ES2373713T3 - PÉPTIDOS PARA LA REGULACIÓN DE UROQUINASA (uPA) Y ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO DE TIPO TEJIDO (tPA) Y MÉTODO PARA OPTIMIZAR LA EFICACIA TERAPÉUTICA. - Google Patents
PÉPTIDOS PARA LA REGULACIÓN DE UROQUINASA (uPA) Y ACTIVADOR DE PLASMINÓGENO DE TIPO TEJIDO (tPA) Y MÉTODO PARA OPTIMIZAR LA EFICACIA TERAPÉUTICA. Download PDFInfo
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Abstract
- Un polipéptido Ac-RMAPEEIIMDRFLYVVR-amida que tiene un efecto inhibidor sobre la vasoactividad inducida por activadores de plasminógeno, en donde el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos: Ac-Arg-Met-Ala-Pro- Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Tyr-Val-Val-Arg-Amida.
Description
Peptidos para la regulaci6n de uroquinasa (uPA) y activador de plasmin6geno de tipo tejido (tPA) y metodo para optimizar la eficacia terapeutica
CAMPO DE LA INVENCION
5 Esta invenci6n describe un peptido que comprende seis aminoacidos (EEIIMD) (SEC ID N°: 1) o una amida de dieciocho amino acidos (Ac-RMAPEEIIDRPFLYVVR) (SEC ID N°: 2) que tiene la propiedad de unirse al sitio de "acoplamiento" del activador de plasmin6geno de uroquinasa (uPA) y en el activador de plasmin6geno de tipo tejido (tPA) fuera del centro activo. La invenci6n tambien se refiere a la regulaci6n de la actividad cuando se administra tPA o uPA en el tratamiento de la apoplejfa isquemica, en particular a la capacidad del tPA o del uPA para inducir
10 una hemorragia intracerebral (ICH), al activador de plasmin6geno de uroquinasa de cadena sencilla (scuPA) para deshacer coagulos sangufneos que provocan apoplejfas o infartos de miocardio.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El activador de plasmin6geno de tipo tejido es la unica terapia para la apoplejfa tromboemb6lica aguda, que esta aprobada por la Administraci6n de Alimentos y Farmacos (FDA, "Food and Drug Administration"). Sin embargo, hay 15 razones para la preocupaci6n porque el uso de tPA para el tratamiento de la apoplejfa isquemica puede exponer a los pacientes a una hemorragia intracerebral secundaria. Wardlaw JC y col., Lancet 1997, 350: 607-614. Esto es debido a que existe aproximadamente un seis por ciento de incidencia de una posterior hemorragia intracerebral sintomatica y aproximadamente el cincuenta por ciento de estos pacientes fallecen. La aparici6n de hemorragia intracerebral despues del tratamiento con tPA se atribuye a su capacidad para interferir con la vasoactividad normal
20 de los vasos sangufneos cerebrales. Se ha demostrado que el tPA tiene efectos vasoconstrictores o vasodilatadores dependientes de la dosis ademas de promover la activaci6n de plasmin6geno.
El activador de plasmin6geno de tipo tejido es una molecula natural liberada por las celulas endoteliales vasculares, y se produce una desaparici6n rapida de tPA de la sangre por eliminaci6n en el hfgado. Los hepatocitos expresan la protefna relacionada con receptor de lipoprotefna de baja densidad o receptor de macroglobulina d2 que se une a
25 tPA y a complejos de inhibidor de activador de plasmin6geno (PAI-1) con tPA y tcuPA. Alternativamente, las celulas endoteliales expresan un receptor dependiente de manosa de 170 kDa que tambien esta implicado en la desaparici6n rapida de tPA.
La pro-uroquinasa (Pro-UK), tambien conocida como activador de plasmin6geno de uroquinasa de cadena sencilla (scuPA), es una molecula natural liberada por las celulas endoteliales vasculares en respuesta a la formaci6n de
30 coagulos sangufneos y otras afecciones patol6gicas. El scuPA o Pro-UK puede activarse mediante dos mecanismos diferentes: a) por ruptura de un unico enlace de peptido por acci6n de plasmina que conduce a la generaci6n de la forma activa compuesta por dos cadenas (tcuPA), y b) por uni6n de scuPA a su receptor, el receptor de activador de plasmin6geno de uroquinasa (uPAR).
El inhibidor de activador de plasmin6geno de tipo 1 (PAI-1) se une a tcuPA e inhibe su actividad catalftica. Sin
35 embargo, el PAI-1, que se une a tcuPA con una elevada afinidad, se une s6lo con baja afinidad a scuPA, si es que se une.
El inhibidor de activador de plasmin6geno de tipo 1 interactua tanto con tPA como con uPA e inhibe la actividad catalftica de ambas protefnas. El PAI-1, que se une a tPA y uPA con una elevada afinidad esta presente a concentraciones elevadas en la circulaci6n de pacientes que padecen hipertensi6n. Y la reducci6n de la tensi6n
40 sangufnea mediante tratamiento medico da como resultado un descenso de las concentraciones de PAI-1. El mecanismo de acci6n subyacente para el aumento de PAI-1 en determinadas afecciones patol6gicas no se comprende bien del todo. Sin embargo, la relaci6n inversa con el tPA y/o el uPA sugiere que el PAI-1 sirve para neutralizar de algun modo el efecto vasoactivo del tPA y/o uPA. Simmons M., Cardiol. Clin. 1995, 13: 339-345; Cipolla M. y col., Stroke, 2000, 31: 940-945; de PAI-1; y Higazi, A.A.-R. y col., J. Biol. Chem., 1995, 270: 9472-9477.
45 Hasta la fecha no se ha evaluado la cuesti6n de si esto relaciona el aumento del nivel de concentraci6n de PAI-1 en determinadas afecciones patol6gicas y el tPA producido de forma natural, o de si existe una relaci6n entre el PAI-1 y la hemorragia intracerebral debido al uso de tPA producida comercialmente. La presente invenci6n esta dirigida a obtener un mejor entendimiento del control, si lo hay, de PAI-1 o tPA o uPA, y a proporcionar una composici6n o producto que sea 6ptimamente efectivo para regular la actividad de tPA o uPA, reduciendo con ello el riesgo de
50 hemorragia intracerebral en pacientes que reciben una terapia tromboemb6lica tal como tPA y/o uPA.
Se han investigado varias estrategias de terapia trombolftica, una de ellas sobre la infusi6n sistemica de activadores de las variedades naturales y de las recombinantes producidas comercialmente de agentes fibrinolfticos. La uroquinasa es un agente trombolftico activo a traves de la conversi6n de plasmin6geno en plasmina. La uroquinasa es una protefna compleja de estructura conocida que se encuentra en la orina en cantidades traza. Se han 55 desarrollado formas recombinantes de uroquinasa y su eficacia clfnica esta siendo evaluada, por ejemplo la Patente de EE.UU. 4.558.010 expedida para Abbott Laboratories describe un acido desoxirribonucleico recombinante que
codifica para la protefna de activador de plasmin6geno que tiene actividad de uroquinasa humana.
La presente invenci6n demuestra que un peptido de seis aminoacidos EEIIMD o un peptido de dieciocho aminoacidos (Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida), puede reducir los efectos secundarios no deseados de los agentes fibrinolfticos, por ejemplo, el riesgo de hemorragia intracerebral en pacientes que reciben tPA, uPA, tcuPA, estreptoquinasa, rt-PA o alteplasa, derivados de rt-PA o complejo de estreptoquinasa anisoilada. En el protocolo empleado el peptido se introdujo en el regimen trombolftico en las etapas finales para prevenir los efectos vasoactivos o secundarios del agente trombolftico primario.
Hasta la fecha no se ha investigado la cuesti6n de si el peptido tiene algun efecto cuando se administra en la etapa inicial de la terapia trombolftica. La presente invenci6n describe algunos resultados inesperados obtenidos cuando el peptido se administra en combinaci6n con un activador de plasmin6geno justo desde el inicio de la terapia trombolftica. Los resultados son inesperados debido a que demuestran un efecto sinergico cuando el peptido y el activador de plasmin6geno se administran juntos en sistemas in vitro e in vivo. Por tanto, la presente invenci6n proporciona nuevas composiciones de diferentes activadores de plasmin6geno y el peptido, y metodos para optimizar la eficacia de los agentes trombolfticos en regfmenes terapeuticos de combinaci6n. Dicha estrategia sugiere que la dosis efectiva del agente trombolftico puede reducirse en presencia del peptido. Esto a su vez reduce el riesgo de efectos secundarios de estos agentes, manifestandose los efectos secundarios en la etapa final de la terapia.
RESUMEN DE LA INVENCION
La presente invenci6n tambien se refiere a la composici6n y al uso de un polipeptido como el reivindicado en la Reivindicaci6n 1.
Especfficamente, los polipeptidos son utiles para potenciar la actividad del agente trombolftico (que incluye, aunque sin limitaci6n, scuPA, tPA, uPA, tcuPA, estreptoquinasa, rt-PA o alteplasa, derivados de rt-PA (tales como reteplasa, lanoteplasa y TNK-rt-PA), complejo de estreptoquinasa de plasmin6geno anisoilado (APSC) o anistreplasa, o derivado de estreptoquinasa) reduciendo con ello la dosis efectiva de agente trombolftico requerida para la prevenci6n y/o el tratamiento de trastornos tromboemb6licos.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Las ventajas y caracterfsticas de la presente invenci6n seran facilmente percibidas tras leer la siguiente descripci6n detallada y figuras de referencia, que son:
Figura 1A: es un diagrama que describe los resultados de experimentos sobre el efecto de tPA en la contracci6n inducida por PE de anillos de aorta de rata aislados. La contracci6n de anillos a6rticos fue inducida aumentando las concentraciones de fenilefrina (PE), en ausencia de tPA (triangulos rellenos) o en presencia de tPA 1nM (cuadrados rellenos) 6 20nM (cuadrados huecos).
Figura 1B: describe los resultados de experimentos en los que se indujo la contracci6n de anillos a6rticos en ausencia de TNK-tPA (triangulos rellenos), en presencia de tPA 1nM (cuadrados rellenos) 6 20nM (cuadrados vacfos).
Figura 2: es una representaci6n grafica de los resultados obtenidos en experimentos destinados a estudiar el efecto del PAI-1 sobre la vasoactividad de tPA. Se determin6 la EC50 de PE en ausencia (Control) o en presencia de tPA 1nM, tPA 20 nM, tPA 1nM y una concentraci6n equimolar de PAI-1, tPA 20 nM y una concentraci6n equimolar de PAI-1, tPA 1nM y 2IM de EEIIMD o tPA 20nM y 2IM de EEIIMD.
Figura 3: es una representaci6n grafica de los resultados obtenidos en experimentos dirigidos a estudiar el efecto de RAP y anticuerpos anti-LRP sobre la vasoactividad de tPA. Se determin6 la EC50 de PE en ausencia (Control) o en presencia de tPA 1nM, tPA 20 nM, tPA 1nM y una concentraci6n equimolar de PAI-1, tPA 20 nM y una concentraci6n equimolar de PAI-1, tPA 1nM y 2IM de EEIIMD o tPA 20nM y 2IM de EEIIMD.
Figura 4: es un grafico que describe el efecto de tPA sobre la contracci6n inducida por fenilefrina de anillos de aorta de rata aislados in vitro. La contracci6n de los anillos a6rticos fue inducida con concentraciones variables de fenilefrina en ausencia de tPA (triangulos rellenos), en presencia de tPA 1nM (cuadrados rellenos) o en presencia de tPA 10nM (cuadrados vacfos). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo a procedimientos descritos previamente por Haj-Yehia y col., FASEB J., 2000, 14: 1411-1422.
Figura 5: es un diagrama de barras que describe los resultados de experimentos sobre la vasoactividad de uPA y tPA en presencia o en ausencia de PAI-1, por ejemplo, se determin6 el efecto de uP 2nM o de tPA 1nM sobre la vasoconstricci6n inducida mediante fenilefrina en presencia o en ausencia de concentraciones equimolares de PAI-1.
Figura 6: es un diagrama de barras que describe los resultados de estudios realizados sobre el efecto de peptido derivado de PAI-1 en la vasoactividad de tPA. La constricci6n de anillos a6rticos fue inducida mediante
concentraciones crecientes de fenilefrina en ausencia o en presencia de tPA 1nM, tPA 1nM y EEIIMD 1OM, tPA 10nM o tPA 10nM y EEIIMD 1OM.
Figura 7: es un diagrama de barras que describe los resultados de experimentos sobre el efecto de peptido derivado de PAI-1 en la lisis de coagulos mediada por tPA. Se determin6 la capacidad del tPA para inducir lisis de coagulos en presencia y en ausencia de EEIIMD 1OM. En estos experimentos se dej6 coagular sangre de voluntarios a temperatura ambiente durante una hora, se separ6 el coagulo sangufneo del plasma, se coloc6 en un papel absorbente para eliminar todo el suero y se cort6 en varios trozos. Los trozos se pesaron y se pusieron en tamp6n PBS solo o que contenfa tPA 100 nM, con o sin EEIIMD 1OM. Tras incubaci6n durante 3 horas a temperatura ambiente, se separaron los trombos del medio, se secaron y se pesaron.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
De acuerdo con la presente invenci6n, se proporcionan composiciones farmaceuticas de los peptidos EEIIMD (Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp) y/o Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida (Ac-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-ProPhe-Leu-Tyr-Val-Val-Arg-Amida), presentando dichas composiciones efectos inhibidores sobre trastornos hemorragicos relacionados con tPA y/o uPA que son el resultado de efectos secundarios graves de dichos agentes fibrinolfticos. Asimismo, en la presente invenci6n se contemplan metodos para reducir la ocurrencia de hemorragia intracerebral en pacientes que reciben tPA o uPA en el tratamiento de trastornos tromboemb6licos.
La presente invenci6n tambien proporciona composiciones farmaceuticas y kits que comprenden el polipeptido EEIIMD y/o Ac-RMAPEEITMDRPFLYVVR-amida, en combinaci6n con uno o mas agentes fibrinolfticos que incluyen tPA, uPA, tcuPA, estreptoquinasa, rt-PA o alteplasa, derivados de rt-PA (tal como reteplasa, lanoteplasa y TNK-rt-PA), complejo de estreptoquinasa de plasmin6geno anisoilado (APSC) o anistreplasa, o derivados de estreptoquinasa.
La presente invenci6n tambien proporciona metodos para mejorar la eficacia de agentes fibrinolfticos, reduciendo con ello la dosis efectiva, combinando el agente fibrinolftico con el peptido, en una relaci6n de 0,1/1,0 a 1,0/0,1 respectivamente.
La presente invenci6n proporciona ademas metodos para prevenir y/o tratar efectos secundarios tales como la hemorragia intracerebral y anormalidades vasculares relacionadas asociadas a agentes fibrinolfticos tales como tPA
o uPA, proporcionando regfmenes terapeuticos -solo o en combinaci6n, en combinaci6n con una cantidad efectiva de EEIIMD y/o Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida, para prevenir y/o inhibir efectos secundarios.
La TPA es una proteasa de serina de cadena sencilla compuesta por 530 aminoacidos, aunque originalmente se identificaron 527. La enzima t-PA esta compuesta por varios dominios con homologfas respecto a otras protefnas:
Un dominio de dedo que comprende los residuos 4-50,
Un dominio de factor de crecimiento que comprende los residuos 50-87,
dos dominios Kringle que comprenden los residuos 87-176 y 176-262, y el dominio de proteasa constituido por los residuos 276-527 que comprenden la triada catalftica. La uni6n de tPA a fibrina esta muy probablemente mediada por los dominios de dedo y el segundo Kringle. La uni6n inicial de t-PA a fibrina esta gobernada por el dominio de dedo y el Kringle 2, que se une a residuos de lisina carboxil-terminales expuestos.
La TPA tiene una afinidad debil por plasmin6geno en ausencia de fibrina (Km = 76 IM) pero una afinidad mucho mayor en presencia de fibrina (K entre 0,15 y 1,5 IM). En esta reacci6n el plasmin6geno se une a fibrina principalmente a traves de estructuras especfficas denominadas "sitio de uni6n de lisina". Por tanto, un modo de regular la fibrin6lisis es a nivel de activaci6n de plasmin6geno localizada en la superficie de la fibrina.
Los inhibidores de activador de plasmin6geno, especfficamente PAI-1 y PAI-2 inhiben los activadores de plasmin6geno fisiol6gico, por ejemplo, el PAI-1 es el inhibidor primario de t-PA y u-PA en plasma. El PAI-1, un inhibidor de serina proteasa, es una glicoprotefna de cadena sencilla derivada de celulas endoteliales y otros tipos de celulas. El PAI-1 inhibe tPA mediante la formaci6n de un complejo entre el sitio activo de tPA y los residuos "cebo" (Arg 346-Met 347) del PAI-1.
La concentraci6n de PAI-1 en plasma aumenta en varias enfermedades, que incluyen tromboembolismo, obesidad, sepsis y enfermedad de arteria coronaria. Una elevada actividad de PAI-1 constituye un factor de riesgo independiente para el infarto de miocardio en sujetos j6venes en los primeros tres (3) anos despues del primer ataque. Existe una clara correlaci6n entre la variaci6n circadiana en el momento de inicio del infarto de miocardio, siendo la mayor incidencia a aproximadamente las 8 am, y el ritmo circadiano de la actividad de PAI-1 en plasma que es tambien mayor por la manana.
El inhibidor de activador de plasmin6geno de tipo 1 interacciona tanto con tPA como con uPA e inhibe la actividad catalftica de ambas protefnas. El PAI-1, que se une a tPA y uPA con una elevada afinidad (Heckman C.M., Archires of Biochem. Biophysics, 1988, 262: 199-210), tambien esta presente en concentraciones elevadas en circulaci6n en
pacientes que padecen hipertensi6n. La reducci6n de la tensi6n sangufnea mediante tratamiento medico da como resultado el descenso de la concentraci6n de PAI-1. Erden Y.C. y col., Am. J. Hypertens., 1999, 12: 1071-1076. El mecanismo de acci6n subyacente para explicar el aumento de PAI-1 en algunas afecciones patol6gicas es desconocido.
El PAI-1 reacciona con tPA de cadena sencilla, tPA de cadena doble y tcuPA. La constante cinetica de segundo orden para su inhibici6n de tPA de cadena sencilla por PAI-1 es de aproximadamente 107 M-1s, mientras que la inhibici6n de tPA de doble cadena y de tcuPA es algo mas rapida. Las regiones cargadas positivamente en el tPA (residuos 296-304) y 9 residuos de uPA (179-184) estan implicados en esta rapida reacci6n. La actividad de PAI desaparece muy rapidamente de la circulaci6n por acci6n del hfgado. Excepto las plaquetas, que contienen PAI-1 tanto funcional como inactivo, el PAI-1 no se almacena dentro de las celulas, pero es secretado rapida y constitutivamente despues de la sfntesis.
El PAI-1 se une a tPA y uPA a traves de dos epftopos independientes, uno de los cuales interacciona con el sitio activo. El otro epftopo esta compuesto por 6 residuos de aminoacido, EEIIMD, que corresponde a los residuos de aminoacido 350 a 355 del PAI-1. Este segundo epftopo de PAI-1 interacciona con un sitio de "acoplamiento" en uPA y tPA que esta fuera del centro activo. Adams D.S. y col., J. Biol. Chem., 1999, 266: 8476-8482.
scuPA
La presente invenci6n describe el efecto del peptido de 6 aminoacidos sobre la actividad fibrinolftica de scuPA e indica que el peptido estimula sinergicamente la actividad de scuPA sobre la lisis de coagulos sangufneos. Estas observaciones se describen en detalle en la secci6n de Ejemplos.
El peptido de la presente invenci6n, aunque previene y/o inhibe los efectos adversos de scuPA sobre los vasos sangufneos, no tiene efecto sobre la actividad fibrinolftica de scuPA. Por lo tanto, el peptido es util en la lisis de coagulos durante la terapia trombolftica en el infarto de miocardio, la apoplejfa y complicaciones relacionadas.
El tPA disponible comercialmente se produce mediante tecnologfa de ADN recombinante (tal como t-PA y rt-PA recombinantes) de dos formas: una preparaci6n de cadena sencilla (alteplasa) y una preparaci6n de cadena doble (duteplasa). Otros tipos de tPA incluyen reteplasa (r-PA) y un mutante de rt-PA, TNK-rt-PA. Ver mas adelante los detalles en la secci6n titulada "TNA=t-PA y rtPA".
El regimen de dosis preferido de alteplasa selectiva de fibrina consta de un regimen acelerado (cargado en el frente) ajustado al peso durante 90 minutos (bolo de 15 mg, 0,75 mg/kg a lo largo de 30 minutos (sin exceder de 50 mg) y
0.05 mg/kg a lo largo de 60 minutos (sin exceder de 35 mg)). La presente invenci6n proporciona una composici6n de alteplasa y el peptido, de tal modo que el nivel de actividad fibrinolftica alcanzado en el anterior regimen de dosis se obtiene en realidad con una dosis de alteplasa mucho menor. Esto es debido a que la combinaci6n de alteplasa y el peptido da como resultado una mejor actividad de lisis.
La anterior mejora tambien se observa cuando el regimen de dosis preferido de alteplasa selectiva de fibrina consiste en un regimen acelerado (cargado en el frente) ajustado al peso durante 90 minutos (bolo de 15 mg, 0,75 mg/kg a lo largo de 30 minutos (sin exceder de 50 mg) y 0,05 mg/kg a lo largo de 60 minutos (sin exceder de 35 mg)).
El regimen de dosis preferido para el peptido consiste en una cantidad efectiva para potenciar 6ptimamente la actividad de la actividad fibrinolftica a la vez que tambien se previene los efectos vasoactivos daninos de un agente fibrinolftico en una base caso a caso. El peptido puede ser un componente de una secuencia de numero variable de aminoacidos, o el peptido puede tener una modificaci6n de uno o mas aminoacidos en su secuencia. La relaci6n de peptido/tPA, UPA o TNK-tPA puede estar en el intervalo de 0,1/1,0 a 1,0/0,1.
El peptido de la presente invenci6n es util en el tratamiento de sepsis, cuando se administra solo en una dosis efectiva o en combinaci6n con una terapia anticoagulante tradicional. En condiciones fisiol6gicas, varios mecanismos antitromb6ticos actuan simultaneamente para prevenir la coagulaci6n, y para preservar la fluidez de la sangre. Cualquier trombina que escape del control de este sistema anticoagulante fisiol6gico esta disponible para convertir fibrin6geno en fibrina. Esto a su vez activa el sistema fibrinolftico.
tPA
La presente invenci6n describe el efecto del peptido sobre la vasoactividad de tPA y uPa e indica que el peptido elimina el efecto potenciador del tPA sobre la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina en cultivos de anillo de aorta. De forma similar, el peptido de la presente invenci6n suprime el efecto potenciador del uPA sobre la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina. Estas observaciones se describen en detalle en la secci6n de Ejemplos.
Los peptidos EEIIMD y/o Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida de la presente invenci6n, aunque previenen y/o inhiben los efectos adversos del tPA o del uPA sobre los vasos sangufneos, no tienen efecto sobre la actividad fibrinolftica de tPa o uPa, tan util en la lisis de coagulos durante la terapia trombolftica en el infarto de miocardio, la apoplejfa y complicaciones relacionadas.
El tPA disponible comercialmente se produce mediante tecnologfa de ADN recombinante (tal como t-PA o rt-PA recombinante) de dos formas: una preparaci6n de cadena sencilla (alteplasa) y una preparaci6n de cadena doble (duteplasa). Otros tipos de tPA incluyen reteplasa (r-PAO) y un mutante de rt-PA, el TNK-rt-PA.
El regimen de dosis preferido de alteplasa selectiva de fibrina consta de un regimen acelerado (cargado en el frente) ajustado al peso durante 90 minutos (bolo de 15 mg, 0,75 mg/kg a lo largo de 30 minutos (sin exceder de 50 mg) y 0,05 mg/kg a lo largo de 60 minutos (sin exceder de 35 mg)).
El regimen de dosis preferido para el peptido consiste en una cantidad efectiva para prevenir los efectos vasoactivos daninos del tPA en una base de caso a caso. El peptido puede ser un componente de una secuencia de numero variable de aminoacidos, o el peptido puede tener una modificaci6n de uno o mas aminoacidos en su secuencia.
El peptido de la presente invenci6n es util en el tratamiento de la sepsis, cuando se administra solo en una dosis efectiva o en combinaci6n con una terapia anticoagulante tradicional. En condiciones fisiol6gicas, varios mecanismos antitromb6ticos actuan juntos para prevenir la coagulaci6n, y para preservar la fluidez sangufnea. Cualquier trombina que escape del control de dicho sistema anticoagulante fisiol6gico es capaz de convertir fibrin6geno en fibrina. Esto a su vez activa el sistema fibrinolftico.
TNK-tPA y rtPA
El t-PA consta de cinco dominios: un dominio de tipo dedo de fribronectina, un dominio de factor de crecimiento epidermal (EGF), dos dominios de Kringle (K1 y K2), y un dominio de proteasa. El TNK-t-PA difiere del rt-PA en los dominios K1 y de proteasa. En el K1 el sitio de glicosilaci6n del aminoacido 117 (N117) ha sido desplazado al aminoacido 103, mientras que en el dominio de proteasa existe una tetrasustituci6n de alanina (K296A/H297A/R298A/R299A) en el sitio de acoplamiento del inhibidor de activador de plasmin6geno-1 (PAI-1), lo que le hace resistente a la desactivaci6n por PAI-1.
El activador de plasmin6geno de tejido TNK (TNK-tPA) es una variante disenada mediante ingenierfa biol6gica del activador de plasmin6geno de tipo tejido (t-PA), que tiene una mayor vida media que el tPA. Es resistente a la desactivaci6n por inhibidor de activador de plasmin6geno-1 al presentar una tetrasustituci6n de alanina en el domino de proteasa (K296A/H297A/R298A/R299A).
El TNK-tPA exhibe una resistencia 80 veces superior a la del inhibidor de activador de plasmin6geno-1 (PAI-1) que el tPA y una especificidad de fibrina relativa 14 veces superior.
In vitro, el TNK-tPA es 8 y 13 veces mas potente que el tPA frente a sangre entera y coagulos enriquecidos en plaquetas, respectivamente.
In vivo, el tiempo requerido por el TNK-tPA para una lisis del 50% en modelos de shunt venoso arterial de fribrinolisis en conejos, fue solo un tercio del requerido por rtPA. A pesar de estas enormes ventajas del TNK-tPA sobre el tPA en situaciones experimentales, el TNK-tPA no presenta una ventaja significativa sobre el tPA en estudios clfnicos.
En ensayos clfnicos comparativos, se ha descubierto que el TNK-tPA tiene una eficacia equivalente al rtPA y con una velocidad de hemorragia intracraneal similar a obtenida con rtPA. La unica ventaja significativa del TNK-tPA sobre el rtPA es el hecho de que el TNK-tPA esta asociado a menos episodios de hemorragia no cerebral (4,66% frente a 5,94%).
La presente invenci6n investiga la base de la discrepancia entre los efectos in vitro del TNK-tPA y los efectos in vivo en humanos. Especfficamente, se examinaron los efectos de TNK-tPA, rtPA y/o tPA sobre la contracci6n inducida por PE de anillos aislados. Los resultados obtenidos se describen en detalle mas adelante en la secci6n de EJEMPLOS. En resumen, los resultados obtenidos indican que 15 rtPA tiene dos epftopos de uni6n que estan implicados en la vasoactividad. El primer epftopo tiene una mayor afinidad (alrededor de 1nM) e inhibe la vasoconstricci6n inducida por PE. El segundo epftopo tiene una menor afinidad (alrededor de 20 nM) y estimula la vasoconstricci6n inducida por PE. La presente invenci6n tambien sugiere que el primer epftopo, que induce prodilataci6n, ha sido desactivado en el TNK-tPA.
Los resultados obtenidos en la presente invenci6n indican que el efecto vasoactivo del TNK-tPA no se ve afectado por una concentraci6n equimolar de peptido PAI-1. Sin embargo, a una concentraci6n 5 molar del peptido, el efecto vasoactivo del TNK-tPA se suprime. Por tanto, los resultados descritos en los EJEMPLOS sugieren que el hexapeptido EEIIMD derivado de PAI-1 es util para inhibir los efectos vasoactivos del tPA, rtPA y/o TNK-tPA. Se obtuvieron resultados similares con Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida (resultados no presentados).
tPA y LRP
Se sabe que el tPA se une a aDKLRP: un receptor de senalizaci6n y un cosechador multifuncional (Strickland J.H.,
J. Clin. Invest. 2001; 108: 779-784) (LRP). Dicha uni6n esta regulada por PAI-1. Los resultados obtenidos en la presente invenci6n demuestran que el LRP tambien esta implicado en la vasoactividad del tPA (veanse mas adelante los detalles en la secci6n de EJEMPLOS).
Especfficamente, los anticuerpos anti-LRP y el antagonista de LRP, la protefna asociada a receptor recombinante, el rRAP, eliminan el efecto vasoactivo del tPA y el TNK-tPA. Los resultados descritos en la presente invenci6n sugieren que los anticuerpos anti-LRP y/o rRAP prolongan la vida media de tPA en circulaci6n. Estos resultados tambien sugieren que los anticuerpos anti-LRP y/o RAP pueden usarse para prolongar la vida media de scuPA o complejo scuPA/suPAR (descrito en las solicitudes de patente de EE.UU. pendientes con numeros de serie 09/325.917, presentada el 4 de junio de 1999; la 09/968.752, presentada el 2 de octubre de 2001; la 09/302.392, del 10 de julio de 2001; y la 09/902.135, presentada el 10 de julio de 2001).
EJEMPLO 1
Se compar6 el efecto de TNK-tPA sobre la contracci6n inducida por PE con el efecto de tPA, en los anillos a6rticos aislados. El procedimiento experimental seguido se ha descrito previamente (Haj-Yehia A., Nassar T., Sachais B., Kuo A., Bdeir K., Al-Mehdi A.-B., Mazar A., Cines D., Higazi A.A.-R. Urokinase-derived peptides regulate vascular smooth muscle contraction in vitro and in vivo. FASEB J. 2000; 14: 1411-1422.
La Figura 1A muestra que tPA 1nM inhibi6 la vasoconstricci6n inducida por PE. La Figura 1B muestra que a la misma concentraci6n (1nM) el TNK-tPA ejerci6 un efecto opuesto al del tPA sobre la contracci6n de anillos a6rticos. TNK-tPA 1nM estimul6 la vasoconstricci6n inducida por PE.
Puesto que la concentraci6n de tPA usada en los experimentos previos se encontraba en el rango fisiol6gico, pero muy por debajo del rango terapeutico, se examinaron los efectos de concentraciones mas elevadas de variantes de tPA sobre la vasoactividad. La Figura 1A muestra que el aumento de la concentraci6n de rtPA produjo un efecto similar al inducido por TNK-tPA 1nM. rtPA 20nM estimul6 la constricci6n inducida por PE y la EC50 disminuy6 de 34 a 1,6nM.
La Figura 1B muestra que aumentar la concentraci6n de TNK-tPA desde 1 a 20nM aument6 su efecto estimulador sobre la vasoconstricci6n inducida por PE, disminuyendo su EC50 desde 34 a 0,63 nM.
EJEMPLO 2
En un intento por entender el fundamento de la modificaci6n de la vasoactividad del TNK-tPA, se examin6 el papel del sito de acoplamiento de PAI-1 en el proceso. La Figura 2 muestra que la pro-vasodilataci6n de rtPA, asf como los efectos pro-vasoconstrictivos, se ven inhibidos por concentraciones equimolares de PAI-1.
El PAI-1 interacciona con tPa a traves de centros independientes; el centro catalftico y un sitio de acoplamiento, presentes en los aminoacidos 296 a 299. El sitio de acoplamiento de PAI-1 esta mutado en el TNK-tPA. Para examinar con mas detalle el papel del sitio de acoplamiento de PAI-1 en la vasoactividad de TNK-tPA especfficamente y de rtPA en general, examinamos el efecto del hexapeptido derivado de PAI-1 EEIIMD, que corresponde a los residuos de aminoacido 350 a 355 del PAI-1 (el epftopo de PAI-1 que interacciona con el sitio de acoplamiento de tPA). Madison E.L., Goldsmith E.J., Gerard R.D., Gething M.J.H., Sambrook J.F., Bassel-Duby R.S. Amino acid residues that affect interaction of tissue plasminogen activator with plasminogen activator inhibitor 1. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 1990; 87: 3530-3534. Madison E.L., Goldsmith E.J., Gething M.-J., H., Sambrook J.F., Gerard R.D. Restoration of serine protease-inhibitor interaction by protein engineering. Journal of Biological Chemistry. 1990; 265: 21423-21426.
La Figura 2 muestra que una concentraci6n de 2 IM, el peptido derivado de PAI-1 suprimi6 los efectos vasoactivos del rtPA. De forma interesante, el efecto vasoactivo de TNK-tPA no se vio afectado por una concentraci6n 2 IM de peptido de PAI-1. Sin embargo, a 10 IM, el peptido elimin6 el efecto de TNK-tPA.
Por lo tanto, la presente invenci6n proporciona un medio para inhibir la vasoactividad tanto de tPA como de TNK-tPa combinandolos con una cantidad efectiva del peptido de PAI-1. Se obtuvieron resultados similares con Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida (resultados no presentados).
EJEMPLO 3
El efecto de revertasa y TNK-tPA sobre la vasoconstricci6n inducida por PE se estudi6 en presencia o en ausencia del antagonista de LRP (RAP) o de anticuerpos anti-LRP. Los resultados obtenidos mostrados en la Figura 3 indican que el efecto vasoactivo del tPA y/o el TNK-tPA es suprimido totalmente por los anticuerpos anti-LRP, asf como por el antagonista de LRP rRAP.
EJEMPLO 4
Efecto de tPA sobre la contracci6n inducida por fenilefrina
La figura 4 describe un grafico que describe el efecto de tPA sobre la contracci6n inducida por fenilefrina de anillos de aorta de rata aislados in vitro. La contracci6n de los anillos a6rticos fue inducida mediante concentraciones variables de fenilefrina en ausencia de tPA (triangulos rellenos), en presencia de tPA 1nM (cuadrados rellenos) o en presencia de tPA 10 nM (cuadrados huecos). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo a procedimientos
descritos previamente por Haj-Yehia A. y col., FASEB J., 2000, 14: 1411-1422.
Los resultados obtenidos confirman que el tPA tiene la capacidad de inducir vasodilataci6n.
La Figura 4 muestra que la presencia de tPA 1nM inhibe la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina. El aumento de la concentraci6n de tPa indujo el efecto opuesto, es decir, la presencia de tPa 1nM estimul6 la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina. De forma similar, el uPA tiene la capacidad de inducir vasodilataci6n (Haj-Yehia A. y col., FASEB J., 2000, 14: 1411-1422).
EJEMPLO 5
Efecto de PAI-1 sobre la vasoactividad de uPA y tPA
La Figura 5 describe un diagrama de barras que describe los resultados de experimentos sobre la vasoactividad de uPA y tPA en presencia o ausencia de PAI-1, por ejemplo, se determin6 el efecto de uPA 2nM o de tPA 1nM sobre la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina en presencia o en ausencia de concentraciones equimolares de PAI-1.
EJEMPLO 6
La Figura 6 es un diagrama de barras que describe los resultados de estudios realizados sobre el efecto de peptido derivado de PAI-1 sobre la vasoactividad de tPA. La constricci6n de anillos a6rticos fue inducida mediante concentraciones crecientes de fenilefrina en ausencia o en presencia de tPA 1nM, tPA 1nM y 1 OM, tPA 10 nM 6 tPA 10 nM y 1 OM.
Los resultados obtenidos muestran que 1 OM de eliminaci6n del efecto potenciador del tPA sobre la vasoconstricci6n inducida por fenilefrina ejerci6 el mismo efecto sobre uPa. Ni el PAI-1 ni solo tuvieron ningun efecto sobre la contracci6n de anillos a6rticos (Figura 3). Por tanto, el mecanismo mediante el cual el PAI-1 afecta al efecto vasoactivo de tPA o uPA es a traves de su interacci6n con el sitio de acoplamiento.
EJEMPLO 7
Efecto del peptido derivado de PAI-1 EEIIMD sobre la lisis de coagulo mediada por tPA
La Figura 7 es un diagrama de barras que describe los resultados de experimentos dirigidos a determinar el efecto del peptido derivado de PAI-1 sobre la lisis de coagulo mediada por tPA. Se determin6 la capacidad del tPA para inducir la lisis de coagulos en presencia y en ausencia de 1 OM. En estos experimentos, se dej6 coagular sangre procedente de voluntarios a temperatura ambiente durante una hora, se separ6 el coagulo sangufneo del plasma, se coloc6 sobre papel absorbente para eliminar todo el suero y se cort6 en varios trozos. Los trozos fueron pesados y colocados en tamp6n PBS solo o que contenfa tPA 100 nM, con o sin 1 OM. Tras incubaci6n durante 3 horas a temperatura ambiente, los trombos fueron separados del medio, secados y pesados.
Se usaron dos metodos para determinar si el peptido afectaba la actividad fibrinolftica de tPA inhibiendo la actividad de plasmin6geno. 1) El ensayo cromogenico descrito en detalle anteriormente (Higazi A.A.-R. y col., J. Biol. Chem., 1995, 270: 9472-9477); y 2) el ensayo de lisis de coagulo descrito anteriormente (Higazi A.A.-R. y col., Blood, 1988,
92: 2075-2083).
Los resultados obtenidos muestra que no tenfa un efecto significativo sobre la actividad catalftica del tPA. Figura 7.
Por lo tanto, estos datos indican que el peptido EEIIMD derivado de PAI-1 (y/o Ac-KMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida, resultados no mostrados) y sus derivados pueden neutralizar la vasoactividad de tPA o uPA, reduciendo con ello sus efectos adversos sobre los vasos sangufneos y previniendo las complicaciones que aparecen durante la terapia trombolftica como en el caso de infarto de miocardio, apoplejfa y enfermedades similares.
Claims (4)
- REIVINDICACIONES1.-Un polipeptido Ac-RMAPEEIIMDRFLYVVR-amida que tiene un efecto inhibidor sobre la vasoactividad inducida por activadores de plasmin6geno, en donde el polipeptido tiene la secuencia de aminoacidos: Ac-Arg-Met-Ala-Pro5 Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Tyr-Val-Val-Arg-Amida.
- 2.-Una composici6n que comprende una cantidad efectiva del polipeptido Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida para prevenir hemorragias.
- 3.-La composici6n de acuerdo con la reivindicaci6n 2, que ademas comprende un agente fibrinolftico seleccionado del grupo que consiste en scuPA, tPA, uPA, tcuPA, estreptoquinasa, rt-PA, alteplasa, derivados de rt-PA, reteplasa, 10 lanoteplasa, TNK-rt-PA, complejo de estreptoquinasa de plasmin6geno anisoilado, anistreplasa o un derivado de estreptoquinasa.
- 4.-Una composici6n farmaceutica que comprende el polipeptido Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-amida.
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