de oligonucleótidos, una mezcla que incluyera Ala y Trp también incluiría necesariamente Ser y Gly. Los tipos de aminoácidos permitidos en las posiciones variegadas se eligen con referencia a la estructura de los anticuerpos, u otros péptidos, polipéptidos o proteínas de la familia, la diversidad observada en los genes de la línea germinal, las mutaciones somáticas observadas, observadas frecuentemente y las áreas y tipos deseados de variegación.

En una realización preferida de esta invención, las secuencias de ácido nucleico para al menos una CDR u otra región de los péptidos, polipéptidos o proteínas de la familia son ADNc producidos por transcripción inversa a partir de ARNm. Más preferiblemente, los ARNm se obtienen a partir de células de sangre periférica, células de la médula ósea, células del bazo o células de los ganglios linfáticos (tales como linfocitos B o células plasmáticas) que expresan miembros de conjuntos naturalmente diversos de genes relacionados. Más preferiblemente, los ARNm codifican una familia diversa de anticuerpos. Lo más preferiblemente, los ARNm se obtienen de pacientes que padecen al menos un trastorno autoinmune o cáncer. Preferiblemente, se usan los ARNm que contienen una alta diversidad de enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome de antifosfolípido y vasculitis.

En una realización preferida de esta invención, los ADNc se producen a partir de ARNm usando transcripción inversa. En esta realización preferida, los ARNm se separan de la célula y se degradan usando métodos estándar, de manera que sólo permanezcan los ARNm de longitud completa (es decir, con caperuza). La caperuza se elimina y se usa la transcripción inversa para producir los ADNc.

La transcripción inversa de la primera (antisentido) cadena puede hacerse de cualquier manera con un cebador adecuado. Véase, por ejemplo, HJ de Haard et al., Journal of Biological Chemistry, 279(26):18218-30 (1999). En la realización preferida de esta invención en la que los ARNm codifican anticuerpos, pueden usarse los cebadores que son complementarios a las regiones constantes de los genes de anticuerpo. Estos cebadores son útiles porque no generan sesgo hacia subclases de anticuerpos. En otra realización, pueden usarse cebadores poli-dT (y pueden preferirse para los genes de cadena pesada). Alternativamente, las secuencias complementarias al cebador pueden unirse al extremo de la cadena antisentido.

En una realización preferida de esta invención, el cebador de la transcriptasa inversa puede estar biotinilado, permitiendo así que el producto ADNc pueda inmovilizarse en lechos de estreptavidina (Sv). La inmovilización también puede efectuarse usando un cebador marcado en el extremo 5' con uno de a) grupo amino libre, b) tiol, c) ácido carboxílico, o d) otro grupo no encontrado en el ADN que puede reaccionar para formar un enlace fuerte con una pareja conocida en un medio insoluble. Si, por ejemplo, se proporciona un amino libre (preferiblemente amino primario) en el extremo 5' de un cebador de ADN, este amino puede reaccionar con grupos ácido carboxílico en un lecho de polímero usando química estándar de formación de amida. Si dicha inmovilización preferida se usa durante la transcripción inversa, el ARN de la cadena superior se degrada usando enzimas muy conocidas, tales como una combinación de ARNasaH y ARNasaA, bien antes o después de la inmovilización.

Las secuencias de ácido nucleico útiles en los métodos de esta invención se amplifican generalmente antes de ser usadas para presentar y/o expresar los péptidos, polipéptidos o proteínas que codifican. Antes de la amplificación, los ADN monocatenarios pueden escindirse usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Alternativamente, los ADN monocatenarios pueden amplificarse y escindirse usando uno de estos métodos.

Cualquiera de los métodos muy conocidos para amplificar secuencias de ácido nucleico puede usarse para dicha amplificación. Se prefieren los métodos que maximizan, y no sesgan, la diversidad. En una realización preferida de esta invención en la que las secuencias de ácido nucleico se obtienen de genes de anticuerpo, la presente invención utiliza preferiblemente cebadores en las regiones constantes de los genes de la cadena pesada y ligera y cebadores para una secuencia sintética que están unidos al extremo 5' de la cadena con sentido. El cebado en dicha secuencias sintética evita el uso de secuencias en las regiones variables de los genes de anticuerpo. Aquellos sitios de cebado de la región variable generan sesgo frente a los genes V que son bien de subclases raras o que han sido mutados en los sitios de cebado. Este sesgo se debe parcialmente a la supresión de la diversidad en la región del cebador y se deben parcialmente a la ausencia de cebado cuando están presentes muchas mutaciones en la región complementaria al cebador. Los métodos descritos en esta invención tienen la ventaja de no sesgar la población de genes de anticuerpo amplificada para tipos de genes V particulares.

Las secuencias sintéticas pueden unirse al extremo 5' de la cadena de ADN por varios métodos muy conocidos para ligar secuencias de ADN entre sí. La RT CapExtention es un método preferido.

En RT CapExtention (obtenido de Smart PCR(™)), una superposición corta (5'-...GGG-3' en el cebador de la cadena superior (USP-GGG) se complementa con 3'-CCC....5' en la cadena inferior) y las transcriptasas inversas se usan de manera que el complemento inverso del cebador de la cadena superior se une a la cadena inferior.

Las FIGs. 1 y 2 muestran esquemas para amplificar los genes VH y VL usando RT CapExtention. La FIG. 1 muestra un esquema de la amplificación de genes VH. La FIG. 1, Panel A muestra un cebador específico de la región poli-dT de la síntesis cebada de 3' UTR de la primera cadena (inferior). Los cebadores que se unen en la región constante también son adecuados. El Panel B muestra la cadena inferior extendida en su extremo 3' por tres Cs que no son complementarias al ARNm. El Panel C muestra el resultado de la hibridación de un cebador de la cadena superior sintético que termina en tres GGG que hibridan con las CCC del extremo 3' y extendiendo la transcripción inversa extendiendo la cadena inferior por el complemento inverso de la secuencia de cebador sintético. El Panel D muestra el resultado de la amplificación por PCR usando un cebador de cadena superior sintético biotinilado en 5' que replica el extremo 5' del cebador sintético del panel C y un cebador de cadena inferior complementario a parte del dominio constante. El Panel E muestra ADNc (ds) bicatenario inmovilizado obtenido usando un cebador de cadena superior biotinilado en 5'.

La FIG. 2 muestra un esquema similar para la amplificación de genes VL. La FIG. 2, Panel A muestra un cebador específico de la región constante en o cerca del extremo 3' de la síntesis cebada de la primera cadena (inferior). Los cebadores que se unen en la región poli-dT también son adecuados. El Panel B muestra la cadena inferior extendida en su extremo 3' por tres Cs que no son complementarias al ARNm. El Panel C muestra el resultado de la hibridación de un cebador de la cadena superior sintético que termina en tres GGG que hibridan con las CCC del extremo 3' y extendiendo la transcripción inversa extendiendo la cadena inferior por el complemento inverso de la secuencia de cebador sintético. El Panel D muestra el resultado de la amplificación por PCR usando un cebador de cadena superior sintético biotinilado en 5' que replica el extremo 5' del cebador sintético del panel C y un cebador de cadena inferior complementario a parte del dominio constante. El cebador de la cadena inferior también contiene un sitio de endonucleasa de restricción útil, tal como AscI. El Panel E muestra ADNc inmovilizado obtenido usando un cebador de cadena superior biotinilado en 5'.

En las FIGs. 1 y 2, cada gen V consiste en una región no traducida 5' (UTR) y una señal de secreción, seguido de la región variable, seguida de un región constante, seguida de una región no traducida 3' (que termina típicamente en poli-A). Un cebador inicial para transcripción inversa puede ser complementario a la región constante o al segmento poli A de 3'-UTR. Para los genes de cadena pesada humanos, se prefiere un cebador de 15 T. Las transcriptasas inversas unen varios residuos C al extremo 3' del ADN recién sintetizado. La RT CapExtention aprovecha esta característica. La reacción de transcripción inversa se corre en primer lugar sólo con un cebador de cadena inferior. Después de aproximadamente 1 hora, se añade un cebador que termina en GGG (USP-GGG) y más RTasa. Esto causa que el ADNc de cadena inferior se extienda por el complemento inverso de USP-GGG hasta el GGG final. Usando un cebador idéntico a parte de la secuencia sintética unida y un segundo cebador complementario a una región de secuencia conocida en el extremo 3' de la cadena con sentido, todos los genes V se amplifican independientemente de su subclase de gen V.

En otra realización preferida, las secuencias sintéticas pueden añadirse por la Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase Frohman, M.A., Dush, M.K., & Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (85): 8998-9002).

La FIG. 1 muestra un esquema de amplificación RACE de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo. En primer lugar, se selecciona el ARNm tratando ARN total o poli(A+) con fosfatasa intestinal de ternera (CIP) para eliminar el 5'-fosfato de todas las moléculas que los tienen tales como ARN ribosomal, ARNm fragmentado, ARNt y ADN genómico. El ARNm de longitud completa (que contiene una estructura de caperuza protectora 7-metilo) no resulta afectado. El ARN se trata con pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP) para eliminar la estructura de caperuza de los ARNm de longitud completa dejando un grupo 5'-monofosfato. A continuación, se liga un adaptador de ARN sintético a la población de ARN, sólo las moléculas que tienen un 5-fosfato (ARNm sin caperuza, de longitud completa) aceptarán el adaptador. Se usan reacciones de transcriptasa inversa que usan un cebador oligodT y PCR anidada (que usa un cebador adaptador (localizado en el adaptador sintético 5') y un cebador para el gen) para amplificar el transcrito deseado

En una realización preferida de esta invención, el cebador de cadena superior o de cadena inferior también puede biotinilarse o marcarse en el extremo 5' con uno de a) grupo amino libre, b) tiol, c) ácido carboxílico y d) otro grupo no encontrado en el ADN que puede reaccionar para formar un enlace fuerte con una pareja conocida como un medio insoluble. Éstos pueden usarse para inmovilizar la cadena marcada después de la amplificación. El ADN inmovilizado puede ser mono o bicatenario.

Después de la amplificación (usando, por ejemplo, RT CapExtension o RACE), los ADN de esta invención se vuelven monocatenarios. Por ejemplo, las cadenas pueden separarse usando un cebador biotinilado, capturando el producto biotinilado en lechos de estreptavidina, desnaturalizando el ADN y eliminando por lavado la cadena complementaria. Dependiendo de qué extremo se quiera del ADN capturado, se elegirá inmovilizar bien la cadena superior (con sentido)

o la cadena inferior (antisentido).

Para preparar los ADN monocatenarios amplificados para clonación en paquetes genéticos con el fin de conseguir la presentación de, o la expresión de, los péptidos, polipéptidos o proteínas codificados, al menos en parte, por estos ADN, deben manipularse para proporcionar extremos adecuados para clonación y presentación y/o expresión. En particular, cualesquiera regiones no traducidas 5' y secuencias señal de mamíferos deben eliminarse y reemplazarse, en marco, por una secuencia señal que funcione en el huésped de presentación o expresión. Además, las partes de los dominios variables (en genes de anticuerpo) pueden eliminarse y reemplazarse por segmentos sintéticos que contienen diversidad sintética. La diversidad en otras familias de genes puede expandirse asimismo con diversidad sintética.

Según los métodos de esta invención, existen dos maneras de manipular los ADN monocatenarios para presentación y/o expresión. El primer método comprende las etapas de:

(i)

poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido monocatenario, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario al ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión e incluyendo una secuencia que con su complemento en el ácido nucleico forma un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que después de la restricción resulta en la escisión del ácido nucleico en la localización deseada; y

(ii)

escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de reconocimiento formado por la complementación del ácido nucleico y el oligonucleótido;

realizándose las etapas de poner en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en una forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario al ácido nucleico sobre una región lo suficientemente larga para permitir que las dos cadenas se asocien de manera que la escisión pueda ocurrir a la temperatura elegida y en la localización deseada y realizándose la escisión usando una endonucleasas de restricción que es activa a la temperatura elegida.

En este primer método, se hibridan oligonucleótidos cortos con el ADN monocatenario de manera que los sitios de reconocimiento de la endonucleasa de restricción formados en las regiones del ADN ahora bicatenarias pueden escindirse. En particular, un sitio de reconocimiento que ocurre en la misma posición en una fracción sustancial de los ADN monocatenarios es idéntico.

Para los genes de anticuerpo, esto puede hacerse usando un catálogo de secuencias de línea germinal. Véase, por ejemplo, "http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.htm 1." Las actualizaciones pueden obtenerse partir de este sitio bajo el encabezamiento "Amino acid and nucleotide sequence alignments." Para otras familias, existen comparaciones similares y pueden usarse para seleccionar las regiones apropiadas para escisión y para mantener la diversidad.

Por ejemplo, la Tabla 1 muestra las secuencias de ADN de las regiones FR3 de los 51 genes conocidos de la línea germinal VH humana. En esta región, los genes contienen sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción mostrados en la Tabla 2. Se prefieren las endonucleasas de restricción que escinden una amplia fracción de genes de la línea germinal en el mismo sitio sobre las endonucleasas que cortan en una variedad de sitios. Además, se prefiere que sólo haya un sitio para las endonucleasas de restricción en la región al que se une el oligonucleótido corto en el ADN monocatenario, por ejemplo, aproximadamente 10 bases a cada lado del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción.

También es más preferible una enzima que escinde en 3' respecto de FR3 porque captura menos mutaciones en el marco. Esto puede ser ventajoso en algunos casos. Sin embargo, es muy conocido que las mutaciones marco existen y confieren e incrementan unión de anticuerpo. La presente invención, mediante la elección del sitio de restricción apropiado, permite capturar toda o parte de la diversidad en FR3. Por lo tanto, el método también permite capturar una diversidad extensa.

Finalmente, en los métodos de esta invención, se usan endonucleasas de restricción que son activas entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 75°C. Preferiblemente, pueden usarse las endonucleasas de restricción que son activas entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 75°C. Más preferiblemente, se usan las enzimas que son activas por encima de 50°C y lo más preferiblemente activas a aproximadamente 55°C. Dichas temperaturas mantienen la secuencia de ácido nucleico que se va a escindir sustancialmente en forma monocatenaria.

Las enzimas mostradas en la Tabla 2 que cortan muchos de los genes de la línea germinal de cadena pesada FR3 en una única posición incluyen: MaeIII(24@4), Tsp45I(21@4), HphI(44@5), BsaJI(23@65), AluI(23@47), BlpI(21@48), DdeI(29@58), BglII(10@61), MslI(44@72), BsiEI(23@74), EaeI(23@74), EagI(23@74), HaeIII(25@75), Bst4CI(51@86), HpyCH4III(51@86), HinfI(38@2), MlyI(18@2), PleI(18@2), MnlI(31@67), HpyCH4V(21@44), BsmAI(16@11), BpmI(19@12), XmnI(12@30), y SacI(11@51). (La notación usada significa, por ejemplo, que BsmAI corta 16 de los genes de la línea germinal FR3 con un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que empieza en la base 11 de FR3.)

Para la escisión de las cadenas pesadas humanas en FR3, las endonucleasas de restricción preferidas son: Bst4CI (o TaaI o HpyCH4III), BlpI, HpyCH4V, y MslI. Como ACNGT (el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción para Bst4CI, TaaI, y HpyCH4III) se encuentra en un sitio consistente en todos los genes de la línea germinal humana FR3, una de estas enzimas es la más preferida para capturar la diversidad en CDR3 de cadena pesada. BlpI y HpyCH4V son complementarios. BlpI corta a la mayor parte de los miembros de las familias VH1 y VH4 mientras que HpyCH4V corta a la mayor parte de los miembros de las familias VH3, VH5, VH6 y VH7. Ninguna enzima corta VH2s, pero ésta es una familia muy pequeña, que contiene sólo tres miembros. Así, estas enzimas también pueden usarse en realizaciones preferidas de los métodos de esta invención.

Las endonucleasas de restricción HpyCH4III, Bst4CI, y TaaI reconocen todas 5'-ACnGT-3' y cortan el ADN de cadenasuperior después de n y el ADN de cadena inferior antes de la base complementaria a n. Éste es el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción más preferido para este método en cadenas pesadas humanas porque se encuentra en todos los genes de la línea germinal. Además, la región de reconocimiento de la endonucleasa de restricción (ACnGT) coinciden con la segunda y tercera base de un codón de tirosina (tay) y el codón siguiente de cisteína (tgy) como se muestra en la Tabla 3. Estos codones están altamente conservados, especialmente la cisteína en los genes de anticuerpo maduros.

La Tabla 4 E muestra los diferentes oligonucleótidos con una longitud de 22 (excepto el último que tiene una longitud de 20) bases. La Tabla 5 C muestra el análisis de 1.617 genes precisos de cadena pesada de anticuerpo. De éstos, 1.511 tienen el sitio y se emparejan con uno de los oligonucleótidos candidatos con un error de 4 emparejamientos erróneos. Ocho oligonucleótidos son los responsables de la mayor parte de los emparejamientos y se proporcionan en la Tabla 4

F.1. Los 8 oligonucleótidos son muy similares de manera que es probable que se consiga una escisión satisfactoria sólo con un oligonucleótido (tal como H43.77.97.1-02#1) ajustando la temperatura, pH, salinidad y semejantes. Uno o dos oligonucleótidos pueden ser asimismo suficientes siempre que las secuencias de los genes de la línea germinal se diferencien muy poco y especialmente si se diferencian muy poco cerca de la región de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que se va a escindir. La Tabla 5 D muestra un análisis de repetición de 1.617 genes de cadena pesada de anticuerpo precisos usando sólo los 8 oligonucleótidos elegidos. Esto muestra que 1.463 de las secuencias se emparejan al menos con uno de los oligonucleótidos con un error de 4 emparejamientos erróneos y tienen el sitio como se esperaba. Sólo 7 secuencias tienen una segunda región de reconocimiento de endonucleasa de restricción HpyCH4III en esta región.

Otra ilustración de elección de un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción apropiado implica la escisión en FR1 de las cadenas pesadas humanas. La escisión en FR1 permite la captura de la diversidad completa de CDR de la cadena pesada.

Los genes de la línea germinal para FR1 de la cadena pesada humana se muestran en la Tabla 6. La Tabla 7 muestra los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción encontrados en los genes de línea germinal humana FR1. Los sitios preferidos son BsgI(GTGCAG;39@4), BsoFI(GCngc:43@6,11@9,2@3,1@12), TseI (Gcwgc;43@6,11@9,2@3,1@12), MspA1I(CMGckg;46@7,2@1), PvuII(CAGctg;46@7,2@1), AluI(AGct;48@82@2), DdeI(Ctnag;22@52,9@48), HphI(tcacc;22@80), BssKI(Nccngg;35@39,2@40), BsaJI(Ccnngg;32@90,2@41), BstNI( CCwgg;33@40), ScrFI(CCngg:35@40,2@41), EcoO109I(RGgnccy;22@46, 11@43), Sau96I(Ggncc;23@47,11@44), AvaII(Ggwcc;23@47,4@44), PpuMI (RGgwccy;22@96,9@43), BsmFI (gtccc;20@48), HinfI( Gantc:34@16,21@56,21@77), TfiI(21@77), MlyI(GAGTC;34@16), MlyI(gactc;21@56), y AlwNI(CAGnnnctg:22@68). Los sitios más preferidos son MspAI y PvuII. MspAI y PvuII tienen 46 sitios en 7-12 y 2 en 1-6. Para evitar la escisión en ambos sitios, se usan oligonucleótidos que no abarcan totalmente el sitio en 1-6. Así, el ADN no se escindirá en ese sitio. Hemos mostrado que el ADN que se extiende 3, 4, ó 5 bases más allá de un sitio PvuII puede escindirse eficazmente.

Otra ilustración de elección de un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción apropiado implica la escisión en FR1 de las cadenas ligeras kappa humanas. La Tabla 8 muestra los genes de la línea germinal de FR1 de kappa humana y la Tabla 9 muestra los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que se encuentran en un número sustancial de genes de la línea germinal de FR1 de kappa humana en localizaciones consistentes. De los sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción listados, BsmAI y PflFI son las enzimas más preferidas. Los sitios BsmAI se encuentran en la base 18 en 35 de 40 genes de la línea germinal. Los sitios PflFI se encuentran en 35 de 40 genes de la línea germinal en la base 12.

Otro ejemplo de elección de un sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción apropiado implica la escisión en FR1 de la cadena ligera lambda humana. La Tabla 10 muestra las 31 secuencias de genes de la línea germinal FR1 de lambda humana conocidas. La Tabla 11 muestra sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción encontrados en los genes de línea germinal FR1 de lambda humana. HinfI y DdeI son las endonucleasas de restricción más preferidas para cortar cadenas lambda humanas en FR1.

Después de haber elegido el sitio o sitios de escisión apropiados, se preparan uno o más oligonucleótidos cortos de manera que complemente funcionalmente, sólo o en combinación, el sitio de reconocimiento elegido. Los oligonucleótidos también incluyen secuencias que flanquean el sitio de reconocimiento en la mayor parte de los genes amplificados. Esta región flanqueante permite que la secuencia hibride con el ADN monocatenario lo suficiente como para permitir la escisión por la endonucleasas de restricción específica para el sitio elegido.

La longitud y la secuencia precisas del oligonucleótido dependen del sitio de reconocimiento y de las condiciones que se vayan a usar para poner en contacto y escindir. La longitud debe ser suficiente de manera que el oligonucleótido sea funcionalmente complementario al ADN monocatenario sobre una región lo suficientemente larga para permitir que las dos cadenas se asocien de manera que la escisión pueda ocurrir a la temperatura elegida y en la localización deseada.

Típicamente, los oligonucleótidos de este método preferido de la invención tienen una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 30 nucleótidos. Por debajo de aproximadamente 17 bases, la hibridación es demasiado débil y por encima de 30 bases puede haber una pérdida de especificidad. Una longitud preferida es 18 a 24 bases.

Los oligonucleótidos de esta longitud no necesitan ser complementos idénticos de los genes de la línea germinal. En lugar de esto, pueden tolerarse unos pocos emparejamientos erróneos. Preferiblemente, sin embargo, no se permiten más de 1-3 emparejamientos erróneos. Dichos emparejamientos erróneos no afectan adversamente la hibridación del oligonucleótido al ADN monocatenario. Por lo tanto, se dice que los dos ADN son funcionalmente complementarios.

El segundo método para manipular los ADN monocatenarios de esta invención para presentación y/o expresión comprende las etapas de:

(i)

poner en contacto el ácido nucleico con un oligonucleótido parcialmente bicatenario, siendo la región monocatenaria del oligonucleótido funcionalmente complementaria al ácido nucleico en la región en la que se desea la escisión, y teniendo la región bicatenaria del oligonucleótido un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción; y

(ii)

escindir el ácido nucleico solamente en el sitio de escisión formado por la complementación del ácido nucleico y la región monocatenaria del oligonucleótido;

realizándose las etapas de poner en contacto y escisión a una temperatura suficiente para mantener el ácido nucleico en una forma sustancialmente monocatenaria, siendo el oligonucleótido funcionalmente complementario al ácido nucleico sobre una región lo suficientemente larga para permitir que las dos cadenas se asocien de manera que la escisión pueda ocurrir a la temperatura elegida y en la localización deseada y realizándose la escisión usando una endonucleasas de restricción que es activa a la temperatura elegida.

Como se ha explicado anteriormente, el sitio de escisión puede formarse por la parte monocatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario que forma un dúplex el ADN monocatenario, el sitio de escisión puede estar presente en la parte bicatenaria del oligonucleótido parcialmente bicatenario o el sitio de escisión puede introducirse por el cebador de amplificación usado para amplificar la combinación ADN monocatenario-oligonucleótido parcialmente bicatenario. En esta realización, se prefiere el primero. Y, el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción puede estar localizado bien en la parte bicatenaria del oligonucleótido o puede introducirse por el cebador de amplificación, que es complementario a esta región bicatenaria, como se usa para amplificar la combinación.

Preferiblemente, el sitio de la endonucleasa de restricción es el de una endonucleasa de restricción de Tipo II-S, cuyo sitio de escisión está localizado a una distancia conocida de su sitio de reconocimiento.

Este segundo método, preferiblemente, emplea Endonucleasas de Restricción Universales ("URE"). Las URE son oligonucleótidos parcialmente bicatenarios. La parte monocatenaria o superposición de la consiste en un adaptador de ADN que es funcionalmente complementario a la secuencia que se va a escindir en el ADN monocatenario. La parte bicatenaria consiste en un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción, preferiblemente de tipo II-S.

El método de URE de esta invención es específico y preciso y puede tolerar algunos (por ejemplo, 1-3) emparejamientos erróneos en las regiones complementarias, es decir, es funcionalmente complementario a esa región. Además, las condiciones bajo las que se usa la URE pueden ajustarse de manera que la mayor parte de los genes que se amplifican puedan cortarse, reduciendo el sesgo en la biblioteca producida a partir de esos genes.

La secuencia del adaptador de AFN monocatenario o parte de superposición de la URE consiste típicamente en aproximadamente 14-22 bases. Sin embargo, pueden usarse adaptadores más largos o más cortos. El tamaño depende de la capacidad del adaptador para asociarse con su complemento funcional en el ADN monocatenario y de la temperatura usada para poner en contacto la URE y el ADN monocatenario a la temperatura usada para escindir el ADN con la enzima de restricción. El adaptador debe ser funcionalmente complementario al ADN monocatenario sobre una región lo suficientemente larga para permitir que las dos cadenas se asocien de manera que la escisión pueda ocurrir a la temperatura elegida y en la localización deseada. Preferimos partes monocatenarias o de superposición con una longitud de 14-17 bases y más preferiblemente con una longitud de 18-20 bases.

El sitio elegido para la escisión usando la URE es preferiblemente uno que está sustancialmente conservado en la familia de los ADN amplificados. Comparado con el primer método de escisión de esta invención, estos sitios no necesitan ser sitios de reconocimiento de endonucleasa. Sin embargo, como el primer método, los sitios elegidos pueden sintéticos en lugar de existir en el ADN nativo. Dichos sitios pueden elegirse por referencias a las secuencias de anticuerpos conocidos u otras familias de genes. Por ejemplo, las secuencias de muchos genes de la línea germinal se indican en http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ok.html. Por ejemplo, un sitio preferido se encuentra cerca del extremo de FR3 -- codón 89 hasta la segunda base del codón 93. CDR3 empieza en el codón 95.

Las secuencias de 79 genes de cadena pesada humana también están disponibles en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entre2/nucleotide.html.Este sitio puede usarse para identificar las secuencias apropiadas para la escisión con URE según los métodos de esta invención. Véase, por ejemplo, la Tabla 12B.

Lo más preferiblemente, se identifican una o más secuencias usando estos sitios u otra información de secuencia disponible. Estas secuencias conjuntamente están presentes en una fracción sustancial de los ADN amplificados. Por ejemplo, podrían usarse múltiples secuencias para permitir la diversidad conocida de genes de la línea germinal o mutaciones somáticas frecuentes. También podrían usarse secuencias degeneradas sintéticas. Preferiblemente, se elige una o unas secuencias que aparezcan en al menos el 65% de los genes examinados con no más de 2-3 emparejamientos erróneos

Los adaptadores o superposiciones URE monocatenarias se preparan para ser complementarias a las regiones elegidas. Las condiciones para usar las URE se determinan empíricamente. Estas condiciones deberían permitir la escisión del ADN que contiene las secuencias funcionalmente complementarias con no más de 2 ó 3 emparejamientos erróneos pero sin permitir la escisión del ADN que carezca de dichas secuencias.

Como se ha descrito anteriormente, la parte bicatenaria de la URE incluye un sitio de reconocimiento de endonucleasa, preferiblemente un sitio de reconocimiento de Tipo II-S. Puede usarse cualquier enzima que sea activa a una temperatura necesaria para mantener el ADN monocatenario sustancialmente en esa forma y para permitir que la parte de adaptador de ADN monocatenaria de la URE hibride en la longitud suficiente del ADN monocatenario para permitir la escisión en el sitio deseado.

Las enzimas de Tipo II-S preferidas para usarse en los métodos con URE de esta invención proporcionan una escisión asimétrica del ADN monocatenario. Entre éstas están las enzimas listadas en la Tabla 13. La enzima de Tipo II-S más preferida es FokI.

Cuando se usa la URE preferida que contiene FokI, se usan preferiblemente varias condiciones para efectuar la escisión:

1) Debería estar presente un exceso de la URE sobre el ADN diana para activar la enzima. La URE presente sólo en cantidades equimolares respecto al ADN diana rendiría una menor escisión del ADNss porque la cantidad de enzima activa disponible sería limitante.

2) Puede usarse un activador para activar parte de la enzima FokI para dimerizar sin causar escisión. Los ejemplos de activadores apropiados se muestran en la Tabla 14.

3) La reacción de escisión se realiza a una temperatura entre 45°-75°C, preferiblemente por encima de 50°C y lo más preferiblemente por encima de 55°C.

Las URE usadas en la técnica anterior contenían un segmento monocatenario de 14 bases, un tallo de 10 bases (que contiene un sitio FokI), seguido del palíndromo del tallo de 10 bases. Aunque dichas URE pueden usarse en los métodos de esta invención, las URE preferidas de esta invención también incluyen un segmento de tres a ocho bases (un bucle) entre los segmentos que contienen el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción FokI. En la realización preferida, el tallo (que contiene el sitio FokI) y su palíndromo también son mayores de 10 bases. Preferiblemente, tienen una longitud de 10-14 bases. Los ejemplos de estos adaptadores URE "lollipop" se muestran en la Tabla 15.

Un ejemplo de uso de una URE para escindir un ADN monocatenario implica la región FR3 de la cadena pesada humana. La Tabla 16 muestra un análisis de 840 cadenas pesadas humanas maduras de longitud completa mostrando las secuencias de reconocimiento URE. La gran mayoría (718/840=0,85) serán reconocidas con 2 o menos emparejamientos erróneos usando cinco URE (VHS881-1.1, VHS881-1.2, VHS881-2.1, VHS881-4.1, y VHS881-9.1). Cada una tiene una secuencia de adaptador de 20 bases para complementar el gen de la línea germinal, un segmento tallo de diez bases que contiene un sitio FokI, un bucle de cinco bases y el complemento inverso del primer segmento tallo. La hibridación de estos adaptadores, solos o en combinación, con ADN de cadena pesada antisentido monocatenario y el tratamiento con FokI en presencia, por ejemplo, del activador FOKIact, dará lugar a la escisión de la cadena antisentido en la posición indicada.

Otro ejemplo del uso de una o unas URE para escindir un ADN monocatenario implica la región FR1 de las cadenas ligeras Kappa humanas. La Tabla 17 muestra un análisis de 182 cadenas kappa humanas de longitud completa para el emparejamiento con las cuatro secuencias sonda de 19 bases mostradas. El noventa y seis por ciento de las secuencias se emparejan con una de las sondas con 2 o menos emparejamientos erróneos. Los adaptadores URE mostrados en la Tabla 17 son para la escisión de la cadena con sentido de las cadenas kappa. Así, las secuencias adaptadoras son el complemento inverso de las secuencias de genes de la línea germinal. La URE consiste en un tallo de diez bases, un bucle de cinco bases, el complemento inverso del tallo y la secuencia de complementación. El bucle mostrado aquí es TTGTT, pero podrían usarse otras secuencias. Su función es interrumpir el palíndromo de los tallos de manera que se favorece la formación de un monómero lollypop sobre la dimerización. La Tabla 17 también muestra dónde se escinde la cadena con sentido.

Otro ejemplo de uso de una URE para escindir un ADN monocatenario implica la cadena ligera lambda humana. La Tabla 18 muestra el análisis de 128 cadenas ligeras lambda humanas para emparejamiento con las cuatro sondas de 19 bases mostradas. Con tres o menos emparejamientos erróneos, 88 de 128 (69%) de las cadenas se emparejan con una de las sondas. La Tabla 18 también muestra adaptadores URE correspondientes a estas sondas. La hibridación de estos adaptadores con el ADNss de cadena superior de las cadenas lambda y el tratamiento con FokI en presencia de FOKIact a una temperatura a o por encima de 45°C dará lugar a la escisión específica y precisa de las cadenas.

Las condiciones bajo las cuales las secuencias de oligonucleótido cortas del primer método y las URE del segundo método se ponen en contacto con los ADN monocatenarios pueden determinarse empíricamente. Las condiciones deben ser tales que el ADN monocatenario permanezca en forma sustancialmente monocatenaria. Más particularmente, las condiciones deben ser tales que el ADN monocatenario no forme bucles que puedan interferir con su asociación con la secuencia de oligonucleótido o la URE o que puedan proporcionar en sí mismos sitios para la escisión por la endonucleasa de restricción elegida.

La eficacia y especificidad de los oligonucleótidos cortos (primer método) y URE (segundo método) pueden ajustarse controlando las concentraciones de los adaptadores URE/oligonucleótidos y el ADN sustrato, la temperatura, el pH, la concentración de iones metálicos, la fuerza iónica, la concentración de caótropos (tales como urea y formamida), la concentración de la endonucleasa de restricción (por ejemplo, FokI), y el tiempo de la digestión. Estas condiciones pueden optimizarse con oligonucleótidos sintéticos que tengan: 1) secuencias de genes de la línea germinal diana, 2) secuencia de genes diana mutados, o 3) secuencias no diana relacionadas de alguna manera. El objetivo es escindir la mayor parte de las secuencias diana y cantidades mínimas de no dianas.

Según esta invención, el ADN monocatenario se mantiene sustancialmente en esa forma usando una temperatura entre aproximadamente 37°C y aproximadamente 75°C. Preferiblemente, se usa una temperatura entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 75°C. Más preferiblemente, se usa una temperatura entre 50°C y 60°C, lo más preferiblemente entre 55°C y 60°C. Estas temperaturas se emplean tanto cuando se pone en contacto el ADN con el oligonucleótido o URE y cuando se escinde el ADN usando los métodos de esta invención.

Los dos métodos de escisión de esta invención tienen varias ventajas. El primer método permite a los miembros individuales de la familia de ADN monocatenarios ser escindidos preferentemente en un sitio de reconocimiento de endonucleasa sustancialmente conservado. El método tampoco requiere construir un sitio de reconocimiento de endonucleasa en los cebadores de transcripción inversa o amplificación. Puede usarse cualquier sitio nativo o sintético en la familia.

El segundo método tiene estas dos ventajas. Además, el método con URE preferido permite escindir los ADN monocatenarios en posiciones en las que no se encuentra ningún sitio nativo de reconocimiento de endonucleasa o que se ha construido sintéticamente.

Lo más importante, los dos métodos de escisión permiten el uso de cebadores 5' y 3' con el fin de maximizar la diversidad y la escisión para eliminar secuencias no deseadas o perjudiciales antes de la clonación, presentación y/o expresión.

Después de la escisión de los ADN amplificados usando uno de los métodos de esta invención, el ADN se prepara para clonación, presentación y/o expresión. Esto se hace usando un adaptador de ADN sintético parcialmente en dúplex, cuya secuencia terminal se basa en el sitio de escisión específico en el que se ha escindido el ADN amplificado.

El ADN sintético se diseña de manera que cuando se liga al ADN monocatenario escindido en el marco de lectura apropiado el péptido, polipéptido o proteína deseado pueda presentarse en la superficie del paquete genético y/o expresarse. Preferiblemente, la parte bicatenaria del adaptador comprende la secuencia de varios codones que codifican la secuencia de aminoácidos característica de la familia de péptidos, polipéptidos o proteínas hasta el sitio de escisión. Para las cadenas pesadas humanas, se usan preferiblemente los aminoácidos del marco 3-23 para proporcionar las secuencias requeridas para la expresión del ADN escindido.

Preferiblemente, la parte bicatenaria del adaptador tiene una longitud de aproximadamente 12 a 100 bases. Más preferiblemente, se usan aproximadamente 20 a 100 bases. La región bicatenaria del adaptador también contiene preferiblemente al menos un sitio de reconocimiento de endonucleasa útil para clonar el ADN en un vector de presentación y/o expresión adecuado (o un vector receptor usado para archivar la diversidad). Este sitio de endonucleasa de restricción puede ser nativo respecto a las secuencias de genes de la línea germinal usadas para extender la secuencia de ADN. También puede construirse usando secuencias degeneradas respecto a las secuencias de genes de la línea germinal. O, puede ser completamente sintético.

La parte monocatenaria del adaptador es complementaria a la región de la escisión en el ADN monocatenario. La superposición puede ser de aproximadamente 2 bases hasta aproximadamente 15 bases. Cuando más larga sea la superposición, más probabilidad hay de que la ligación sea más eficaz. Una longitud preferida de superposición es 7 a

10. Esto permite algunos emparejamientos erróneos en la región de manera que puede capturarse la diversidad en esta región.

La región monocatenaria o de superposición del adaptador parcialmente en dúplex es ventajosa porque permite capturar el ADN escindido en el sitio elegido pero no otros fragmentos. Dichos fragmentos contaminarían la biblioteca con genes que codifican secuencias que no se plegarían en los anticuerpos correctos y que probablemente se unirían de forma no específica.

Una ilustración del uso de un adaptador parcialmente en dúplex en los métodos de esta invención implica la ligación de dicho adaptador a una región FR3 humana que se ha escindido, como se ha descrito anteriormente, en 5'-ACnGT-3' usando HpyCH4III, Bst4CI o TaaI.

La Tabla 4 F.2 muestra la cadena inferior de la parte bicatenaria del adaptador para la ligación al ADN de la cadena inferior escindido. Como el sitio HpyCH4III está muy a la derecha (como se muestra en la Tabla 3), puede añadirse una secuencia que incluye el sitio AflII así como el sitio XbaI. Esta parte de la cadena inferior del adaptador parcialmente en dúplex, H43.XAExt, incorpora tanto sitios XbaI como AflII. La cadena superior de la parte bicatenaria del adaptador no tienen ningún sitio (debido a los emparejamientos erróneos planeados en los segmentos opuestos a los sitios XbaI y AflII de H43.XAExt), pero hibridará muy fuertemente con H43.XAExt. H43AExt contiene sólo el sito AflII y puede usarse con las cadenas superiores H43.ABr1 y H43.ABr2 (que tienen alteraciones intencionadas para destruir el sitio AflII).

Después de la ligación, el ADN deseado, capturado, puede amplificarse de nuevo por PCR, si se desea, usando en la realización preferida un cebador en 3' respecto a la región constante del gen del anticuerpo y un cebador para parte de la región bicatenaria del adaptador. Los cebadores también pueden contener sitios de endonucleasa de restricción para usarse en la clonación del ADN amplificado.

Después de la ligación, y quizá de la amplificación, del adaptador parcialmente bicatenario con el ADN monocatenario amplificado, el ADN compuesto se escinde en los sitios de reconocimiento de endonucleasa 5' y 3' elegidos.

Los sitios de escisión útiles para la clonación dependen del fago o fagémido u otros vectores en los que se insertará el casete y de los sitios disponibles en los genes de anticuerpo. La Tabla 19 proporciona datos de endonucleasas de restricción para 75 cadenas ligeras humanas. La Tabla 20 muestra los datos correspondientes para 79 cadenas pesadas humanas. En cada Tabla, las endonucleasas están ordenadas por frecuencia creciente de corte. En estas Tablas, Nch es el número de cadenas cortado por la enzima y Ns es el número de sitios (algunas cadenas tienen más de un sitio).

De este análisis, SfiI, NotI, AflII, ApaLI, y AscI son muy adecuados. SfiI y NotI se usan preferiblemente en pCES1 para insertar el segmento de presentación de cadena pesada. ApaLI y AscI se usan preferiblemente en pCES1 para insertar el segmento de presentación de cadena ligera.

Los sitios BstEII aparecen en el 97% de los genes JH de la línea germinal. En los genes V reorganizados, sólo 54/79 (68%) de los genes de cadena pesada contiene un sitio BstEII y 7/61 de éstos contienen dos sitios. Así, 47/79 (59%) contiene un único sitio BstEII. Una alternativa al uso de BstEII es escindir mediante URE en el extremo de JH y ligar a un oligonucleótido sintético que codifica parte de CH1.

Un ejemplo de preparación de una familia de secuencias de ADN usando los métodos de esta invención implica capturar diversidad en CDR 3 humana. Como se ha descrito anteriormente, los ARNm de varios pacientes autoinmunes se transcriben de manera inversa en ADNc de cadena inferior. Después de degradar el ARN de cadena superior, la cadena inferior se inmoviliza y se usa un oligonucleótido corto para escindir el ADNc en 5' respecto a CDR3. Un adaptador de ADN sintético parcialmente en dúplex se hibrida con el ADN y el ADN se amplifica usando un cebador para el adaptador y un cebador para la región constante (después de FR4). El ADN se escinde usando BstEII (en FR4) y una endonucleasa de restricción apropiada para el adaptador parcialmente bicatenario (por ejemplo, XbaI y AflII (en FR3)). El ADN se liga en un esqueleto sintético VH tal como 3-23.

Un ejemplo de preparación de un ADN monocatenario que se escindió usando el método con URE implica la cadena Kappa humana. El sitio de escisión en la cadena con sentido de esta cadena se muestra en la Tabla 17. El oligonucleótido kapextURE se hibrida con los oligonucleótidos (kaBR01UR, kaBR02UR, kaBR03UR, y kaBR04UR) para formar un ADN parcialmente en dúplex. Este ADN se liga con las cadenas kappa solubles escindidas. El producto de la ligación se amplifica usando los cebadores kapextUREPCR y CKForeAsc (que inserta un sitio AscI después del extremo de C kappa). Este producto se escinde con ApaLI y AscI y se liga a un vector receptor cortado de manera similar.

Otro ejemplo implica la escisión de las cadenas ligeras lambda, ilustrado en la Tabla 18. Después de la escisión, se hibrida un extensor (on_LamEx133) y cuatro oligonucleótidos puente (ON_LamB1-133, ON-LamB2-133, ON_LamB3133, y ON-LamB4-133) para formar un ADN parcialmente en dúplex. Este ADN se liga con las cadenas con sentido cadena lambda escindidas. Después de la ligación, el ADN se amplifica con ON_Lam133PCR y un cebador directo específico para el dominio constante lambda, tal como CL2ForeAsc o CL7ForeAsc (Tabla 130).

En las cadenas pesadas humanas, pueden escindirse casi todos los genes en FR4 (en 3', es decir, hacia el extremo 3' de la cadena con sentido, de CDR3) en un sitio BstEII que está en una posición constante en una fracción muy grande de los genes de cadena pesada V humanos. Se necesita un sitio en FR3, si sólo quiere capturarse la diversidad en CDR3, en FR2, si se quiere la diversidad en CDR2 y CDR3, o en FR1, si se quiere toda la diversidad en CDR. Estos sitios se insertan preferiblemente como parte del adaptador parcialmente bicatenario.

La presente descripción también se refiere a vectores receptores (por ejemplo, para presentación y/o expresión) que tienen sitios que permiten la clonación de las cadenas ligeras o pesadas. Dichos vectores son muy conocidos y se usanampliamente en la técnica. Un vector fago de presentación preferido según esta invención es el fago MALIA3. Éste presenta en gen III. La secuencia del fago MALIA3 se muestra en la Tabla 21A (anotado) y en la Tabla 21B (condensado).

El ADN que codifica las regiones seleccionadas de las cadenas ligera o pesada puede transferirse a los vectores usando endonucleasas que sólo cortan bien las cadenas ligeras o pesadas muy raramente. Por ejemplo, las cadenas ligeras pueden capturarse con ApaLI y AscI. Los genes de cadena pesada se clonan preferiblemente en un vector receptor que tiene los sitios SfiI, NcoI, XbaI, AflII, BstEII, ApaI, y NotI. Las cadenas ligeras se mueven preferiblemente en la biblioteca como fragmentos ApaLI-AscI. Las cadenas pesadas se mueven preferiblemente en la biblioteca como fragmentos SfiI-NotI.

Lo más preferiblemente, la presentación se produce en la superficie de un derivado del fago M13. Los vectores más preferidos contienen todos los genes de M13, un gen de resistencia antibiótico y el casete de presentación. El vector preferido se proporciona con sitios de restricción que permiten la introducción y escisión de los miembros de la familia diversa de genes, como casetes. El vector preferido es estable frente a la reorganización bajo las condiciones de crecimiento usadas para amplificar el fago.

En otra realización de esta invención, la diversidad capturada por los métodos de la presente invención pueden presentarse y/o expresarse en un vector fagémido (por ejemplo, pCES1) que presenta y/o expresa el péptido, polipéptido o proteína. Dichos vectores también pueden usarse para almacenar la diversidad para presentación y/o expresión posterior usando otros vectores o fago.

En otra realización de esta invención, la diversidad capturada por los métodos de la presente invención puede presentarse y/o expresarse en un vector de levadura.

En otra realización, el modo de presentación puede ser a través de un conector corto de dominios de anclaje --comprendiendo un posible anclaje la parte final de M13 III ("soporteIII") y siendo un posible segundo anclaje la proteína madura de longitud completa III.

El fragmento de soporteIII contiene lo suficiente de M13 III para ensamblaje en el fago pero no los dominios implicados en mediar la infectividad. Como las proteínas III w.t. están presentes, no es probable que el fago delecione los genes de anticuerpo y el fago que delecione estos segmentos recibe sólo una ventaja muy pequeña de crecimiento. Para cada uno de los dominios de anclaje, el ADN codifica la secuencia de AA w.t., pero se diferencia de la secuencia de ADN w.t. en un grado muy alto. Esto reducirá de manera importante el potencial de recombinación homóloga entre el gen de anclaje y el w.t. que también está presente (véase el Ejemplo 6).

Lo más preferiblemente, la presente invención usa un fago completo que contiene un gen de resistencia a antibiótico (tal como un gen de resistencia a ampicilina) y el casete de presentación. Como los genes iii w.t. y posiblemente los genes viii están presentes, las proteínas w.t. también están presentes. El casete de presentación se transcribe desde un promotor regulable (por ejemplo, PLacz). El uso de un promotor regulable permite el control de la proporción del gen de presentación de fusión respecto a la proteína de recubrimiento w.t. correspondiente. Esta proporción determina el número medio de copias de la fusión de presentación por partícula fago (o fagémido).

En otra realización de los métodos de esta invención, el fago o fagémido puede presentar y/o expresar proteínas distintas de Fab, reemplazando las partes de Fab indicadas anteriormente, con genes de otras proteínas.

Pueden usarse varios huéspedes en el aspecto de presentación y/o expresión de esta invención. Dichos huéspedes son muy conocidos en la técnica. En la realización preferida, cuando se presentan y/o expresan Fab, el huésped preferido debe crecer a 30°C y ser RecA- (para reducir la recombinación genética no deseada) y EndA- (para facilitar la recuperación de RF ADN). También se prefiere que la cepa huésped se transforme fácilmente por electroporación.

XL1-Blue MRF' satisface la mayor parte de estas preferencias, pero no crece bien a 30°C. XL1-Blue MRF' crece lentamente a 38°C y es así un huésped aceptable. TG-1 también es un huésped aceptable aunque es RecA* y EndA*. XL1-Blue MRF' es más preferido para el huésped intermedio usado para acumular la diversidad antes de la construcción final de la biblioteca.

Después de la presentación y/o expresión, las bibliotecas de esta invención pueden cribarse usando técnicas muy conocidas y usadas convencionalmente. Los péptidos, polipéptidos o proteínas seleccionados pueden usarse para tratar enfermedades. Generalmente, los péptidos, polipéptidos o proteínas para usarse en terapia o en composiciones farmacéuticas se producen aislando el ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína deseado del miembro de la biblioteca seleccionado. Este ADN se usa en métodos convencionales para producir el péptido, polipéptido o proteína que codifica en células huésped apropiadas, preferiblemente células huésped de mamíferos, por ejemplo, células CHO. Después del aislamiento, el péptido, polipéptido o proteína se usa solo o con composiciones farmacéuticamente aceptables en terapia para tratar enfermedades.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Amplificación RACE de repertorios de cadena pesada y ligera de anticuerpo a partir de pacientes autoinmunes.

Se aisló ARN total de muestras de sangre individuales (50 ml) de 11 pacientes usando un kit RNAzolTM (CINNA/Biotecx), como describe el fabricante. Los pacientes se diagnosticaron como sigue:

1.

SLE y síndrome de fosfolípidos

2.

esclerosis sistémica limitada

3.

SLE y síndrome de Sjogren

4.

Esclerosis Sistémica Limitada

5.

Artritis Reumatoide con vasculitis activa

6.

Esclerosis sistémica limitada y Síndrome de Sjogren

7.

Artritis Reumatoide y vasculitis (no activa)

8.

SLE y Síndrome de Sjogren

9.

SLE

10.

SLE y glomerulonefritis (activa)

11.

Poliartritis/ Fenómeno de Raynauds

De estas 11 muestras de ARN total, se aisló ARN Poli-A+ usando el kit de aislamiento de ARNm PolyATtract® de promega (Promega).

250 ng de cada muestra de ARN poli-A+ se usaron para amplificar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo con el kit GeneRAacerTM (Invitrogen no. de cat L1500-01). Una visión global esquemática del procedimiento RACE se muestra en la FIG. 3.

Usando el protocolo general del kit GeneRAacer™, se ligó un adaptador de ARN al extremo 5' de todos los ARNm. A continuación, se realizó una reacción de transcriptasa inversa en presencia de cebador específico oligo(dT15) bajo las condiciones descritas por el fabricante en el kit GeneRAacer™.

Se usó 1/5 del ADNc de la reacción de transcriptasa inversa en una reacción de PCR de 20 ul. Para la amplificación del repertorio de cadena pesada de IgM, se usaron un cebador directo basado en la cadena CH1 de IgM [HuCmFOR] y un cebador inverso basado en la secuencia del adaptador sintético ligado [5'A]. (Véase la Tabla 22)

Para la amplificación de las cadenas ligeras kappa y lambda, se usó un cebador directo que contiene el extremo 3' codificador del ADNc [HuCkFor y HuCLFor2+HuCLfor7] y un cebador inverso basado en la secuencia del adaptador sintético ligado [5'A] (Véase la Tabla 22). Se obtuvieron productos de la amplificación específicos después de 30 ciclos de PCR primaria.

La FIG. 4 muestra los productos de amplificación obtenidos después de la reacción de PCR primaria de 4 muestras de pacientes diferentes. Se analizaron 8 ul del producto de PCR primaria de 4 pacientes diferentes en un gel de agarosa [marcados como 1, 2, 3 y 4]. Para la cadena pesada, se obtiene un producto de aproximadamente 950 nt mientras que para las cadenas ligeras kappa y lambda el producto es aproximadamente 850 nt. M1-2 son marcadores de peso molecular.

Los productos de PCR también se analizaron por secuenciación de ADN [10 clones de los repertorios de las cadenas lambda, kappa o pesada]. Todos los genes de anticuerpo secuenciados recuperados contenían la secuencia codificadora completa así como la secuencia líder en 5' y la diversidad en el gen V fue la diversidad esperada (comparada con los datos en la bibliografía).

50 ng de todas las muestras de todas las 11 muestras individuales amplificadas se mezclaron para las cadenas pesada, ligera lambda o ligera kappa y se usaron en reacciones de PCR secundarias.

En todas las PCR secundarias aproximadamente 1 ng de ADN molde de la mezcla de PCR primaria se usó en reacciones múltiples de PCR de 50 ul [25 ciclos].

Para la cadena pesada, se usó un cebador directo biotinilado anidado [HuCm-Anidado] y un cebador inverso en el extremo 5' anidado localizado en la secuencia del adaptador sintético [5'NA]. La cadena inferior de la cadena pesada estaba biotinilada en el extremo 5'.

Para las cadenas ligeras, se usó un cebador anidado biotinilado en el extremo 5' en el adaptador sintético [5'NA] en combinación con un cebador en el extremo 3' en la región constante de Ckappa y Clambda, extendido con una secuencia que codifica el sitio de restricción AscI [ kappa: HuCkForAscI, Lambda: HuCL2-FOR-ASC + HuCL7-FORASC]. [El extremo 5' del ADN de la Cadena Superior estaba biotinilado]. Después del análisis en gel, los productos de la PCR secundaria se juntaron y se purificaron con Promega Wizzard PCR cleanup. Se aislaron aproximadamente 25 ug de ADN biotinilado de la cadena pesada, cadena ligera lambda y kappa de los 11 pacientes.

Ejemplo 2: Captura de las cadenas kappa con BsmAI.

Se preparó un repertorio de ARNm de cadena kappa humana usando el método RACE del Ejemplo 1 a partir de una colección de pacientes con varias enfermedades autoinmunes.

Este Ejemplo siguió el protocolo del Ejemplo 1. Aproximadamente 2 microgramos (ug) de material RACE del gen de la cadena kappa humana (Igkappa) con biotina unida al extremo 5' de la cadena superior se inmovilizaron como en el Ejemplo 1 en 200 microlitros (μL) de lechos magnéticos de Seradyn. La cadena inferior se eliminó lavando el ADN con 2 alicuotas de 200 μL de 0,1 M NaOH (pH 13) durante 3 minutos para la primera alicuota seguido de 30 segundos para la segunda alicuota. Los lechos se neutralizaron con 200 μL de 10 mM Tris (pH 7,5) 100 mM NaCl. Los oligonucleótidos cortos mostrados en la Tabla 23 se añadieron en un exceso molar de 40 veces en 100 μL de tampón NEB 2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol pH 7,9) a los lechos secos. La mezcla se incubó a 95°C durante 5 minutos y se enfrió hasta 55°C durante 30 minutos. El oligonucleótido en exceso se eliminó por lavado con 2 lavados de tampón NEB 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol pH 7,9). Se añadieron diez unidades de BsmAI (NEB) en tampón NEB 3 y se incubó durante 1 h a 55°C. El ADN escindido en 3' se recogió y se purificó en una columna de purificación Qiagen PCR (FIGs. 5 y 6).

La FIG. 5 muestra un análisis de ADN monocatenario digerido kappa. Aproximadamente 151,5 pmoles de adaptador se hibridaron con 3,79 pmoles de ADN monocatenario inmovilizado kappa seguido de digestión con 15 U de BsmAI. El sobrenadante que contiene el ADN deseado se recogió y se analizó por gel de poliacrilamida al 5% junto con los lechos restantes que contenían el ADN kappa de longitud completa no escindido. Se purificaron 189 pmoles de ADN monocatenario escindido para análisis adicional. El cinco por ciento del ADNss de longitud completa original permaneció en los lechos.

La FIG. 6 muestra un análisis de la ligación extensor - kappa escindido. Se ligaron 180 pmoles de puente/extensor prehibridado con 1,8 pmoles de ADN monocatenario digerido con BsmAI. El ADN ligado se purificó por columna de purificación Qiagen PCR y se analizó en un gel de poliacrilamida al 5%. Los resultados indicaron que la ligación del extensor al ADN monocatenario tuvo una eficacia del 95%.

Se preparó un adaptador parcialmente bicatenario usando el oligonucleótido mostrado en la Tabla 23. El adaptador se añadió al ADN monocatenario en un exceso molar de 100 veces junto con 1.000 unidades de ADN ligasa T4 y se incubó toda la noche a 16°C. El oligonucleótido en exceso se eliminó con una columna de purificación Qiagen PCR. El material ligado se amplificó por PCR usando los cebadores kapPCRt1 y kapfor mostrados en la Tabla 23 durante 10 ciclos con el programa mostrado en la Tabla 24.

El producto de PCR soluble se corrió en un gel y mostró una banda de aproximadamente 700 n, como se esperaba (FIGs. 7 y 8). El ADN se escindió con las enzimas ApaLI y AscI, se purificó por gel y se ligó al vector escindido de manera similar pCES1.

La FIG. 7 muestra un análisis del producto de PCR de la amplificación extensor-kappa. El extensor-ADN monocatenario kappa ligado se amplificó con cebadores específicos para el extensor y para la región constante de la cadena ligera. Se usaron dos concentraciones diferentes de molde, 10 ng frente a 50 ng, como molde y se usaron 13 ciclos para generar aproximadamente 1,5 ug de ADNds como se muestra por análisis en gel de agarosa al 0,8%.

La FIG. 8 muestra un análisis del producto de PCR purificado de la amplificación extensor-kappa. Aproximadamente 5 ug del ADN bicatenario del extensor-kappa amplificado por PCR se corrieron en un gel de agarosa al 0,8%, se cortaron y se extrajeron con una columna de purificación en gel GFX. Por análisis en gel, se prepararon 3,5 ug de ADN bicatenario.

El ensayo para capturar las cadenas kappa con BsmA1 se repitió y se produjeron resultados similares. La FIG 9A muestra el ADN después de ser escindido y recogido y purificado en una columna de purificación Qiagen PCR. La FIG. 9B muestra el adaptador parcialmente bicatenario ligado al ADN monocatenario. Este material ligado se amplificó (FIG. 9C). El gel mostró una banda de aproximadamente 700 n.

La Tabla 25 muestra la secuencia de ADN de una cadena ligera kappa capturada por este procedimiento. La Tabla 26 muestra una segunda secuencia capturada por este procedimiento. La secuencia puente más cercana era complementaria a la secuencia 5'-agccacc-3', pero la secuencia capturada lee 5'-Tgccacc-3', lo que muestra que se tolera algún emparejamiento erróneo en la región superpuesta.

Ejemplo 3: Construcción de Diversidad Sintética en CDR1 y CDR2 en Marco V-3-23 VH.

La diversidad sintética en la Región Determinante de la Complementariedad (CDR) 1 y 2 se creó en el marco 3-23 VH en un proceso de dos etapas: en primer lugar se construyó un vector que contiene el marco 3-23 VH; y después, se ensamblaron CDR 1 y 2 sintéticas y se clonaron en este vector.

Para la construcción del marco 3-23 VH, 8 oligonucleótidos y dos cebadores de PCR (oligonucleótidos largos -TOPFR1A, BOTFR1B, BOTFR2, BOTFR3, F06, BOTFR4, ON-vgCl, y ON-vgC2 y cebadores - SFPRMET y BOTPCRPRIM, mostrados en la Tabla 27) que se superponen se diseñaron tomando como base la secuencia de Genebank de la región marco 3-23 VH. El diseño incorporó al menos un sitio de restricción útil en cada región marco, como se muestra en la Tabla 27. En la Tabla 27, los segmentos que se sintetizaron se muestran en negrita, las regiones de superposición están subrayadas y las regiones cebadoras de PCR en cada extremo están subrayadas.

Una mezcla de estos 8 oligos se combinó a una concentración final de 2,5uM en una reacción de PCR de 20ul. La mezcla de PCR contenía 200uM dNTPs, 2,5mM MgCl2, 0,02U ADN Polimerasa Pfu Turbo™, 1U ADN Polimerasa Taq HotStart Qiagen y 1X tampón de PCR Qiagen. El programa de PCR consistió en 10 ciclos de 94°C durante 30s, 55°C durante 30s y 72°C durante 30s.

La secuencia de ADN de 3-23 VH ensamblada se amplificó, usando 2,5ul de un dilución de 10 veces de la PCR inicial en 100ul de reacción de PCR. La reacción de PCR contenía 200uM dNTPs, 2,5mM MgCl2, 0,02U ADN Polimerasa Pfu Turbo™, 1U ADN POlimerasa Taq HotStart Qiagen, 1X Tampón de PCR Qiagen y 2 cebadores externos (SFPRMET y BOTPCRPRIM) a una concentración de 1uM. El programa de PCR consistió en 23 ciclos a 94°C durante 30s, 55°C durante 30s y 72°C durante 60s. La secuencia de ADN 3-23 VH se digirió y se clonó en pCES1 (vector fagémido) usando los sitios de endonucleasas de restricción SfiI y BstEII. Todas las enzimas de restricción mencionadas en la presente memoria se obtuvieron de New England BioLabs, Beverly, MA y se usaron según las instrucciones del fabricante.

Se introdujeron secuencias de relleno (mostradas en la Tabla 28 y Tabla 29) en pCES1 para reemplazar las secuencias CDR1/CDR2 (900 bases entre los sitios RE BspEI y XbaI) y las secuencias CDR3 (358 bases entre AflII y BstEII) antes de clonar la diversidad CDR1/CDR2. Este nuevo vector se denominó pCES5 y su secuencia se proporciona en la Tabla

29.

El tener rellenos en lugar de las CDR evita el riesgo de que una secuencia parental esté sobre representada en la biblioteca. Las secuencias de relleno son fragmentos del gen de la penicilasa de E. coli. El relleno CDR1-2 contiene los sitios de restricción para Bg1II, Bsu36I, BclI, XcmI, MluI, PvuII, HpaI, y HincII, siendo los sitios subrayados únicos en el vector pCES5. El relleno que reemplaza CDR3 contiene el sitio de endonucleasa de restricción único RsrII.

Una representación esquemática del diseño para la diversidad sintética de CDR1 y CDR2 se muestra en la FIG. 10. El diseño se basó en la presencia de mutaciones en DP47/3-23 y en genes de la línea germinal relacionados. La diversidad se diseñó para ser introducida en las posiciones en CDR1 y CDR2 indicadas por los números en la FIG. 10.

La diversidad en cada posición se eligió para ser uno de los tres esquemas siguientes: 1 = ADEFGHIKLMNPQRSTVWY; 2 = YRWVGS; 3 = PS, en los que las letras codifican mezclas equimolares se los aminoácidos indicados.

Para la construcción de la diversidad en CDR1 y CDR2, se diseñaron 4 oligonucleótidos de superposición (ON-vgC1, ON_Br12, ON_CD2Xba, y ON-vgC2, mostrados en la Tabla 27 y Tabla 30) que codifican CDR1/2, más regiones flanqueantes. Una mezcla de estos 4 oligos se combinó a una concentración final de 2,5uM en una reacción de PCR de 40ul. Dos de los 4 oligos contenían secuencias variegadas posicionadas en la CDR1 y la CDR2. La mezcla de PCR contenía 200uM dNTPs, 2,5U ADN Polimerasa Pwo (Roche), y 1X tampón de PCR Pwo con 2mM MgSO4. El programa de PCR consistió en 10 ciclos a 94°C durante 30s, 60°C durante 30s y 72°C durante 60s. Esta secuencia de ADN ensamblada CDR1/2 se amplificó usando 2,5ul de la mezcla en 100ul de reacción de PCR. La reacción de PCR contenía 200uM dNTPs, 2,5U ADN Polimerasa Pwo, 1X Tampón de PCR Pwo con 2mM MgSO4 y 2 cebadores externos a una concentración de 1uM. El programa de PCR consistió en 10 ciclos a 94°C durante 30s, 60°C durante 30s y 72°C durante 60s. Estas secuencias variegadas se digirieron y se clonaron en el marco 3-23 VH en lugar del relleno CDR1/2.

Obtuvimos aproximadamente 7 X 107 transformantes independientes. La diversidad en CDR3 bien de poblaciones donantes o de ADN sintético puede clonarse en el vector que contiene diversidad sintética en CDR1 y CDR 2.

Una representación esquemática de este procedimiento se muestra en la FIG. 11. Una secuencia que codifica las regiones FR del segmento génico humano V3-23 y regiones CDR con diversidad sintética se preparó por ensamblaje de oligonucleótidos y clonación mediante los sitios BspE1 y Xba1 en un vector que complementa las regiones FR1 y FR3. En esta biblioteca de segmentos sintéticos VH, se clonó la secuencia complementaria VH-CDR3 (superior derecha) mediante los sitios Xbal y BstEll. Los genes CH clonados resultantes contienen una combinación de diversidad sintética diseñada y diversidad natural (véase la FIG. 11).

Ejemplo 4: Escisión y ligación de las cadenas ligeras lambda con HinfI.

Un esquema de la escisión y ligación de las cadenas ligeras de anticuerpo se muestra en las FIGS.12A y 12B. Aproximadamente 2 ug de ADN Lambda humano biotinilado preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1 se inmovilizaron en 200 ul de lechos magnéticos Seradyn. La cadena inferior se eliminó por incubación del ADN con 200 ul de 0,1 M NaOH (pH=13) durante 3 minutos, el sobrenadante se eliminó y se realizó un lavado adicional de 30 segundos con 200 ul de 0,1 M NaOH. El sobrenadante se quitó y los lechos se neutralizaron con 200 ul de 10 mM Tris (pH=7.5), 100 mM NaCl. Se realizaron 2 lavados adicionales con 200 ul tampón NEB2 2, que contiene 10 mM Tris (pH=7,9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 y 1 mM ditiotreitol. Después de la inmovilización, la cantidad de ADNss se estimó en un gel 5% PAGE-UREA.

Aproximadamente 0,8 ug de ADNss se recuperaron y se incubaron en 100 ul de tampón NEB2 2 que contiene un exceso molar de 80 veces de una mezcla equimolar de ON_LamlaB7, ON_Lam2aB7, ON Lam31B7 y ON_Lam3rB7 [cada oligo en un exceso molar de 20 veces] (véase la Tabla 31).

La mezcla se incubó a 95°C durante 5 minutos y se enfrió lentamente hasta 50°C durante un periodo de 30 minutos. El exceso de oligonucleótido se eliminó por lavado con 2 lavados de 200 ul de tampón NEB 2. Se añadieron 4 U/ug de Hinf I y se incubó durante 1 hora a 50° C. Los lechos se mezclaron cada 10 minutos.

Después de incubar la muestra se purificó en una columna de purificación Qiagen PCR y se analizó posteriormente en un gel 5% PAGE-urea (véase la FIG. 13A, la eficacia de la escisión fue más del 70%).

Un esquema de la ligación de las cadenas ligeras escindidas se muestra en la FIG. 12B. Se preparó una mezcla de pares puente/extensor de los oligos Brg/Ext listados en la Tabla 31 (exceso molar total de 100 veces) en 1.000 U de ADN ligasa T4 (NEB) y se incubó toda la noche a 16° C. Después de ligar el ADN, el oligonucleótido en exceso se eliminó con una columna de purificación Qiagen PCR y la ligación se comprobó en un gel Urea-PAGE (véase la FIG. 13B; la eficacia de la ligación fue mayor del 95%).

Se realizaron múltiples PCR que contienen 10 ng del material ligado en una reacción de PCR de 50 ul usando 25 pMoles ON lamPlePCR y 25 pmoles de una mezcla equimolar de cebador Hu-CL2AscI/HuCL7AscI (véase el Ejemplo 1).

Se realizó PCR a 60° C durante 15 ciclos usando polimerasa Pfu. Aproximadamente 1 ug de ADNds se recuperó por PCR (véase la FIG. 13C) y se escindió con ApaL1 y AscI para clonación de las cadenas ligeras lambda en pCES2.

Ejemplo 5: Captura de la población de CD3 de la cadena pesada humana.

Un esquema de la escisión y ligación de las cadenas ligeras de anticuerpo se muestra en las FIGS. 14A y 14B.

Aproximadamente 3 ug de material RACE del gen de la cadena pesada humana (IgM) con biotina unida en el extremo 5' de la cadena inferior se inmovilizaron en 300 uL de lechos magnéticos Seradyn. La cadena superior se eliminó lavando el ADN con 2 alicuotas de 300 μL de 0,1 M NaOH (pH 13) durante 3 minutos para la primera alicuota seguido de 30 segundos para la segunda alicuota. Los lechos se neutralizaron con 300 μL de 10 mM Tris (pH 7,5) 100 mM NaCl. Los REdaptors (oligonucleótidos usados para hacer un ADN monocatenario localmente bicatenario) mostrados en la Tabla 32 se añadieron en un exceso molar de 30 veces en 200 uL de tampón NEB 4 (50 mM Acetato de Potasio, 20 mM Tris-Acetato, 10 mM Acetato de Magnesio, 1 mM ditiotreitol pH 7,9) a los lechos secos. Los REadaptors se incubaron con el ADN monocatenario a 80°C durante 5 minutos y se enfriaron hasta 55°C durante 30 minutos. Los REdaptors en exceso se eliminaron por lavado con 2 lavados de tampón NEB 4. Se añadieron quince unidades de HpyCH4III (NEB) en tampón NEB 4 y se incubó durante 1 hora a 55 °C. El ADN escindido en 3' que permanece en los lechos se eliminó de los lechos usando una columna de eliminación Qiagen Nucleotide (véase la FIG. 15).

Los pares Puente/Extensor mostrados en la Tabla 33 se añadieron en un exceso molar de 25 veces junto con 1.200 unidades de ADN ligasa T4 y se incubó toda la noche a 16°C. El Puente/Extensor en exceso se eliminó con una columna de purificación Qiagen PCR. El material ligado se amplificó por PCR usando los cebadores H43.XAExtPCR2 y Hucumnest mostrados en la Tabla 34 durante 10 ciclos con el programa mostrado en la Tabla 35.

El producto de PCR soluble se corrió en un gel y mostró una banda de aproximadamente 500 n, como se esperaba (véase la FIG.15B). El ADN se escindió con las enzimas SfiI y NotI, se purificó por gel y se ligó al vector escindido de manera similar pCES1.

Ejemplo 6: Descripción del Vector de Presentación en Fago CJRA05, un miembro de la biblioteca construida en el vector DY3F7.

La Tabla 36 contiene una secuencia de ADN anotada de un miembro de la biblioteca, CJRA05, véase la FIG. 16. La Tabla 36 debe leerse como sigue: en cada línea todo los que sigue a un signo de exclamación "!" es un comentario. Todas las apariciones de A, C, G, y T antes de "!" son la secuencia de ADN. Las mayúsculas se usan sólo para mostrar que determinadas bases constituyen características especiales, tales como sitios de restricción, sitios de unión a ribosoma, y semejantes, que están marcadas por debajo del ADN. CJRA05 es un derivado del fago DY3F7, obtenido por clonación de un fragmento ApaLI a NotI en estos sitios en DY3F31. DY3F31 es como DY3F7 excepto en que los genes de la cadena ligera y la cadena pesada se han reemplazado por ADN "de relleno" que no codifica ningún anticuerpo. DY3F7 contiene un anticuerpo que une estreptavidina, pero no proviene de la presente biblioteca.

Los genes de fago empiezan con el gen ii y continúan con los genes x, v, vii, ix, viii, iii, vi, i, y iv. El gen iii se ha modificado ligeramente ya que se han insertado ocho codones entre la secuencia señal y la proteína madura y los aminoácidos finales de la secuencia señal se han alterado. Esto permite que estén presentes sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción EagI y XbaI. Después del gen iv está el origen de replicación (ori) del fago. Después de ori está bla que confiere resistencia a ampicilina (ApR). Los genes de fago y bla se transcriben en el mismo sentido.

Después de bla, está el casete Fab (ilustrado en la FIG. 17) que comprende:

a) Promotor PlacZ,

b) Un primer Sitio de Unión a Ribosoma (RBS1),

c) La secuencia señal de M13 iii,

d) un RERS ApaLI,

e) Una cadena ligera (una kappa L20::JK1 acortada por un codón en el límite V-J en este caso),

f) Un RERS AscI,

g) Un segundo Sitio de Unión a Ribosoma (RBS2),

h) Una secuencia señal, preferiblemente PelB, que contiene,

i) Un RERS SfiI,

j) Una región sintética 3-23 V con diversidad en CDR1 y CDR2,

k) Una CDR3 capturada,

l) Una región parcialmente sintética J (FR4 después de BstEII),

m) CH1,

n) Un RERS NotI,

o) Una etiqueta His6,

p) Una etiqueta cMyc,

q) Un codón ámbar, r) Un ADN de anclaje que codifica la misma secuencia de aminoácidos que los codones 273 a 424 de M13 iii (como se muestra en la Tabla 37).

s) Dos codones de parada,

t) Un RERS AvrII, y

u) Un terminador trp.

El anclaje (elemento r) codifica la misma secuencia de aminoácidos que los codones 273 a 424 de M13 iii pero el ADN es aproximadamente tan diferente como es posible de la secuencia de ADN de tipo salvaje. En la Tabla 36, el eje III' va desde la base 8997 a la base 9455. Por debajo del ADN, como comentarios, están las diferencias con iii de tipo salvaje para los codones comparables con "!W.T" en los extremos de estas líneas. Obsérvese que Met y Trp sólo tienen un único codón y deben dejarse como tal. Estos tipos de AA son raros. Los codones Ser pueden cambiarse en las tres bases, mientras que los codones Leu y Arg pueden cambiarse en dos.

En la mayor parte de los casos, puede introducirse un cambio de base por codón. Esto tiene tres ventajas: 1) la recombinación con el gen de tipo salvaje producida en otra parte en el fago es menos probable, 2) pueden introducirse nuevos sitios de restricción, lo que facilita la construcción; y 3) pueden diseñarse cebadores de secuenciación que se unen sólo a una de las dos regiones.

El fragmento de M13 III mostrado en CJRA05 tiene la longitud preferida para el segmento de anclaje. También pueden utilizarse segmentos de anclaje alternativos más largos o más cortos definidos por referencia a la proteína III madura completa.

La secuencia de M13 III consiste en los elementos siguientes: Secuencia Señal::Dominio 1 (D1)::Conector 1 (L1)::Dominio 2 (D2)::Conector 2 (L2)::Dominio 3 (D3)::Segmento Transmembrana (TM):: Anclaje Intracelular (IC) (véase la Tabla 38).

El anclaje pIII (también conocido como trpIII) consiste preferiblemente en D2::L2::D3::TM::IC. Otra realización para el anclaje pIII consiste en D2'::L2::D3::TM::IC (en el que D2' comprende los últimos 21 residuos de D2 con los primeros 109 residuos delecionados). Una realización adicional del anclaje pIII consiste en D2'(C>S)::L2::D3::TM::IC (en el que D2'(C>S) es D2' con el único C convertido en S), y d) D3::TM::IC.

La Tabla 38 muestra un fragmento de gen que comprende el sitio NotI, etiqueta His6, etiqueta cMyc, un codón ámbar, un sitio de escisión de enteroquinasa recombinante, y la proteína M13 III total madura. El ADN usado para codificar esta secuencia es intencionadamente muy diferente del ADN del gen iii de tipo salvaje como se muestra por las líneas indicadas como "W.T." que contiene las bases w.t. en las que éstas se diferencian de este gen. III está dividido en dominios indicados como "dominio 1", "conector 1", "dominio 2", "conector 2", "dominio 3", "segmento transmembrana", y "anclaje intracelular".

Los segmentos de anclaje alternativos preferidos (definidos por referencia a la secuencia de la Tabla 38) incluyen:

codones 1-29 unidos a los codones 104-435, delecionando el dominio 1 y reteniendo el conector 1 en el extremo;

codones 1-38 unidos a los codones 104-435, delecionando el dominio land y reteniendo el sitio de escisión rEK más el conector 1 en el extremo de III;

codones 1-29 unidos a los codones 236-435, delecionando el dominio 1, conector 1, y la mayor parte del dominio 2 y reteniendo el conector 2 en el extremo;

codones 1-38 unidos a los codones 236-435, delecionando el dominio 1, conector 1, y la mayor parte del dominio 2 y reteniendo el conector 2 en el extremo y el sitio de escisión rEK;

codones 1-29 unidos a los codones 236-435 y cambiando el codón 240 a Ser (por ejemplo, agc), delecionando el dominio 1, conector 1, y la mayor parte del dominio 2 y reteniendo el conector 2 en el extremo; y

codones 1-38 unidos a los codones 236-435 y cambiando el codón 240 a Ser (por ejemplo, agc), delecionando el dominio 1, conector 1, y la mayor parte del dominio 2 y reteniendo el conector 2 en el extremo y el sitio de escisión rEK.

Las construcciones se deberán hacer fácilmente por métodos similares a los de Wang y Wilkinson (Biotechniques 2001: 31(4)722-724) en los que se usa PCR para copiar el vector excepto la parte que se va a delecionar y se introducen sitios de restricción correspondientes o se retienen en cualquiera de los extremos de la parte que se va a conservar. La Tabla 39 muestra los oligonucleótidos que se deben usar en la deleción de las partes del segmento de anclaje III. El ADN mostrado en la Tabla 38 tiene un sitio NheI antes del sitio de escisión de la enteroquinasa recombinante (rEKCS) DINDDRMA. Si se usa NheI en el proceso de deleción con este ADN, el sitio rEKCS se perdería. Este sitio podría ser muy útil en la escisión de Fab del fago y podría facilitar la captura de anticuerpos de muy alta afinidad. Se podría mutagenizar esta secuencia de manera que el sitio NheI estaría después del sitio rEKCS, una secuencia de aminoácido Ala Ser está ya presente. Alternativamente, se podría usar SphI para las deleciones. Esto implicaría un cambio ligero en la secuencia de aminoácidos pero no tendría ninguna consecuencia.

Ejemplo 7 : Selección de ligantes de anticuerpo de una biblioteca enriquecida de anticuerpos humanos usando el vector fago DY3F31.

En este ejemplo, la biblioteca de anticuerpo humano usada se describe en de Haard et al., (Journal of Biological Chemistry, 274 (26): 18218-30 (1999). Esta biblioteca, que consiste en una biblioteca de fagémido grande Fab no inmune humano, se enriqueció en primer lugar en antígeno, bien en estreptavidina o en fenil-oxazolona (phOx). Los métodos para esto son muy conocidos en la técnica. Dos bibliotecas Fab preseleccionadas, la primera seleccionada una vez en phOx-BSA (R1-ox) inmovilizado y la segunda seleccionada dos veces en estreptavidina (R2-strep), se eligieron para la reclonación.

Estos repertorios enriquecidos de anticuerpos de fago, en los que sólo un porcentaje muy bajo tenía actividad de unión al antígeno usado en la selección, se confirmaron por cribado de los clones en un ELISA para unión de antígeno. Los genes Fab seleccionados se transfirieron del vector fagémido de esta biblioteca al vector DY3F31 mediante sitios de restricción ApaL1-Not1.

El ADN del vector fago DY3F31 se pretrató con ADNasa dependiente de ATP para eliminar el ADN cromosómico y se digirió con ApaL1 y Not1. Se realizó una digestión extra con AscI entre medias para evitar la autoligación del vector. El fragmento ApaL1/NotI Fab de las bibliotecas preseleccionadas se ligó posteriormente al ADN del vector y se transformó en células XL1-blue MRF competentes.

Las bibliotecas se hicieron usando unas proporciones vector:inserto de 1:2 para la biblioteca phOx y 1:3 para la biblioteca STREP y usando 100 ng de ADN ligado por 50 μl de células competentes para la electroporación (condiciones de la electroporación: un choque de 1.700 V, 1 hora de recuperación de las células en medio SOC rico, siembra en placas de agar que contienen ampicilina).

Esta transformación resultó en una biblioteca con un tamaño de 1,6 x 106 para R1-ox en DY3F31 y 2,1 x 106 para R2strep en DY3F31. Dieciséis colonias de cada biblioteca se cribaron para el insreto y todas mostraron el inserto con el tamaño correcto (±1.400 pb) (para las dos bibliotecas).

El fago se preparó a partir de estas bibliotecas Fab como sigue. Una muestra representativa de la biblioteca se inoculó en medio con ampicilina y glucosa, y a DO 0,5, el medio se cambió por ampicilina y 1 mM IPTG. Después de un crecimiento toda la noche a 37 °C, el fago se recogió del sobrenadante por precipitación con PEG-NaCl. El fago se usó para selección en el antígeno. R1-ox se seleccionó en phOx-recubierto con BSA por adsorción pasiva en inmunotubos y R2-strep en lechos paramagnéticos recubiertos con estreptavidina (Dynal, Noruega), en procedimientos descritos en de Haard et. al. y Marks et. al., Journal of Molecular Biology, 222(3): 581-97 (1991). Las titulaciones de fago se proporcionan en la Tabla 40.

Los clones de estas bibliotecas seleccionadas, denominados R2-ox y R3-strep respectivamente, se cribaron para unión a sus antígenos en ELISA. 44 clones de cada selección se tomaron aleatoriamente y se cribaron como Fab de fago o soluble para unión en ELISA. Para las bibliotecas en DY3F31, los clones se crecieron en primer lugar en 2TY-2% glucosa-50 μg/ml AMP hasta una DO600 de aproximadamente 0,5 y se crecieron toda la noche en 2TY-50 μg/ml AMP +/- 1mM IPTG. La inducción con IPTG puede resultar en la producción tanto de Fab de fago como de Fab soluble. Por lo tanto, los (mismos) clones también se crecieron sin IPTG. La Tabla 41 muestra los resultados de un cribado con ELISA del sobrenadante resultante, bien para la detección de partículas de fago con unión a antígeno (Anti-M13 HRP = anticuerpo anti-fago), o para la detección de Fab humanos, en el fago o como fragmentos solubles, bien usando el anticuerpo anti-myc 9E10 que detecta la etiqueta myc que porta cada Fab en el extremo C-terminal de la cadena pesada seguido de un suero de conejo anti-Ratón marcado con HRP (columna 9E10/RAM-HRP), o con reactivo anticadena ligera seguido de un antisuero de cabra anti-conejo marcado con HRP (anti-CK/CL Gar-HRP).

Los resultados muestran que en ambos casos, se identifican ligantes de antígeno en la biblioteca, con como Fab en fago o con los reactivos anti-Fab (Tabla 41). La inducción con IPTG rinde un incremento en el número de positivos. También puede verse que para los clones phOx, el ELISA de fago rinde más positivos que el ELISA de Fab soluble, debido muy probablemente a la unión ávida del fago. Veinticuatro de los clones positivos en ELISA se cribaron usando PCR del inserto Fab del vector, seguido de digestión con BstNI. Esto rindió 17 patrones diferentes para los Fab de unión phOx en 23 muestras que se analizaron correctamente y 6 de 24 para los clones de unión de estreptavidina. Así, los datos de la selección y cribado de esta biblioteca de Fab no inmune pre-enriquecida muestran que el vector DY3F31 es adecuado para la presentación y selección de fragmentos Fab y proporciona tanto Fab soluble como Fab en fago para los experimentos de cribado después de la selección.

Ejemplo 8: Selección de bibliotecas Fago-anticuerpo en lechos magnéticos de estreptavidina.

El ejemplo siguiente describe una selección en la que primero se depleciona una muestra de la biblioteca de ligantes de estreptavidina y opcionalmente de ligantes de una no diana (es decir, una molécula distinta de la diana a la que no se quiere que se una el Fab seleccionado). Se hipotetiza que se tiene una molécula, denominada un "ligando competitivo", que se une a la diana y que un anticuerpo que se une en el mismo sitio sería especialmente útil.

Para este procedimiento se bloquearon Lechos Magnéticos de Estreptavidina (Dynal) una vez con disolución de bloqueo (2% Leche Marvel, PBS (pH 7,4), 0,01% Tween-20 ("2%MPBST")) durante 60 minutos a temperatura ambiente y se lavaron cinco veces con 2%MPBST. 450 μL de lechos se bloquearon para cada depleción y conjunto posterior de selección.

Para cada selección, se añadieron 6,25 μL de diana de depleción biotinilada (1 mg/mL disolución madre en PBST) a 0,250 mL de lechos lavados, bloqueados (de la etapa 1). Se dejó que la diana se uniera toda la noche, con mezclado por rotación, a 4°C. Al día siguiente, los lechos se lavan 5 veces con PBST.

Para cada selección, se añadieron 0,010 mL de antígeno diana biotinilado (1 mg/mL disolución madre en PBST) a 0,100 mL de lechos bloqueados y lavados (de la etapa 1). Se dejó que el antígeno se uniera toda la noche, con mezclado por rotación, a 4°C. Al día siguiente, los lechos se lavaron 5 veces con PBST.

En el ciclo 1, 2 X 1012 hasta 1013 unidades formadoras de placas (pfu) por selección se bloquearon frente a unión no específica añadiendo a 0,500 mL de 2%MPBS (=2%MPBST sin Tween) durante 1 hr a RT (con mezclado por rotación). En ciclos posteriores, 1.011 pfu por selección se bloquearon como se ha hecho en el ciclo 1.

Cada conjunto de fagos se incubó con 50 μL de lechos diana de depleción (el sobrenadante del lavado final se eliminó justo antes del uso) en un mezclador por rotación Labquake durante 10 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, el sobrenadante de los fagos se retiró y se incubó con otros 50 μL de lechos diana de depleción. Esto se repitió 3 veces más usando lechos diana de depleción y dos veces usando lechos de estreptavidina bloqueados durante un total de 7 ciclos de depleción, de manera que cada conjunto de fagos requirió 350 μL de lechos de depleción.

Una pequeña muestra de cada conjunto de biblioteca deplecionado se tomó para titulación. Cada conjunto de biblioteca se añadió a 0,100 mL de lechos diana (el sobrenadante del lavado final se retiró justo antes del uso) y se dejó incubar durante 2 horas a temperatura ambiente (con mezclado por rotación).

Los lechos se lavaron tan rápidamente como fue posible (por ejemplo, 3 minutos en total) con 5 X 0,500 mL PBST y 2X con PBS. Los fagos todavía unidos a los lechos después del lavado se eluyeron una vez con 0,250 mL de ligando competitivo (~1 μμM) en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente en un mezclador por rotación Labquake. El eluato se retiró, se mezcló con 0,500 mL disolución de sales Mínima A y se guardó. Para una segunda selección, se usaron 0,500 mL 100 mM TEA para la elución durante 10 min a RT, se neutralizó en una mezcla de 0,250 mL de 1 M Tris, pH 7,4 + 0,500 mL sales Min A.

Después de la primera elución de selección, los lechos pueden eluirse de nuevo con 0,300 mL de diana no biotinilada (1 mg/mL) durante 1 hr a RT en un mezclador por rotación Labquake. Los fagos eluidos se añaden a 0,450 mL de sales Mínima A.

Tres eluatos (competidor de la 1a selección, diana de la 1a selección y elución con TEA neutralizada de la 2a selección) se guardaron separados y se tomó una pequeña alicuota de cada uno para titulación. Se añadieron 0,500 mL de sales Mínima A a las alicuotas de lechos restantes después de la elución del competidos y la diana y después de la elución con TEA. La toma de una pequeña alicuota de cada uno se tomó para titulación.

Cada elución y cada conjunto de lechos eluidos se mezcló con 2X YT y una alicuota (por ejemplo, 1 mL con 1. E 10/mL) de células XL1-Blue MRF' de E. coli (u otra línea celular F') que se había enfriado en hielo después de haberse crecido hasta la fase semi-logarítmica, se privaron y se concentró (véase el procedimiento más adelante - "Prep semi-Log de células XL-1 blue MRF' para infección").

Después de aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente, las mezclas fago/célula se extendieron en Placas Bio-Assay (243 X 243 X 18 mm, Nalge Nunc) que contienen agar 2XYT, 1mM IPTG. Las placas se incubaron toda la noche a 30°C. Al día siguiente, cada cultivo de fago amplificado se recogió de su placa respectiva. La placa se inundó con 35 mL TBS o LB y las células se rasparon de la placa. Las células resuspendidas se transfirieron a una botella de centrífuga. Se usaron 20 mL adicionales de TBS o LB para eliminar todas las células de la placa y se juntaron con las células en la botella de centrífuga. Las células se retiraron por centrifugación y el fago en el sobrenadante se recuperó por precipitación con PEG. Durante el día siguiente, las preps de fago amplificadas se titularon.

En el primer ciclo, dos selecciones rindieron cinco eluatos amplificados. Estos eluatos amplificados se recubrieron durante 2-3 ciclos adicionales de selección usando ~1. E 12 entrada de fago/ciclo. Para cada ciclo adicional, los lechos de depleción y diana se prepararon la noche anterior al inicio del ciclo.

Para las etapas de elución en ciclos posteriores, se hicieron todas las eluciones hasta la etapa de elución de la que procede la elución amplificada y las eluciones previas se trataron como lavados. Para los fagos amplificados de los lechos de infección, por ejemplo, se hicieron las eluciones del ligando competitivo y la diana y se mezclaron como lavados (véase más adelante). Los lechos se usaron para infectar a E. coli. Dos conjuntos, por lo tanto, rindieron un total de 5 eluciones finales al final de la selección.

1er conjunto de selección

A. Elución amplificada de ligando: eluir con ligando durante 1 hr, guardar como elución

B. Elución amplificada de diana: eluir con ligando durante 1 hr, mezclar como eluato de lavado con diana durante 1 hr, guardar como elución

C. Elución amplificada de infección de lechos: eluir con ligando durante 1 hr, mezclar como eluato de lavado con diana durante 1 hr, mezclar como eluato de lavado con infección celular, guardar como elución

2º conjunto de selección

A. Elución amplificada de TEA: eluir con TEA 10min, guardar como elución

B. Elución amplificada de infección de lechos: eluir con TEA 10min, mezclar como elute de lavado con infección celular, guardar como elución

Prep semi-log de células XL1 blue MRF' para infección (basada en Barbas et al. Phage Display manual procedure)

Cultivar XL1 blue MRF' en NZCYM (12,5 mg/mL tet) a 37°C y 250 rpm toda la noche. Se empezó un cultivo de 500 mL en matraz de 2 litros diluyendo las células 1/50 en NZCYM/tet (10 mL añadidos de cultivo de toda la noche) y se incubó a 37°C a 250 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 0,45 (1,5-2 hrs). La agitación se redujo hasta 100 rpm durante 10 min. Cuando la DO600 fue entre 0,55-0,65, las células se transfirieron a 2 botellas de centrífuga de 250 mL, se centrifugó a 600 g durante 15 min a 4°C. El sobrenadante se retiró por vertido. El líquido residual se retiró con una pipeta.

Los sedimentos se resuspendieron suavemente (sin pipetear arriba y abajo) en el volumen original de 1 X sales Mínima A a temperatura ambiente. Las células resuspendidas se transfirieron de nuevo al matraz de 2 litros, se agitaron a 100 rpm durante 45 min a 37°C. Este proceso se realizó con el fin de privar las células y restaurar pili. Las células se transfirieron a 2 botellas de centrífuga de 250 mL y se centrifugaron como anteriormente.

Las células se resuspendieron suavemente en sales Mímina A enfriadas en hielo (5 mL por 500 mL de cultivo original). Las células se pusieron en hielo para uso en infecciones tan pronto como fue posible.

Los eluatos de fago se llevaron hasta 7,5 mL con medio 2XYT y se añadieron 2,5 mL de células. Los lechos se llevaron hasta 3 mL con 2XYT y se añadió 1 mL de células. Se incubó a 37oC durante 30 min. Las células se sembraron en placas NUNC grandes con agar 2XYT, 1 mM IPTG y se incubaron durante 18 hr a 30°C.

Ejemplo 9: Incorporación de región sintética en la región FR1/3.

Más adelante se describen ejemplos para incorporar residuos fijos en secuencias de anticuerpo para los genes de la cadena ligera kappa y lambda, y para las cadenas pesadas. Las condiciones experimentales y los oligonucleótidos usados para los ejemplos siguientes se han descrito en ejemplos previos (por ejemplo los Ejemplos 3 y 4).

El proceso para incorporar residuos FR1 fijos en una secuencia lambda de anticuerpo consiste en 3 etapas (véase la FIG. 18): (1) hibridar el material de ADN monocatenario que codifica los genes VL con una mezcla de oligonucleótidos parcialmente complementarios (indicado con Ext y Puente), para hibridar en este ejemplo con la región que codifica los residuos 5-7 de FR1 de los genes lambda (indicado con X..X; en los genes lambda la superposición puede no ser perfecta algunas veces); (2) ligación de este complejo; (3) PCR del material ligado con el cebador indicado ('PCRpr') y por ejemplo un cebador basado en el gen VL. En este proceso los primeros pocos residuos de todos los genes lambda estarán codificados por las secuencias presentes en los oligonucleótidos (Ext., Puente o PCRpr). Después de la PCR, los genes lambda pueden clonarse usando el sitio de restricción indicado para ApaLI.

El proceso para incorporar residuos FR1 fijos en una secuencia kappa de anticuerpo (FIG. 19) consiste en 3 etapas: (1) hibridar el material de ADN monocatenario que codifica los genes VK con una mezcla de oligonucleótidos parcialmente complementarios (indicado con Ext y Bri), para hibridar en este ejemplo con la región que codifica los residuos 8-10 de FR1 de los genes kappa (indicado con X..X; en los genes kappa la superposición puede no ser perfecta algunas veces);

(2) ligación de este complejo; (3) PCR del material ligado con el cebador indicado ('PCRpr') y por ejemplo un cebador basado en el gen VK. En este proceso los primeros pocos (8) residuos de todos los genes kappa estarán codificados por las secuencias presentes en los oligonucleótidos (Ext., Puente o PCRpr). Después de la PCR, los genes kappa pueden clonarse usando el sitio de restricción indicado para ApaLI.

El proceso para incorporar residuos FR3 fijos en una secuencia de cadena pesada de anticuerpo (FIG. 20) consiste en 3 etapas: (1) hibridar el material de ADN monocatenario que codifica parte de los genes VH (por ejemplo, que codifica las regiones FR3, CDR3 y FR4) con una mezcla de oligonucleótidos parcialmente complementarios (indicado con Ext y Puente), para hibridar en este ejemplo con la región que codifica los residuos 92-94 (en la región FR3) de los genes VH (indicado con X..X; en los genes VH la superposición puede no ser perfecta algunas veces); (2) ligación de este complejo; (3) PCR del material ligado con el cebador indicado ('PCRpr') y por ejemplo un cebador basado en el gen VH (tal como en la región FR4). En este proceso determinados residuos de todos los genes VH estarán codificados por las secuencias presentes en los oligonucleótidos usados aquí, en particular de PCRpr (para los residuos 70-73), o de los oligonucleótidos Ext/Puente (residuos 74-91). Después de la PCR, los genes VH parciales pueden clonarse usando el sitio de restricción indicado para XbaI.

Deberá entenderse que lo anterior es sólo ilustrativo de los principios de esta invención y que los expertos en la técnica pueden hacer varias modificaciones sin apartarse del alcance de y el espíritu de la invención.

Tabla 2: Enzimas que cortan bien 15 o más GLG humanos o tienen 5+-base de reconocimiento en la entrada Típica de FR3:

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

BstEII Ggtnacc

2

1: 3

48: 3

Hay 2 aciertos en la base#

3

MaeIII gtnac

36

1: 4

2: 4 3: 4 4: 4 5: 4 6: 4

7: 4

8: 4 9: 4 10: 4 11: 4 37: 4

37: 58

38: 4 38: 58 39: 4 39: 58 40: 4

40: 58

91: 4 91: 58 42: 4 42: 58 93: 4

43: 58

44: 4 44: 58 45: 4 45: 58 46: 4

46: 58

47: 4 47: 58 48: 4 49: 4 50: 58

Hay 24 aciertos en la base#

4

Tsp45I gtsac

33

1: 4

2: 4 3: 4 4: 4 5: 4 6: 4

7: 4

8: 4 9: 4 10: 4 11: 4 37: 4

37: 58

38: 4 38: 58 39: 58 40: 4 40: 58

41: 58

42: 58 43: 4 43: 58 44: 4 44: 58

45: 4

45: 58 46: 4 46: 58 47: 4 97: 58

48: 4

49: 4 50: 58

Hay 21 aciertos en la base#

4

HphI tcacc

45

1: 5

2: 5 3: 5 4: 5 5: 5 6: 5

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

7: 5

8: 5 11: 5 12: 5 12: 11 13: 5

14: 5

15: 5 16: 5 17: 5 18: 5 19: 5

20: 5

21: 5 22: 5 23: 5 24: 5 25: 5

26: 5

27: 5 28: 5 29: 5 30: 5 31: 5

32: 5

33: 5 34: 5 35: 5 36: 5 37: 5

38: 5

40: 5 43: 5 44: 5 45: 5 46: 5

47: 5

48: 5 49: 5

Hay 44 aciertos en la base#

5

NlaIII CATG

26

1: 9

1: 42 2: 42 3: 9 3: 42 4: 9

4: 42

5: 9 5: 42 6: 42 6: 78 7: 9

7: 42

8: 21 8: 42 9: 42 10: 42 11: 42

12: 57

13: 48 13: 57 14: 57 31: 72 38: 9

48: 78

49: 78

Hay 11 aciertos en la base# 42

Hay 1 acierto en la base# 48 Podría causar desigualdades.

BsaJI Ccnngg

37

1: 14

2: 14 5: 14 6: 14 7: 14 8: 14

8: 65

9: 14 10: 14 11: 14 12: 14 13: 14

14: 14

15: 65 17: 14 17: 65 18: 65 19: 65

20: 65

21: 65 22: 65 26: 65 29: 65 30: 65

33: 65

34: 65 35: 65 37: 65 38: 65 39: 65

40: 65

42: 65 43: 65 48: 65 49: 65 50: 65

51: 14

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

Hay 23 aciertos en la base# 65

Hay 14 aciertos en la base# 14

AluI AGct

42

1: 47

2: 47 3: 47 4: 47 5: 47 6: 47

7: 47

8: 47 9: 47 10: 47 11: 47 16: 63

23: 63

24: 63 25: 63 31: 63 32: 63 36: 63

37: 47

37: 52 38: 47 38: 52 39: 47 39: 52

40: 47

40: 52 41: 47 41: 52 42: 47 42: 52

43: 47

43: 52 44: 47 44: 52 45: 47 45: 52

46: 47

46: 52 47: 47 47: 52 49: 15 50: 47

Hay 23 aciertos en la base# 47

Hay 11 aciertos en la base# 52 Sólo 5 bases de 47

BlpI GCtnagc

21

1: 48

2: 48 3: 48 5: 48 6: 48 7: 48

8: 48

9: 48 10: 48 11: 48 37: 48 38: 48

39: 48

40: 48 41: 48 42: 48 43: 48 44: 48

45: 48

46: 48 47: 48

Hay 21 aciertos en la base# 48

MwoI GCNNNNNnngc

19

1: 48

2: 28 19: 36 22: 36 23: 36 24: 36

25: 36

26: 36 35: 36 37: 67 39: 67 40: 67

41: 67

42: 67 43: 67 44: 67 45: 67 46: 67

47: 67

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

Hay 10 aciertos en la base# 67

Hay 7 aciertos en la base# 36

DdeI Ctnag

71

1: 49

1: 58 2: 49 2: 58 3: 49 3: 58

3: 65

4: 49 4: 58 5: 49 5: 58 5: 65

6: 49

6: 58 6: 65 7: 49 7: 58 7: 65

8: 49

8: 58 9: 49 9: 58 9: 65 10: 49

10: 58

10: 65 11: 49 11: 58 11: 65 15: 58

16: 58

16: 65 17: 58 18: 58 20: 58 21: 58

22: 58

23: 58 23: 65 24: 58 24: 65 25: 58

25: 65

26: 58 27: 58 27: 65 28: 58 30: 58

31: 58

31: 65 32: 58 32: 65 35: 58 36: 58

36: 65

37: 49 38: 49 39: 26 39: 49 40: 49

41: 49

42: 26 42: 49 43: 49 44: 49 45: 49

46: 49

47: 49 48: 12 49 12 51: 65

Hay 29 aciertos en la base# 58

Hay 22 aciertos en la base# 49 Sólo nueve bases de 58

Hay 16 aciertos en la base# 65 Sólo siete bases de 58

BglII Agatct

11

1: 61

2: 61 3: 61 4: 61 5: 61 6: 61

7: 61

9: 61 10: 61 11: 61 51: 47

Hay 10 aciertos en la base# 61

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

BstYI Rgatcy

12

1: 61

2: 61 3: 61 4: 61 5: 61 6: 61

7: 61

8: 61 9: 61 10: 61 11: 61 51: 47

Hay 11 aciertos en la base# 61

Hpy188I TCNga

17

1: 64

2: 64 3: 64 9: 64 5: 64 6: 64

7: 64

8: 64 9: 64 10: 64 11: 64 16: 57

20: 57

27: 57 35: 57 48: 67 49: 67

Hay 11 aciertos en la base# 64

Hay 4 aciertos en la base# 57

Hay 2 aciertos en la base# 67 Podría ser desigual.

Ms1I CAYNNnnRTG

44

1: 72

2: 72 3: 72 4: 72 5: 72 6: 72

7: 72

8: 72 9: 72 10: 72 11: 72 15: 72

17: 72

18: 72 19: 72 21: 72 23: 72 24: 72

25: 72

26: 72 28: 72 29: 72 30: 72 31: 72

32: 72

33: 72 34: 72 35: 72 36: 72 37: 72

38: 72

39: 72 40: 72 41: 72 42: 72 43: 72

44: 72

45: 72 46: 72 47: 72 48: 72 49: 72

50: 72

51: 72

Hay 44 aciertos en la base# 72

BsiEI CGRYcg

23

1: 74

3: 74 4: 74 5: 74 7: 74 8: 74

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

9: 74

10: 74 11: 74 17: 74 22: 74 30: 74

33: 74

34: 74 37: 74 38: 74 39: 74 40: 74

41: 74

42: 74 45: 74 46: 74 47: 74

Hay 23 aciertos en la base# 74

EaeI Yggccr

23

1: 74

3: 74 4: 74 5: 74 7: 74 8: 74

9: 74

10: 74 11: 74 17: 74 22: 74 30: 74

33: 74

34: 74 37: 74 38: 74 39: 74 40: 74

41: 74

42: 74 45: 74 46: 74 47: 74

Hay 23 aciertos en la base# 74

EagI Cggccg

23

1: 74

3: 74 4: 74 5: 74 7: 74 8: 74

9: 74

10: 74 11: 74 17: 74 22: 74 30: 74

33: 74

34: 74 37: 74 38: 74 39: 74 40: 74

41: 74

42: 74 45: 74 46: 74 47: 74

Hay 23 aciertos en la base# 74

HaeIII GGcc

27

1: 75

3: 75 4: 75 5: 75 7: 75 8: 75

9: 75

10: 75 11: 75 16: 75 17: 75 20: 75

22: 75

30: 75 33: 75 34: 75 37: 75 38: 75

39: 75

40: 75 41: 75 42: 75 45: 75 46: 75

47: 75

48: 63 49: 63

Hay 25 aciertos en la base# 75

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

Bst4CI ACNgt 65°C

63 Sitios Hay un tercer isoesquizómero

1: 86

2: 86 3: 86 4: 86 5: 86 6: 86

7: 34

7: 86 8: 86 9: 86 10: 86 11: 86

12: 86

13: 86 14: 86 15: 36 15: 86 16: 53

16: 86

17: 36 17: 86 18: 86 19: 86 20: 53

20: 86

21: 36 21: 86 22: 0 22: 86 23: 86

24: 86

25: 86 26: 86 27: 53 27: 86 28: 36

28: 86

29: 86 30: 86 31: 86 32: 86 33: 36

33: 86

34: 86 35: 53 35: 86 36: 86 37: 86

38: 86

39: 86 40: 86 41: 86 42: 86 43: 86

44: 86

45: 86 46: 86 47: 86 48: 86 49: 86

50: 86

51: 0 51: 86

Hay 51 aciertos en la base# 86 Todos los demás sitios están muy lejos

HpyCH4III ACNgt

63

1: 86

2: 86 3: 86 4: 86 5: 86 6: 86

7: 34

7: 86 8: 86 9: 86 10: 86 11: 86

12: 86

13: 86 14: 86 15: 36 15: 86 16: 53

16: 86

17: 36 17: 86 18: 86 19: 86 20: 53

20: 86

21: 36 21: 86 22: 0 22: 86 23: 86

24: 86

25: 86 26: 86 27: 53 27: 86 28: 36

28: 86

29: 86 30: 86 31: 86 32: 86 33: 36

33: 86

34: 86 35: 53 35: 86 36: 86 37: 86

38: 86

39: 86 40: 86 41: 86 42: 86 43: 86

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

44: 86

45: 86 46: 86 47: 86 48: 86 49: 86

50: 86

51: 0 51: 86

Hay 51 aciertos en la base# 86

HinfI Gantc

43

2: 2

3: 2 4: 2 5: 2 6: 2 7: 2

8: 2

9: 2 9: 22 10: 2 11: 2 15: 2

16: 2

17: 2 18: 2 19: 2 19: 22 20: 2

21: 2

23: 2 24: 2 25: 2 26: 2 27: 2

28: 2

29: 2 30: 2 31: 2 32: 2 33: 2

33: 22

34: 22 35: 2 36: 2 37: 2 38: 2

40: 2

43: 2 44: 2 45: 2 46: 2 47: 2

50: 60

Hay 38 aciertos en la base# 2

MlyI GAGTCNNNNNn

18

2: 2

3: 2 4: 2 5: 2 6: 2 7: 2

8: 2

9: 2 10: 2 11: 2 37: 2 38: 2

40: 2

43: 2 44: 2 45: 2 46: 2 47: 2

Hay 18 aciertos en la base# 2

PleI gagtc

18

2: 2

3: 2 4: 2 5: 2 6: 2 7: 2

8: 2

9: 2 10: 2 11: 2 37: 2 38: 2

40: 2

43: 2 44: 2 45: 2 46: 2 47: 2

Hay 18 aciertos en la base# 2

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

AciI Ccgc

24

2: 26

9: 14 10: 14 11: 14 27: 74 37: 62

37: 65

38: 62 39: 65 40: 62 40: 65 41: 65

42: 65

43: 62 43: 65 44: 62 44: 65 45: 62

46: 62

47: 62 47: 65 48: 35 48: 74 49: 74

Hay 8 aciertos en la base# 62

Hay 8 aciertos en la base# 65

Hay 3 aciertos en la base# 14

Hay 3 aciertos en la base# 74

Hay 1 acierto en la base# 26

Hay 1 acierto en la base# 35

-"- Gcgg

11

8: 91

9: 16 10: 16 11: 16 37: 67 39: 67

40: 67

42: 67 43: 67 45: 67 46: 67

Hay 7 aciertos en la base# 67

Hay 3 aciertos en la base# 16

Hay 1 acierto en la base# 91

BsiHKAI GWGCWc

20

2: 30

4: 30 6: 30 7: 30 9: 30 10: 30

12: 89

13: 89 14: 89 37: 51 38: 51 39: 51

40: 51

41: 51 42: 51 43: 51 44: 51 45: 51

46: 51

47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

Bsp1286I GDGCHc

20

2: 30

4: 30 6: 30 7: 30 9: 30 10: 30

12: 89

13: 89 14: 89 37: 51 38: 51 39: 51

40: 51

41: 51 42: 51 43: 51 44: 51 45: 51

46: 51

47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

HgiAI GWGCWc

20

2: 30

4: 30 6: 30 7: 30 9: 30 10: 30

12: 89

13: 89 14: 89 37: 51 38: 51 39: 51

40: 51

41: 51 42: 51 43: 51 44: 51 45: 51

46: 51

47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

BsoFI GCngc

26

2: 53

3: 53 5: 53 6: 53 7: 53 8: 53

8: 91

9: 53 10: 53 11: 53 31: 53 36: 36

37: 64

39: 64 40: 64 41: 64 42: 64 43: 64

44: 64

45: 64 46: 64 47: 64 48: 53 49: 53

50: 45

51: 53

Hay 13 aciertos en la base# 53

Hay 10 aciertos en la base# 64

TseI Gcwgc

17

2: 53

3: 53 5: 53 6: 53 7: 53 8: 53

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

9: 53

10: 53 11: 53 31: 53 36: 36 45: 64

46: 64

48: 53 49: 53 50: 45 51: 53

Hay 13 aciertos en la base# 53

MnlI gagg

34

3: 67

3: 95 4: 51 5: 16 5: 67 6: 67

7: 67

8: 67 9: 67 10: 67 11: 67 15: 67

16: 67

17: 67 19: 67 20: 67 21: 67 22: 67

23: 67

24: 67 25: 67 26: 67 27: 67 28: 67

29: 67

30: 67 31: 67 32: 67 33: 67 34: 67

35: 67

36: 67 50: 67 51: 67

Hay 31 aciertos en la base# 67

HpyCH4V TGca

34

5: 90

6: 90 11: 90 12: 90 13: 90 14: 90

15: 44

16: 44 16: 90 17: 44 18: 90 19: 44

20: 44

21: 44 22: 44 23: 44 24: 44 25: 44

26: 44

27: 44 27: 90 28: 44 29: 44 33: 44

34: 44

35: 44 35: 90 36: 38 48: 44 49: 44

50: 44

50: 90 51: 44 51: 52

Hay 21 aciertos en la base# 44

Hay 1 acierto en la base# 52

AccI GTmkac

13 5-base recognition

7: 37

11: 24 37: 16 38: 16 39: 16 40: 16

41: 16

42: 16 43: 16 44: 16 45: 16 46: 16

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

47: 16

Hay 11 aciertos en la base# 16

SacII CCGCgg

8 6-base recognition

9: 14

10: 14 11: 14 37: 65 39: 65 40: 65

42: 65

43: 65

Hay 5 aciertos en la base# 65

Hay 3 aciertos en la base# 14

TfiI Gawtc

24

9: 22

15: 2 16: 2 17: 2 18: 2 19: 2

19: 22

20: 2 21: 2 23: 2 24: 2 25: 2

26: 2

27: 2 28: 2 29: 2 30: 2 31: 2

32: 2

33: 2 33: 22 34: 22 35: 2 36: 2

Hay 20 aciertos en la base# 2

BsmAI Nnnnnngagac

19

15: 11

16: 11 20: 11 21: 11 22: 11 23: 11

24: 11

25: 11 26: 11 27: 11 28: 11 28: 56

30: 11

31: 11 32: 11 35: 11 36: 11 44: 87

48: 87

Hay 16 aciertos en la base# 11

BpmI ctccag

19

15: 12

16: 12 17: 12 18: 12 20: 12 21: 12

22: 12

23: 12 24: 12 25: 12 26: 12 27: 12

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

28: 12

30: 12 31: 12 32: 12 34: 12 35: 12

36: 12

Hay 19 aciertos en la base# 12

XmnI GAANNnnttc

12

37: 30

38: 30 39: 30 40: 30 41: 30 42: 30

43: 30

44: 30 45: 30 46: 30 47: 30 50: 30

Hay 12 aciertos en la base# 30

BsrI NCcagt

12

37: 32

38: 32 39: 32 40: 32 41: 32 42: 32

43: 32

44: 32 45: 32 46: 32 47: 32 50: 32

Hay 12 aciertos en la base# 32

BanII GRGCYc

11

37: 51

38: 51 39: 51 40: 51 41: 51 42: 51

43: 51

44: 51 45: 51 46: 51 47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

Ecl136I GAGctc

11

37: 51

38: 51 39: 51 40: 51 41: 51 42: 51

43: 51

44: 51 45: 51 46: 51 47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

SacI GAGCTc

11

Reconocimiento REname

#sitios

GLGid#:base#

GLGid#:base#

GLGid#:base#.....

37: 51

38: 51 39: 51 40: 51 41: 51 42: 51

43: 51

44: 51 45: 51 46: 51 47: 51

Hay 11 aciertos en la base# 51

Tabla 5: Análisis de frecuencia de emparejamiento de REdaptors en genes V precisos

A: HpyCH4V en HC en las bases 35-56

Número de emparejamientos erróneos..................... Número

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cut Id Sonda

1

510 5 11 274 92 61 25 22 11 1 3 5 443 6-1 agttctcccTGCAgctgaactc

2

192 54 42 32 24 15 2 3 10 3 1 6 167 3-11 cactgtatcTGCAaatgaacag

3

58 19 7 17 6 5 1 0 1 0 2 0 54 3-09 ccctgtatcTGCAaatgaacag

4

267 42 33 9 8 8 82 43 22 8 11 1 100 5-51 ccgcctaccTGCAgtggagcag

5

250 111 59 41 24 7 5 1 0 0 2 0 242 3-15 cgctgtatcTGCAaatgaacag

6

7 0 2 0 1 0 0 0 0 0 4 0 3 7-4.1 cggcatatcTGCAgatctgcag

7

7

0 2 2 0 0 2 1 0 0 0 0 4 3-73 cggcgtatcTGCAaatgaacag

8

26 10 4 1 3 1 2 1 3 1 0 0 19 5-a ctgcctaccTGCAgtggagcag

9

21 8 2 3 1 6 1 0 0 0 0 0 20 3-49 tcgcctatcTGCAaatgaacag

1338

249 162 379 149 103 120 71 47 13 23 12 1052

249

411 790 939 1162 1280 1316

1042

1233 1293 1338

Id

Sonda sonda punteada

Id

Sonda sonda punteada

6-1

agttctcccTGCAgctgaactc agttctcccTGCAgctgaactc

3-11

cactgtatcTGCAaatgaacag cac.g.at.....aa.....ag

3-09

ccctgtatcTGCAaatgaacag ccc.g.at.....aa.....ag

5-51

ccgcctaccTGCAgtggagcag ccgc..a.......tg..g.ag

3-15

cgctgtatcTGCAaatgaacag c.c.g.at.....aa.....ag

7-4.1

cggcatatcTGCAgatctgcag c.gca.at......a.ctg.ag

3-73

cggcgtatcTGCAaatgaacag c.gcg.at.....aa.....ag

5-a

ctgcctaccTGCAgtggagcag ctgc..a.......tg..g.ag

3-49

tcgcctatcTGCAaatgaacag tcgc..at.....aa.....ag

Seqs sólo con el sitio RE esperado.......1004

(Cuenta sólo los casos con 4 o menos emparejamientos erróneos)

Seqs sólo con un sitio no esperado......... 0

Seqs tanto con esperado como no esperado.... 48

(Cuenta sólo los casos con 4 o menos emparejamientos erróneos)

Seqs sin sitios........................ 0

Id

Sonda sonda punteada

B: Blpl en HC

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ncut Name

1

133 73 16 11 13 6 9 1 4 0 119 1-58 acatggaGCTGAGCagcctgag

2

14 11 1 0 0 0 0 1 0 1 12 1-02 acatggagctgagcaggctgag

3

34 17 8 2 6 1 0 0 0 0 0 1-18 acatggagctgaggagcctgag

4

120 50 32 16 10 9 1 1 1 0 2 5-51 acctgcagtggagcagcctgaa

5

55 13 11 10 17 3 1 0 0 0 0 3-15 atctgcaaatgaacagcctgaa

6

340 186 88 41 15 6 3 0 1 0 0 3303 atctgcaaatgaacagcctgag

7

82 25 16 25 12 1 3 0 0 0 0 3-20 atctgcaaatgaacagtctgag

8

3 0 2 0 1 0 0 0 0 0 0 74.1 atctgcagatctgcagcctaaa

9

23 18 2 2 1 0 0 0 0 0 0 3-66 atcttcaaatgaacagcctgag

10

2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 3-64 atcttcaaatgggcagcctgag

11

486 249 78 81 38 21 10 4 4 1 467 4301 ccctgaagctgagctctgtgac

12

16 6 3 1 0 1 1 3 1 0 1 6-1 ccctgcagctgaactctgtgac

13

28 15 8 2 2 1 0 0 0 0 0 2-70 tccttacaatgaccaacatgga

B: Blpl en HC

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ncut Name

14

2 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2-26 tccttaccatgaccaacatgga

601

Nombre

Secuencia completa Modo de puntos

1-58

acatggaGCTGAGCagcctgag acatggaGCTGAGCagcctgag

1-02

acatggagctgagcaggctgag ................g.....

1-18

acatggagctgaggagcctgag .............g........

5-51

acctgcagtggagcagcctgaa ..c..c..tg...........a

3-15

atctgcaaatgaacagcctgaa .tc..c.aa...a........a

3-30.3

atctgcaaatgaacagcctgag .tc..c.aa...a.........

3-20

atctgcaaatgaacagtctgag .tc..c.aa...a...t.....

7-4.1

atctgcagatctgcagcctaaa .tc..c..a.ct.......a.a

3-66

atcttcaaatgaacagcctgag .tc.tc.aa...a.........

3-64

atcttcaaatgggcagcctgag .tc.tc.aa..g..........

4-30.1

ccctgaagctgagctctgtgac c.c..a........tctg...c

6-1

ccctgcagctgaactctgtgac c.c..c......a.tctg...c

Nombre

Secuencia completa Modo de puntos

2-70

tccttacaatgaccaacatgga t.c.tacaa...c..a.a..ga

2-26

tccttaccatgaccaacatgga t.c.tacca...c..a.a..ga

Seqs sólo con el sitio RE esperado....... 597 (contando las secuencias con 4 o menos emparejamientos erróneos)

Seqs sólo con un sitio no esperado......... 2

Seqs tanto con esperado como no esperado.... 2

Seqs sin sitios........................ 686

C: HpyCH4III, Bst4CI, o TaaI en HC

En la puntuación de si el sitio RE de interés está presente, sólo se cuentan ON que tienen 4 o menos emparejamientos erróneos.

Número de secuencias.......... 1.617

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ncut acngt acngt

1

244 78 92 43 18 10 1 2 0 0 241 102#1,1 ccgtgtattACTGTgcgagaga ccgtgtattactgtgcgagaga

2

457 69 150 115 66 34 11 8 3 1 434 103#2,3 ctgtgtattactgtgcgagaga .t....................

3

173 52 45 36 22 14 3 0 0 1 169 108#3 ccgtgtattactgtgcgagagg .....................g

4

16 0 3 2 2 1 6 0 1 1 8 124#5,1 ccgtgtattactgtgcaacaga ................a.c...

5

4 0 0 1 0 1 1 0 1 0 2 145#6 ccatgtattactgtgcaagata ..a.............a...t.

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ncut acngt acngt

6

15 1 0 1 0 6 4 1 1 1 8 158#8 ccgtgtattactgtgcggcaga .................gc...

7

23 4 8 5 2 2 1 1 0 0 21 205#12 ccacatattactgtgcacacag ..aca...........acacag

8

9 1 1 1 0 3 2 1 0 0 6 226#13 ccacatattactgtgcacggat ..aca...........ac.gat

9

7 1 3 1 1 0 0 1 0 0 6 270#14 ccacgtattactgtgcacggat ..ac............ac.gat

10

23 7 3 5 5 2 1 0 0 0 22 309#16, ccttgtattactgtgcaaaaga ..t.............a.a...

11

35 5 10 7 6 3 3 0 1 0 31 313#18, ctgtgtattactgtgcaagaga .t..............a.....

12

18 2 3 2 2 6 1 0 2 0 15 315#19 ccgtgtattactgtaccacaga ..............a.c.c...

13

3 1 2 0 0 0 0 0 0 0 3 320#20 ccttgtatcactgtgcgagaga ..t.....c.............

14

117 29 23 28 22 8 4 2 1 0 110 323#22 ccgtatattactgtgcgaaaga ....a.............a...

15

75 21 25 13 9 1 4 2 0 0 69 330#23, ctgtgtattactgtgcgaaaga .t................a...

16

14 2 2 2 3 0 3 1 1 0 9 349#29 ccgtgtattactgtactagaga ..............a.t.....

17

2 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 372#33 ccgtgtattactgtgctagaga ................t.....

18

1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 373#34 ccgtgtattactgtactagaca ..............a.t...c.

19

2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 3d#36 ctgtgtattactgtaagaaaga .t............aa..a...

20

34 4 9 9 4 5 3 0 0 0 31 428#38 ccgtgtattactgtgcgagaaa ....................a.

21

17 5 4 2 2 3 1 0 0 0 16 4302#40 ccgtgtattactgtgccagaga ................c.....

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ncut acngt acngt

22

75 15 17 24 7 10 1 1 0 0 73 439#44 ctgtgtattactgtgcgagaca .t..................c.

23

40 14 15 4 5 1 0 1 0 0 39 551#48 ccatgtattactgtgcgagaca ..a.................c.

24

213 26 56 60 42 20 7 2 0 0 204 5a#49 ccatgtattactgtgcgagaAA ..a.................AA

Grupo

337 471 363 218 130 58 23 11 6

Acumulativo

337 808 1171 1389 1519 1577 1600 1611 1617

Seqs sólo con el sitio RE esperado.......

1511

Seqs sólo con un sitio no esperado.........

0

Seqs tanto con esperado como no esperado....

8

Seqs sin sitios........................

0

Tabla 5D:

Análisis repetido usando sólo 8 REdaptors mejores

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8+

1

301 78 101 54 32 16 9 10 1 0 281 102#1

ccgtgtattactgtgcgagaga

2

493 69 155 125 73 37 14 11 3 6 459 103#2

ctgtgtattactgtgcgagaga

Análisis repetido usando sólo 8 REdaptors mejores

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8+

3

189 52 45 38 23 18 5 4 1 3 176 108#3

ccgtgtattactgtgcgagagg

4

127 29 23 28 24 10 6 5 2 0 114 323#22

ccgtatattactgtgcgaaaga

5

78 21 25 14 11 1 4 2 0 0 72 330#23

ctgtgtattactgtgcgaaaga

6 79 15 17 25 8 11 1 2 0 0 76

439#44

ctgtgtattactgtgcgagaca

7

43 14 15 5 5 3 0 1 0 0 42 551#48

ccatgtattactgtgcgagaca

8

307 26 63 72 51 38 24 14 13 6 250 5a#49

ccatgtattactgtgcgaga

1

102#1 ccgtgtattactgtgcgagaga ccgtgtattactgtgcgagaga

2

103#2 ctgtgtattactgtgcgagaga .t....................

3

108#3 ccgtgtattactgtgcgagagg .....................g

4

323#22 ccgtatattactgtgcgaaaga ....a.............a...

Análisis repetido usando sólo 8 REdaptors mejores

Id

Ntot 0 1 2 3 4 5 6 7 8+

5

330#23 ctgtgtattactgtgcgaaaga .t................a...

6

439#44 ctgtgtattactgtgcgagaca .t..................c.

7

551#48 ccatgtattactgtgcgagaca ..a.................c.

8

5a#49 ccatgtattactgtgcgagaAA ..a.................AA

Seqs sólo con el sitio RE esperado.......1.463/1.617

Seqs sólo con un sitio no esperado......... 0

Seqs tanto con esperado como no esperado.... 7

Seqs sin sitios........................ 0

Tabla 6: Secuencias HC GLG FR1 Humanas

VH Exón - Alineamiento de secuencias de nucleótidos

VH1

102

103

VH Exón - Alineamiento de secuencias de nucleótidos

VH1

108

118

124

145

146

158

169

1-e

1-f

VH2

2-05

2-26

2-70

VH3

3-07

3-09

3-11

3-13

3-15

VH3

3-20

3-21

3-23

3-30

3-30.3

3-30.5

3-33

3-43

3-48

3-49

VH3

3-53

3-64

3-66

3-72

3-73

3-74

3-d

VH4

4-04

4-28

VH4

4-30.1

4-30.2

4-30.4

4-31

4-34

4-39

4-59

4-61

4-b

VH5

5-51

5-a

VH6

6-1

VH7

7-4.1

Tabla 7: Sitios RERS en HC GLG FR1 Humanas en las que hay al menos 20 GLG cortados

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

1: 4

1: 13 2: 13 3: 4 3: 13 4: 13

6: 13

7: 4 7: 13 8: 13 9: 4 9: 13

10: 4

10: 13 15: 4 15: 65 16: 4 16: 65

17: 4

17: 65 18: 4 18: 65 19: 4 19: 65

20: 4

20: 65 21: 4 21: 65 22: 4 22: 65

23: 4

23: 65 24: 4 24: 65 25: 4 25: 65

26: 4

26: 65 27: 4 27: 65 28: 4 28: 65

29: 4

30: 4 30: 65 31: 4 31: 65 32: 4

32: 65

33: 4 33: 65 34: 4 39: 65 35: 4

35: 65

36: 4 36: 65 37: 4 38: 4 39: 4

41: 4

42: 4 43: 4 45: 4 46: 4 47: 4

48: 4

48: 13 49: 4 49: 13 51: 4

Hay 39 aciertos en la base# 4

Hay 21 aciertos en la base# 65

-"- ctgcac

9

12: 63

13: 63 14: 63 39: 63 41: 63 42: 63

44: 63

45: 63 46: 63

BbvI GCAGC

65

1: 6

3: 6 6: 6 7: 6 8: 6 9: 6

10: 6

15: 6 15: 67 16: 6 16: 67 17: 6

17: 67

18: 6 18: 67 19: 6 19: 67 20: 6

20: 67

21: 6 21: 67 22: 6 22: 67 23: 6

23: 67

24: 6 24: 67 25: 6 25: 67 26: 6

26: 67

27: 6 27: 67 28: 6 28: 67 29: 6

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

30: 6

30: 67 31: 6 31: 67 32: 6 32: 67

33: 6

33: 67 39: 6 39: 67 35: 6 35: 67

36: 6

36: 67 37: 6 38: 6 39: 6 40: 6

41: 6

42: 6 93: 6 44: 6 45: 6 46: 6

47: 6

98: 6 99: 6 50: 12 51: 6

Hay 43 aciertos en la base# 6 Los sitios en negrita sitios muy cercanos listados más adelante

Hay 21 aciertos en la base# 67

-"- gctgc

13

37: 9

38: 9 39: 9 40: 3 40: 9 41: 9

42: 9

44: 3 44: 9 45: 9 46: 9 47: 9

50: 9

Hay 11 aciertos en la base# 9

BsoFI GCnge

78

1: 6

3: 6 6: 6 7: 6 8: 6 9: 6

10: 6

15: 6 15: 67 16: 6 16: 67 17: 6

17: 67

18: 6 18: 67 19: 6 19: 67 20: 6

20: 67

21: 6 21: 67 22: 6 22: 67 23: 6

23: 67

24: 6 24: 67 25: 6 25: 67 26: 6

26: 67

27: 6 27: 67 28: 6 28: 67 29: 6

30: 6

30: 67 31: 6 31: 67 32: 6 32: 67

33: 6

33: 67 34: 6 39: 67 35: 6 35: 67

36: 6

36: 67 37: 6 37: 9 38: 6 38: 9

39: 6

39: 9 40: 3 40: 6 40: 9 41: 6

41: 9

42: 6 42: 9 43: 6 44: 3 44: 6

44: 9

45: 6 45: 9 46: 6 46: 9 47: 6

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

47: 9

48: 6 49: 6 50: 9 50: 12 51: 6

Hay 43 aciertos en la base# 6 Frecuentemente aparecen juntos.

Hay 11 aciertos en la base# 9

Hay 2 aciertos en la base# 3

Hay 21 aciertos en la base# 67

TseI Gcwgc

78

1: 6

3: 6 6: 6 7: 6 8: 6 9: 6

10: 6

15: 6 15: 67 16: 6 16: 67 17: 6

17: 67

18: 6 18: 67 19: 6 19: 67 20: 6

20: 67

21: 6 21: 67 22: 6 22: 67 23: 6

23: 67

24: 6 24: 67 25: 6 25: 67 26: 6

26: 67

27: 6 27: 67 28: 6 28: 67 29: 6

30: 6

30: 67 31: 6 31: 67 32: 6 32: 67

33: 6

33: 67 34: 6 34: 67 35: 6 35: 67

36: 6

36: 67 37: 6 37: 9 38: 6 38: 9

39: 6

39: 9 40: 3 40: 6 40: 9 41: 6

41: 9

42: 6 42: 9 43: 6 44: 3 44: 6

44: 9

45: 6 45: 9 46: 6 46: 9 47: 6

47: 9

48: 6 49: 6 50: 9 50: 12 51: 6

Hay 43 aciertos en la base# 6 Frecuentemente juntos.

Hay 11 aciertos en la base# 9

Hay 2 aciertos en la base# 3

Hay 1 acierto en la base# 12

Hay 21 aciertos en la base# 67

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

MspAlI CMGckg

48

1: 7

3: 7 4: 7 5: 7 6: 7 7: 7

8: 7

9: 7 10: 7 11: 7 15: 7 16: 7

17: 7

18: 7 19: 7 20: 7 21: 7 22: 7

23: 7

29: 7 25: 7 26: 7 27: 7 28: 7

29: 7

30: 7 31: 7 32: 7 33: 7 34: 7

35: 7

36: 7 37: 7 38: 7 39: 7 40: 1

40: 7

41: 7 42: 7 44: 1 44: 7 45: 7

46: 7

47: 7 48: 7 49: 7 50: 7 51: 7

Hay 46 aciertos en la base# 7

PvuII CAGctg

48

1: 7

3: 7 4: 7 5: 7 6: 7 7: 7

8: 7

9: 7 10: 7 11: 7 15: 7 16: 7

17: 7

18: 7 19: 7 20: 7 21: 7 22: 7

23 : 7

24: 7 25 : 7 26: 7 27: 7 28: 7

29: 7

30: 7 31: 7 32: 7 33: 7 34: 7

35: 7

36: 7 37: 7 38: 7 39: 7 40: 1

40: 7

41: 7 42: 7 44: 1 44: 7 45: 7

46: 7

47: 7 48: 7 49: 7 50: 7 51: 7

Hay 46 aciertos en la base# 7

Hay 2 aciertos en la base# 1

AluI AGct

54

1: 8

2: 8 3: 8 4: 8 4: 24 5: 8

6: 8

7: 8 8: 8 9: 8 10: 8 11: 8

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

15: 8

16: 8 17: 8 18: 8 19: 8 20: 8

21: 8

22: 8 23: 8 24: 8 25: 8 26: 8

27: 8

28: 8 29: 8 29: 69 30: 8 31: 8

32: 8

33: 8 34: 8 35: 8 36: 8 37: 8

38: 8

39: 8 40: 2 40: 8 41: 8 42: 8

43: 8

44: 2 44: 8 45: 8 46: 8 47: 8

48: 8

48: 82 49: 8 49: 82 50: 8 51: 8

Hay 48 aciertos en la base# 8

Hay 2 aciertos en la base# 2

DdeI Ctnag

48

1: 26

1: 48 2: 26 2: 48 3: 26 3: 48

4: 26

4: 48 5: 26 5: 48 6: 26 6: 48

7: 26

7: 48 8: 26 8: 48 9: 26 10: 26

11: 26

12: 85 13: 85 14: 85 15: 52 16: 52

17: 52

18: 52 19: 52 20: 52 21: 52 22: 52

23: 52

24: 52 25: 52 26: 52 27: 52 28: 52

29: 52

30: 52 31: 52 32: 52 33: 52 35: 30

35: 52

36: 52 40: 24 49: 52 51: 26 51: 48

Hay 22 aciertos en la base# 52 52 y 48 nunca juntos.

Hay 9 aciertos en la base# 48

Hay 12 aciertos en la base# 26 26 y 24 nunca juntos.

HphI tcacc

42

1: 86

3: 86 6: 86 7: 86 8: 80 11: 86

12: 5

13: 5 14: 5 15: 80 16: 80 17: 80

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

18: 80

20: 80 21: 80 22: 80 23: 80 24: 80

25: 80

26: 80 27: 80 28: 80 29: 80 30: 80

31: 80

32: 80 33: 80 34: 80 35: 80 36: 80

37: 59

38: 59 39: 59 40: 59 41: 59 42: 59

43: 59

44: 59 45: 59 46: 59 47: 59 50: 59

Hay 22 aciertos en la base# 80 80 y 86 nunca juntos

Hay 5 aciertos en la base# 86

Hay 12 aciertos en la base# 59

BssKI Nccngg

50

1: 39

2: 39 3: 39 4: 39 5: 39 7: 39

8: 39

9: 39 10: 39 11: 39 15: 39 16: 39

17: 39

18: 39 19: 39 20: 39 21: 29 21: 39

22: 39

23: 39 24: 39 25: 39 26: 39 27: 39

28: 39

29: 39 30: 39 31: 39 32: 39 33: 39

34: 39

35: 19 35: 39 36: 39 37: 24 38: 24

39: 24

41: 24 42: 24 44: 24 45: 24 46: 24

47: 24

48: 39 48: 40 49: 39 49: 40 50: 24

50: 73

51: 39

Hay 35 aciertos en la base# 39 39 y 40 juntos dos veces.

Hay 2 aciertos en la base# 40

BsaJI Ccnngg

47

1: 40

2: 40 3: 40 4: 40 5: 40 7: 40

8: 40

9: 40 9: 47 10: 40 10: 47 11: 40

15: 40

18: 40 19: 40 20: 40 21: 40 22: 40

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

23: 40

24: 40 25: 40 26: 40 27: 40 28: 40

29: 40

30: 40 31: 40 32: 40 34: 40 35: 20

35: 40

36: 40 37: 24 38: 24 39: 24 41: 24

42: 24

44: 24 45: 24 46: 24 47: 24 48: 40

48: 41

49: 40 49: 41 50: 74 51: 40

Hay 32 aciertos en la base# 40 40 y 41 juntos dos veces

Hay 2 aciertos en la base# 41

Hay 9 aciertos en la base# 24

Hay 2 aciertos en la base# 47

BstNI CCwgg

44

PspGI ccwgg

ScrFI(SM.HpaII) CCwgg

1: 40

2: 40 3: 40 4: 40 5: 40 7: 40

8: 40

9: 40 10: 40 11: 40 15: 40 16: 40

17: 40

18: 40 19: 40 20: 40 21: 30 21: 40

22: 40

23: 40 24: 40 25: 40 26: 40 27: 40

28: 40

29: 40 30: 40 31: 40 32: 40 33: 40

34: 40

35: 40 36: 40 37: 25 38: 25 39: 25

41: 25

42: 25 44: 25 45: 25 46: 25 47: 25

50: 25

51: 40

Hay 33 aciertos en la base# 40

ScrFI CCngg

50

1: 40

2: 40 3: 40 4: 40 5: 40 7: 40

8: 40

9: 40 10: 40 11: 40 15: 40 16: 40

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

17: 40

18: 40 19: 40 20: 40 21: 30 21: 40

22: 40

23: 40 24: 40 25: 40 26: 40 27: 40

28: 40

29: 40 30: 40 31: 40 32: 40 33: 40

34: 40

35: 20 35: 40 36: 40 37: 25 38: 25

39: 25

41: 25 42: 25 44: 25 45: 25 46: 25

47: 25

48: 40 48: 41 49: 40 49: 41 50: 25

50: 74

51: 40

Hay 35 aciertos en la base# 40

Hay 2 aciertos en la base# 41

EcoO109I RGgnccy

34

1: 43

2: 43 3: 43 4: 43 5: 43 6: 43

7: 43

8: 43 9: 43 10: 43 15: 46 16: 46

17: 46

18: 46 19: 46 20: 46 21: 46 22: 46

23: 46

24: 46 25: 46 26: 46 27: 46 28: 46

30: 46

31: 46 32: 46 33: 46 34: 46 35: 46

36: 46

37: 46 43: 79 51: 43

Hay 22 aciertos en la base# 46 46 y 43 nunca juntos

Hay 11 aciertos en la base# 43

N1aIV GGNncc

71

1: 43

2: 43 3: 43 4: 43 5: 43 6: 43

7: 43

8: 43 9: 43 9: 79 10: 43 10: 79

15: 46

15: 47 16: 47 17: 46 17: 47 18: 46

18: 47

19: 46 19: 47 20: 46 20: 47 21: 46

21: 47

22: 46 22: 47 23: 47 24: 47 25: 47

26: 47

27: 46 27: 47 28: 46 28: 47 29: 47

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

30: 46

30: 47 31: 46 31: 47 32: 46 32: 47

33: 46

33: 47 34: 46 34: 47 35: 46 35: 47

36: 46

36: 47 37: 21 37: 46 37: 47 37: 79

38: 21

39: 21 39: 79 40: 79 41: 21 41: 79

42: 21

42: 79 43: 79 44: 21 44: 79 45: 21

45: 79

46: 21 46: 79 47: 21 51: 43

Hay 23 aciertos en la base# 47 46 y 47 frecuentemente juntos

Hay 17 aciertos en la base# 46 Hay 11 aciertos en la base# 43

Sau96I Ggncc

70

1: 44

2: 3 2: 44 3: 44 4: 44 5: 3 5: 44 6: 44

7: 44

8: 22 8: 44 9: 44 10: 44 11: 3 12: 22 13: 22

14: 22

15: 33 15: 47 16: 47 17: 47 18: 47 19: 47 20: 47

21: 47

22: 47 23: 33 23: 47 24: 33 24: 47 25: 33 25: 47

26: 33

26: 47 27: 47 28: 47 29: 47 30: 47 31: 33 31: 47

32: 33

32: 47 33: 33 33: 47 34: 33 34: 47 35: 47 36: 47

37: 21

37: 22 37: 47 38: 21 38: 22 39: 21 39: 22 41: 21

41: 22

42: 21 42: 22 43: 80 44: 21 44: 22 45: 21 45: 22

46: 21

46: 22 47: 21 47: 22 50: 22 51: 44

Hay 23 aciertos en la base# 47 Éstos no ocurren juntos.

Hay 11 aciertos en la base# 44

Hay 14 aciertos en la base# 22 Éstos aparecen juntos.

Hay 9 aciertos en la base# 21

BsmAI GTCTCNnnnn

22

1: 58

3: 58 4: 58 5: 58 8: 58 9: 58

10: 58

13: 70 36: 18 37: 70 38: 70 39: 70

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

40: 70

41: 70 42: 70 44: 70 45: 70 46: 70

47: 70

48: 48 49: 48 50: 85

Hay 11 aciertos en la base# 70

-"- Nnnnnngagac

27

13: 40

15: 48 16: 48 17: 48 18: 48 20: 48

21: 48

22: 48 23: 48 24: 48 25: 48 26: 48

27: 48

28: 48 29: 48 30: 10 30: 48 31: 48

32: 48

33: 48 35: 48 36: 48 43: 40 44: 40

45: 40

46: 40 47: 40

Hay 20 aciertos en la base# 48

AvaII Ggwcc

44

Sau96I($M.HaeIII) Ggwcc

44

2: 3

5: 3 6: 44 8: 44 9: 44 10: 44

11: 3

12: 22 13: 22 14: 22 15: 33 15: 47

16: 47

17: 47 18: 47 19: 47 20: 47 21: 47

22: 47

23: 33 23: 47 24: 33 24: 47 25: 33

25: 47

26: 33 26: 47 27: 47 28: 47 29: 47

30: 47

31: 33 31: 47 32: 33 32: 47 33: 33

33: 47

34: 33 34: 47 35: 47 36: 47 37: 47

43: 80

50: 22

Hay 23 aciertos en la base# 47 44 y 47 nunca juntos

Hay 4 aciertos en la base# 44

PpuMI RGgwccy

27

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

6: 43

8: 43 9: 43 10: 43 15: 46 16: 46

17: 46

18: 46 19: 46 20: 46 21: 46 22: 46

23: 46

24: 46 25: 46 26: 46 27: 46 28: 46

30: 46

31: 46 32: 46 33: 46 34: 46 35: 46

36: 46

37: 46 43: 79

Hay 22 aciertos en la base# 46 43 y 46 nunca aparecen juntos.

Hay 4 aciertos en la base# 43

BsmFI GGGAC

3

8: 43

37: 46 50: 77

-"- gtccc

33

15: 48

16: 48 17: 48 1: 0 1: 0 20: 48

21: 48

22: 48 23: 48 24: 48 25: 48 26: 48

27: 48

28: 48 29: 48 30: 48 31: 48 32: 48

33: 48

34: 48 35: 48 36: 48 37: 54 38: 54

39: 54

40: 54 41: 54 42: 54 43: 54 44: 54

45: 54

46: 54 47: 54

Hay 20 aciertos en la base# 48

Hay 11 aciertos en la base# 54

HinfI Gantc

80

8: 77

12: 16 13: 16 14: 16 15: 16 15: 56

15: 77

16: 16 16: 56 16: 77 17: 16 17: 56

17: 77

18: 16 18: 56 18: 77 19: 16 19: 56

19: 77

20: 16 20: 56 20: 77 21: 16 21: 56

21: 77

22: 16 22: 56 22: 77 23: 16 23: 56

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

23: 77

24: 16 24: 56 24: 77 25: 16 25: 56

25: 77

26: 16 26: 56 26: 77 27: 16 27: 26

27: 56

27: 77 28: 16 28: 56 28: 77 29: 16

29: 56

29: 77 30: 56 31: 16 31: 56 31: 77

32: 16

32: 56 32: 77 33: 16 33: 56 33: 77

34: 16

35: 16 35: 56 35: 77 36: 16 36: 26

36: 56

36: 77 37: 16 38: 16 39: 16 40: 16

41: 16

42: 16 44: 16 45: 16 46: 16 47: 16

48: 46

49: 46

Hay 34 aciertos en la base# 16

TfiI Gawtc

21

8: 77

15: 77 16: 77 17: 77 18: 77 19: 77

20: 77

21: 77 22: 77 23: 77 24: 77 25: 77

26: 77

27: 77 28: 77 29: 77 31: 77 32: 77

33: 77

35: 77 36: 77

Hay 21 aciertos en la base# 77

MlyI GAGTC

38

12: 16

13: 16 14: 16 15: 16 16: 16 17: 16

18: 16

19: 16 20: 16 21: 16 22: 16 23: 16

24: 16

25: 16 26: 16 27: 16 27: 26 28: 16

29: 16

31: 16 32: 16 33: 16 34: 16 35: 16

36: 16

36: 26 37: 16 38: 16 39: 16 40: 16

41: 16

42: 16 44: 16 45: 16 46: 16 47: 16

48: 46

49: 46

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

Hay 34 aciertos en la base# 16

-"- GACTC

21

15: 56

16: 56 17: 56 18: 56 19: 56 20: 56

21: 56

22: 56 23: 56 24: 56 25: 56 26: 56

27: 56

28: 56 29: 56 30: 56 31: 56 32: 56

33: 56

35: 56 36: 56

Hay 21 aciertos en la base# 56

PleI gagtc

38

12: 16

13: 16 14: 16 15: 16 16: 16 17: 16

18: 16

19: 16 20: 16 21: 16 22: 16 23: 16

24: 16

25: 16 26: 16 27: 16 27: 26 28: 16

29: 16

31: 16 32: 16 33: 16 34: 16 35: 16

36: 16

36: 26 37: 16 38: 16 39: 16 40: 16

41: 16

42: 16 44: 16 45: 16 46: 16 47: 16

48: 46

49: 46

Hay 34 aciertos en la base# 16

-"- gactc

21

15: 56

16: 56 17: 56 18: 56 19: 56 20: 56

21: 56

22: 56 23: 56 24: 56 25: 56 26: 56

27: 56

28: 56 29: 56 30: 56 31: 56 32: 56

33: 56

35: 56 36: 56

Hay 21 aciertos en la base# 56

AlwNI CAGNNNctg

26

15: 68

16: 68 17: 68 18: 68 19: 68 20: 68

BsgI GTGCAG

71 (corta 16/14 bases a la derecha)

21: 68

22: 68 23: 68 24: 68 25: 68 26: 68

27: 68

28: 68 29: 68 30: 68 31: 68 32: 68

33: 68

34: 68 35: 68 36: 68 39: 46 40: 46

41: 46

42: 46

Hay 22 aciertos en la basel 68

Tabla 9 Sitios RERS encontrados en FR1 GLG Kappa Humana

Msll

Fokl --> <-- -> PflFI Bsrl BsmAl Mnll HpyCH 4V

VKI

O12 1-69

3 23 3 49 12 15 47 18 26 36

O2 101.169

103 123 103 149 112 115 147 118 126 136

O18 201-269

203 223 203 249 212 215 247 218 226 236

O8 301-369

303 323 303 349 312 315 347 318 326 336

A20 401-469

403 423 403 449 412 415 447 418 426 436

A30 501-569

503 523 503 549 512 515 547 518 526 536

L14 601-669

603 603 649 612 615 647 618 - 636

L1 701-769

703 723 703 749 712 715 747 718 726 736

L15 801-869

803 823 803 849 812 815 847 818 826 836

L4 901-969

- 923 903 949 912 915 906 947 918 926 936

L18 1001-1069

- 1003 1049 101 1015 1006 1047 1018 1026 1036

L5 1101-1169

1103 - 1149 1112 1115 1147 1118 - 1136

L19 1201-1269

1203 1203 1249 1212 1215 1247 1218 - 1236

L8 1301-1369

- 1323 1303 1349 1312 1315 1306 1347 1318 - 1336

Msll

Fokl --> <-- -> PflFI Bsrl BsmAl Mnll HpyCH 4V

VKI

L23 1401-1469

1403 1403 1408 1449 1412 1415 1447 1418 - 1436

L9 1501-1569

1503 1523 1508 1503 1549 1512 1515 1547 1518 1526 1536

L24 1601-1669

1603 1623 1608 1649 1612 1615 1647 1618 - 1636

L11 1701-1769

1703 1723 1703 1749 1712 1715 1747 1718 1726 1736

L12 1801-1869

1803 1803 1849 1812 1815 1847 1818 - 1836

VKII

O11 1901-1969

- - - - - 1956 -

O1 2001-2069

- - - - 2056 -

A17 2101-2169

- - 2112 - 2118 2156 -

A1 2201-2269

- - 2212 - 2218 2256 -

A18 2301-2369

- - - - - 2356 -

A2 2401-2469

- - - - - 2456 -

A19 2501-2569

- - 2512 - 2518 2556 -

A3 2601-2669

- - 2612 - 2618 2656 -

A23 2701-2769

- - - - - 2756 2729 -

VKIII

A27 2801-2869

- - 2812 - 2839 2818 2860 -

A11 2901-2969

- - 2912 - 2939 2918 2960 -

L2 3001-3069

- - 3012 - 3039 3018 3060 -

L16 3101-3169

- - 3112 - 3139 3118 3160 -

L6 3201-3269

- - 3212 - 3239 3218 3260 -

L20 3301-3369

- - 3312 - 3339 3318 3360 -

L25 3401-3469

- - 3412 - 3439 3418 3460 -

VKIV

B3 3501-3569

3503 - 3512 3515 3539 3518 3551< -

VKV

82 3601-3669

- - 3649 - 3647 3618 -

VKVI

A26 3701-3769

- - 3712 - 3718 -

A10 3801-3869

- - 3812 - 3818 -

A14 3901-3969

- - 3912 - 3918 3930> -

VKI

VKI

O12 1-69

37 41 53 53 55 56 -

O2 101-169

137 141 153 153 155 156 -

O18 201-269

237 241 253 253 255 256 -

O8 301-369

337 341 353 353 355 356 -

A20 401-469

437 441 453 453 455 456 -

A30 501-569

537 541 553 553 555 556 -

L14 601-669

637 641 653 653 655 656 -

L1 701-769

737 741 753 753 755 756 -

L15 801-869

837 841 853 853 855 856 -

L4 901-969

937 941 953 953 955 956 -

L18 1001-1069

1037 1041 1053 1053 1055 1056 -

L5 1101-1169

1137 1141 1153 1153 1155 1156 -

L19 1201-1269

1237 1241 1253 1253 1255 1256 -

L8 1301-1369

1337 1341 1353 1353 1355 1356 -

L23 1401-1469

1437 1441 1453 1453 1455 1456 1406

L9 1501-1569

1537 1541 1553 1553 1555 1556 1506

SfaNl

Sfcl Hinfl Mlyl --> --> <-- Maelll Tsp45l mismos sitios Hphl xx38 xx56 xx62 Hpall Mspl xx06 xx52

L24 1601-1669

1637 1641 1653 1653 1655 1656

L11 1701-1769

1737 1741 1753 1753 1755 1756

L12 1801-1869

1837 1841 1853 1853 1855 1856

VKII

O11 1901-1969

- - 1918 1918 1937 1938 1952

O1 2001-2069

- - 2018 2018 2037 2038 2052

A17 2101-2169

- - 2112 2112 2137 2138 2152

A1 2201-2269

- - 2212 2212 2237 2238 2252

A18 2301-2369

- - 2318 2318 2337 2338 2352

A2 2401-2469

- - 2418 2418 2437 2438 2452

A19 2501-2569

- - 2512 2512 2537 2538 2552

A3 2601-2669

- - 2612 2612 2637 2638 2652

A23 2701-2769

- - 2718 2718 2737 2738* 2731* -

VKIII

A27 2801-2869

- - - - -

A11 2901-2969

- - - - -

VKIII

L2 3001-3069

- - - - -

L16 3101-3169

- - - - -

L6 3201-3269

- - - - -

L20 3301-3369

- - - - -

L25 3401-3469

- - - - -

VKIV

B3 3501-3569

- - 3525 3525 -

VKV

B2 3601-3669

- - 3639 3639 -

VKVI

A26 3701-3769

- - 3739 3712 3739 3712 3755 3737 3762 3756 -

A10 3801-3869

- - 3839 3812 3839 3812 3855 3837 3862 3856 -

A14 3901-3969

- - 3939 3939 3955 3937 3962 3956 -

BsaJl xx29 xx42 xx43

BssKl (NstNl) xx22 xx30 xx43 Bpml xx20 xx41 xx44 --> --> <-- BsrFl Cac8l Nael NgoMIV Haelll Tsp509l

VKI

O12 1-69

- - - - - -

BsaJl xx29 xx42 xx43

BssKl (NstNl) xx22 xx30 xx43 Bpml xx20 xx41 xx44 --> --> <-- BsrFl Cac8l Nael NgoMIV Haelll Tsp509l

VKI

O2 101-169

- - - - - -

O18 201-269

- - - - - -

O8 301-369

- - - - - -

A20 401-469

- - - - - -

A30 501-569

- - - - - -

L14 601-669

- - - - - -

L1 701-769

- - - - - -

L15 801-869

- - - - - -

L4 901-969

- - - - - -

L18 1001-1069

- - - - - -

L5 1101-1169

- - - - - -

L19 1201-1269

- - - - - -

L8 1301-1369

- - - - - -

L23 1401-1469

- - - - - -

L9 1501-1569

- - - - - -

BsaJl xx29 xx42 xx43

BssKl (NstNl) xx22 xx30 xx43 Bpml xx20 xx41 xx44 --> --> <-- BsrFl Cac8l Nael NgoMIV Haelll Tsp509l

VKI

L24 1601-1669

- - - - - -

L11 1701-1769

- - - - - -

L12 1801-1869

- - - - - -

VKII

O11 1901-1969

1942 1943 1944 1951 1954 -

O1 2001-2069

2042 2043 2044 2051 2054 -

A17 2101-2169

2142 - - 2151 2154 -

A1 2201-2269

2242 - - 2251 2254 -

A18 2301-2369

2342 2343 - 2351 2354 -

A2 2401-2469

2442 2443 - 2451 2454 -

A19 2501-2569

2542 2543 2544 2551 2554 -

A3 2601-2669

2642 2643 2644 2651 2654 -

A23 2701-2769

2742 - - 2751 2754 -

VKIII

A27 2801-2869

2843 2843 2822 2841 2820 - - 2803

VKIII

A11 2901-2969

2943 2943 2941 2920 - - 2903

L2 3001-3069

3043 3043 3041 - - -

L16 3101-3169

3143 3143 3141 3120 - - -

L6 3201-3269

3243 3243 3241 3220 - - 3203

L20 3301-3369

3343 3343 3341 3320 - - 3303

L25 3401-3469

3443 3443 3441 3420 - - 3403

VKIV

B3 3501-3569

3529 3530 3520 - 3554

VKV

B2 3601-3669

3643 3641 3620 - -

VKVI

A26 3701-3769

- 3720 - - 3703

A10 3801-3869

- 3820 - - 3803

A14 3901-3969

3943 3943 3941 3920 - - -

Tabla 10 Secuencias GLG de FR1 Lambda

! VL1

! VL2

! VL3

VL4

! VL5

! VL6

! VL7

! VL8

! VL9

! VL10

Tabla 11 RERS encontrados en GLG de FR1 lambda humana

! Hay 31 GLG lambda

MlyI NnnnnnGACTC

25

1: 6

3: 6 4: 6 6: 6 7: 6 8: 6

9: 6

10: 6 11: 6 12: 6 15: 6 16: 6

20: 6

21: 6 22: 6 23: 6 23: 50 24: 6

25: 6

25: 50 26: 6 27: 6 28: 6 30: 6

31: 6

Hay 23 aciertos en la base# 6

-"- GAGTCNNNNNn

1

26: 34

MwoI GCNNNNNnngc

20

1: 9

2: 9 3: 9 4: 9 11: 9 11: 56

12: 9

13: 9 14: 9 16: 9 17: 9 18: 9

19: 9

20: 9 23: 9 24: 9 25: 9 26: 9

30: 9

31: 9

Hay 19 aciertos en la base# 9

HinfI Gantc

27

1: 12

3: 12 4: 12 6: 12 7: 12 8: 12

9: 12

10: 12 11: 12 12: 12 15: 12 16: 12

20: 12

21: 12 22: 12 23: 12 23: 46 23: 56

24: 12

25: 12 25: 56 26: 12 26: 34 27: 12

28: 12

30: 12 31: 12

Hay 23 aciertos en la base# 12

PleI gactc

25

1: 12

3: 12 4: 12 6: 12 7: 12 8: 12

9: 12

10: 12 11: 12 12: 12 15: 12 16: 12

20: 12

21: 12 22: 12 23: 12 23: 56 24: 12

25: 12

25: 56 26: 12 27: 12 28: 12 30: 12

31: 12

Hay 23 aciertos en la base# 12

-"- gagtc

1

26: 34

DdeI Ctnag

32

1: 14

2: 24 3: 14 3: 24 4: 14 4: 24

5: 24

6: 14 7: 14 7: 24 8: 14 9: 14

10: 14

11: 14 11: 24 12: 14 12: 24 15: 5

15: 14

16: 14 16: 24 19: 24 20: 14 23: 14

24: 14

25: 14 26: 14 27: 14 28: 14 29: 30

30: 14

31: 14

Hay 21 aciertos en la base# 14

BsaJI Ccnngg

38

1: 23

1: 40 2: 39 2: 40 3: 39 3: 40

4: 39

9: 40 5: 39 11: 39 12: 38 12: 39

13: 23

13: 39 14: 23 14: 39 15: 38 16: 39

17: 23

17: 39 18: 23 18: 39 21: 38 21: 39

21: 47

22: 38 22: 39 22: 47 26: 40 27: 39

28: 39

29: 14 29: 39 30: 38 30: 39 30: 47

31: 23

31: 32

Hay 17 aciertos en la base# 39

Hay 5 aciertos en la base# 38

Hay 5 aciertos en la base# 40 Hace la escisión desigual.

Mn1I cctc

35

1: 23

2: 23 3: 23 4: 23 5: 23 6: 19

6: 23

7: 19 8: 23 9: 19 9: 23 10: 23

11: 23

13: 23 14: 23 16: 23 17: 23 18: 23

19: 23

20: 47 21: 23 21: 29 21: 47 22: 23

22: 29

22: 35 22: 47 23: 26 23: 29 24: 27

27: 23

28: 23 30: 35 30: 47 31: 23

Hay 21 aciertos en la base# 23

Hay 3 aciertos en la base# 19

Hay 3 aciertos en la base# 29

Hay 1 acierto en la base# 26

Hay 1 acierto en la base# 27 Éste podría hacer la escisión desigual.

-"- gagg

7

1: 48

2: 48 3: 48 4: 48 27: 44 28: 44

29: 44

BssKI Nccngg

39

1: 40

2: 39 3: 39 3: 40 4: 39 9: 40

5: 39

6: 31 6: 39 7: 31 7: 39 8: 39

9: 31

9: 39 10: 39 11: 39 12: 38 12: 52

13: 39

13: 52 14: 52 16: 39 16: 52 17: 39

17: 52

18: 39 18: 52 19: 39 19: 52 21: 38

22: 38

23: 39 24: 39 26: 39 27: 39 28: 39

29: 14

29: 39 30: 38

Hay 21 aciertos en la base# 39

Hay 4 aciertos en la base# 38

Hay 3 aciertos en la base# 31

Hay 3 aciertos en la base# 40 Desigual

BstNI CCwgg

30

1: 41

2: 40 5: 40 6: 40 7: 40 8: 40

9: 40

10: 40 11: 40 12: 39 12: 53 13: 40

13: 53

14: 53 16: 40 16: 53 17: 40 17: 53

18: 40

18: 53 19: 53 21: 39 22: 39 23: 40

24: 40

27: 40 28: 40 29: 15 29: 40 30: 39

Hay 17 aciertos en la base# 40

Hay 7 aciertos en la base# 53

Hay 4 aciertos en la base# 39

Hay 1 acierto en la base# 41 Desigual

PspGI ccwgg

30

1: 41

2: 40 5: 40 6: 40 7: 40 8: 40

9: 40

10: 40 11: 40 12: 39 12: 53 13: 40

13: 53

14: 53 16: 40 16: 53 17: 40 17: 53

18: 40

18: 53 19: 53 21: 39 22: 39 23: 40

24: 40

27: 40 28: 40 29: 15 29: 40 30: 39

Hay 17 aciertos en la base# 40

Hay 7 aciertos en la base# 53

Hay 4 aciertos en la base# 39

Hay 1 acierto en la base# 41

ScrFI CCngg

39

1: 41

2: 40 3: 40 3: 41 4: 40 4: 41

5: 40

6: 32 6: 40 7: 32 7: 40 8: 40

9: 32

9: 40 10: 40 11: 40 12: 39 12: 53

13: 40

13: 53 14: 53 16: 40 16: 53 17: 40

17: 53

18: 40 18: 53 19: 40 19: 53 21: 39

22: 39

23: 40 29: 40 26: 40 27: 40 28: 40

29: 15

29: 40 30: 39

Hay 21 aciertos en la base# 40

Hay 4 aciertos en la base# 39

Hay 3 aciertos en la base# 41

MaeIII gtnac

16

1: 52

2: 52 3: 52 4: 52 5: 52 6: 52

7: 52

9: 52 26: 52 27: 10 27: 52 28: 10

28: 52

29: 10 29: 52 30: 52

Hay 13 aciertos en la base# 52

Tsp45I gtsac

15

1: 52

2: 52 3: 52 4: 52 5: 52 6: 52

7: 52

9: 52 27: 10 27: 52 28: 10 28: 52

29: 10

29: 52 30: 52

Hay 12 aciertos en la base# 52

HphI tcacc

26

1: 53

2: 53 3: 53 4: 53 5: 53 6: 53

7: 53

8: 53 9: 53 10: 53 11: 59 13: 59

14: 59

17: 59 18: 59 19: 59 20: 59 21: 59

22: 59

23: 59 24: 59 25: 59 27: 59 28: 59

30: 59

31: 59

Hay 16 aciertos en la base# 59

Hay 10 aciertos en la base# 53

BspMI ACCTGCNNNNn

14

11: 61

13: 61 14: 61 17: 61 18: 61 19: 61

20: 61

21: 61 22: 61 23: 61 24: 61 25: 61

30: 61

31: 61

Hay 14 aciertos en la base# 61 Va en CDR1

Tabla 12: Emparejamientos con adaptadores URE FR3 en 79 HC humanos.

A. Lista de genes de cadena pesada muestreados

AF008566

AF103367 HSA235674 HSU94417 S83240

AF035043

AF103368 HSA235673 HSU94418 SABVH369

AF103026

AF103369 HSA240559 HSU96389 SADEIGVH

af103033

AF103370 HSCB201 HSU96391 SAH2IGVH

AF103061

af103371 HSIGGVHC HSU96392 SDA3IGVH

Af103072

AF103372 HSU44791 HSU96395 SIGVHTTD

af103078

AF158381 HSU44793 HSZ93849 SUK4IGVH

AF103099

E05213 HSU82771 HSZ93850

AF103102

E05886 HSU82949 HSZ93851

AF103103

E05887 HSU82950 HSZ93853

AF103174

HSA235661 HSU82952 HSZ93855

AF103186

HSA235664 HSU82961 HSZ93857

A. Lista de genes de cadena pesada muestreados

af103187

HSA235660 HSU86522 HSZ93860

AF103195

HSA235659 HSU86523 HSZ93863

af103277

HSA235678 HSU92452 MCOMFRAA

af103286

HSA235677 HSU94412 MCOMFRVA

AF103309

HSA235676 HSU94415 582745

af103343

HSA235675 HSU94416 S82764

Tabla 12B. Ensayo de todas los diferentes GLG de las bases 89.1 a 93.2 del dominio variable pesado

Id

Nb 0 1 2 3 4 SEQ ID NO:

1

38 15 11 10 0 2 Seq1 gtgtattactgtgc 25

2

19 7 6 4 2 0 Seq2 gtAtattactgtgc 26

3

1 0 0 1 0 0 Seq3 gtgtattactgtAA 27

4

7 1 5 1 0 0 Seq4 gtgtattactgtAc 28

5

0 0 0 0 0 0 Seq5 Ttgtattactgtgc 29

6

0 0 0 0 0 0 Seq6 TtgtatCactgtgc 30

7

3 1 0 1 1 0 Seq7 ACAtattactgtgc 31

8

2 0 2 0 0 0 Seq8 ACgtattactgtgc 32

9

9

2 2 4 1 0 Seq9 ATqtattactqtqc 33

Grupo

26 26 21 4 2

Acumulativo

26 52 73 77 79

Tabla 12C Seqs de reconocimiento de URE más importantes en FR3 pesado

1

VHSzyl GTGtattactgtgc (ON_SHC103) (SEQ ID NO:25)

2

VHSzy2 GTAtattactgtgc (ON_SHC323) (SEQ ID NO:26)

3

VHSzy4 GTGtattactgtac (ON_SHC349) (SEQ ID NO:28)

4

VHSzy9 ATGtattactgtgc (ON_SHC5a) (SEQ ID NO:33)

Tabla 12D, ensayo de 79 genes HC V humanos con cuatro sondas Tabla 13

Número de secuencias

79

Número de bases

29143

Número de emparejamientos erróneos

Id

Mejor 0 1 2 3 4 5

1

39 15 11 10 1 2 0 Seq1 gtgtattactgtgc (SEQ ID NO:25)

2

22 7 6 5 3 0 1 Seq2 gtAtattactgtgc (SEQ ID NO:26)

3

7 1 5 1 0 0 0 Seq4 gtgtattactgtAc (SEQ ID NO:28)

4

11 2 4 4 1 0 0 Seq9 ATgtattactgtgc (SEQ ID NO:33)

Grupo

25 26 20 5 2

Acumulativo

25 51 71 76 78

Una secuencia tiene cinco emparejamientos erróneos con las secuencias 2, 4, y 9; se puntúa como el mejor para 2. Id es el número del adaptador. Mejor es el número de secuencia para la que el adaptador identificado fue el mejor disponible. El resto de la tabla muestra cómo de bien las secuencias se emparejan con los adaptadores. Por ejemplo, hay 10 secuencias que se emparejan con VHSzy1(Id=1 con 2 emparejamientos erróneos y son peores para todos los demás adaptadores. En esta muestra, el 90% vienen en 2 bases de uno de los cuatro adaptadores.

La lista siguientede enzimas se tomó de http://rebase.neb.com/cqi-bin/asymmlist.

He eliminado las enzimas que a) cortan en el sitio de reconocimiento, b) cortan en ambos lados del sitio de reconocimiento, o c) tienen menos de 2 bases entre el sitio de reconocimiento y el de corte más cercano.

REBASE Enzimas 04/13/2001

Enzimas de restricción de Tipo II con secuencias de reconocimiento asimétricas:

Enzimas

Secuencia de Reconocimiento Isoesquizómeros Proveedores

AarI

CACCTGCNNNN^NNNN_ - y

AceIII

CAGCTCNNNNNNN^NNNN_ - -

Bbr7I

GAAGACNNNNNNN^NNNN_ - -

BbvI

GCAGCNNNNNNNN^NNNN_ y

BbvII

GAAGACNN^NNNN_

Bce83I

CTTGAGNNNNNNNNNNNNNN_NN^_ - -

BceAI

ACGGCNNNNNNNNNNNN^NN_ - y

BcefI

ACGGCNNNNNNNNNNNN^N_ - -

BciVI

GTATCCNNNNN_N^ BfuI y

BfiI

ACTGGGNNNN_N^ BmrI y

BinI

GGATCNNNN^N_

BscAI

GCATCNNNN^NN_ - -

BseRI

GAGGAGNNNNNNNN_NN^ - y

BsmFI

GGGACNNNNNNNNNN^NNNN_ BspLU11III y

BspMI

ACCTGCNNNN^NNNN_ Acc36I y

EciI

GGCGGANNNNNNNNN_NN^ - y

Eco57I

CTGAAGNNNNNNNNNNNNNN_NN^ BspKT5I y

FauI

CCCGCNNNN^NN_ BstFZ438I y

FokI

GGATGNNNNNNNNN^NNNN_ BstPZ418I y

GsuI

NN^ CTGGAGNNNNNNNNNNNNNN_NN^ - y

HgaI

GACGCNNNNN^NNNNN_ - y

Enzimas

Secuencia de Reconocimiento Isoesquizómeros Proveedores

HphI

GGTGANNNNNNN N^ AsuHPI y

MboII

GAAGANNNNNNN_N^ - y

MlyI

GAGTCNNNNN^ SchI y

MmeI

TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNN_NN^ - -

MnlI

CCTCNNNNNN_N^ - y

PleI

GAGTCNNNN^N_ PpsI y

RleAI

CCCACANNNNNNNNN_NNN^ - -

SfaNI

GCATCNNNNN^NNNN_ BspST5I y

SspD5I

GGTGANNNNNNNN^ - -

Sth132I

CCCGNNNN^NNNN_ - -

StsI

GGATGNNNNNNNNNN^NNNN_ - -

TaqII

GACCGANNNNNNNNN_NN^, CACCCANNNNNNNNN_NN^ -

TthlllII

CAARCANNNNNNNNN_NN^ - -

UbaPI

CGAACG - -

La notación es ^ significa corta la cadena superior y _ significa corta la cadena inferior. Si la cadena superior e inferior se cortan en el mismo sitio, sólo aparece ^.

Tabla 14

(FOKIact)

5'-cAcATccgTg TTgTT cAcggATgTg-3' a revoir para los ADN emies

(VHEx881)

5'-AATAgTAgAc TgcAgTgTcc TcAgcccTTA AgcTgTTcAT cTgcAAgTAgAgAgTATTcT TAgAgTTgTc TcTAgAcTTA gTgAAgcg-3'

! obsérvese que

VHEx881 es el complemento inverso del ON siguiente

!

[RC] 5'-cgCttcacTaag-

!

Scab........

!

3-23 sintético como en la Tabla 206

!

|TCT|AGA|gac|aac|tct|aag|aat|act|ctc|tac|ttg|cag|atg|XbaI...

!

|aac|agC|TTA|AGg|gct|gag|gac|aCT|GCA|Gtc|tac|tat|t-3' Af1II...

(VHBA881)

5'-cgCttcacTaag|TCT|AGA|gac|aac|tct|aag|aat|act|ctc|tac|ttg|cag|atg||aac|agC|TTA|AGg|gct|gag|gac|aCT|GCA|Gtc|tac|tat|tgt gcg ag-3'

(VHBB881)

5'-cgCttcacTaag|TCT|AGA|gac|aac|tct|aag|aat|act|ctc|tac|ttg|cag|atg||aac|agC|TTA|AGg|gct|gag|gac|aCT|GCA|Gtc|tac|tat|tgt Acg ag-3'

(VH881PCR)

5'-cgCttcacTaag|TCT|AGA|gac|aac -3'

Tabla 15: Uso de FokI como "Enzima de Restricción Universal"

FokI - para ADNds, I representa sitios de secisión

sitios de escisión 5'-cacGGATGtq--nnnnnnn|nnnnnnn-3'(SEQ ID NO:15)

Caso I

5'-...gtg|tatt-actgtgc..Sustrato....-3' (SEQ ID NO:17)

Caso II

5'-...gtgtatt|agac-tgc..Sustrato....-3'(SEQ ID NO:19)

Caso III (Caso I girado 180 grados)

3'-...cacagaa-tgtc|agg..sustrato....-5'(SEQ ID NO:22)

Caso IV (Caso II girado 180 grados)

Sustrato 3'-...ctc-agag|tgactcg...-5'(SEQ ID NO:24)

Adaptadores FokI mejorados

FokI - para ADNds, I representa sitios de secisión

Caso I

Tallo 11, bucle 5, tallo 11, reconocimiento 17

Caso II

Tallo 10, bucle 5, tallo 10, reconocimiento 18

Caso III (Caso I girado 180 grados)

Tallo 11, bucle 5, tallo 11, reconocimiento 20

Caso IV (Caso II girado 180 grados)

Tallo 11, bucle 4, tallo 11, reconocimiento 17

BseRI

Tallo 11, bucle 5, tallo 11, reconocimiento 19

Enzima

Reconocimiento* Nch Ns Localización planeada del sitio

AfeI

AGCgct 0 0

Af1II

Cttaag 0 0 HC FR3

AgeI

Accggt 0 0

AscI

GGcgcgcc 0 0 Después de LC

BglII

Agatct 0 0

BsiWI

Cgtacg 0 0

BspDI

ATcgat 0 0

BssHII

Gcgcgc 0 0

BstBI

TTcgaa 0 0

DraIII

CACNNNgtg 0 0

EagI

Cggccg 0 0

FseI

GGCCGGcc 0 0

FspI

TGCgca 0 0

HpaI

GTTaac 0 0

MfeI

Caattg 0 0 HC FR1

MluI

Acgcgt 0 0

Ncol

Ccatgg 0 0 Señal de cadena pesada

NheI

Gctagc 0 0 HC/conector de anclaje

NotI

GCggccgc 0 0 In conector después de HC

NruI

TCGcga 0 0

Enzima

Reconocimiento* Nch Ns Localización planeada del sitio

PacI

TTAATtaa 0 0

PmeI

GTTTaaac 0 0

PmlI

CACgtg 0 0

PvuI

CGATcg 0 0

SacII

CCGCgg 0 0

SalI

Gtcgac 0 0

SfiI

GGCCNNNNnggcc 0 0 Señal de Cadena Pesada

SgfI

GCGATcgc 0 0

SnaBI

TACgta 0 0

StuI

AGGcct 0 0

XbaI

Tctaga 0 0 HC FR3

AatII

GACGTc 1 1

AclI

AAcgtt 1 1

AseI

ATtaat 1 1

BsmI

GAATGCN 1 1

BspEI

Tccgga 1 1 HC FR1

BstXI

CCANNNNNTGG 1 1 HC FR2

DrdI

GACNNNNnngtc 1 1

HindIII

Aagctt 1 1

PciI

Acatgt 1 1

SapI

gaagagc 1 1

ScaI

AGTact 1 1

SexAI

Accwggt 1 1

SpeI

Actagt 1 1

TliI

Ctcgag 1 1

XhoI

Ctcgag 1 1

Enzima

Reconocimiento* Nch Ns Localización planeada del sitio

BcgI

cgannnnnntgc 2 2

BlpI

GCtnagc 2 2

BssSI

Ctcgtg 2 2

BstAPI

GCANNNNntgc 2 2

EspI

GCtnagc 2 2

KasI

Ggcgcc 2 2

PflMI

CCANNNNntgg 2 2

XmnI

GAANNnnttc 2 2

ApaLI

Gtgcac 3 3 seq señal LC

NaeI

GCCggc 3 3

NgoMI

Gccggc 3 3

PvuII

CAGctg 3 3

RsrII

CGgwccg 3 3

BsrBI

GAGcgg 4 4

BsrDI

GCAATGNNn 4 4

BstZ17I

GTAtac 4 4

EcoRI

Gaattc 4 4

SphI

GCATGc 4 4

SspI

AATatt 4 4

AccI

GTmkac 5 5

BclI

Tgatca 5 5

BsmBI

Nnnnnngagacg 5 5

BsrGI

Tgtaca 5 5

Oral

TTTaaa 6 6

NdeI

CAtatg 6 6 HC FR4

SwaI

ATTTaaat 6 6

Enzima

Reconocimiento* Nch Ns Localización planeada del sitio

BamHI

Ggatcc 7 7

SacI

GAGCTc 7 7

BciVI

GTATCCNNNNNN 8 8

BsaBI

GATNNnnatc 8 8

NsiI

ATGCAt 8 8

Bsp120I

Gggccc 9 9 CH1

ApaI

GGGCCc 9 9 CH1

PspOOM1

Gggccc 9 9

BspHI

Tcatga 9 11

EcoRV

GATatc 9 9

AhdI

GACNNNnngtc 11 11

BbsI

GAAGAC 11 14

PsiI

TTAtaa 12 12

BsaI

GGTCTCNnnnn 13 15

XmaI

Cccggg 13 14

AvaI

Cycgrg 14 16

BglI

GCCNNNNnggc 14 17

AlwNI

CAGNNNctg 16 16

BspMI

ACCTGC 17 19

XcmI

CCANNNNNnnnntgg 17 26

BstEII

Ggtnacc 19 22 HC FR4

Sse8387I

CCTGCAgg 20 20

AvrII

Cctagg 22 22

HincII

GTYrac 22 22

BsgI

GTGCAG 27 29

MscI

TGGcca 30 34

Enzima

Reconocimiento* Nch Ns Localización planeada del sitio

BseRI

NNnnnnnnnnctcctc 32 35

Bsu36I

CCtnagg 35 37

PstI

CTGCAg 35 40

EciI

nnnnnnnnntccgcc 38 40

PpuMI

RGgwccy 41 50

StyI

Ccwwgg 44 73

EcoO109I

RGgnccy 46 70

Acc65I

Ggtacc 50 51

KpnI

GGTACc 50 51

BpmI

ctccag 53 82

AvaII

Ggwcc 71 124

* la escisión se produce en la cadena superior después de la última base en mayúsculas. Para RE que cortan secuencias palindrómicas, la cadena inferior se corta en el sitio simétrico.

Tabla 20: Escisión de 79 cadenas pesadas humanas

Enzima

Reconocimiento Nch Ns Localización planeada del sitio

AfeI

AGCgct 0 0

AflII

Cttaag 0 0 HC FR3

AscI

GGcgcgcc 0 0 Después de LC

BsiWI

Cgtacg 0 0

BspDI

ATcgat 0 0

BssHII

Gcgcgc 0 0

FseI

GGCCGGcc 0 0

HpaI

GTTaac 0 0

Nhel

Gctagc 0 0 Conector HC

NotI

Gcggccgc 0 0 En conector, HC/anclaje

NruI

TCGcga 0 0

Enzima

Reconocimiento Nch Ns Localización planeada del sitio

NsiI

ATGCAt 0 0

PacI

TTAATtaa 0 0

PciI

Acatgt 0 0

PmeI

GTTTaaac 0 0

PvuI

CGATcg 0 0

RsrII

CGgwccg 0 0

SapI

gaagagc 0 0

SfiI

GGCCIJNNNnggcc 0 0 Seq señal HC

SgfI

GCGATcgc 0 0

SwaI

ATTTaaat 0 0

AclI

AAcgtt 1 1

AgeI

Accggt 1 1

AseI

ATtaat 1 1

AvrII

Cctagg 1 1

BsmI

GAATGCN 1 1

BsrBI

GAGcgg 1 1

BsrDI

GCAATGNNn 1 1

DraI

TTTaaa 1 1

FspI

TGCgca 1 1

HindIII

Aagctt 1 1

MfeI

Caattg 1 1 HC FR1

NaeI

GCCggc 1 1

NgoMI

Gccggc 1 1

SpeI

Actagt 1 1

Acc65I

Ggtacc 2 2

BstBI

TTcgaa 2 2

Enzima

Reconocimiento Nch Ns Localización planeada del sitio

KpnI

GGTACc 2 2

MluI

Acgcgt 2 2

NcoI

Ccatgg 2 2 Seq señal En HC

NdeI

CAtatg 2 2 HC FR4

PmlI

CACgtg 2 2

XcmI

CCANNNNNnnnntgg 2 2

BcgI

cgannnnnntgc 3 3

BclI

Tgatca 3 3

BglI

GCCNNNNnggc 3 3

BsaBI

GATNNnnatc 3 3

BsrGI

Tgtaca 3 3

SnaBI

TACgta 3 3

Sse8387I

CCTGCAgg 3 3

ApaLI

Gtgcac 4 4 Señal LC/FR1

BspHI

Tcatga 4 4

BssSI

Ctcgtg 4 4

PsiI

TTAtaa 4 5

SphI

GCATGc 4 4

AhdI

GACNNNnngtc 5 5

BspEI

Tccgga 5 5 HC FR1

MscI

TGGcca 5 5

SacI

GAGCTc 5 5

ScaI

AGTact 5 5

SexAI

Accwggt 5 6

SspI

AATatt 5 5

TliI

Ctcgag 5 5

Enzima

Reconocimiento Nch Ns Localización planeada del sitio

XhoI

Ctcgag 5 5

BbsI

GAAGAC 7 8

BstAPI

GCANNNNntgc 7 8

BstZ17I

GTAtac 7 7

EcoRV

GATatc 7 7

EcoRI

Gaattc 8 8

BlpI

GCtnagc 9 9

Bsu36I

CCtnagg 9 9

DraIII

CACNNNgtg 9 9

EspI

GCtnagc 9 9

StuI

AGGcct 9 13

XbaI

Tctaga 9 9 HC FR3

Bsp120I

Gggccc 10 11 CH1

ApaI

GGGCCc 10 11 CH1

PspOOMI

Gggccc 10 11

BciVI

GTATCCNNNNNN 11 11

SalI

Gtcgac 11 12

DrdI

GACNNNNnngtc 12 12

KasI

Ggcgcc 12 12

XmaI

Cccggg 12 14

BglII

Agatct 14 14

HincII

GTYrac 16 18

BamHI

Ggatcc 17 17

PflMI

CCANNNNntgg 17 18

BsmBI

Nnnnnngagacg 18 21

BstXI

CCANNNNNntgg 18 19 HC FR2

Enzima

Reconocimiento Nch Ns Localización planeada del sitio

XmnI

GAANNnnttc 18 18

SacII

CCGCgg 19 19

PstI

CTGCAg 20 24

PvuII

CAGctg 20 22

AvaI

Cycgrg 21 24

EagI

Cggccg 21 22

AatII

GACGTc 22 22

BspMI

ACCTGC 27 33

AccI

GTmkac 30 43

StyI

Ccwwgg 36 49

AlwNI

CAGNNNctg 38 44

BsaI

GGTCTCNnnnn 38 44

PpuMI

RGgwccy 43 46

BsgI

GTGCAG 44 54

BseRI

NNnnnnnnnnctcctc 48 60

EciI

nnnnnnnnntccgcc 52 57

BstEII

Ggtnacc 54 61 HC Fr4, 47/79 tienen uno

EcoO109I

RGgnccy 54 86

BpmI

ctccag 60 121

AvaIl

Ggwcc 71 140

Tabla 22: Cebadores usados en amplificación RACE:

Cadena pesada

HuCμ-FOR (1a PCR)

5'-TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT-3'

HuCμ-Anidado (2a PCR)

5' CTT TTC TTT GTT GCC GTT GGG GTG-3'

Cadena ligera kappa

HuCkFor (1a PCR)

5'-ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT-3'

HuCkForAscI(2a PCR)

Cadena ligera lambda

HuClambdaFor (1a PCR)

HuCL2-FOR

5'-TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG-3'

HuCL7-FOR

5'-AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG-3'

HuClambdaForAscI (2a PCR)

HuCL2-FOR-ASC

HuCL7-FOR-ASC

Cebadores 5' GeneRAcer proporcionados con el kit (Invitrogen)

5'A 1a PCR

5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'

5'NA 2a pCR

5'GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3'

Tabla 23: ON usados en la Captura de cadenas ligeras kappa usando el método CJ y BsmAI

Todos los ON están escritos 5' a 3'.

REdapters (6)

ON_20SK15012

gggAggATggAgAcTgggTc

ON_20SK15L12

gggAAgATggAgAcTgggTc

ON_20SK15A17

gggAgAgTggAgAcTgAgTc

ON_20SK15A27

gggTgccTggAgAcTgcgTc

ON_20SK15A11

gggTggcTggAgAcTgcgTc

ON_20SK15B3

gggAgTcTggAgAcTgggTc

Puentes (6)

kapbri1012

gggAggATggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

kapbri1L12

gggAAgATggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

kapbrilA17

gggAgAgTggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

kapbri1A27

gggTgccTggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

kapbri1A11

gggTggcTggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

kapbrilB3

gggAgTcTggAgAcTgggTcATcTggATgTcTTgTgcAcTgTgAcAgAgg

Extensor (5' biotinilado)

kapextl bio

ccTcTgTcAcAgTgcAcAAgAcATccAgATgAcccAgTcTcc

Cebadores

kaPCRtl

ccTcTgTcAcAgTgeAcAAgAc

kapfor

5'-aca ctc tcc cct gtt gaa gct ctt-3'

Tabla 24: Programa de PCR para la amplificación de ADN kappa

95°C

5 minutos

95°C

15 segundos

65°C

30 segundos

72°C

1 minuto

72°C

7 minutos

4°C

mantenido

Reactivos (reacción de 100 ul):

Molde

50 ng

10x tampón de PCR turbo

1x

Pfu turbo

4U

dNTPs

200 μM cada uno

kaPCRtl

300 nM

kapfor

300 nM

Todas las secuencias son 5' a 3'.

1) ON_CD1Bsp, 30 bases

2) ON_Br12, 42 bases

3) ON_CD2Xba. 51 bases

4) ON_BotXba, 23 bases

Tabla 31: Oligonucleótidos Puente/Extensor

ON_Lam1aB7(rc)

.........................GTGCTGACTCAGCCACCCTC. 20

ON_Lam2aB7(rc)

........................GCCCTGACTCAGCCTGCCTC. 20

ON_Lam31B7(rc)

.......................GAGCTGACTCAGG.ACCCTGC 20

ON_Lam3rB7(rc)

........................GAGCTGACTCAGCCACCCTC. 20

ON_LamHf1cBrg(rc)

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGTCTTGACTCAGCC....... 38

ON_LamHf1cExt

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGTCTTG............... 30

ON_LamHf2b2Brg(rc)

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGCTTTGACTCAGCC....... 38

ON_LamHf2b2Ext

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGCTTTG............... 30

ON_LamHf2dBrg(rc)

CCTCGACAGCTAAGTGCACAGAGCGCTTTGACTCAGCC....... 38

ON_LamHf2dExt

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGCTTTG............... 30

ON_LamHf31Brg(rc)

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGAATTGACTCAGCC....... 38

ON_LamHf31Ext

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGAGCGAATTG............... 30

ON_LamHf3rBrg(rc)

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGTACGAATTGACTCAGCC....... 38

ON_LamHf3rExt

CCTCGACAGCGAAGTGCACAGTACGAATTG............. 30

ON_lamPlePCR

CCTCGACAGCGAAGTGCACAG........................ 21

Consenso

Tabla 33: Pares Puente/extensor

Puentes (2) H43.XABrl

H43.XABr2

Extensor H43.XAExt

Tabla 34: Cebadores de PCR

Cebadores

H43.XAPCR2

gactgggTgTAgTgATcTAg

Hucmnest

cttttctttgttgccgttggggtg

Tabla 35: Programa de PCR para la amplificación del ADN de CDR3 de cadena pesada

95 grados C

5 minutos

95 grados C

20 segundos

60 grados C

30 segundos repetir 20x

72 grados C

1 minuto

72 grados C

7 minutos

4 grados C

mantenido

Reactivos (reacción de 100 ul):

Molde

5ul mezcla de ligación

10x tampón de PCR

1x

Taq

5U

dNTPs

200 uM cada uno

MgCl2

2mM

H43.XAPCR2-biotina

400 nM

Hucmnest

200 nM

Tabla 40: Titulaciones de fagos y enriquecimientos de unas selecciones con una biblioteca de Fab humano basada en DY3F31

Entrada (cfu totales)

Salida (cfu totales) Proporción salida/entrada

R1-ox seleccionado en phOx-BSA

4,5 x 1012 3,4 x 105 7,5 x 10-8

R2-Strep seleccionado en lechos Strep

9,2 x 1012 3 x 108 3,3 x 10-5

Tabla 41: Frecuencia de positivos en ELISA en bibliotecas de Fab basadas en DY3F31

Anti-M13 HRP

9E10/RAMHRP Anti-CK/CL Gar-HRP

R2-ox (con inducción con IPTG) R2-ox (sin IPTG)

18/44 13/44 10/44 ND 10/44 ND

R3-strep (con IPTG)

39/44 38/44 36/44

R3-strep (sin IPTG)

33/44 ND ND

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> LADNER, ROBERT C. COHEN, EDWARD H. NASTRI, HORACIO G. ROOKEY, KRISTIN L. HOET, RENE HOOGENBOOM, HENDRICUS R. J. M.

<120> NUEVOS MÉTODOS PARA CONSTRUIR BIBLIOTECAS QUE COMPRENDEN MIEMBROS PRESENTADOS Y/O EXPRESADOS DE UNA FAMILIA DIVERSA DE PÉPTIDOS, POLIPÉPTIDOS O PROTE�?NAS Y LAS NUEVAS BIBLIOTECAS

<130> DYAX/002 CIP2

<140> 10/045,674

<141> 2001-10-25

<150> 06/198,069

<151> 2000-04-17

<150> 09/837,306

<151> 2001-04-17

<160> 635

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 1 catgtgtatt actgtgc 17

<210> 2

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 2 cacatccgtg cttcttgcac ggatgtggca cagtaataca catg 44

<210> 3

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 3 gtgtattaga ctgctgcc 18

<210> 4

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 4 ggcagcagtc taatacacca catccgtgtt cttcacggat gtg 43

<210> 5

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 5 cacatccgtg tttgttacac ggatgtggtg tcttacagtc cattctg 47

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 6 cagaatggac tgtaagacac 20

<210> 7

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 7 atcgagtctc actgagccac atccgtggtt ttccacggat gtg 43

<210> 8

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 8 gctcagtgag actcgat 17

<210> 9

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (10)..(24)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 9 cacgaggagn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 10

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 10 atgaccgaat tgctacaag 19

<210> 11

<211> 46

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 11 gactcctcag cttcttgctg aggagtcctt gtagcaattc ggtcat 46

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: etiqueta 6 His

<400> 12

<210> 13

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 13 gtctcnnnnn 10

<210> 14

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 14 nnnnnngaga c 11

<210> 15

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (11)..(24)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 15 cacggatgtg nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 16

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(14)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 16 nnnnnnnnnn nnnncacatc cgtg 24

<210> 17

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 17 gtgtattact gtgc 14

<210> 18

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 18 cacatccgtg cacggatgtg gcacagtaat acac 34

<210> 19

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 19 gtgtattaga ctgc 14

<210> 20

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 20 gcagtctaat acaccacatc cgtgcacgga tgtg 34

<210> 21

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 21 cacatccgtg cacggatgtg gtgtcttaca gtcc 34

<210> 22

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 22 ggactgtaag acac 14

<210> 23

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 23 gagtctcact gagccacatc cgtgcacgga tgtg 34

<210> 24

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 24 gctcagtgag actc 14

<210> 25

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 25 gtgtattact gtgc 14

<210> 26

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 26 gtatattact gtgc 14

<210> 27

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 27 gtgtattact gtaa 14

<210> 28

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 28 gtgtattact gtac 14

<210> 29

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 29 ttgtattact gtgc 14

<210> 30

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 30 ttgtatcact gtgc 14

<210> 31

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 31 acatattact gtgc 14

<210> 32

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 32 acgtattact gtgc 14

<210> 33

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 33 atgtattact gtgc 14

<210> 34

<211> 101

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45 <210> 46

<211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 60 <210> 61

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 69

<210> 70

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 70

<210> 71

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 71

<210> 72

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 74

<210> 75

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75 <210> 76

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 76

<210> 77

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 77

<210> 78

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 78

<210> 79

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 81

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 81

<210> 82

<211> 96

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210> 83

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 83

<210> 84

<211> 98

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (3)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 85 gcnnnnnnng c 11

<210> 86

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 86 caynnnnrtg 10

<210> 87

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 87 gagtcnnnnn n 11

<210> 88

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 88 nnnnnngaga c 11

<210> 89

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 89 gaannnnttc 10

<210> 90

<211> 90

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos 3-23 FR3 sintética

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(90)

<220>

<221> base_modificada

<222> (3)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (9)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (12)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (21)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (30)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (36)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (51)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada 5 <222> (57)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (60) 10 <223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada

<222> (69)

<223> A, T, C o G

15 <220>

<221> base_modificada

<222> (72)

<223> A, T, C o G

<220> 20 <221> base_modificada

<222> (75)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base_modificada 25 <222> (78)

<223> A, T, C o G

<220>

<221> base modificada

<222> (87) 30 <223> A, T, C o G

<400> 90

<210> 91

<211> 30 35 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de la proteína 3-23 FR3 sintética

<400> 91

<210> 92

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

45 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 92 agttctccct gcagctgaac tc 22

<210> 93

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 93 cactgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 94

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 94 ccctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 95

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 95 ccgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 96

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 96 cgctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 97

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 97 cggcatatct gcagatctgc ag 22

<210> 98

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 98 cggcgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 99

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 99 ctgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 100

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 100 tcgcctatct gcaaatgaac ag 22

<210> 101

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 101

<210> 102

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 102 caagtagaga gtattcttag agttgtctct agacttagtg aagcg 45

<210> 103

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 103 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagct gaac 54

<210> 104

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 104 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcaaat gaac 54

<210> 105

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 105 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagtg gagc

<210> 106

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 106 cgcttcacta agtctagaga c 21

<210> 107

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 107 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 108

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 108 acatggagct gagcaggctg ag 22

<210> 109

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 109 acatggagct gaggagcctg ag 22

<210> 110

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 110 acctgcagtg gagcagcctg aa 22

<210> 111

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 111 atctgcaaat gaacagcctg aa 22

<210> 112

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 112 atctgcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 113

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 113 atctgcaaat gaacagtctg ag 22

<210> 114

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 114 atctgcagat ctgcagccta aa 22

<210> 115

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 115 atcttcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 116

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 116 atcttcaaat gggcagcctg ag 22

<210> 117

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 117 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 118

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 118 ccctgcagct gaactctgtg ac 22

<210> 119

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 119 tccttacaat gaccaacatg ga 22

<210> 120

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 120 tccttaccat gaccaacatg ga 22

<210> 121

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 121 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 122

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 122 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 123

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 123 cgcttcacta agtctagaga caactctaag aatactctct acttgcagat gaac 54

<210> 124

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 124 cgcttcactc agtctagaga taacagtaaa aatactttgt acttgcagct gagcagcctg

<210> 125

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 125 cgcttcactc agtctagaga taacagtaaa aatactttgt acttgcagct gagctctgtg 60

<210> 126

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 126 tcagctgcaa gtacaaagta tttttactgt tatctctaga ctgagtgaag cg 52

<210> 127

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 127 cgcttcactc agtctagaga taac 24

<210> 128

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 128 ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 129

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 129 ctgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 130

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 130 ccgtgtatta ctgtgcgaga gg 22

<210> 131

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 131 ccgtgtatta ctgtgcaaca ga 22

<210> 132

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 132 ccatgtatta ctgtgcaaga ta 22

<210> 133

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 133 ccgtgtatta ctgtgcggca ga 22

<210> 134

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 134 ccacatatta ctgtgcacac ag 22

<210> 135

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 135 ccacatatta ctgtgcacgg at 22

<210> 136

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 136 ccacgtatta ctgtgcacgg at 22

<210> 137

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 137 ccttgtatta ctgtgcaaaa ga 22

<210> 138

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 138 ctgtgtatta ctgtgcaaga ga 22

<210> 139

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 139 ccgtgtatta ctgtaccaca ga 22

<210> 140

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 140 ccttgtatca ctgtgcgaga ga 22

<210> 141

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 141 ccgtatatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 142

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 142 ctgtgtatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 143

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 143 ccgtgtatta ctgtactaga ga 22

<210> 144

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 144 ccgtgtatta ctgtgctaga ga 22

<210> 145

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 145 ccgtgtatta ctgtactaga ca 22

<210> 146

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 146 ctgtgtatta ctgtaagaaa ga 22

<210> 147

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 147 ccgtgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 148

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 148 ccgtgtatta ctgtgccaga ga 22

<210> 149

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 149 ctgtgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 150

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 150 ccatgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 151

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 151 ccatgtatta ctgtgcgaga 20

<210> 152

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 152 ccgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 153

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 153 ctgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 154

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 154 ccgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 155

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 155 ccgtatatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 156

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 156 ctgtgtatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 157

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 157 ctgtgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 158

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 158 ccatgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 159

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 159 ccatgtatta ctgtgcgaga 20

<210> 160

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 160

<210> 161

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 161

<210> 162

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 162 <212> ADN

<210> 163 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 163 ggtgtagtga tctagagaca ac

22

<210> 164 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 164 ggtgtagtga aacagcttta gggctgagga cactgcagtc tactattgtg cgaga

55

<210> 165 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 165 ggtgtagtga aacagcttta gggctgagga cactgcagtc tactattgtg cgaaa

55

<210> 166 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 166 atagtagact gcagtgtcct cagcccttaa gctgtttcac tacacc

46

<210> 167 <211> 46

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 167 ggtgtagtga aacagcttaa gggctgagga cactgcagtc tactat 46

<210> 168

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 168 ggtgtagtga aacagcttaa gggctg 26

<210> 169

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 169 agttctccct gcagctgaac tc 22

<210> 170

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 170 cactgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 171

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 171 ccctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 172

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 172 ccgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 173

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 173 cgctgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 174

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 174 cggcatatct gcagatctgc ag 22

<210> 175

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 175 cggcgtatct gcaaatgaac ag 22

<210> 176

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 176 ctgcctacct gcagtggagc ag 22

<210> 177

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 177 tcgcctatct gcaaatgaac ag 22

<210> 178

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 178 acatggagct gagcagcctg ag 22

<210> 179

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 179 acatggagct gagcaggctg ag 22

<210> 180

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 180 acatggagct gaggagcctg ag 22

<210> 181

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 181 acctgcagtg gagcagcctg aa 22

<210> 182

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 182 atctgcaaat gaacagcctg aa 22

<210> 183

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 183 atctgcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 184

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 184 atctgcaaat gaacagtctg ag 22

<210> 185

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 185 atctgcagat ctgcagccta aa 22

<210> 186

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 186 atcttcaaat gaacagcctg ag 22

<210> 187

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 187 atcttcaaat gggcagcctg ag 22

<210> 188

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 188 ccctgaagct gagctctgtg ac 22

<210> 189

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 189 ccctgcagct gaactctgtg ac 22

<210> 190

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 190 tccttacaat gaccaacatg ga 22

<210> 191

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 191 tccttaccat gaccaacatg ga 22

<210> 192

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 192 ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 193

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 193 ctgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 194

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 194 ccgtgtatta ctgtgcgaga gg 22

<210> 195

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 195 ccgtgtatta ctgtgcaaca ga 22

<210> 196

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 196 ccatgtatta ctgtgcaaga ta 22

<210> 197

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 197 ccgtgtatta ctgtgcggca ga 22

<210> 198

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 198 ccacatatta ctgtgcacac ag 22

<210> 199

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 199 ccacatatta ctgtgcacgg at 22

<210> 200

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 200 ccacgtatta ctgtgcacgg at 22

<210> 201

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 201 ccttgtatta ctgtgcaaaa ga 22

<210> 202

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 202 ctgtgtatta ctgtgcaaga ga 22

<210> 203

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 203 ccgtgtatta ctgtaccaca ga 22

<210> 204

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 204 ccttgtatca ctgtgcgaga ga 22

<210> 205

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 205 ccgtatatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 206

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 206 ctgtgtatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 207

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 207 ccgtgtatta ctgtactaga ga 22

<210> 208

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 208 ccgtgtatta ctgtgctaga ga 22

<210> 209

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 209 ccgtgtatta ctgtactaga ca 22

<210> 210

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 210 ctgtgtatta ctgtaagaaa ga 22

<210> 211

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 211 ccgtgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 212

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 212 ccgtgtatta ctgtgccaga ga 22

<210> 213

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 213 ctgtgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 214

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 214 ccatgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 215

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 215 ccatgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 216

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 216

<210> 217

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 217

<210> 218

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 218

<210> 219

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 219

<210> 220

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 220

<210> 221

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 221

<210> 222

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 222

<210> 223

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 223

<210> 224

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 224 <210> 225

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 225

<210> 226

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 226

<210> 227

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 227

<210> 228

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 228

<210> 229

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 229

<210> 230

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 230

<210> 231

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 231

<210> 232

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 232

<210> 233

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 233

<210> 234

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 234

<210> 235

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 235

<210> 236

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 236

<210> 237

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 237

<210> 238

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 238

<210> 239

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 239 <210> 240

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 240

<210> 241

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 241

<210> 242

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 242

<210> 243

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 243

<210> 244

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 244

<210> 245

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 245

<210> 246

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 246

<210> 247

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 247

<210> 248

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 248

<210> 249

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 249

<210> 250

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 250

<210> 251

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 251

<210> 252

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 252

<210> 253

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 253

<210> 254

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 254

<210> 255

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 255

<210> 256

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 256

<210> 257

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 257

<210> 258

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 258

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<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 259

<210> 260

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 260

<210> 261

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 261 <210> 262

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 262

<210> 263

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 263

<210> 264

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 264

<210> 265

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 265

<210> 266

<211> 90

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 266

<210> 267

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 267 ccgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 268

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 268 ctgtgtatta ctgtgcgaga ga 22

<210> 269

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 269 ccgtgtatta ctgtgcgaga gg 22

<210> 270

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 270 ccgtatatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 271

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 271 ctgtgtatta ctgtgcgaaa ga 22

<210> 272

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 272 ctgtgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 273

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 273 ccatgtatta ctgtgcgaga ca 22

<210> 274

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 274 ccatgtatta ctgtgcgaga aa 22

<210> 275

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 275

<210> 276

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 276

<210> 277

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 277

<210> 278

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 278

<210> 279

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 279

<210> 280

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 280

<210> 281

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 281

<210> 282

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 282

<210> 283

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 283

<210> 284

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 284

<210> 285

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 285

<210> 286

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 286

<210> 287

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 287

<210> 288

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 288

<210> 289

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 289 <210> 290

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 290

<210> 291

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 291

<210> 292

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 292

<210> 293

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 293

<210> 294

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 294

<210> 295

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 295

<210> 296

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 296

<210> 297

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 297

<210> 298

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 298

<210> 299

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 299

<210> 300

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 300

<210> 301

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 301

<210> 302

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 302

<210> 303

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 303

<210> 304

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 304 <210> 305

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 305

<210> 306

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 306

<210> 307

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 307

<210> 308

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 308

<210> 309

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 309

<210> 310

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 310

<210> 311

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 311

<210> 312

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 312

<210> 313

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 313

<210> 314

<211> 69

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 314

<210> 315

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 315

<210> 316

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 316

<210> 317

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 317

<210> 318

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 318

<210> 319

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 319

<210> 320

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 320

<210> 321

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 321

<210> 322

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 322

<210> 323

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 323

<210> 324

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 324

<210> 325

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 325

<210> 326

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 326 <210> 327

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 327

<210> 328

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 328

<210> 329

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 329

<210> 330

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 330

<210> 331

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 331

<210> 332

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 332

<210> 333

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 333

<210> 334

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 334

<210> 335

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 335

<210> 336

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 336

<210> 337

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 337

<210> 338

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 338

<210> 339

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 339

<210> 340

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 340

<210> 341

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 341 <210> 342

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 342

<210> 343

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 343

<210> 344

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 344

<210> 345

<211> 66

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 345

<210> 346

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1) .. (6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 346 nnnnnngact c 11

<210> 347

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 347 gagtcnnnnn n 11

<210> 348

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (3) .. (9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 348 gcnnnnnnng c 11

<210> 349

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 349 acctgcnnnn n 11

<210> 350

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 350 cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 25

<210> 351

<211> 88

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 351

<210> 352

<211> 88

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 352

<210> 353

<211> 95

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 353

<210> 354

<211> 95

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 354

<210> 355

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 355 cgcttcacta agtctagaga caac 24

<210> 356

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (8) .. (15)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 356 cacctgcnnn nnnnn 15

<210> 357

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 357 cagctcnnnn nnnnnnn 17

<210> 358

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 358 gaagacnnnn nnnnnnn 17

<210> 359

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 359 gcagcnnnnn nnnnnnn 17

<210> 360

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 360 gaagacnnnn nn 12

<210> 361

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (22)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 361 cttgagnnnn nnnnnnnnnn nn 22

<210> 362

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (19)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 362 acggcnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 363

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (18)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 363 acggcnnnnn nnnnnnnn 18

<210> 364

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 364 gtatccnnnn nn 12

<210> 365

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 365 actgggnnnn n 11

<210> 366

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 366 ggatcnnnnn 10

<210> 367

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 367 gcatcnnnnn n 11

<210> 368

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (16)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 368 gaggagnnnn nnnnnn 16

<210> 369

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (19)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 369 gggacnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 370

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (14)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 370 acctgcnnnn nnnn 14

<210> 371

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 371 ggcggannnn nnnnnnn 17

<210> 372

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (22)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 372 ctgaagnnnn nnnnnnnnnn nn 22

<210> 373

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 373 cccgcnnnnn n 11

<210> 374

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (18)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 374 ggatgnnnnn nnnnnnnn 18

<210> 375

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (22)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 375 ctggagnnnn nnnnnnnnnn nn 22

<210> 376

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6)..(15)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 376 gacgcnnnnn nnnnn 15

<210> 377

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (13)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 377 ggtgannnnn nnn 13

<210> 378

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (13)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 378 gaagannnnn nnn 13

<210> 379

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 379 gagtcnnnnn 10

<210> 380

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (26)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 380 tccracnnnn nnnnnnnnnn nnnnnn 26

<210> 381

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (5) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 381 cctcnnnnnn n 11

<210> 382

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 382 gagtcnnnnn 10

<210> 383

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (18)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 383 cccacannnn nnnnnnnn 18

<210> 384

<211> 14

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (14)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 384 gcatcnnnnn nnnn 14

<210> 385

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (13)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 385 ggtgannnnn nnn 13

<210> 386

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (5) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 386 cccgnnnnnn nn 12

<210> 387

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (6) .. (19)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 387 ggatgnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 388

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 388 gaccgannnn nnnnnnn 17

<210> 389

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 389 cacccannnn nnnnnnn 17

<210> 390

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (7) .. (17)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 390 caarcannnn nnnnnnn 17

<210> 391

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 391 gctgtgtatt actgtgcgag 20

<210> 392

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 392 gccgtgtatt actgtgcgag 20

<210> 393

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética <400> 393 gccgtatatt actgtgcgag 20

<210> 394

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 394 gccgtgtatt actgtacgag 20

<210> 395

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda sintética

<400> 395 gccatgtatt actgtgcgag 20

<210> 396

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 396 cacatccgtg ttgttcacgg atgtg 25

<210> 397

<211> 88

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 397

<210> 398

<211> 95

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 398

<210> 399

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 399 cgcttcacta agtctagaga caac 24

<210> 400

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 400 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggagg atggagactg ggtc 44

<210> 401

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 401 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggaga gtggagactg agtc 44

<210> 402

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 402 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggtgc ctggagactg cgtc 44

<210> 403

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 403 cacatccgtg ttgttcacgg atgtgggtgg ctggagactg cgtc 44

<210> 404

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 404 cctctactct tgtcacagtg cacaagacat ccag 34

<210> 405

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 405 cctctactct tgtcacagtg 20

<210> 406

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 406 ggaggatgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 407

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 407 ggagagtgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 408

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 408 ggtgcctgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 409

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 409 ggtggctgga ctggatgtct tgtgcactgt gacaagagta gagg 44

<210> 410

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 410 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggatcg actgtccagg agac 44

<210> 411

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 411 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggactg tctgtcccaa ggcc 44

<210> 412

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 412 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggactg actgtccagg agac 44

<210> 413

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 413 cacatccgtg ttgttcacgg atgtggaccc tctgccctgg ggcc 44

<210> 414

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 414 cctctgactg agtgcacaga gtgctttaac ccaaccggct agtgttagcg gttccccgg 59

<210> 415

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 415

<210> 416

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 416

<210> 417

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 417 <210> 418

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 418

<210> 419

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 419 cctctgactg agtgcacaga gtgc 24

<210> 420

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (5)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 420 ggccnnnnng gcc 13

<210> 421

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 421 ccannnnnnn nntgg 15

<210> 422

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 422 cgannnnnnt gc 12

<210> 423

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 423 gccnnnnngg c 11

<210> 424

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 424 gatnnnnatc 10

<210> 425

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 425 gacnnnnngt c 11

<210> 426

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 426 gcannnnntg c 11

<210> 427

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 427 gtatccnnnn nn 12

<210> 428

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 428 gacnnnnnng tc 12

<210> 429

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 429 ccannnnntg g 11

<210> 430

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1) .. (6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 430 nnnnnngaga cg 12

<210> 431

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 431 ccannnnnnt gg 12

<210> 432

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 432 gaannnnttc 10

<210> 433

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 433 ggtctcnnnn n 11

<210> 434

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1) .. (10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 434 nnnnnnnnnn ctcctc 16

<210> 435

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1) .. (9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 435 nnnnnnnnnt ccgcc 15

<210> 436

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (5)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 436 ggccnnnnng gcc 13

<210> 437

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 437 ccannnnnnt gg 12

<210> 438

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 438 gacnnnnnng tc 12

<210> 439

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 439 cgannnnnnt gc 12

<210> 440

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 440 gcannnnntg c 11

<210> 441

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 441 ccannnnntg g 11

<210> 442

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 442 gaannnnttc 10

<210> 443

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 443 nnnnnngaga cg 12

<210> 444

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 444 gtatccnnnn nn 12

<210> 445

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, C, G, otra o desconocida

<400> 445 gacnnnnngt c 11

<210> 446

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 446 ggtctcnnnn n 11

<210> 447

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 447 gccnnnnngg c 11

<210> 448

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 448 ccannnnnnn nntgg 15

<210> 449

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (1)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 449 nnnnnnnnnn ctcctc 16

<210> 450

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 450 nnnnnnnnnt ccgcc 15

<210> 451

<211> 9532

<212> ADN

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de nucleótidos MALIA3

<220>

<221> CDS

<222> (1579)..(1638)

<220>

<221> CDS

<222> (2343)..(3443)

<220>

<221> CDS

<222> (3945)..(4400)

<220>

<221> CDS

<222> (4406)..(4450)

<220>

<221> CDS

<222> (4746)..(5789)

<400> 451

<210> 452

<211> 20

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: secuencia peptídica MALIA3

<400> 452

5 <210> 453

<211> 367

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220> 10 <223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de la proteína MALIA3

<400> 453

<210> 454

<211> 152

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de la proteína MALIA3

<400> 454 <210> 455

<211> 15

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: secuencia peptídica MALIA3

<400> 455

10 <210> 456

<211> 34B

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220> 15 <223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de la proteína MALIA3

<400> 456

<210> 457

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 457 tggaagaggc acgttctttt cttt

24

<210> 458 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 458 cttttctttg ttgccgttgg ggtg

24

<210> 459 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 459 acactctccc ctgttgaagc tctt

24

<210> 460 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 460 accgcctcca ccgggcgcgc cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t

51

<210> 461 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 461 tgaacattct gtaggggcca ctg

23

<210> 462 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 462 agagcattct gcaggggcca ctg

23

<210> 463 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 463 accgcctcca ccgggcgcgc cttattatga acattctgta ggggccactg

50

<210> 464

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 464 accgcctcca ccgggcgcgc cttattaaga gcattctgca ggggccactg

<210> 465

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 465 cgactggagc acgaggacac tga 23

<210> 466

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 466 ggacactgac atggactgaa ggagta 26

<210> 467

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 467 gggaggatgg agactgggtc 20

<210> 468

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 468 gggaagatgg agactgggtc 20

<210> 469

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 469 gggagagtgg agactgagtc 20

<210> 470

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 470 gggtgcctgg agactgcgtc 20

<210> 471

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 471 gggtggctgg agactgcgtc 20

<210> 472

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 472 gggaggatgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 473

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 473 gggaagatgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 474

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 474 gggagagtgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 475

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 475 gggtgcctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 476

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 476 gggtggctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 477

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 477 gggagtctgg agactgggtc atctggatgt cttgtgcact gtgacagagg 50

<210> 478

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 478 cctctgtcac agtgcacaag acatccagat gacccagtct cc 42

<210> 479

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 479 cctctgtcac agtgcacaag ac 22

<210> 480

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 480 acactctccc ctgttgaagc tctt 24

<210> 481

<211> 668

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(668)\

<400> 481

<210> 482

<211> 223

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 482

<210> 483 5 <211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

10 <400> 483 agccaccctg tct 13

<210> 484

<211> 700

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(699)

<400> 484

<210> 485

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 485

<210> 486 5 <211> 419

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos de 3-23 VH sintética

10 <220>

<221> CDS

<222> (12)..(419)

<400> 486

<210> 487

<211> 136

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de la proteína 3-23 VH sintética

<400> 487

<210> 488

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 488 ctgtctgaac ggcccagccg 20

<210> 489

<211> 83

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 489

<210> 490

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 490 gaaagtgaat ccggaagcag cgcaagaaag acgtaaagaa ccaccaggct gaac 54

<210> 491

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 491 agaaacccac tccaaacctt taccaggagc ttggcgaacc ca 42

<210> 492

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 492

<210> 493

<211> 81

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 493

<210> 494

<211> 72

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 494

<210> 495

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 495 ggggaagacc gatgggccct tgg 23

<210> 496

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (22)..(24)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<220>

<221> base_modificada

<222> (28)..(30)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <210> 498

<220> <221> base_modificada <222> (34)..(36) <223> A, T, C, G, otra o desconocida

5

<220> <223> nnn codifica cualquier aminoácido excepto Cys

<400> 496 gcttccggat tcactttctc tnnntacnnn atgnnntggg ttcgccaagc tcctgg

56

10

<210> 497 <211> 68 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

15

<220> <221> base_modificada <222> (19)..(21) <223> A, T, C or G

20

<220> <221> base_modificada <222> (25)..(30) <223> A, T, C or G

25

<220> <221> base_modificada <222> (40)..(42) <223> A, T, C or G

30

<220> <221> base_modificada <222> (46)..(48) <223> A, T, C or G

<400> 497

<211> 912 35 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<400> 498

<210> 499 40 <211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220> .

<221> base_modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 499 gatnnnnatc 10

<210> 500

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(15)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 500 nnnnnnnnnn nnnnngtccc 20

<210> 501

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 501 gcannnnntg c 11

<210> 502

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (9)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 502 gacnnnngtc 10

<210> 503

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 503 nnnnnnngcg gg 12

<210> 504

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 504 gtatccnnnn nn 12

<210> 505

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 505 gcannnnnnt cg 12

<210> 506

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 506 gccnnnnngg c 11

<210> 507

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 507 ggtctcnnnn n 11

<210> 508

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 508 gacnnnnngt c 11

<210> 509

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 509 gacnnnnngt c 11

<210> 510

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 510 gacnnnnnng tc 12

<210> 511

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 511 ccannnnntg g 11

<210> 512

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 512 nnnnnnnnng caggt 15

<210> 513

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 513 acctgcnnnn n 11

<210> 514

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (5)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 514 ggccnnnnng gcc 13

<210> 515

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 515 ccannnnnnn nntgg 15

<210> 516

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 516 cgtctcnnnn n 11

<210> 517

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(6)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 517 nnnnnngaga cg 12

<210> 518

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 518 nnnnnnnnnn ctcctc 16

<210> 519

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(16)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 519 gaggagnnnn nnnnnn 16

<210> 520

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 520 cctnnnnnag g 11

<210> 521

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 521 ccannnnnnt gg 12

<210> 522

<211> 6680

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos del vector pCES5

<220>

<221> CDS

<222> (201)..(1058)

<220>

<221> CDS

<222> (2269)..(2682)

<220>

<221> CDS

<222> (2723)..(2866)

<220>

<221> CDS

<222> (3767)..(3850)

<220>

<221> CDS

<222> (4198)..(5799)

<400> 522

<210> 523

<211> 286

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína del vector pCES5

<400> 523 <210> 524

<211> 138

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína del vector pCES5

<400> 524

<210> 525

<211> 48

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína del vector pCES5

<210> 526

<211> 28

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína del vector pCES5

<400> 526

<210> 527 20 <211> 533

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína del vector pCES5

<400> 527

<210> 528

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 528 acctcactgg cttccggatt cactttctct 30

<210> 529

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 529 agaaacccac tccaaacctt taccaggagc ttggcgaacc ca 42

<210> 530

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 530 ggaaggcagt gatctagaga tagtgaagcg acctttaacg gagtcagcat a

<210> 531

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 531 ggaaggcagt gatctagaga tag 23

<210> 532

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 532 gtgctgactc agccaccctc 20

<210> 533

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 533 gccctgactc agcctgcctc 20

<210> 534

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 534 gagctgactc aggaccctgc 20

<210> 535

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 535 gagctgactc agccaccctc 20

<210> 536

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 536 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgtcttg actcagcc 38

<210> 537

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 537 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgtcttg 30

<210> 538

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 538 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgctttg actcagcc 38

<210> 539

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 539 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgctttg 30

<210> 540

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 540 cctcgacagc taagtgcaca gagcgctttg actcagcc 38

<210> 541

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 541 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgctttg 30

<210> 542

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 542 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgaattg actcagcc 38

<210> 543

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 543 cctcgacagc gaagtgcaca gagcgaattg 30

<210> 544

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 544 cctcgacagc gaagtgcaca gtacgaattg actcagcc 38

<210> 545

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 545 cctcgacagc gaagtgcaca gtacgaattg 30

<210> 546

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 546 cctcgacagc gaagtgcaca g 21

<210> 547

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 547 ccgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 548

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 548 ctgtgtatta ctgtgcgaga g 21

<210> 549

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 549 ccgtatatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 550

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 550 ctgtgtatta ctgtgcgaaa g 21

<210> 551

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 551 ctgtgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 552

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 552 ccatgtatta ctgtgcgaga c 21

<210> 553

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 553

<210> 554

<211> 94

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 554

<210> 555

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 555

<210> 556

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 556 gactgggtgt agtgatctag 20

<210> 557

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 557 cttttctttg ttgccgttgg ggtg 24

<210> 558

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 558 nnnnnnnnng caggt 15

<210> 559

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 559 acctgcnnnn n 11

<210> 560

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 560 gatnnnnatc 10

<210> 561

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(16)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 561 gaggagnnnn nnnnnn 16

<210> 562

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 562 nnnnnnnnnn ctcctc 16

<210> 563

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 563 ctcttcnnnn 10

<210> 564

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(5)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 564 nnnnngaaga g 11

<210> 565

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (1)..(15)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 565 nnnnnnnnnn nnnnngtccc 20

<210> 566

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 566 gacnnnnnng tc 12

<210> 567

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 567 cgtctcnnnn n 11

<210> 568

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 568 gtatccnnnn nn 12

<210> 569

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 569 gcannnnnnt cg 12

<210> 570

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (9)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 570 gccnnnnngg c 11

<210> 571

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (7)..(11)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 571 ggtctcnnnn n 11

<210> 572

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 572 gacnnnnngt c 11

<210> 573

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 573 gacnnnnngt c 11

<210> 574

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 574 ccannnnntg g 11

<210> 575

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 575 ccannnnnnn nntgg 15

<210> 576

<211> 13

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <220>

<221> base_modificada

<222> (5)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 576 ggccnnnnng gcc 13

<210> 577

<211> 12

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(9)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 577 ccannnnnnt gg 12

<210> 578

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 578 cctnnnnnag g 11

<210> 579

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 579 gacnnnngtc 10

<210> 580

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (12)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida <400> 580 ccannnnnnn nntgg 15

<210> 581

<211> 11

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4)..(8)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 581 gcannnnntg c 11

<210> 582

<211> 10251

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos de CJRA05

<220>

<221> CDS

<222> (1578)..(1916)

<220>

<221> CDS

<222> (2388)..(2843)

<220>

<221> CDS

<222> (2849)..(2893)

<220>

<221> CDS

<222> (3189)..(4232)

<220>

<221> CDS

<222> (7418)..(8119)

<220>

<221> CDS

<222> (8160)..(9452)

<400> 582

<210> 583

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de CJRA05

<400> 583

10 <210> 584

<211> 152

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de CJRA05

<400> 584

<210> 585

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia peptídica de CJRA05

<210> 586

<211> 348

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de CJRA05

<400> 586

<210> 587

<211> 234

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de CJRA05

<210> 588

<211> 431

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de CJRA05

<400> 588 <210> 589

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido ilustrativo

10 <210> 590

<211> 1275

<212> ADN

<213> Organismo Desconocido

<220> 15 <221> CDS

<222> (1) .. (1272)

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de nucleótidos de M13

<400> 590

<210> 591

<211> 424

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Secuencia de proteína de M13

<400> 591 <210> 592

<211> 35

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 592 caacgatgat cgtatggcgc atgctgccga gacag 35

10 <210> 593

<211> 1355

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos de M13-III

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (1305)

<400> 593

<210> 594

<211> 434

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de proteína de M13-III

<400> 594 <210> 595

<211> 22

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 595 cgttgatatc gctagcctat gc 22

10 <210> 596

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 15 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 596 gataggctta gctagcccgg agaacgaagg 30

<210> 597

<211> 37 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 597 ctttcacagc ggtttcgcta gcgacccttt tgtctgc 37

5 <210> 598

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 598 ctttcacagc ggtttcgcta gcgacccttt tgtcagcgag taccagggtc 50

<210> 599

<211> 37 15 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 599 20 gactgtctcg gcagcatgcg ccatacgatc atcgttg 37

<210> 600

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

25 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> CDS

<222> (2)..(25)

30 <400> 600

<210> 601

<211> 8

<212> PRT 35 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

<400> 601

40 <210> 602

<211> 37

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 45 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético <400> 602 ctttcacagc ggtttgcatg cagacccttt tgtctgc 37

<210> 603

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 603 ctttcacagc ggtttgcatg cagacccttt tgtcagcgag taccagggtc 50

<210> 604

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido iIustrativo

<400> 604

<210> 605

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 605 cctcgacagc gaagtgcaca g 21

<210> 606

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 606 ggctgagtca agacgctctg tgcacttcgc tgtcgagg 38

<210> 607

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido ilustrativo <400> 607

<210> 608

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 608 cctctgtcac agtgcacaag ac 22

<210> 609

<211> 42

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 609 cctctgtcac agtgcacaag acatccagat gacccagtct cc

<210> 610

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 610 gggaggatgg agactgggtc gtctggatgt cttgtgcact gtgacagagg

<210> 611

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido ilustrativo

<400> 611

<210> 612

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Cebador

<400> 612 gactgggtgt agtgatctag 20

<210> 613

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 613 ggtgtagtga tcttctagtg acaactct 28

<210> 614

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

<400> 614

<210> 615

<211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(15)

<400> 615

<210> 616

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

<400> 616

<210> 617

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 617 ggtgccgata ggcttgcatg caccggagaa cgaagg 36

<210> 618

<211> 95

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 618

<210> 619

<211> 10

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada

<222> (4) .. (7)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 619 gatnnnnatc 10

<210> 620

<211> 10

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Péptido derivado de MALIA3

<210> 621

<211> 29

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido derivado de CJRA05

<400> 621

<210> 622 20 <211> 15

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de nucleótidos ilustrativa

25 <400> 622 tttttttttt ttttt 15

<210> 623

<211> 87

<212> PRT 30 <213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Péptido derivado de MALIA3

<400> 623

35 <210> 624

<211> 29

<212> PRT

<213> Organismo Desconocido

<220>

<223> Descripción de Organismo Desconocido: Péptido derivado de MALIA3

<400> 624

<210> 625

<211> 10

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<220>

<221> base_modificada 15 <222> (7)..(10)

<223> A, T, C, G, otra o desconocida

<400> 625 ctcttcnnnn 10

<210> 626 20 <211> 87

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido derivado de CJRA05

25 <400> 626

<210> 627

<211> 10 30 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido derivado de CJRA05

<400> 627

<210> 628

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 628 gacccagtct ccatcctcc 19

<210> 629

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 629 gactcagtct ccactctcc 19

<210> 630

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 630 gacgcagtct ccaggcacc 19

<210> 631

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 631 gacgcagtct ccagccacc 19

<210> 632

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 632 gtctcctgga cagtcgatc 19

<210> 633

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 633 ggccttggga cagacagtc 19

<210> 634

<211> 19 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

5 <400> 634 gtctcctgga cagtcagtc 19

<210> 635

<211> 19

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético

<400> 635 ggccccaggg cagagggtc 19

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para producir una población o biblioteca de genes de inmunoglobulina que comprende las etapas de:

   (i)

   introducir diversidad sintética en al menos uno de VH CDR1 o VH CDR2 de estos genes; y

   (ii)

   combinar la diversidad de la etapa (i) con diversidad en VH CDR3 capturada de células B.

2. 2.

   El método según la reivindicación 1, en el que la diversidad sintética se introduce tanto en VH CDR1 como en VH CDR2.

3. 3.

   El método según la reivindicación 2, en el que la diversidad sintética comprende:

   (a)

   una VH CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula -X1-Y-X2-M-X3-, en la que X1, X2, y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; y

   (b)

   una VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X4-I-X5-X6-S-G-G-X7-T-X8-Y-A-D-S-V-KG-, en la que X4 y X5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en Y, R, W, V, G, y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en P y S, y X7 y X8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y.

4. 4. Una biblioteca que comprende una colección de paquetes genéticos que presentan un miembro de una familia diversa de péptidos, polipéptidos o proteínas y que presentan colectivamente al menos una parte de la familia, estando codificados los péptidos, polipéptidos o proteínas presentados por secuencias de ADN que comprenden secuencias que codifican

   (a)

   una VH CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula -X1-Y-X2-M-X3-, en la que X1, X2, y X3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y;

   (b)

   una VH CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X4-I-X5-X6-S-G-G-X7-T-X8-Y-A-D-S-V-KG-, en la que X4 y X5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en Y, R, W, V, G, y S, X6 se selecciona del grupo que consiste en P y S, y X7 y X8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, e Y; y

   (c)

   una secuencia que codifica una VH CDR3, en la que dicha VH CDR3 es una VH CDR3 capturada de la región VH CDR3 de un gen de inmunoglobulina de una célula B.

5. 5.

   La biblioteca según la reivindicación 4, en la que dichas secuencias de ADN comprenden además una secuencia que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina.

6. 6.

   La biblioteca según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se captura de una célula B.

7. 7.

   La biblioteca según la reivindicación 6, en la que dicha célula B se aísla de una muestra de sangre de un paciente autoinmune.

8. 8.

   La biblioteca según la reivindicación 7, en la que el paciente autoinmune está diagnosticado con un trastorno seleccionado del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, artritis reumatoide, síndrome antifosfolípido y vasculitis.

9. 9.

   La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 a 8, en la que dichas secuencias de ADN comprenden además secuencias que codifican regiones marco VH 3-23.

10. 10.

    La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 a 8, en la que dichos paquetes genéticos son fagos M13.

11. 11.

    La biblioteca según la reivindicación 10, en la que dichas secuencias de ADN están en un vector fago.

12. 12.

    La biblioteca según la reivindicación 10 u 11, en la que dicho fago comprende un gen iii de tipo salvaje y un gen iii truncado para la presentación de péptidos, polipéptidos o proteínas.

13. 13.

    La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5 a 8, en la que dichas secuencias de ADN están en un vector fagémido.

14. 14.

    La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que dichos péptidos, polipéptidos o proteínas presentados se presentan mediante un conector corto a la parte final del gen III de M13.