ES2373598A1 - Compuesto para tratar enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos y/o demencias. - Google Patents
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Abstract
Se describe el uso del compuesto gemifloxacino para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits cognitivos, demencias, enfermedades asociadas con el envejecimiento y procesos patológicos asociados con la edad y la progeria y en especial de la enfermedad de Alzheimer, debido al descubrimiento de nuevas propiedades intrínsecas a este compuesto.
Description
Compuesto para tratar enfermedades
neurodegenerativas, déficits cognitivos y/o demencias.
La invención se relaciona con la utilización del
compuesto gemifloxacino (7^{4}-(Z)-(O-metiloxima)
del ácido
(\pm)-7-[3-(aminometil)-4-oxo-1-pirrolidinil]-1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-oxo-1,8-naftiridina-3-carboxílico)
para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, déficits
cognitivos, demencias y en especial de la enfermedad de Alzheimer,
debido al descubrimiento de nuevas propiedades intrínsecas a este
compuesto.
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La gran incidencia de las enfermedades
neurodegenerativas y de las enfermedades asociadas con el
envejecimiento como los déficits cognitivos o las demencias, es un
problema de primer orden en todo el mundo. Por ello es necesaria la
búsqueda de compuestos neuroprotectores que eviten o palíen dichas
enfermedades. De todas ellas, la enfermedad de Alzheimer (EA) es la
más prevalente, estimándose que en el año 2040, 81 millones de
personas sufrirán esa enfermedad (Blennow et al., Lancet
2006; 368: 387-403). Sólo en España se estima que
más de medio millón de personas sufren actualmente la EA. Los costes
asociados a esta enfermedad son proporcionalmente altos, y se
calcula que el coste total derivado del cuidado de los enfermos de
Alzheimer es de 81.000 y 22.000 millones de
\euroen Estados Unidos y en el Reino Unido, respectivamente. Actualmente no existen fármacos eficientes que prevengan o impidan esta enfermedad, con lo que la búsqueda y validación de nuevos compuestos neuroprotectores que eviten el daño neuronal es una necesidad.
Una de las etapas previas asociadas a la EA y a
otras demencias es el deterioro cognitivo leve o MCI (del inglés
Mild Cognitive Impairment), también conocido como demencia
incipiente o deterioro aislado de memoria. El MCI está
reconocido como un factor de riesgo de la EA, y afecta a unos 30
millones de personas en todo el mundo. El MCI se considera como un
paso previo a la EA, donde entre el 10 y el 15% de los individuos
con MCI progresan a EA cada año (Grundman et al. Arch. Neurol
2004; 61 [1]: 59-66). A pesar de la significativa
prevalencia del MCI y del alto riesgo de los pacientes a progresar a
demencias, no existe en la actualidad ningún tratamiento o terapia
para esta entidad clínica, con lo que se recomienda el uso de
antioxidantes o fármacos contra la EA para el tratamiento del MCI.
Las opciones terapéuticas actuales frente a la EA se basan en la
inhibición de la acetilcolinesterasa con fármacos como el
donepezilo, la galantamina o la rivastigmina, o en la capacidad de
la memantina en antagonizar un receptor de glutamato, el NMDA (ácido
N-metil-D-aspártico).
No obstante, se ha demostrado que el uso de rivastigmina no detiene
o enlentece la progresión del MCI o de la EA (Feldman et al.
Lancet Neurol 2007; 6[6]: 501-12), mientras
que el uso del donepezilo sólo muestra beneficios discretos a corto
plazo, pero con el inconveniente de presentar efectos secundarios
significativos (Birks and Flicker, Cochrane Database Syst Rev 2006;
3: CD006104). Así pues, en la actualidad no existen fármacos para el
tratamiento del MCI, y los actuales fármacos contra la EA ofrecen
pocos beneficios a los pacientes, los cuales retrasan temporalmente
(en el mejor de los casos un año), algunos síntomas de la dolencia,
pero no evitan su evolución.
Debido al poco éxito de estos fármacos se han
abierto nuevas líneas de investigación, y entre ellas destaca la
estrategia de reposicionamiento de fármacos que se basa en el
descubrimiento de nuevas indicaciones para medicamentos que, bien se
están utilizando en el mercado para otras indicaciones, o bien han
superado la Fase I (estudios de primera administración y evaluación
de la seguridad en humanos). La estrategia de reposicionamiento
presenta ventajas como el conocimiento de la farmacología clínica,
la posibilidad de realización de pruebas de concepto rápidas, la
reducción del riesgo toxicológico y el conocimiento de la
administración y del desarrollo galénico.
Por otra parte, en WO 2009/149149, se describe
la utilización de uno o más antibióticos, solos o en combinación con
microflora exógena o con uno o más compuestos probióticos, con el
fin de modificar la población de la microflora para proporcionar un
efecto regulatorio autoinmune y hacer así posible el tratamiento de
enfermedades autoinmunes.
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Los inventores ahora han encontrado
sorprendentemente que el gemifloxacino, habitualmente utilizado como
antibiótico, tiene propiedades neuroprotectoras. El gemifloxacino es
un compuesto de cuarta generación de la familia de las
fluoroquinolonas, que son antimicrobianos bactericidas que inhiben
la síntesis de ADN bacteriano mediante el bloqueo de la subunidad A
de la ADN girasa (topoisomerasa II). Las fluoroquinolonas presentan
una alta biodisponibilidad oral, una excreción fundamentalmente por
vía renal, y en general son bien toleradas, aunque algunas de ellas
han manifestado efectos secundarios en el sistema nervioso central
como encefalopatías, convulsiones, confusión o psicosis. Los
inventores han puesto de manifiesto la actividad neuroprotectora del
gemifloxacino mediante el estudio de la protección de la muerte
neuronal causada por estrés de retículo endoplásmico (Ejemplo 1),
por desorganización del citoesqueleto (Ejemplo 2) o por daño
mitocondrial (como la inhibición de la succinato deshidrogenasa)
(modelo de Huntington) en líneas celulares humanas de origen
colinérgico (Ejemplo 3). La actividad neuroprotectora ha sido
confirmada mediante el estudio de la protección de la muerte
neuronal causada por apoptosis en líneas celulares humanas de origen
colinérgico (Ejemplo 4). Además se ha demostrado la capacidad del
gemifloxacino de inhibir la acetilcolinesterasa (AChE) (modelo de
Alzheimer) tanto in vitro como in vivo (Ejemplo 5).
Por último se ha determinado que el gemifloxacino atraviesa la
barrera hematoencefálica de forma eficiente (Ejemplo 6),
convirtiéndolo así en potencialmente útil para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos o demencias, y
en especial para las enfermedades de Alzheimer y Huntington. Estos
ejemplos ponen de manifiesto el potencial empleo del gemifloxacino
en la prevención y/o tratamiento de la muerte neuronal asociada a
enfermedades neurodegenerativas (e.g., Alzheimer, deterioro
cognitivo leve, Huntington, Parkinson, esclerosis múltiple,
esclerosis lateral amiotrófica, Creutzfeldt-Jakob,
déficits cognitivos y/o psicomotores, ataxias, demencias,
enfermedades cerebrovasculares, enfermedad de Alexander, etc.),
déficits cognitivos, demencias, enfermedades asociadas al
envejecimiento, procesos patológicos asociados a la edad y
progeria.
Los resultados obtenidos pueden ser extrapolados
con fines profilácticos o terapéuticos para su aplicación sobre la
población de riesgo. Asimismo, debido a que este compuesto se
utiliza habitualmente como antibiótico, los estudios de
farmacovigilancia han demostrado que presenta un perfil de toxicidad
relativamente bajo, con lo que su uso como fármaco neuroprotector
resulta muy adecuado y no requiere de ensayos clínicos complejos
como ocurre con otros candidatos a fármacos cuya toxicidad y
seguridad se desconocen.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con el empleo del gemifloxacino en la elaboración de una
composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits
cognitivos, demencias o enfermedades asociadas al envejecimiento,
procesos patológicos asociados a la edad y progeria.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de una composición farmacéutica de gemifloxacino para la
prevención y/o el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas,
deterioro cognitivo leve, déficits cognitivos, demencias o
enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos patológicos
asociados a la edad y progeria tiene lugar mediante neuroprotección,
en particular mediante la inhibición directa de la muerte
neuronal.
En un aspecto adicional, la invención se
relaciona con el empleo de una composición farmacéutica de
gemifloxacino para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits cognitivos,
demencias o enfermedades asociadas al envejecimiento, procesos
patológicos asociados a la edad y progeria, mediante la modulación
del neurotransmisor acetilcolina.
Finalmente, la invención se relaciona con un
método para la prevención y/o tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o enfermedades
asociadas al envejecimiento, en un sujeto con necesidad de
tratamiento, que comprende la administración a dicho sujeto de una
cantidad terapéuticamente eficiente de gemifloxacino, o una sal,
prodroga y/o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
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La Figura 1 es una gráfica de barras que
representa el efecto protector del gemifloxacino sobre la muerte
neuronal causada por tunicamicina (TM). La figura muestra el
porcentaje de la muerte celular (tomando el 100% la producida por
TM) de los cultivos tratados con 23 \muM TM y gemifloxacino a
diferentes concentraciones, representando las medias\pmSD de 3
experimentos independientes por triplicado. *Diferencia
significativa respecto a los tratamientos con TM sola, de acuerdo al
test de Student (p<0.05).
La Figura 2 es una gráfica de barras que
representa el efecto protector del gemifloxacino sobre la muerte
neuronal causada por ácido okadaico (AO). La figura muestra el
porcentaje de la muerte celular (tomando el 100% la producida por
AO) de los cultivos tratados con 20 nM AO y gemifloxacino a
diferentes concentraciones, representando las medias\pmSD de 3
experimentos independientes por triplicado. *Diferencia
significativa respecto a los tratamientos con AO solo, de acuerdo al
test de Student (p<0.05).
La Figura 3 es una gráfica de barras que
representa el efecto protector del gemifloxacino sobre la muerte
neuronal causada por ácido 3-nitropropiónico
(3-NP). La figura muestra el porcentaje de la muerte
celular (tomando el 100% la producida por 3-NP) de
los cultivos tratados con 30 \muM 3-NP y
gemifloxacino a diferentes concentraciones, representando las
medias\pmSD de 3 experimentos independientes por triplicado.
La Figura 4 es una gráfica de barras que
representa el efecto protector del gemifloxacino sobre la muerte
neuronal causada por camptotecina (CPT). La figura muestra el
porcentaje de la muerte celular (tomando el 100% la producida por
CPT) de los cultivos tratados con 20 nM CPT y gemifloxacino a
diferentes concentraciones, representando las medias\pmSD de 3
experimentos independientes por triplicado. *Diferencia
significativa respecto a los tratamientos con CPT sola, de acuerdo
al test de Student (p<0.05).
La Figura 5 es una gráfica de barras que
representa el efecto neuroprotector del gemifloxacino [codificada en
la figura como GFX] (en comparación con el inhibidor específico de
caspasas Z-VAD-fmk) de la activación
de la caspasa 3/7 por camptotecina (CPT). La figura muestra el
porcentaje de inhibición de la actividad caspasa 3/7 de los cultivos
tratados con 50 \muM CPT y gemifloxacino a diferentes
concentraciones y Z-VAD-fmk (en
presencia o ausencia de CPT), representando las medias\pmSD de 2
experimentos independientes por triplicado. *Diferencia
significativa respecto a los tratamientos con CPT sola, de acuerdo
al test de Student (p<0.05).
La Figura 6 es una gráfica de barras que
representa el efecto neuroprotector del gemifloxacino [codificada en
la figura como GFX] (en comparación con el inhibidor específico de
caspasas Z-VAD-fmk) de la apoptosis
causada por camptotecina (CPT) y determinada por citometría de
flujo. La figura muestra el porcentaje de células apoptóticas
determinadas por fragmentación de ADN (tomando el 100% de actividad
la producida por CPT) de los cultivos tratados con 50 \muM CPT y
gemifloxacino a diferentes concentraciones y
Z-VAD-fmk (en presencia o ausencia
de CPT), representando las medias\pmSD de 2 experimentos
independientes por triplicado. *Diferencia significativa respecto a
los tratamientos con CPT sola, de acuerdo al test de Student
(p<0.05).
La Figura 7 es una gráfica de barras que
representa el efecto inhibidor in vitro sobre la
acetilcolinesterasa (AChE) del gemifloxacino (en comparación con el
inhibidor específico de BW284c51). La figura muestra el porcentaje
de actividad AChE y su modulación por gemifloxacino a diferentes
concentraciones y BW284c51, representando las medias\pmSD de 2
experimentos independientes por triplicado. *Diferencia
significativa respecto al control (sin tratamiento), de acuerdo al
test de Student (p<0.05).
La Figura 8 es una gráfica de barras que
representa el efecto inhibidor in vivo sobre la
acetilcolinesterasa (AChE) del gemifloxacino (en comparación con el
inhibidor específico de BW284c51). La figura muestra el porcentaje
de actividad AChE celular normalizado por la cantidad de proteína y
su inhibición por gemifloxacino a diferentes concentraciones y
BW284c51, representando las medias\pmSD de 2 experimentos
independientes por triplicado. *Diferencia significativa respecto al
control (sin tratamiento), de acuerdo al test de Student
(p<0.05).
La Figura 9 es una gráfica de dispersión XY que
representa el paso de barrera hematoencefálica por difusión pasiva
del gemifloxacino en comparación con un fármaco que atraviesa la
barrera con facilidad (verapamilo) y otro que no atraviesa la
barrera (teofilina). En el eje X se representa el porcentaje de paso
de barrera hematoencefálica de los compuestos, y en el eje Y se
representa el parámetro de permeabilidad efectiva (P_{e}) de los
compuestos.
La Figura 10 es una gráfica de dispersión XY que
representa el paso de barrera hematoencefálica del gemifloxacino
[codificada en la figura como GFX] en peces cebra adulto (medias
\pm SEM). Los peces fueron administrados con 1.000 mg/Kg de
gemifloxacino en el agua y la cantidad de compuesto fue determinado
en el cerebro de los animales después de 15 min, 30 min, 1 h, 4 h y
24 h post-tratamiento mediante UPLC/MS. En el eje X
se representa el tiempo post-tratamiento del
gemifloxacino, y en el eje Y se representa la cantidad de
gemifloxacino en el cerebro (peso/peso).
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Para facilitar la comprensión de la invención
objeto de esta solicitud de patente, a continuación se expone el
significado de algunos términos y expresiones utilizados en el
contexto de la invención.
Una "sustancia neurotóxica" tal como aquí
se utiliza son sustancias químicas que producen alteraciones
funcionales, estructurales y bioquímicas del sistema nervioso
central. Estos efectos adversos implican cambios que producen una
desregulación o alteración del sistema nervioso. La naturaleza de
dicho cambio puede ser neuroquímica, morfológica, o relacionada con
la conducta y puede manifestarse transitoria o permanentemente.
El término "enfermedad neurodegenerativa",
tal como aquí se utiliza, incluye enfermedades que resultan de la
degeneración o deterioro del tejido nervioso, en particular de las
neuronas, que conduce, a lo largo del tiempo, a una disfunción o a
una incapacidad; el término degeneración incluye pérdida de la
viabilidad celular, pérdida de la función celular y/o pérdida del
número de células (neuronas y otras). Ejemplos ilustrativos, no
limitativos, de enfermedades neurodegenerativas incluyen enfermedad
de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Huntingon,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Alexander, déficits
cognitivos y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades
cerebrovasculares, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis
múltiple (EM), etc. En una realización particular, dicha enfermedad
neurodegenerativa es una enfermedad relacionada con la muerte
neuronal causada por una sustancia neurotóxica, por ejemplo, una
sustancia que produce estrés de retículo endoplásmico, apoptosis,
desorganización del citoesqueleto, degeneración de los ganglios
basales o daño mitocondrial.
Los términos "neuroprotección" y
"neuroprotector", tal como aquí se utilizan, se refieren a la
atenuación de los efectos de la degeneración o muerte neuronal
mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer por ejemplo,
necrosis, apoptosis, autofagia, excitotoxicidad, daño oxidativo,
daño mitocondrial, daño de retículo endoplásmico, deposición de
subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc, o a la
desaparición de los efectos de la degeneración o muerte neuronal
mediante cualquier mecanismo conocido o por conocer por ejemplo,
necrosis, apoptosis, autofagia, excitotoxicidad, daño oxidativo,
daño mitocondrial, daño de retículo endoplásmico, deposición de
subproductos, pérdida de la arquitectura celular, etc., o a la
disminución o desaparición de sus efectos secundarios.
El término "sujeto", tal como aquí se
utiliza, se refiere a un miembro de una especie de mamífero, e
incluye, pero no se limita a, animales domésticos, primates y
humanos; preferentemente, el sujeto es un ser humano, masculino o
femenino, de cualquier edad o raza. En una realización particular,
dicho sujeto es un mamífero que padece, o es susceptible de padecer
una enfermedad neurodegenerativa, tal como una enfermedad
neurodegenerativa crónica o una enfermedad asociada al
envejecimiento.
El término "sal" debe entenderse que
significa cualquier forma del gemifloxacino en el que el compuesto
asume una forma iónica, o está cargado y se acopla con un contraión
(un catión o anión) o están en disolución. Por esto debe entenderse
también complejos del compuesto activo con otras moléculas e iones,
y en particular complejos que se complejan a través de interacciones
iónicas.
El término "solvato" según esta invención
debe entenderse que significa cualquier forma del compuesto
gemifloxacino que tenga unido a través de un enlace no covalente
otra molécula (más probablemente un disolvente).
El término "profármaco" o "prodroga"
se usa en su sentido más amplio y engloba aquellos derivados que se
convierten in vivo en los compuestos de la invención. Tales
derivados se les ocurrirán fácilmente a aquellos expertos en la
técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes
en la molécula. Ejemplos de métodos bien conocidos para producir un
profármaco de un compuesto de actuación dado son conocidos por
aquellos expertos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo,
en Krogsgaard-Larsen et al., "Textbook of
Drugdesign and Discovery" Taylor & Francis (Abril 2002).
Derivados o profármacos particularmente favorables son aquellos que
aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención
cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo,
permitiendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba
más fácilmente en la sangre) o aquellos que aumentan la
administración del compuesto original un compartimiento biológico
(por ejemplo, el cerebro o sistema linfático) en relación con la
especie original.
El término "farmacéuticamente aceptable" se
refiere a composiciones y entidades moleculares que son tolerables
fisiológicamente y no producen normalmente reacciones alérgicas o
reacciones no favorables similares como trastornos gástricos,
mareos, y reacciones del mismo estilo, cuando son administradas en
humanos o animales. Preferiblemente, el término "farmacéuticamente
aceptable" significa que está aprobado por una agencia
regulatoria, o que está incluido en una farmacopea para su uso en
animales, y particularmente, en humanos.
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En un aspecto, la invención se relaciona con el
empleo del gemifloxacino de fórmula (I), las sales, profármacos y/o
solvatos del mismo, en la elaboración de una composición
farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento de la muerte
neuronal, en particular la asociada a enfermedades
neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits cognitivos,
demencias, enfermedades asociadas al envejecimiento y/o procesos
patológicos asociados a la edad y progeria.
Los resultados de la investigación realizada por
los inventores demuestran que la prevención y/o el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, deterioro cognitivo leve, déficits
cognitivos, demencias, enfermedades asociadas al envejecimiento y/o
procesos patológicos asociados a la edad y progeria con el compuesto
gemifloxacino tiene lugar, al menos parcialmente, mediante
neuroprotección, en particular mediante la inhibición directa de la
muerte neuronal, esto es, mediante la inhibición de la muerte de las
células neuronales del sistema nervioso una vez que dicho compuesto
ha atravesado la barrera hematoencefálica (BHE). Por tanto, este
mecanismo de acción tendría lugar sin la participación del sistema
inmune.
Numerosos ensayos realizados por los inventores
han puesto de manifiesto tanto el efecto neuroprotector del
gemifloxacino frente a la acción de diferentes sustancias
neurotóxicas, como su efecto antiapoptótico en neuronas colinérgicas
de origen humano.
El efecto neuroprotector del gemifloxacino
frente a la acción de una sustancia causante de estrés de retículo
endoplásmico (tunicamicina) en células colinérgicas humanas se
describe en el Ejemplo 1. En dicho ejemplo, se observó que el
gemifloxacino es capaz de reducir, cuantitativamente y de forma
significativa la muerte neuronal causada por es-
trés de retículo endoplásmico, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 1).
trés de retículo endoplásmico, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 1).
Con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron en el
Ejemplo 2 con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el
análisis de la muerte neuronal causada por la acción del ácido
okadaico (AO), que es una sustancia causante de muerte celular por
desorganización del citoesqueleto. El AO se usa para modelizar
farmacológicamente una de las marcas histopatológicas observadas en
los cerebros de enfermos de Alzheimer, como son los ovillos
neurofibrilares o tangles, consecuencia de la
hiperfosforilación de la proteína Tau. En dicho ejemplo, se observó
que el gemifloxacino es capaz de reducir cuantitativamente y de
forma significativa la muerte neuronal causada por desorganización
del citoesqueleto, lo que pone de manifiesto la capacidad
neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 2).
Con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron en el
Ejemplo 3 con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el
análisis de la muerte neuronal causada por el tratamiento con ácido
3-nitropropiónico (3-NP), que es una
toxina mitocondrial que interfiere en la síntesis de ATP, inhibiendo
la enzima succinato deshidrogenasa, lo que causa estrés oxidativo y
muerte celular. El 3-NP se usa para modelizar
farmacológicamente la neurodegeneración característica de la
enfermedad de Huntington. En dicho ejemplo, se observó que el
gemifloxacino es capaz de reducir cuantitativamente la muerte
neuronal causada por daño mitocondrial, lo que pone de manifiesto la
capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura 3).
Con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron en el
Ejemplo 4 con más detalle el proceso neurodegenerativo mediante el
análisis de la muerte neuronal causada por la acción de una
sustancia causante de apoptosis (camptotecina [CPT]), determinando
que el gemifloxacino es capaz de reducir cuantitativamente y de
forma significativa la muerte neuronal causada por apoptosis, lo que
pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto
(Figura 4). Asimismo, con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector de dicho compuesto, los inventores analizaron con más
detalle el proceso neurodegenerativo mediante el análisis de la
actividad de la caspasa 3/7 determinando que el gemifloxacino es
capaz de reducir cuantitativamente y de forma significativa la
activación de la caspasa 3/7, en comparación con un inhibidor
específico de la muerte neuronal por apoptosis, el
Z-VAD-fmk, lo que pone de
manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura
5). Asimismo, con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector de dicho compuesto, los inventores analizaron con más
detalle el proceso neurodegenerativo mediante citometría de flujo de
la muerte neuronal causada por apoptosis y su inhibición por el
gemifloxacino, en comparación con un inhibidor específico de la
muerte neuronal por apoptosis, el
Z-VAD-fmk, determinando que el
gemifloxacino es capaz de inhibir cuantitativamente y de forma
significativa la muerte neuronal causada por apoptosis (Figura
6).
Con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron en el
Ejemplo 5 la capacidad de inhibir el enzima acetilcolinesterasa
(AChE) in vitro, ya que este enzima degrada el
neurotransmisor acetilcolina (ACh), formando colina y acetato e
impidiendo la actividad de la ACh en la sinapsis nerviosa, lo que se
ha relacionado con, entre otras, la enfermedad de Alzheimer (EA). En
dicho ejemplo, se observó que el gemifloxacino es capaz de inhibir
la AChE in vitro, en comparación con un inhibidor específico
de la AChE, lo que pone de manifiesto la capacidad neuroprotectora
de dicho compuesto (Figura 7). Asimismo, con el objetivo de definir
mejor el efecto inhibidor del gemifloxacino sobre la AChE, los
inventores analizaron con más detalle la inhibición mediante
estudios in vivo utilizando neuronas humanas, observándose
que el gemifloxacino es capaz de inhibir la AChE in vivo, en
comparación con un inhibidor específico de la AChE, lo que pone de
manifiesto la capacidad neuroprotectora de dicho compuesto (Figura
8). Por lo que en otro aspecto de la invención, se reivindica el
gemifloxacino o una formulación farmacéutica del mismo para su uso
en la modulación del neurotransmisor acetilcolina y para la
prevención y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con la
modulación del neurotransmisor acetilcolina.
Con el objetivo de definir mejor el efecto
neuroprotector del compuesto, los inventores analizaron en el
Ejemplo 6 la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica
(BHE) del gemifloxacino. En dicho ejemplo, se observó que el
gemifloxacino es capaz de atravesar la BHE por difusión pasiva con
una mayor eficiencia que un compuesto conocido (teofilina) que no
atraviesa la barrera, y próximo a un compuesto conocido que sí la
atraviesa (verapamilo), lo que pone de manifiesto la utilidad
terapéutica de dicho compuesto en neuroprotección (Figura 9).
Adicionalmente, los investigadores determinaron que el gemifloxacino
es capaz de atravesar BHE en un modelo animal vertebrado como es el
pez cebra, lo que confirma su utilidad terapéutica (Figura 10).
Se puede dar el caso que enfermedades
neurodegenerativas se deban a procesos autoinmunes como el caso de
la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la esclerosis múltiple
(EM). La composición farmacéutica proporcionada por esta invención,
que comprende gemifloxacino, se usa para la prevención y/o el
tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis
múltiple, de tal manera que el principio activo gemifloxacino actúa
mediante neuroprotección, en particular mediante la inhibición
directa de la muerte neuronal.
Para su administración en la prevención y/o
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos,
demencias o enfermedades asociadas al envejecimiento, el
gemifloxacino se formulará en una composición farmacéutica, en una
cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos o
excipientes farmacéuticamente aceptables.
La composición farmacéutica proporcionada por
esta invención puede contener el gemifloxacino o uno o más fármacos
diferentes junto con uno o más vehículos o excipientes
farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, dicha
composición farmacéutica comprende únicamente el gemifloxacino.
Dicha composición farmacéutica es útil para el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o
enfermedades asociadas al envejecimiento.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
gemifloxacino, proporcionadas por esta invención, pueden formularse
en cualquier forma farmacéutica de administración adecuada para su
administración por la vía de administración elegida. A modo
ilustrativo, no limitativo, las composiciones farmacéuticas
proporcionadas por esta invención pueden formularse en una forma
farmacéutica sólida de administración por vía oral (e.g., gránulos,
comprimidos, cápsulas, etc.), en una forma farmacéutica líquida de
administración por vía oral (e.g., soluciones, suspensiones,
emulsiones, etc.), en una forma farmacéutica para su administración
por vía parenteral (e.g., soluciones, suspensiones, emulsiones,
etc.). Para ello, en cada caso, se elegirán los vehículos y
excipientes farmacéuticamente aceptables apropiados para la forma
farmacéutica de administración y vía de administración elegida, por
ejemplo, aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes,
humectantes, etc., para la formulación de formas farmacéuticas de
administración sólidas, y tampones, tensioactivos, etc., para la
formulación de formas farmacéuticas de administración líquidas.
Dichos vehículos y excipientes deben ser farmacéuticamente
aceptables y farmacológicamente tolerables y han de poder ser
combinados con otros componentes de la formulación sin ejercer
ningún efecto adverso sobre el sujeto tratado. Información sobre
dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas
farmacéuticas de administración de dicho principio activo puede
encontrarse en tratados de farmacia galénica. Una revisión de las
distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en
general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en
el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo,
1ª Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
La composición farmacéutica proporcionada por
esta invención comprende, al menos, el gemifloxacino en una cantidad
terapéuticamente eficiente. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente eficiente"
se refiere a la cantidad de fármaco calculada para producir el
efecto deseado. La dosis de fármaco a administrar a un sujeto puede
variar dentro de un amplio intervalo dependiendo de numerosos
factores, entre los que se incluyen las características del fármaco
utilizada, e.g., su actividad y vida media biológica, la
concentración del fármaco en la composición farmacéutica, la
situación clínica del sujeto, la severidad de la patología, la forma
farmacéutica de administración elegida, etc. La composición
farmacéutica proporcionada por esta invención se puede administrar
una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos o con
otras pautas de administración, no necesariamente diaria sino
también de forma puntual, semanal, etc. En una realización
particular, la dosis de principio activo administrada a un sujeto
que necesita tratamiento para el tratamiento y/o prevención de los
estados mencionados anteriormente está en el intervalo de 0,1 a 20
mg/kg de peso corporal, normalmente entre 0.2 y 15 mg/kg de peso
corporal y preferiblemente entre 1 y 13 mg/kg de peso corporal.
En un aspecto la invención se relaciona con un
método para la prevención o tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o enfermedades
asociadas al envejecimiento, en un sujeto con necesidad de
tratamiento, que comprende la administración a dicho sujeto de una
composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente
eficiente de gemifloxacino, o una sal, prodroga y/o solvato
farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto preferido, este
método de prevención o tratamiento actúa mediante neuroprotección,
en particular mediante la inhibición directa de la muerte
neuronal.
Otro aspecto la invención trata de un método en
el que la composición farmacéutica proporcionada por esta invención,
si se desea, puede usarse junto con otros fármacos, por ejemplo,
fármacos útiles en el tratamiento de las enfermedades
neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o enfermedades
asociadas con el envejecimiento, con el fin de aumentar la
eficiencia de la composición farmacéutica proporcionada por esta
invención, generándose de este modo una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma
composición farmacéutica o, alternativamente, pueden facilitarse
como una composición farmacéutica separada para su administración al
mismo tiempo (administración simultánea) que la composición
farmacéutica proporcionada por esta invención o en momentos
diferentes (administración secuencial) respecto a la administración
de la composición farmacéutica proporcionada por esta invención. A
modo ilustrativo, no limitativo, ejemplos de fármacos adicionales
que pueden formar parte de la misma terapia o composición
farmacéutica junto con el gemifloxacino son: fármacos para el
tratamiento del alzheimer (tacrina, rivastigmina, memantina,
donepezilo, galantamina ...), de parkinson (carbidopa, levodopa,
bromocriptina, pramipexol, ropinirol, amantadina, rasagilina ...),
antipsicóticos como el haloperidol, antidepresivos como la
amitriptilina, ansiolíticos como el lorazepam, antiinflamatorios
como la aspirina, suplementos dietéticos como las vitaminas E,
C,
B, el folato o el extracto de Ginkgo biloba o fármacos contra el resto de neurodegenerativas indicadas en la patente.
B, el folato o el extracto de Ginkgo biloba o fármacos contra el resto de neurodegenerativas indicadas en la patente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el gemifloxacino para el tratamiento y/o prevención de las
enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o
enfermedades asociadas con el envejecimiento. Las características
del fármaco así como las de dichas enfermedades ya han sido
mencionadas previamente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades
neurodegenerativas, déficits cognitivos, demencias o enfermedades
asociadas con el envejecimiento, que comprende administrar a un
sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente
eficiente de gemifloxacino o de una composición farmacéutica
proporcionada por esta invención que comprende el gemifloxacino. Las
características del fármaco así como las de dichas enfermedades y
composiciones farmacéuticas que comprenden un fármaco ya han sido
mencionadas previamente.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo
de neuroblastoma humano SK-N-MC
procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)". En
todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la
manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase
II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron
mantenidas en el medio de cultivo "Minimun Essential Medium
Eagle" suplementado con piruvato sódico 1 mM,
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM,
gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó la inhibición producida por el
mesilato de gemifloxacino de la muerte celular causada por el
tratamiento con tunicamicina (TM) que origina estrés de retículo
endoplásmico. La TM es un inhibidor de la
N-glicosilación de proteínas, lo que produce el
plegamiento anormal de las proteínas en el retículo endoplásmico,
con lo que dichas proteínas se acumulan y producen estrés de
retículo endoplásmico que desemboca en la muerte celular.
Estas células, en pase no superior a 15, fueron
sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 5x10^{4}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3
pocillos de la placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 37ºC y
5% CO_{2} se procedió a los tratamientos celulares con 100 \mul
de volumen total para las condiciones siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- Tunicamicina (TM): medio con tunicamicina 23 \muM, que produce la muerte del 50% de las células.
- -
- TM más mesilato de gemifloxacino: medio con TM (23 \muM) más mesilato de gemifloxacino a 1, 4, 10, 40 ó 100 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células fueron incubadas (a 37ºC y 5%
CO_{2}) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se
añadió el reactivo WST-1. El test
WST-1 se basa en la medida de la actividad
metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de
las células de obtener la energía necesaria para mantener sus
funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las
células metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de
tetrazolium a formazán mediante el sistema
succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena
respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado
colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2
horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de
placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como
aparece en la Figura 1, como el porcentaje de muerte celular para
cada tratamiento referido a la muerte producida por la TM. Se
observó protección de la muerte a 4, 10 y 40 \muM de mesilato de
gemifloxacino, alcanzando aproximadamente un 50% a 40 \muM. De
estos resultados se concluye que el gemifloxacino muestra un efecto
protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada
por estrés de retículo endoplásmico.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo
de neuroblastoma humano SK-N-MC
procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)". En
todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la
manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase
II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron
mantenidas en el medio de cultivo "Minimun Essential Medium
Eagle" suplementado con piruvato sódico 1 mM,
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM,
gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó la inhibición producida por el
mesilato de gemifloxacino de la muerte celular causada por el
tratamiento con ácido okadaico (AO). El AO es un inhibidor de la
protein fosfatasa 1 (PP1) y produce muerte celular por
desorganización del citoesqueleto. El AO se usa para modelizar
farmacológicamente una de las marcas histopatológicas observadas en
los cerebros de enfermos de Alzheimer, como son los ovillos
neurofibrilares o tangles, consecuencia de la
hiperfosforilación de la proteína Tau.
Estas células, en pase no superior a 15, fueron
sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 5x10^{4}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3
pocillos de la placa.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Tras 24 h de incubación de las células a 37ºC y
5% CO_{2} se procedió a los tratamientos celulares con 100 \mul
de volumen total para las condiciones siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- Ácido Okadaico (AO): medio con AO 20 nM, que produce la muerte del 50% de las células.
- -
- AO más mesilato de gemifloxacino: medio con AO (20 nM) más mesilato de gemifloxacino a 1, 4, 10, 40 ó 100 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células fueron incubadas (a 37ºC y 5%
CO_{2}) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se
añadió el reactivo WST-1. El test
WST-1 se basa en la medida de la actividad
metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de
las células de obtener la energía necesaria para mantener sus
funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las
células metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de
tetrazolium a formazán mediante el sistema
succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena
respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado
colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2
horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de
placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como
aparece en la Figura 2, como el porcentaje de muerte celular para
cada tratamiento referido a la muerte producida por AO. Se observó
protección de la muerte a 4, 10 y 40 \muM de mesilato de
gemifloxacino, alcanzando un 57% a 10 \muM. De estos resultados se
concluye que el gemifloxacino muestra un efecto protector de la
muerte de células humanas de origen neuronal causada por
desorganización del citoesqueleto.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo fue realizado sobre células en cultivo
de neuroblastoma humano SK-N-MC
procedentes de "American Type Culture Collection (ATCC)". En
todos los casos se siguieron estrictas normas de esterilidad y la
manipulación se llevó a cabo en cabinas de seguridad biológica clase
II que siguen la norma europea EN 12469. Las células fueron
mantenidas en el medio de cultivo "Minimun Essential Medium
Eagle" (MEM) suplementado con piruvato sódico 1 mM,
L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM,
gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino 10%.
Se analizó la inhibición producida por el
mesilato de gemifloxacino de la muerte celular causada por el
tratamiento con ácido 3-nitropropiónico
(3-NP). El 3-NP es una toxina
mitocondrial que interfiere en la síntesis de ATP, ya que es
inhibidor de la enzima succinato deshidrogenasa, produciendo estrés
oxidativo y muerte celular. En los mamíferos el 3-NP
produce degeneración de los ganglios basales y disfunciones del
movimiento como distonia, corea e hipoquinesia, mimetizando algunos
aspectos de la enfermedad de Huntington como los cambios
neuroanatómicos, fisiológicos y químicos.
Estas células, en pase no superior a 15, fueron
sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 5x10^{4}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3
pocillos de la placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 37ºC y
5% CO_{2} se procedió a los tratamientos celulares con 100 \mul
de volumen total para las condiciones siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- 3-Nitropropiónico (3-NP): medio con 3-NP 30 \muM, que produce la muerte del 50% de las células.
- -
- 3-NP más mesilato de gemifloxacino: medio con 3-NP (30 \muM) más mesilato de gemifloxacino a 1, 4, 10 ó 40 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células fueron incubadas (a 37ºC y 5%
CO_{2}) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se
añadió el reactivo WST-1. El test
WST-1 se basa en la medida de la actividad
metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de
las células de obtener la energía necesaria para mantener sus
funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las
células metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de
tetrazolium a formazán mediante el sistema
succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena
respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado
colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2
horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de
placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como
aparece en la Figura 3, como el porcentaje de muerte celular para
cada tratamiento referido a la muerte producida por el
3-NP. Se observó protección de la muerte a 10 \muM
del mesilato de gemifloxacino, alcanzando un 40% a 10 \muM. De
estos resultados se concluye que el gemifloxacino muestra un efecto
protector de la muerte de células humanas de origen neuronal causada
por daño mitocondrial.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los ensayos fueron realizados sobre células en
cultivo de neuroblastoma humano
SK-N-MC procedentes de "American
Type Culture Collection (ATCC)". En todos los casos se siguieron
estrictas normas de esterilidad y la manipulación se llevó a cabo en
cabinas de seguridad biológica clase II que siguen la norma europea
EN 12469. Las células fueron mantenidas en el medio de cultivo
"Minimun Essential Medium Eagle" (MEM) suplementado con
piruvato sódico 1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos
no esenciales 0.1 mM, gentamicina 0.05 mg/ml y suero fetal bovino
10%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la inhibición producida por el
mesilato de gemifloxacino de la muerte celular causada por el
tratamiento con camptotecina (CPT) (Sigma). La CPT es una quinolina
alcaloide citotóxica que inhibe la enzima ADN topoisomerasa I, por
lo que produce daño en el ADN que conduce a la apoptosis.
Las células
SK-N-MC, en pase no superior a 15,
fueron sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 5x10^{4}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3
pocillos de la placa.
Tras 24 h de incubación de las células a 37ºC y
5% CO_{2} se procedió a los tratamientos celulares con 100 \mul
de volumen total para las condiciones siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- Camptotecina (CPT): medio con CPT 20 nM, que produce la muerte del 50% de las células.
- -
- CPT más mesilato de gemifloxacino: medio con CPT (20 nM) más mesilato de gemifloxacino a 1, 4, 10, 40 ó 100 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células fueron incubadas (a 37ºC y 5%
CO_{2}) con estos tratamientos durante 22 h, pasadas las cuales se
añadió el reactivo WST-1. El test
WST-1 se basa en la medida de la actividad
metabólica. El daño celular produce la pérdida de la habilidad de
las células de obtener la energía necesaria para mantener sus
funciones metabólicas y el crecimiento celular, por lo que las
células metabólicamente activas (vivas) reducen la sal de
tetrazolium a formazán mediante el sistema
succinato-tetrazolium reductasa (de la cadena
respiratoria mitocondrial). El formazán formado puede ser detectado
colorimétricamente, ya que tiene una absorbancia de 440 nm. A las 2
horas de añadido el reactivo se realizó la lectura en un lector de
placas a 440 nm.
Los resultados obtenidos se muestran, como
aparece en la Figura 4, como el porcentaje de muerte celular para
cada tratamiento referido a la muerte producida por la CPT. Se
observó protección de la muerte por el mesilato de gemifloxacino
alcanzando un 34% a 10 \muM. De estos resultados se concluye que
el gemifloxacino muestra un efecto protector de la muerte de células
humanas de origen neuronal causada por apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la caspasa 3/7 activa, como método de
cuantificación de la apoptosis, mediante el kit
Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7
(Promega). La caspasa 3 y la caspasa 7 son cisteín proteasas
caracterizadas por mediar la ruptura de otras proteínas, siendo
caspasas efectoras que desencadenan la señalización apoptótica. Se
cuantificó la activación de la caspasa 3/7 por el tratamiento con
CPT con un pre-tratamiento previo durante 24 h con
mesilato de gemifloxacino (GFX).
Las células
SK-N-MC, en pase no superior a 15,
fueron sembradas sobre placas de 96 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 4x10^{4}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 3
pocillos de la placa.
Después de 24 h tras la siembra de las células
se procedió a los pre-tratamientos celulares (con
mesilato de gemifloxacino a 4 ó 10 \muM) durante 24 h con 100
\mul de volumen total. Tras las 24 h de
pre-tratamiento se procedió a los tratamientos
celulares durante 6 h con 100 \mul de volumen total para las
condiciones siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- CPT: medio con CPT 50 \muM.
\newpage
- -
- CPT más Z-VAD-fmk (Alexis): medio con CPT 50 \muM más Z-VAD-fmk 50 \muM, como control positivo de inhibición.
- -
- CPT más mesilato de gemifloxacino: medio con CPT 50 \muM más mesilato de gemifloxacino a 4 ó 10 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
La medida de la caspasa 3/7 activa se realizó
siguiendo las instrucciones del fabricante. Sobre las células en
cultivo se añadió el tampón de lisis, que lisa y permeabiliza las
células, y el sustrato Z-DEVD-R110
de las caspasas efectoras 3 y 7. La caspasa 3 ó 7 activa produce la
ruptura de los péptidos DEVD del sustrato y emite fluorescencia a
499/521 nm (emisión/excitación), que es determinada mediante el
fluorímetro Infinite M200 (Tecan).
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 5, determinados en unidades de fluorescencia relativa (RFU)
de la caspasa 3/7 activa tras cada tratamiento. La protección se
determinó mediante la medida de la reducción de la caspasa 3/7
activa respecto al tratamiento con CPT, siendo del 29% y 52% a 4 y
10 \muM de mesilato de gemifloxacino, respectivamente. Estos
resultados indican que el gemifloxacino muestra un efecto protector
de la apoptosis en células humanas de origen neuronal. El
Z-VAD-fmk, inhibidor específico de
caspasas, inhibió en un 88% la activación de la caspasa 3/7.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las características que muestran las
células apoptóticas es la fragmentación del ADN. Basado en este
proceso es posible marcar el ADN con el intercalante yoduro de
propidio y mediante citometría de flujo se puede determinar el
porcentaje de células que están en las primeras etapas del ciclo
celular (fase G0/G1, carga n), de las que están duplicándose (fase
S, carga entre n y 2n), de las que están en la última fase y mitosis
(fase G2/M, carga 2n). De esta forma también se determina las
células muertas por apoptosis, ya que tendrán una carga menor que n,
debida a la fragmentación de ADN que se produce durante la
apoptosis.
De esta forma se analizó la fragmentación de ADN
producida tras el tratamiento con CPT durante 6 h con un
pre-tratamiento previo durante 24 h de mesilato de
gemifloxacino (GFX). Las células, en pase no superior a 15, fueron
sembradas sobre placas de 6 pocillos tratadas para células
adherentes con una concentración celular de 7.5x10^{5}
células/pocillo; para cada condición del ensayo se sembraron 2
pocillos de la placa.
Después de 24 h tras la siembra de las células
se procedió a los pre-tratamientos celulares (con
mesilato de gemifloxacino a 4 ó 10 \muM) durante 24 h con 2 ml de
volumen total para las condiciones siguientes. Tras las 24 h de
pre-tratamiento se procedió a los tratamientos
celulares durante 6 h con 2 ml de volumen total para las condiciones
siguientes:
- -
- Control: medio de cultivo (medio).
- -
- CPT: medio con CPT 50 \muM.
- -
- CPT más Z-VAD-fmk: medio con CPT 50 \muM más Z-VAD-fmk 50 \muM, como control positivo de inhibi- ción.
- -
- CPT más mesilato de gemifloxacino: medio con CPT 50 \muM más mesilato de gemifloxacino a 4 ó 10 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
Pasado el tiempo de tratamiento se recogieron
las células junto con su medio de cultivo y se centrifugaron a 300
xg durante 5 min. Se eliminó el medio, se realizó un lavado con PBS
y se fijaron durante 2 minutos con 500 \mul de etanol al 70% a
-20ºC. Una vez fijadas se centrifugaron a 400 xg durante 5 min, se
lavaron con PBS y se les añadió yoduro de propidio a 0.05 mg/ml,
diluido en tampón de ciclo (citrato sódico 0.1%, nonidet
P-40 0.3% y RNAsa 0.02 mg/ml) y se incubaron 1 hora
a 37ºC. Se analizaron por citometría de flujo, comparando la
fluorescencia del yoduro de propidio frente a la cantidad de ADN. El
porcentaje de apoptosis se midió sobre la región
sub-G1 (ADN fragmentado) de cada una de las
condiciones.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 6, como el porcentaje de células en apoptosis (con ADN
fragmentado) de cada tratamiento referido a la apoptosis producida
por la CPT. Se observó una protección del 30% a 4 \muM de mesilato
de gemifloxacino. Estos resultados indican que la gemofloxacina,
muestra un efecto protector de la apoptosis en células humanas de
origen neuronal. El Z-VAD-fmk,
inhibidor específico de caspasas, inhibió en un 90% el número de
células apoptóticas.
\vskip1.000000\baselineskip
La acetilcolinesterasa (AChE) es la enzima que
degrada el neurotransmisor acetilcolina (ACh), formando colina y
acetato e impidiendo la actividad de la ACh en la sinapsis nerviosa.
Se ha relacionado la actividad de esta enzima con la enfermedad de
Alzheimer (EA), ya que: (i) se detecta menos ACh en los cerebros de
enfermos de EA que en los controles sanos, (ii) la ACh es un
neurotransmisor fundamental para la creación de recuerdos, el
aprendizaje y otras actividades intelectuales que están
comprometidas en la EA, y (iii) la AChE degrada la ACh, por lo que
la inhibición de la AChE es una diana terapéutica de la EA.
Se analizó la inhibición de la enzima AChE in
vitro producida por el mesilato de gemifloxacino. Esta medida se
basa en el método de Ellman (Ellman et al. Biochem Pharmacol
1961; 147[393]:406): se usa como sustrato sintético el yoduro
de acetilcolina, que en presencia de la enzima AChE de
Electrophurus electritus se transforma en acetato y
tiocolina. La tiocolina reacciona con el DTNB (ácido
5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico
o reactivo de Ellman) produciendo un compuesto de color amarillo,
4-nitrotiolato, con absorbancia a 412 nm que es
medido en el lector de placas
BechmarkPlus (Biorad). Como control de inhibición se utiliza el compuesto BW284c51 que es un inhibidor específico de la AChE.
BechmarkPlus (Biorad). Como control de inhibición se utiliza el compuesto BW284c51 que es un inhibidor específico de la AChE.
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 7 como el porcentaje de la actividad AChE in vitro de
cada tratamiento referido al control. Se observó una inhibición de
la actividad de la enzima con 4, 10 y 40 \muM de mesilato de
gemifloxacino del 54%, 46% y 29%, respectivamente, mientras que el
inhibidor específico BW284c51 inhibió un 85% la actividad de la
enzima.
Posteriormente se realizó el ensayo sobre la
AChE celular utilizando las células neuronales
SK-N-MC, que tienen actividad
acetilcolinesterasa por lo que son un buen modelo celular. Se
realizaron los tratamientos sobre las células y tras 24 h fueron
Usadas y se realizó el ensayo de medida de actividad AChE basado en
el método de Ellman, de la misma forma que el realizado in
vitro. En este caso se utilizó para todos los tratamientos el
inhibidor de colinesterasas inespecíficas iso-OMPA
(tetraisopropil pirofosforamida). Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 8, como el porcentaje de la actividad AChE
celular de cada tratamiento referido al control y normalizado por la
cantidad de proteína total. Se observó inhibición de la actividad de
la enzima con 10, 40 y 100 \muM de mesilato de gemifloxacino de
21%, 36% y 22% respectivamente. El inhibidor BW284c51 inhibió un 24%
la actividad de la enzima. Estos resultados en conjunto indican que
el gemifloxacino es capaz de inhibir tanto in vitro como
in vivo la enzima AChE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo que tuvo por objeto
predecir si el gemifloxacino es capaz de atravesar la barrera
hematoencefálica (BHE) por difusión pasiva. La barrera se mimetizó
en un sistema in vitro que permitió la evaluación del
compuesto sin empleo de células. Para ello, se llevó a cabo el
denominado ensayo PAMPA (Parallel Artificial Membrane
Permeation Assay), que emplea un sistema sándwich el cual
determina el paso de compuestos por medio de difusión pasiva
obviando el transporte activo. Como control positivo se empleó el
verapamilo, un compuesto de elevada permeabilidad a la BHE, mientras
que como control negativo se empleó teofilina, un compuesto que no
atraviesa la BHE.
Para mimetizar la BHE se hizo uso de una mezcla
de lípidos comercial derivada de cerebro de cerdo con una
composición de fosfolípidos muy semejante a la que constituye la
barrera humana, y denominada PBL (Porcine Polar Brain Lipid).
Este compuesto se conservó a -20ºC disuelto en dodecano a 100
\mug/mL en viales de cristal. Los compuestos mesilato de
gemifloxacino, verapamilo y teofilina fueron almacenados a -20ºC y
utilizados a 100 \muM en un tampón fosfato a pH 7.4 que contenía
fosfato sódico monobásico (0.41 M) y fosfato potásico dibásico
(0.287M) en DMSO al 1%.
En una placa con filtro de 96 pocillos con un
tamaño de poro de 45 \mum (MAIPN4550) se añadieron 5 \muL de PBL
a 20 \mug/mL, y transcurridos dos minutos, se añadieron 300 \muL
del tampón fosfato. Esta placa se consideró la placa aceptora y se
situó en la parte superior del sándwich. Sobre otra placa de 96
pocillos que ensamblaba con la anterior (MATRNP550) se añadieron 300
\muL de mesilato de gemifloxacino, verapamilo o teofilina, a 100
\muM y por triplicado. Además, se incluyó un blanco que incluía
únicamente el 1% de DMSO en el tampón fosfato empleado. Esta placa
se denominó la placa donadora. La placa aceptora fue situada sobre
la placa donadora formando el sistema sándwich. Los compuestos
objeto de estudio difundieron desde los pocillos de la placa
donadora a los pocillos correspondientes de la placa aceptora
durante las 18 h en las que el sistema se mantuvo intacto. El
compuesto restante preparado se conservó en las mismas condiciones
de humedad, temperatura y oscuridad que el sistema sándwich
constituido por las placas. Transcurrido este tiempo, 100 \muL de
los pocillos de las placas donadoras y de las aceptoras se
transvasaron a una placa de 96 pocillos especial para lectura a UV.
Además, se trasvasaron 100 \muL de los compuestos preparados para
la realización del ensayo, conservándose de modo igual a las placas
(pocillos basales). La placa UV se introdujo en un espectrofotómetro
en el cual se llevó a cabo un escáner en el UV desde 230 a 498 nm,
con lecturas cada 4 nm. A partir de los datos espectrofotométricos
se calculó el porcentaje de paso de barrera así como la
permeabilidad efectiva (P_{e}) según lo descrito en la literatura
(Wexler et al. J. Biomol Screen 2005;
10[4]:383-90). A continuación, se seleccionó
en cada caso la longitud de onda adecuada y se tomaron los datos
referidos a dicha longitud de onda para los pocillos de la placa
aceptora, donadora o los pocillos basales. A partir de estos datos
se calculó el porcentaje de paso de BHE, estimando el 100% con la
absorbancia de la media de los pocillos basales, de modo que pudiera
calcularse el porcentaje de compuesto existente en los pocillos
aceptores y donadores tras el tiempo de contacto de las placas. Para
calcular la Pe, se aplicó la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
Donde:
\vskip1.000000\baselineskip
- [Droga]_{aceptora} = Absorbancia del pocillo aceptor.
- [Droga]_{equilibrio} = Absorbancia de la media de los pocillos basales/2.
- V_{A} = Volumen del pocillo aceptor = 0.3 cm^{3}.
- V_{D} = Volumen del pocillo donador = 0.3 cm^{3}.
- Área = 0.24 cm^{2}.
- Tiempo = 64.000 s.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del paso de BHE se muestran en la
Figura 9, donde se representan los dos parámetros relacionados con
la difusión a través de la BHE. El gemifloxacino presenta un paso de
barrera eficiente de aproximadamente un 37% (P_{e} = 4.4 \pm
0.4-10^{-6} cm/s), y claramente superior al
control negativo, teofilina, cuyo paso de barrera es inferior al 5%
(P_{e} = 0.4 \pm 0.3-10^{-6} cm/s).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo tuvo por objeto determinar si el
gemifloxacino (GFX) era capaz de atravesar la barrera
hematoencefálica (BHE), determinando la biodisponibilidad del
compuesto en cerebro de pez cebra adulto.
En este ensayo se utilizaron peces cebra
(Danio rerio) adultos de ambos géneros de la cepa salvaje
AB. Los animales fueron mantenidos en un ciclo constante de
luz/oscuridad de 12/12 h a 26 \pm 1ºC en un sistema automatizado
de peceras de recirculación de agua comercial (Aquaneering, US). Las
condiciones del agua y medioambiente fueron mantenidas de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Todos los procedimientos
experimentales fueron llevados a cabo de acuerdo con la Directiva
del Consejo de la Comunidad Europea 86/609/EEC, del 24 de noviembre
de 1986. Los procedimientos fueron realizados bajo la supervisión de
personal veterinario y fue aprobado por el comité ético de NEURON
BPh.
Los peces cebra adultos fueron tratados por
inmersión del compuesto sin frecuencia de renovación (ensayo
estático) a una dosis de 1.000 mg/Kg siguiendo una cinética de
tiempos de tratamiento que finalizó con el sacrifico humanitario y
extracción de los cerebros de los animales a los 15 min, 30 min, 1
h, 4 h y 24 h post-tratamiento. En los procesos de
manipulación se tomaron estrictas precauciones para prevenir
contaminaciones. Para cada grupo experimental se utilizaron 4
animales, y el ensayo contó con un total de 24 peces cebra divididos
en las siguientes pautas de administración:
- \circ
- 4 animales control, tratados con agua de recirculación del sistema y sacrificados humanitariamente al final del ensayo (24 horas post-tratamiento).
- \circ
- 20 animales tratados con el compuesto gemifloxacino (4 animales por condición) diluido en agua de recirculación del sistema a la dosis de 1.000 mg/Kg sin recambio de la sustancia durante el tiempo que duró el ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Después del tiempo de exposición de las
sustancias a estudio, se determinó el paso de BHE del gemifloxacino
en los cerebros de los peces mediante la técnica de UPLC/MS, tal y
como muestra la Figura 10. El equipo empleado para tal efecto fue un
Acquity/Quatro Premier XE (Waters) con detector de masas Quatro
Premier XE (Waters). La fase móvil consistió en metanol (solvente A)
y 0.1% de ácido fórmico (solvente B). El gradiente de elución fue:
0-4 min 90% A y 10% B. La temperatura de la columna
fue de 35ºC con un flujo de 0.3 mL/min y un volumen de inyección de
muestra de 5 \muL. Las condiciones de MS fijadas fueron: voltaje
del capilar de 4 kV, voltaje de cono de 20 V en modo positivo y una
temperatura de 120ºC. El rango de medida seleccionado en modo SCAN
fue 160-1000 m/z.
Los resultados del estudio demuestran que el
gemifloxacino, sorprendentemente, atravesó la BHE de los peces cebra
adultos ya que se observa su presencia en el cerebro del animal,
presentando un pico de detección máximo a 1 h
post-tratamiento con gemifloxacino.
Por lo tanto, de este ensayo se concluye que el
gemifloxacino atraviesa la BHE de peces cebra adultos, y accede al
cerebro.
Claims (6)
1. Uso de gemifloxacino, una sal, prodroga y/o
solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la elaboración de
una composición farmacéutica para la prevención y/o el tratamiento
de:
- a.
- enfermedades neurodegenerativas,
- b.
- deterioro cognitivo leve,
- c.
- déficits cognitivos,
- d.
- demencias
- e.
- enfermedades asociadas con el envejecimiento, y
- f.
- procesos patológicos asociados a la edad y progeria.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso según la reivindicación 1 en el que la
prevención o tratamiento de:
- a.
- enfermedades neurodegenerativas,
- b.
- deterioro cognitivo leve,
- c.
- déficits cognitivos,
- d.
- demencias
- e.
- enfermedades asociadas con el envejecimiento, y
- f.
- procesos patológicos asociados a la edad y progeria tiene lugar mediante neuroprotección.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Uso según la reivindicación 2 en el que la
neuroprotección se produce mediante la inhibición directa de la
muerte neuronal.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que la
muerte neuronal es causada por una sustancia neurotóxica.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde la enfermedad neurodegenerativa es seleccionada
entre enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad
de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral
amiotrófica, esclerosis múltiple, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, epilepsia, déficits cognitivos
y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades cerebrovasculares
y enfermedad de Alexander.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, donde la enfermedad neurodegenerativa es seleccionada
entre enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo leve, enfermedad
de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, epilepsia, déficits cognitivos
y/o psicomotores, ataxias, demencias, enfermedades cerebrovasculares
y enfermedad de Alexander.
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|---|---|---|---|
| ES201001078A ES2373598B1 (es) | 2010-07-26 | 2010-07-26 | Compuesto para tratar enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos y/o demencias. |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201001078A ES2373598B1 (es) | 2010-07-26 | 2010-07-26 | Compuesto para tratar enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos y/o demencias. |
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|---|---|
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Family
ID=45497530
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|---|---|---|---|
| ES201001078A Withdrawn - After Issue ES2373598B1 (es) | 2010-07-26 | 2010-07-26 | Compuesto para tratar enfermedades neurodegenerativas, déficits cognitivos y/o demencias. |
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|---|---|---|---|---|
| US20010014670A1 (en) * | 1998-01-09 | 2001-08-16 | Brian J. Balin | Treatment and diagnosis of alzheimer's disease |
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|---|---|---|---|---|
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-
2011
- 2011-07-22 WO PCT/ES2011/070539 patent/WO2012013850A2/es active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010014670A1 (en) * | 1998-01-09 | 2001-08-16 | Brian J. Balin | Treatment and diagnosis of alzheimer's disease |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| AMARANTE, G.W.ET AL:"Mechanism and synthesis of pharmacologically active quinolones fromMorita-Baylis-Hillman adducts". Tetrahedron,2010, vol. 66, páginas 4370-4376, páginas 4370, figura 1, compuesto 7, página 4371, columna 1. * |
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