CN103209699A - 许可替代的线粒体电子传递的化合物 - Google Patents

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J.W.辛普金斯
闻一
杨少华
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Abstract

本发明涉及新的组合物及其作为抗氧化剂和/或神经保护剂用于治疗与氧化应激和/或神经损伤相关的医学疾病状态，例如神经系统疾病、病症和创伤，并因此治疗与CNS相关的疾病、病症和创伤的用途。

Description

许可替代的线粒体电子传递的化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年9月23日提交的美国临时专利申请第61/385,915号的优先权，其在此引入作为参考，就如本文中完全阐述一样。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国国立卫生研究院授予的基金号R01NS054687、R01NS054651、P01AG22550和P01AG10485；和阿尔茨海默病协会和德克萨斯州Garvey基金会授予的基金的政府支持下进行。政府在本发明中享有一定的权利。
发明背景
本发明涉及新的组合物及其作为抗氧化剂和/或神经保护剂用于治疗与氧化应激和/或神经损伤相关的医学疾病状态，例如神经系统疾病、病症和创伤，并因此治疗与CNS相关的疾病、病症和创伤的用途。
氧化应激可被认为是打乱了完整细胞中的促氧化/抗氧化系统的平衡状态，并且可由多种不同的氧化激发所引起，包括辐射、环境污染物和给予药物的代谢以及对疾病或感染的免疫系统应答。氧化应激发生时，促氧化系统超过抗氧化系统，这可导致细胞组分(包括脂质、蛋白质、碳水化合物和核酸)的氧化损伤。轻度、慢性氧化应激可通过诱导或抑制参与这些系统的蛋白质和通过耗尽抗氧化材料(例如谷胱甘肽和维生素E)的细胞贮存，来改变抗氧化系统。严重的氧化应激最终可导致细胞死亡。
因此，氧化应激涉及活性氧物种(ROS)，其与许多心脏和中枢神经系统(CNS)功能障碍的发展密切相关。这些器官的缺血/再灌注损伤是人类死亡的主要原因之一。这些损伤由心脏和脑脉管系统的完全或部分局部闭塞、心脏病发作(heart stroke or attack)以及脑发作和脑创伤引起。此外，ROS参与动脉粥样硬化病变、多种神经退行性疾病的演变，并且也在涉及癫痫发作、炎症、各种神经毒物的作用机制中产生，或作为药物的副作用产生。因此，抗氧化试剂和药物构成当代药物开发和药物研究的备受追捧的目标。
慢性退行性变化以及中枢神经系统直接损伤后的延迟或继发性神经元损伤可由大脑的内源性神经化学系统的病理变化引起。虽然对介导继发性损害的确切机制了解甚少，但创伤后的神经化学变化可能包括神经递质释放或再摄取的过度激活、突触前或突触后受体结合的变化或者内源性因子的病理释放或合成。这些因子以及CNS损伤后的神经化学物质级联反应计时的识别和表征为采用清除ROS、改变神经递质和其他后续弱化神经损伤和改善预后的内源性因子的合成、释放、受体结合或生理活性的药物制剂进行治疗提供了机会窗口。大量的研究表明，通过药物干预对损伤后事件进行修饰可以促进多种动物模型和临床CNS损伤的功能恢复。通过这些不同的药物制剂如抗胆碱能药、兴奋性氨基酸拮抗剂，具体包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、内源性阿片样物质拮抗剂、儿茶酚胺、5-羟色胺拮抗剂、花生四烯酸调节剂、抗氧化剂和自由基清除剂、类固醇和脂质过氧化作用抑制剂、血小板活化因子拮抗剂、阴离子交换抑制剂、镁、神经节苷脂和钙通道拮抗剂对内源性系统进行药物控制都被认为可潜在地改善脑损伤后的功能性预后。
神经保护策略(包括自由基清除剂、谷氨酸盐受体拮抗剂、离子通道调节剂和抗炎剂)在过去的二十年中已被广泛探索用于治疗神经系统疾病。不幸的是，没有神经保护剂在临床试验中证明是有效的。本发明证明，亚甲基蓝(MB)作为替代的电子载体起作用，其从NADH接受电子，并将它们传送到细胞色素c，并绕过复合物I/III的阻滞。同时，重新合成的MB衍生物，其通过N-乙酰化使氧化还原中心无效(disabled)，对线粒体复合物活动无影响。在细胞培养中，MB增加细胞的耗氧率并降低细胞的糖酵解。MB在低nM浓度下防止各种体外损伤。数据表明，MB具有独特的机制并与传统的抗氧化剂根本不同。在大鼠帕金森病模型中，MB大大减弱行为、神经化学和神经病理损害。鱼藤酮引起纹状体中多巴胺的严重耗竭，其可几乎完全被MB拯救。MB拯救鱼藤酮对线粒体复合物I-III的抑制作用和自由基的过度生成。鱼藤酮诱导黑质多巴胺能神经元的严重损耗，其可被MB大大减弱。此外，在短暂性局灶性脑缺血模型中，MB显著降低脑缺血再灌注损伤。本发明涉及通过MB或相似分子改变线粒体电子传递的路线，其为涉及线粒体功能障碍的慢性和急性神经性疾病的神经保护作用提供了新策略。
发明概述
本发明涉及包含其可用作抗氧化剂和神经保护剂的亚甲基蓝和类似分子的组合物。本发明还涉及包含作为抗氧化剂和/或神经保护剂的亚甲基蓝的组合​​物用于治疗与氧化应激、神经变性和/或神经损伤相关的各种医学疾病状态以及本文进一步描述的其他医学疾病状态的用途。
根据本发明的另一方面，提供一种包含作为活性成分的如本发明所述的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
根据下面所述的本发明的优选实施方案的进一步特征，将药物组合物包装在包装材料中并在包装材料中或包装材料上的印刷文字中标明，用于治疗选自CNS相关的疾病、病症或创伤、氧化应激相关的疾病或病症和神经保护有益的疾病或病症的医学疾病状态。
根据本发明的又一方面，提供本文所示的化合物用于治疗选自CNS相关的疾病、病症或创伤、氧化应激相关的疾病或病症和神经保护有益的疾病或病症的医学疾病状态的用途。
根据下面所述的本发明的优选实施方案的进一步特征，氧化应激相关的疾病或病症选自动脉粥样硬化、缺血/再灌注损伤、再狭窄、高血压、癌症、炎性疾病或病症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、炎性肠病(IBD)、皮肤和/或眼部炎症、关节炎、代谢疾病或病症和糖尿病。
根据优选实施方案的还进一步特征，CNS相关的疾病、病症或创伤选自神经退行性疾病或病症、中风、脑损伤和/或创伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、帕金森病、阿尔茨海默病、弗里德里希共济失调、自身免疫性脑脊髓炎、AIDS相关的痴呆、癫痫、精神分裂症、疼痛、焦虑、记忆损伤、认知和/或智力功能下降、行动和步态退化、改变的睡眠模式、减少的感官输入、自主神经系统不平衡、抑郁、痴呆、精神错乱、紧张症和谵妄。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。虽然类似于或相当于本文所述的方法和材料皆可用于本发明的实践或试验中，但下文描述了适宜的方法和材料。在产生矛盾时，将服从包括定义在内的本专利说明书。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而非意在限制。
如本文所用，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
如本文所用，术语“治疗”包括去除、基本抑制、减缓或逆转疾病状态的进展、基本改善疾病状态的临床或美学症状或者基本防止疾病状态的临床或美学症状的出现。
术语“包含”是指可以加入不影响最终结果的其它步骤和成分。该术语包括术语“由…组成”和“基本由…组成”。
短语“基本由…组成”是指组合物或方法可以包括另外的成分和/或步骤，条件是另外的成分和/或步骤不实质上改变要求保护的组合物或方法的基本的和新颖的特性。
术语“方法”是指完成给定任务的方式、方法、技术和过程，包括但不限于，化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的方式、方法、技术和过程，或由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者容易地从已知的方式、方法、技术和过程发展来的方式、方法、技术和过程。
术语“活性成分”是指包括在其应用后至少具有一种所期望的药学或治疗效果的任何天然的或合成的化学物质的药物制剂。
附图的简要描述
在本文中仅通过实例并参照附图对本发明进行描述。在对附图进行详细描述时，应强调指出细节描述是通过实施例的方式，目的仅在于说明本发明的优选实施方案，并且是为了提供据信是最有用的且容易理解本发明的原则和概念方面的描述。在这点上，没有以比基本理解本发明所必须的更详细方式显示本发明的结构细节，描述与附图使得本发明的若干形式在实践中如何体现对于本领域技术人员显而易见。
图1显示MB通过改变电子转移的线路对改善线粒体呼吸和衰减ROS产生的影响。(A)：MB对HT-22细胞中的细胞耗氧量的影响。细胞耗氧量通过相继注射MB/溶媒、寡霉素、FCCP和鱼藤酮进行监测。溶媒和MB处理组的耗氧率(OCR)在所有时间点(n =5)有显著差异。(B-D)：在指定的浓度下经过四小时MB/溶媒孵育后，采用与(A)中类似的相继处理对OCR(线粒体呼吸)和细胞外基质酸化率(ECAR，细胞糖酵解)进行监测。MB诱导OCAR显著的剂量依赖性增加、ECAR剂量依赖性减少和鱼藤酮诱导的OCR抑制的剂量依赖性衰减(n =5)；
图2显示MB对线粒体提取物中线粒体复合物I-III和II-III活性的剂量依赖效应。A：复合物I-III活性的代表性试验。B：随MB剂量增加的复合物I-III活性，和在其氧化还原作用失效的N-乙酰MB剂量作用下的复合物I-III活性。C：在复合物III抑制剂(抗霉素A)存在下，随MB剂量增加的复合物I-III活性。D：在含和不含复合物I抑制剂(鱼藤酮)时，随MB剂量增加的复合物I-III活性。*和***表示与无MB的对照组有显著差异；
图3显示MB对鱼藤酮和抗霉素A诱导的线粒体功能障碍和细胞死亡的影响。A-B：MB对HT22细胞中鱼藤酮(A)和抗霉素A(B)诱导的细胞毒性的神经保护作用。**表示与溶媒有显著差异。C：MB对H2O2(由葡萄糖氧化酶释放的)诱导的细胞毒性无保护作用。D-E：MB对鱼藤酮诱导的线粒体特定超氧化物(D)和总细胞ROS(E)的影响。Y轴为最大细胞数量百分数，X为强度。显示的是三组独立实验的代表性结果；
图4显示MB对鱼藤酮诱导的大鼠神经和行为缺陷的影响。A：MB防止鱼藤酮处理所诱导的大鼠体重减轻。B：MB改善长期鱼藤酮处理所诱导的协调运动功能缺陷。**表示指示组之间有显著差异(P<0.01)。*表示ROT/Sal和各个环节的其他两组之间都有显著差异(P<0.05)。C：MB对随机盲测的神经系统评估的影响。***表示指示组之间有显著差异(P<0.001)。D-E：MB对采用杆试验(D)和悬挂实验(E)对鱼藤酮和MB处理的大鼠进行全身僵硬症(catalepsy)测量的影响。F：MB对步态分析中鱼藤酮和MB处理的大鼠步幅长度的影响。ROT：鱼藤酮处理的；Sal：生理盐水(MB的溶媒)；Veh：鱼藤酮的溶媒。*和**表示图(panel)D-F指示组之间有显著差异；
图5显示MB和鱼藤酮对多巴胺和L-Dopac水平、线粒体复合物I-III活性和体内总ROS的影响。A-D：鱼藤酮和MB处理对纹状体多巴胺(A)和L-Dopac(B)水平的影响。C-D：鱼藤酮和MB处理的大鼠中的线粒体I-III活性(C)和总ROS(D)。所有数字标准化为对照组的百分数。*和**表示所有图中的指示组之间有显著差异；
图6显示所提出的机制，在鱼藤酮和抗霉素A抑制作用存在的情况下，MB通过该机制改变ETC中电子转移的路线；
图7显示在有和无复合物III抑制剂、抗霉素A(AA)的情况下，随MB剂量增加的复合物II-III活性。上图：代表性的复合物II-III活性试验显示MB对总的复合物II-III活性无影响。下图：定量分析结果显示在AA存在下，MB对复合物II-III活性无影响。酶的活性根据上图所示的每条曲线的最大斜率来计算；
图8显示鱼藤酮和MB对纹状体中5HT水平的影响。各组之间未发现有显著差异。ROT：鱼藤酮处理的；Sal：生理盐水(MB的溶媒)；Veh：鱼藤酮的溶媒；
图9显示亚甲基蓝及其衍生物的结构。
图10显示亚甲基蓝及其衍生物对HT-22细胞中抗谷氨酸盐毒性的细胞活力的影响，显示出N-结构(N-motif)的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低该保护作用的潜能和效力。此外，S-结构(S-motif)也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。
图11显示亚甲基蓝及其衍生物对HT-22细胞中谷氨酸盐诱导的活性氧物种产生的影响，显示N-结构的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低保护作用的潜能和效力。此外，S-结构也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。
图12显示MB及其衍生物对HT-22细胞中谷氨酸盐诱导的线粒体膜电位瓦解的影响，显示N-结构的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低该保护作用的潜能和效力。此外，S-结构也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。
示例性实施方案的详细描述
线粒体是几乎所有细胞中自由基的动力室和主要来源。线粒体功能障碍与许多神经病理性疾病密切相关，包括帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和中风。除ATP的生成外，线粒体还参与不同的细胞信号传导活动(diverse cell signaling events)并且是细胞存活所必不可少的细胞器。氧化磷酸化结构由五个复合物(复合物I-V)组成。电子从Krebs循环中间体(NADH和FADH2)进入复合物I或II，并被转移至复合物III，然后转移至复合物IV，并最后转移至O2。电子转移过程中释放的能量用于将H+从线粒体基质主动泵出至膜间隙，从而使内膜两侧产生H+电化学梯度，最终被复合物V利用生成ATP。然而，从电子传递链(ETC)，其大多是在复合物I和复合物III中，泄漏的一小部分电子与分子氧反应并产生超氧负离子，其可被转换成其他的活性氧物种。当ROS的产生压垮(overwhelms)内源性抗氧化系统，它们可能会损害各种细胞成分，包括蛋白质、脂质和核酸。ROS与老化和各种病理过程密切相关，并被认为是许多神经退行性疾病的主要元凶。有研究表明，许多神经病理性疾病状态中神经退行性病变产生的原因不是线粒体能量本身的缺陷，而是线粒体复合物阻滞所诱导的ROS过度生成。因此，线粒体靶向策略例如自由基清除剂、线粒体信号调节和电子传递链(ETC)成分补充已被广泛研究。令人失望的是，在临床试验中，这些神经保护策略在任何神经性疾病中均未被证明是成功的。
亚甲基蓝(MB)是杂环芳香族化合物(图9)，其具有多种生物和医学应用。它是FDA批准用于高铁血红蛋白血症的药物和氰化物中毒的解毒剂。以前的出版物表明，MB改善线粒体功能。本发明的实施方案中，MB和类似的化合物被用作在NADH和细胞色素c(cyt c)之间有效地运送电子的替代的电子载体。该过程改变了复合物I和III抑制作用上电子转移的路线，降低电子泄漏，并抑制ROS过度生成。MB在鱼藤酮诱导的帕金森病动物模型和大脑中动脉(MCA)闭塞诱导的缺血性中风动物模型中具有保护作用。
本发明涉及具有有益治疗活性的含有MB和类似化合物(如无色亚甲基蓝和乙酰亚甲基蓝)的组合物及其用途。本发明还涉及该组合物作为抗氧化剂和/或神经保护剂用于治疗与氧化应激和/或神经损伤(例如，神经系统疾病、病症和创伤)有关的医学疾病状态，并因而治疗CNS相关的疾病、病症和创伤的使用方法。
参考附图和附有的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明本发明之前，应该理解，本发明在其应用中不受下面说明书所列出的或实施例所举例说明的细节所限制。本发明能够是其它实施方案或以多种方式实践或进行。此外，还应该理解，本文使用的短语和术语是为了说明的目的，并且不应该认为是限制性的。
正如本文所讨论的，中枢神经系统(CNS)控制活的有机体的所有功能，从自主功能如呼吸、肠运动和反射到认知能力如学习、记忆以及其他心理功能，它是对任何电和化学失衡敏感的高度复杂的系统。本文所提及的这些失衡往往表现为神经退行性疾病和/或CNS相关的疾病、病症或创伤，其引起从轻微不适到完全受损和死亡的症状。
由活性氧物种引起的氧化应激代表了另一种与许多相同急性和慢性疾病和疾病状态相关的损伤机制。活性氧物种例如超氧自由基将引起细胞成分的氧化损伤，如细胞膜脂质的过氧化反应、转运蛋白的失活和线粒体能量产生的抑制。
工作实施例
动物和试剂：
将雄性Sprague-Dawley大鼠(230-250g)(Charles River，Wilmington，MA)在受控温度(22-25℃)和湿度(55%)下单独笼养。在7 a.m.至7 p.m期间用灯维持12小时的明暗循环。所有笼养和程序依照国家研究委员会的实验动物护理和使用委员会(the Institutional Animal Care and Use Committee of the National Research Council)的指导方针进行，并获得North Texas大学健康科学中心的动物护理和使用委员会(the University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee)批准。MB购自Akorn Pharmaceutics(Lake Forest，IL)。N-乙酰MB由Omm Scientific，Inc(Dallas，TX)合成。
含亚甲基蓝的组合物：
MB在分析化学中被广泛用作氧化还原指示剂。在pH 7.0，MB具有11 mV的非常低的氧化还原电位，并且在氧化和还原形式之间是非常有效的循环。已证明，MB能氧化NADH并在封闭系统中将一对电子从NADH转移至分子氧，并且即使在​​氧存在下，MBH2优先直接还原细胞色素c。这些化学数据表明，MB在ETC中也许能够作为电子载体发挥作用。
亚甲基蓝易溶于水(1 gm/25 ml)，并且因此可溶解于生理盐水，其在本文所述的动物研究中使用。该高水溶性允许其制剂在多种药学上可接受的载体中，包括片剂、胶囊栓剂、透皮贴剂、肌内和皮下注射溶液剂和静脉内溶液剂。
线粒体分离和线粒体呼吸链活性试验：
取出新鲜的大鼠心脏并放置在含210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、5 mM HEPES和1 mM EDTA，pH值为7的冰冷的线粒体分离缓冲液中。将心脏立即进行均质化，并如先前所述(Trounce等，1996)，通过差速离心分离线粒体部分。将线粒体贮存于-80℃直至随后的分析。
根据以前的出版物对复合物I(Lenaz等，2004)、复合物I-III、复合物II、复合物III和II-III(Trounce等，1996)进行最低限度的修改，进行所有线粒体活性试验。所有试验使用含磷酸钾pH 7.4(50 mM)、BSA 2.5mg/ml、MgCl2 5 mM、KCN(2mM)以及各种抑制剂或底物，包括鱼藤酮(6 μM)、抗霉素A(2 μM)、NADH(150 μM)、CoQ1(60 μM)、细胞色素c(50 μM)、琥珀酸盐(8 mM)和DBH2(100 μM)的类似预混液(master mix)。复合物I活性通过将NADH加入到有或无鱼藤酮/抗霉素A的混合液中进行监测。将最后的数据标准化至零时的空白值。反应采用动力学分光光度计在340 nm处进行监测。以任意单位测定复合物I活性，并标准化至对照水平进行统计分析。当较大量的线粒体(3至5倍)用于确定抑制是可辨别的时，除抑制剂的试验外，与40-200 µg线粒体蛋白质等值的分离线粒体用于每次试验。将最后的数据标准化至对照水平。对于复合物I-III的活性，反应开始于NADH的加入，细胞色素c被用作最终底物并在550 nm处监测其还原。对于复合物II-III活性的试验，加入琥珀酸盐而不是NADH，并且将电子转移至细胞色素c根据以前的出版物(Atamna等，2008)进行。为检测是否可以在线粒体裂解液中将电子从MB的还原形式(MBH2)转移至细胞色素c，我们将10 μM 2,7-二氯荧光素二脂(DCFH，Invitrogen，Carlsbad，CA)加入到反应体系。自由基将非荧光的DCFH转化为高荧光的DCF(Ex，488 nm和Em，530 nm)。在接受来自MBH2的电子的细胞色素c存在的情况下，DCFH向DCF的转化减少。
细胞活力试验：
将HT-22细胞(David Schubert博士，Salk Institute，San Diego，CA赠予)以每孔4000细胞接种于96孔板上并培养过夜。然后在各种浓度的MB存在或不存在的情况下，将细胞用溶媒(DMSO)、鱼藤酮(2-8μM)、抗霉素A(1-10μg/ml)或葡萄糖氧化酶(2-10 mU)处理24小时。24小时结束时，除去培养基并用PBS漂洗该板以及用10 μM钙黄绿素-AM(Invitrogen，Carlsbad，CA)/PBS孵育20分钟。使用激发/发射设置在485/530 nm的TECAN M200酶标仪(San Jose，CA)测定荧光。漂洗前用漂白剂处理的细胞培养孔作为空白使用。
Seahorse XF-24代谢通量分析
将HT22细胞以8,000/孔接种并在Seahorse XF-24板上进行培养。细胞在先前所描述的培养基和环境中生长24小时。在代谢通量分析当天，将细胞转移至无缓冲的DMEM(DMEM基础培养基，补充有25 mM葡萄糖、10 mM丙酮酸钠、31 mM NaCl、2 mM GlutaMax，pH 7.4)，并在37℃下在无CO2的孵育箱中孵育1小时。所有培养基和注射试剂在试验当天将pH调至7.4。在相继注射线粒体抑制剂前，进行耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的四个基线测量。在加入后续的抑制剂前，每次加入线粒体抑制剂之后读取箭头指示的具体读数。所使用的线粒体抑制剂为寡霉素(10 μM)、FCCP(1 μM)和鱼藤酮(5 μM)。OCR和ECAR通过Seahorse XF-24软件自动计算和记录。试验后，将板保存并测定各孔的蛋白读数以确认每孔相同细胞数。用变化值除以基线读数的平均值来计算相比于基础率的变化百分数。
线粒体超氧化物和细胞ROS分析：
用特定的荧光探针测量线粒体的特定超氧化物和细胞ROS。简言之，在100ng/ml MB存在或不存在的情况下，用溶媒或2 μM鱼藤酮处理HT-22细胞4小时。细胞发生分离，然后在37℃下，在含0.5%BSA和H2DCFDA(细胞ROS)或MitoSox(线粒体超氧化物)的预热PBS中孵育15min，然后用PBS洗涤。然后将细胞重新悬浮在补充的RPMI-1640中以进一步孵育。使用BDTM LSRII流式细胞仪，通过FITC通道(细胞ROS)或PE通道(MitoSox)对细胞进行分析。
MB对PD的鱼藤酮模型的影响：
将大鼠分为三组：对照动物接受溶媒输注和每日生理盐水注射(Veh/Sal N=6-8)；第二组接受5 mg/kg/天剂量的鱼藤酮输注和每日生理盐水注射(ROT/生理盐水 N=8-11)；和第三组接受鱼藤酮输注(5 mg/kg/天)和500 μg/kg/天剂量的MB注射(ROT/MB N=8-10)。溶媒或鱼藤酮通过充满溶媒或溶解在溶媒(等体积的二甲亚砜和聚乙二醇)中的鱼藤酮的Alzet渗透微型泵注入。含溶媒或鱼藤酮的泵用UV照射进行消毒并在背部皮下植入。用生理盐水或在生理盐水中稀释至500 μl最终体积的MB（500 μg/kg/天）进行腹膜内注射给药。最后给予MB或生理盐水治疗后四个小时，在第8天处死大鼠。
加速旋转棒表现：
加速旋转棒，一种发电机驱动的踏车(Omnitech Electronics，Columbus，OH)测量跑动协调性和运动表现。转子由水平安装在衬垫表面上方35.5 cm处的直径7 cm的尼龙圆筒组成。在给定的试验中，将大鼠置于圆筒上，圆筒旋转，并同时激活定时器开关。从0继续加速到最大44 rpm直至动物无法停留在旋转棒顶部并掉落到衬垫表面。如果它们没有掉落，在90秒时移去动物。当大鼠降落到表面，光敏开关跳闸且定时器停止。大鼠一天经受两个环节的该测试，每环节三个试验，共7个环节。每个试验之间有20分钟的休息期。每天的环节之间动物至少有两个小时的休息时间。记录在旋转踏车上的保持时间并作图进行分析。
神经系统评估：
三个不了解治疗条件的评估员进行神经系统评估。评估员从头开始训练直到他们在评估这些测试中的大鼠时产生一致的分数。随后，将实验对象随机化并分别呈现给评估员。每个环节由三项试验组成，单个评估员仅对一个试验中的大鼠进行评分；因此，每个动物的每个环节的最终得分是三个评估员的平均得分。类别包括：震颤、行动、运动迟缓、运动减退、姿势和总体的运动技能。在包括MPTP和6-OHDA模型的各种动物模型中根据以前的出版物对评分系统的细节进行了调整。具体的评定量表如下：
神经系统评估评分系统：
震颤：
0 不存在的
1 偶尔的或几乎检测不到的(老年动物是正常的)，活动时出现
2 频繁的或容易检测到的，活动或静止时出现
3 持续的或强烈的，活动或静止时出现
行动
0 流畅且对称地使用全部四肢
1 行走缓慢(老年是正常的)，明显的跛行
2 行走非常缓慢且用力，可拖动肢体
3 无法走动
运动迟缓
0 快速、精确的运动
1 动作轻度减慢(老年是正常的)
2 减慢刻意动作且发起运动时有明显损伤
3 无运动
运动减退
0 自由移动，警觉的、响应的
1 活动减少(老年是正常的)，移动不频繁(无激怒时)
2 最低限度的活动，激怒时移动
3 运动不能的(基本上无运动)
姿势
0 正常的姿势，能站立自如
1 简化的姿势(老年是正常的)，四肢分开站立，
2 弯腰的姿势、耸肩弓身的、双腿弯曲，常常倚靠在笼壁上
3 不能维持姿势，斜卧的
总体的运动技能
0 正常功能，能准确取回小物体
1 取回小物体的能力/频率下降
2 取回小物件很困难，很少使用
3 不能取回物体。
全身僵硬症测量：
全身僵硬症通过改编以前出版物的标准杆试验和悬挂实验进行测量。对于杆试验，将大鼠放置在表面上方9厘米处的水平杆上并用两只前爪抓住杆。每个动物从杆上撤走一只爪子的时间通过秒表进行手动测量。对于悬挂实验，将大鼠放置在垂直的金属丝网(25.5 cm宽和44 cm高且每根金属丝之间的间隔为1 cm)上，并使用秒表根据动物保持所有四只爪子在网上的时间长度来测定全身僵硬症。杆试验的最大下降潜伏期设置为300秒，而悬挂实验为60秒。
步幅长度的步态分析：
对于步态分析，将各个大鼠的前后爪分别涂上蓝色和红色染料。允许动物穿过吸水纸覆盖的直巷跑道(150 cm长，20 cm宽，20 cm高的不透明壁)进入暗室。试验前，将动物放置在暗室内2分钟以习惯于此环境，并对所有大鼠进行3次训练前奔跑。进行三次试验以获得每个动物的清晰的脚印。在跑道上延长停留或向后转向被认为是失败的试验。由两个独立的盲测观察员(blinded observers)对各个步骤的距离进行分析。每个动物的左和右的平均步幅距离用于统计分析。
组织收集：
神经系统评估和行为试验完成后，在甲苯噻嗪(20 mg/kg，i.p.)和开他敏(100 mg/kg，i.p.)诱导的麻醉下鱼藤酮输注的第8天处死大鼠。检查所有渗透泵的残留液以确保适当的药物输送。一个半球用4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定48小时直到切片处理。另一半球在液氮中快速冷冻，并在-80℃下保存直到提取用于生化分析。从一组单独的动物中解剖的纹状体用于单胺的HPLC分析。
单胺和代谢产物的HPLC分析：
为了测量单胺和代谢产物，从每个半球中解剖纹状体组织，称重，并储存在-80 ℃。为了HPLC分析，用9体积的含0.2 mM焦亚硫酸钠的0.1 M高氯酸超声处理组织样品，并在4 ℃下用台式离心机以15,000 rpm离心20分钟以清除碎片。将5 μL澄清上清液注入C18 HPLC柱，并在0.6 ml/min流速下用MD-TM流动相(ESA公司，Chelmsford，MA)通过等度洗脱分离。使用带有5014B型电池设置为+220 mV电位的ESA CoulArray电化学探测器检测神经递质的单胺和代谢产物。将峰面积与外标物的标准曲线进行比较以计算每mg组织中的多巴胺和代谢产物的量。
免疫组织化学：
大鼠半球依次在10％、20％和30％蔗糖中孵育过夜。然后在最佳切割温度下对大脑进行冷冻(VWR，San Francisco，CA)，并于低温恒温器中在冠状面上切片产生20 μm漂片（floating section）。对于单个的免疫组织化学研究，用5％正常山羊血清封阻20-μm切片，并在4 ºC下于一级抗体中孵育过夜。然后将切片用Picture Plus免疫组织化学试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行免疫染色。将3,3´-四氯化二氨基联苯胺(DAB)用于可视化切片。所用的一级抗体包括抗酪氨酸羟化酶(TH)的小鼠单克隆抗体(1:500)(Millipore，Billerica，MA)、单克隆抗泛素(1:800)(Millipore，Billerica，MA)和单克隆抗α-突触核蛋白(1:100)(Santa Cruz, Santa Cruz CA)。对于fluoro-jade B染色，根据制造商的方案(Millipore Billerica，MA)对各组大脑的多聚甲醛固定的脑切片进行染色。首先将载玻片浸渍在1％NaOH的80％乙醇中5分钟，然后在70％酒精中洗涤2分钟并在蒸馏水中洗涤2分钟。然后将载玻片转移到0.06％高锰酸钾溶液中10分钟以确保切片之间的背景抑制一致。然后用0.0004％ fluoro-jade B溶液将载玻片染色20分钟。TH和fluoro-jadeB的双标记通过免疫荧光完成。最初用fluoro-jadeB对切片进行染色，然后，用抗TH抗体(1:500；Chemicon)在室温下孵育1小时，并使用Alexa 594偶联的山羊抗小鼠IgG检测TH阳性细胞。为了对照，省略一级抗体。双染色切片用传统的荧光显微镜检查，并在连接带有分别可视化FITC、若丹明和DAPI的选择性过滤器装置的图像分析系统的Zeiss显微镜上捕获图像。DAB免疫染色切片用明视野显微镜进行可视化，并用彩色数码相机采集图像。
总ROS试验：
将冷冻的脑组织置于含蛋白酶抑制剂混合物的10倍体积/重量的冰冷PBS中(EMD bioscience Gibbstown，NJ)，并用polytron电力均质器迅速均质。等分试样以50,000 g超速离心30分钟。除去上清液，并使用荧光探针DCFH对总ROS含量进行分析。将DCFH溶于无水乙醇中并用PBS(pH 7.4)稀释至125 μM，并以25 μM的最终浓度加入到样品大脑提取物中，之后在37℃下孵育10分钟。使用激发/发射波长设定为485/530 nm的荧光计(TECAN M200酶标仪 San Jose，CA)测定荧光强度。以相对荧光强度(RFI)获得数据并标准化为对照的百分数。无大脑提取物的DCFH用作空白，并始终小于对照组的1％。
短暂性局灶性脑缺血：
短暂性局灶性脑缺血通过管腔内丝MCA闭塞来诱导(Liu等，2005)。简言之，暴露左颈内动脉(ICA)，并将3-0单丝尼龙缝线通过穿刺引入ICA管腔，并轻轻前进至远端ICA直到感觉到适当的阻力。1小时后，撤回缝线用于再灌注。再灌注后24小时，处死动物并获取大脑。在嗅球后方3、5、7、9、11、13和15mm将大脑进行切片。每个切片在2％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的生理盐水中孵育30分钟，然后用10％福尔马林固定。数字拍摄染色的切片用于测量缺血性病灶体积(Image-Pro Plus 4.1)。
统计分析：
对仅含MB的线粒体复合物活性、动物体重、多巴胺/5-HT水平和体内ROS的数据进行单因素ANOVA分析。对带抑制剂的线粒体I-III活性试验、带抑制剂的复合物II-III试验和细胞活力试验的数据进行双因素ANOVA分析(处理组和浓度)。对旋转棒试验和神经系统评估进行三因素ANOVA分析(组、环节/类别和表现)。当ANOVA检测到显著差异时，进行事后Tukey检验以识别组间的特定差异。值表示为均值±均值的标准误差(SEM)。两个指定样本之间，用学生-t-检验获得P值。p值<0.05用来表示差异有统计学显著性。在所有检测中*表示(P<0.05)，**表示(P <0.01)，***表示(P <0.001)。
在本发明的一个实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于通过增加耗氧率来提供治疗益处。在本发明的另一实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于通过减少糖酵解来提供治疗益处。先前已报道MB改善线粒体功能。在我们最初的实验中，我们使用Seahorse细胞生物能量分析仪检查MB对转化的海马HT-22细胞中线粒体呼吸和细胞糖酵解的影响。依次加入寡霉素(复合物V抑制剂)、FCCP(解偶联剂)和鱼藤酮(复合物I抑制剂)以证明ETC中的特殊作用位点。MB迅速增加OCR并保持所有处理的增强的功能(图1A)。两个小时孵育，MB剂量依赖性地使OCR从溶媒处理的264±10 pmol/min增加至10 μg/ml MB处理的594±19 pmol/min(图1B)，并使ECAR从溶媒处理的44±4 mPH/min减少至10 μg/ml MB处理的9±3 mPH/min(图1C)。此外，MB剂量依赖性减轻鱼藤酮诱导的OCR抑制(图1D)。
在本发明的另一实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于通过增加复合物I-III的活性来提供治疗益处。MB对线粒体 ETC复合物I-III的整体活性的影响在提取的线粒体中进行分析。MB剂量依赖性增强线粒体复合物I-III的活性，如通过从NADH至细胞色素c的增强的电子转移所证明的。在剂量增加的MB(0.1-1μg/ml)存在下，检测到复合物I-III的活性高达9倍的增加(图2A-B)。作为该机制的概念验证，用N-乙酰化修饰MB。该乙酰化阻断MB的氧化还原能力，并完全消除了MB对复合物I-III的作用。在特定的复合物III抑制剂(抗霉素A)(图2C)和特定的复合物I抑制剂(鱼藤酮)(图2D)存在下进行类似的试验。鱼藤酮和抗霉素A分别诱导了复合物I-III活性的90％和70％抑制。MB治疗剂量依赖性阻止抗霉素A和鱼藤酮的抑制作用。具体来说，在抗霉素A存在下，1 μg/ml MB使I-III的活性增加至对照水平的674±99％(图2C)。在鱼藤酮存在下，MB(1 μg/ml)使该活性增加至对照的118.1±6.4％(图2D)。另一方面，MB对复合物II-III的活性无显著影响，因为80％的活性被抗霉素A抑制(图7)。这些数据表明，MB积极参与线粒体中的电子转移过程。
在本发明的又一实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于通过改变复合物I和IIII之间的电子路线来提供治疗益处。进一步研究了MB对单个线粒体复合物I、II和III活性的影响。MB对单独的复合物II或复合物III活性无显著影响(数据未显示)。然而，发现MB是在线粒体复合物I中NADH脱氢酶的直接底物。在典型的复合物I活性试验中，CoQ1(一种复合物I的内源性底物)用于接收来自NADH的电子。这种酶促反应对鱼藤酮非常敏感(95％以上抑制)。该结果表明，MB可完全取代CoQ1作为直接底物接受来自NADH的电子，并将MB转化为其还原形式(MBH2)。这样的活性对鱼藤酮抑制相对不敏感(在最大鱼藤酮浓度时为26.7％)。也观察到，来自还原型MB(MBH2)的电子可进一步传递到细胞色素c。在该实验装置中，用DCFH作为探针以监测电子转移。无细胞色素c时，MB促进电子从NADH转移并增强DCFH探针的氧化。在细胞色素c存在时，MBH2将电子转移至细胞色素c而不是DCFH，从而导致DCFH氧化减少。细胞色素c的加入以剂量依赖的方式显著降低DCFH的氧化，表明MB的还原形式(MBH2)在线粒体中能够将电子转移至细胞色素c。
在本发明的一个实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于提供对细胞毒性的治疗益处。检测了MB治疗对HT-22细胞中线粒体氧化磷酸化抑制作用的影响。在所有检测的鱼藤酮浓度下观察到MB对鱼藤酮毒性(复合物I抑制作用)的显著保护作用。在鱼藤酮的最高浓度(8 μM)下，细胞存活从溶媒联合处理的25.4±1.6％增加至100 ng/ml MB联合处理的60.5±4.5％(图3A)。也发现了MB对不同浓度的复合物III抑制剂(抗霉素A)的显著保护作用。在测定的抗霉素A的最高浓度(25 μg/ml)下，无MB 时19.4±3.0％的细胞存活，而MB为10 ng/ml(26. 7 nM)时，观察到80.3±9.6％的细胞存活。MB为100 ng/ml(267 nM)时发现完全的保护(图3B)。
在细胞培养中，MB提供对ROS过度生成引起的线粒体抑制、线粒体功能障碍和细胞毒性的保护。鉴于高的酶效力和潜能，替代电子转移策略需要比传统的自由基清除剂低得多的神经保护作用浓度。一致地，MB的神经保护作用发生在对HT22细胞中谷氨酸盐毒性的EC50为0.1762 nM的非常低的浓度。因此，替代电子转移策略从根本上不同于传统的自由基清除剂途径。相反，它通过改变电子转移的路线并避开复合物I/III的抑制作用来避免ROS的生成。事实上，MB甚至在较高浓度下未能提供对过氧化氢的直接损害的保护。
此外，检查MB是否可作为直接的ROS清除剂起作用。葡萄糖氧化酶长期地氧化培养基中的葡萄糖以释放H2O2，从而导致细胞死亡。MB不能保护细胞免受该H2O2诱导的氧化损伤(图3C)；因此，MB本身不是直接的ROS清除剂。相反，在HT-22细胞中，当鱼藤酮用于产生线粒体特异性的超氧化物和ROS生成时，MB(100 ng/ml)几乎完全阻断线粒体超氧化物(MitoSox探针)和总的细胞ROS(DCFH2-DA)的增加(图3D-E)。
在本发明的一个实施方案中，含MB或类似化合物的组合物用于通过减轻神经退行性疾病的影响提供治疗益处。全身鱼藤酮输注用于建立PD的大鼠模型。该模型中MB的影响通过神经和行为评估、生化分析和神经病理评估来确定。鱼藤酮处理的大鼠遭受显著的体重减轻，这可通过MB治疗减轻(图4A)。发现鱼藤酮处理的大鼠有严重的运动缺陷(图4B)。在旋转棒试验中，接受溶媒的对照大鼠在早期环节显示出改善的表现。相比之下，ROT/Sal组自环节的开始(鱼藤酮输注后第5天)就显示出下降的表现，并在整个环节中均有较低的表现。事实上，对照组所看到的表现的改善被ROT/Sal组中逐步下降的表现所取代。MB治疗几乎完全阻止这些鱼藤酮诱导的缺陷(图4B)。在随机双盲的神经系统评估中，在鱼藤酮处理的动物中观察到所有类别的严重缺陷，其通过每个评估的较高得分得以证明。MB治疗显著改善鱼藤酮处理大鼠的所有神经系统评分(图4C)。
鱼藤酮输注五天后，通过使用杆和悬挂试验测量下降潜伏期对全身僵硬症进行测定。在这两项测试中，鱼藤酮处理的动物表现出明显的缺陷，这可通过MB治疗显著改善。具体来说，在杆试验中，与对照动物相比，鱼藤酮延长下降潜伏期，MB治疗完全逆转鱼藤酮引起的这种变化(图4D)。同样，在悬挂试验中，鱼藤酮明显减小掉落的潜伏期，这可通过MB治疗减轻(图4E)。在步态分析中，鱼藤酮明显减少步幅长度，这可通过MB治疗改善(图4F)。
对纹状体中多巴胺的水平、多巴胺代谢产物和5-HT进行分析。与对照组(Veh/Sal)相比，来自鱼藤酮处理组(ROT/Sal)的纹状体中的多巴胺水平(图5A)以及它的代谢产物，3,4-二羟基苯乙酸(L-DOPAC)(图5B)显著减少。一致地，这种多巴胺耗竭几乎被MB治疗完全拯救(图5A-B)。所有三组动物中5-HT水平无显著差异(图8)。这些结果证实了鱼藤酮诱导的多巴胺能系统中的选择性毒性。我们还检测了大脑提取物中的线粒体活性。在ROT/Sal组中发现复合物I-III的活性显著降低，这可通过MB治疗得以阻止(图5C)。我们将此理解为ROS诱导的复合物I/III损害的结果，正如以往的文献表明，复合物III在应激过程中是氧化磷酸化链的最敏感成分。我们还测量了大脑提取物中的总ROS，并发现与对照组相比，ROT/生理盐水组的ROS水平显著较高。在ROT/MB组，鱼藤酮引起的ROS增加也衰减至基础水平(图5D)。
组织学分析用于传统的PD病理学。在ROT/Sal组中，复合物I的抑制作用导致黑质纹状体多巴胺能神经元变性。在这一剂量和持续时间的鱼藤酮暴露情况下，动物黑质致密部的多巴胺能神经元表现出严重的损失，同时伴有不同程度的纹状体多巴胺能去神经支配。黑质多巴胺能神经元变性的动物是可变的并与它们的个体行为表现相关联。在11只鱼藤酮处理动物中，观察到有5只出现黑质中的TH阳性细胞接近完全丧失，余下的显示出不同程度的TH阳性细胞的损失。此外，在ROT/Sal处理动物中，腹侧被盖区(VTN)的TH染色表现出显著的神经纤维变性，与先前所观察到的发现类似。另一方面，在ROT/MB动物中，分别在SNC和VTN中观察到足够量的TH阳性细胞和神经纤维。
为确认多巴胺能神经元中TH染色和神经末梢的损失是由于神经变性，对来自这些动物的大脑切片进行fluoro-jade B组织化学。在Veh/Sal组或ROT/MB组中，均未发现fluoro-jade B阳性TH神经元。相反，11只ROT/Sal动物中，有4只在黑质区域观察到fluoro-jade B阳性神经元。我们进一步研究了TH双标记的fluoro-jade B阳性细胞。几乎所有的fluoro-jade B阳性细胞均为TH阳性神经元。总之，TH双标记和fluoro-jade B最终证实了鱼藤酮输注动物中黑质纹状体多巴胺能神经元的选择性变性，这几乎可被MB完全阻断。此外，观察到多巴胺能神经元变性的大鼠中泛素阳性的细胞质包涵物。这些包涵物经常簇生(clustered)在泛素阳性的细胞的细胞质中，与路易体(Lewy bodies)看到的那些类似。在我们的研究中，11只ROT/Sal大鼠中有6只显示泛素阳性聚集，而在对照组或ROT/MB组的任何动物均未发现该包涵体。
在大鼠短暂性MCA闭塞的缺血性中风模型中评估MB的神经保护作用。在脑缺血/再灌注损伤后24小时观察到大量的线粒体衰竭，表现为降低的ETC复合物I、III​和IV活性。通过改变电子转移的路线，其绕过复合物I和III的阻滞，500 μg/kg的MB单剂量显著降低缺血性病灶体积。
本发明的一个实施方案涉及MB或类似化合物使用替代电子转移以提供神经保护作用的用途。神经保护是一种旨在预防或减轻神经系统疾病中神经元变性和功能丧失的治疗途径。替代电子转移通过MB氧化还原循环绕过ETC复合物I和III的抑制作用，避免自由基的过度生成，并对慢性和急性神经系统疾病提供神经保护作用。在本发明的一个实施方案中，MB或类似化合物作为电子载体起作用，并提供沿ETC的替代电子转移，避免ETC阻滞所诱导的ROS过度生成，维持线粒体的功能和防止神经变性。在帕金森病的动物模型中，MB能够减轻鱼藤酮诱导的运动障碍和黑质多巴胺能神经元变性。在缺血性中风模型中，MB显著降低脑缺血再灌注损伤。体内研究表明，MB减轻多巴胺能神经元中复合物I抑制诱导的神经变性，并提供保护作用防止鱼藤酮诱导的帕金森样行为、神经化学和神经病理学特征。
本发明的一个实施方案涉及MB或类似化合物使用替代的电子转移作为治疗途径用于治疗线粒体功能障碍有关的神经系统疾病，如PD和中风的用途。在确定MB在ETC复合物活性中的作用时，MB作为替代的电子载体起作用。MB介导的电子转移对鱼藤酮或抗霉素A抑制均不敏感，表明MB为电子转移提供了替代路线。氧化还原循环(MB→MBH2→MB)完成后，来自NADH的电子以替代路线传递到细胞色素c，该路线对复合物I和III的阻滞不敏感。这种机制通过新合成的MB衍生物（N-乙酰化使氧化还原中心失效）进一步证实。乙酰-MB完全失去了其增强复合物I和III之间电子转移的能力。经由MB的替代电子转移防止复合物I/III抑制引起的“电子泄漏”，并避免了复合物I/III抑制过程中大量的ROS生成(图6)。
本发明的一个实施方案涉及MB或类似化合物用于治疗弗里德里希共济失调的用途。MB的存在大大改善了BSO对BSO诱导的FRDA成纤维细胞死亡的损伤作用，其在体外模拟弗里德里希共济失调的疾病状态。
本发明的另外实施方案涉及MB或类似化合物用于治疗线粒体功能障碍相关的神经系统疾病，如阿尔茨海默病的用途。MB补充膳食的长期喂养改善阿尔茨海默病的临床前动物模型的最大表现，并提高阿尔茨海默病的临床前动物模型的认知功能。
替代的电子转移策略阻止ETC复合物I和III的抑制引起的ROS过度生成，而不是中和自由基。此外，MB增加耗氧率并降低细胞外酸化率，从而预防再灌注期间过多的氧供给引起的超氧化物的产生。体内研究已证实，MB作为替代的电子载体显著降低短暂性局灶性脑缺血诱导的脑缺血再灌注损伤。
在本发明的一个实施方案中，亚甲基蓝衍生物在防止细胞死亡、ROS产生和线粒体膜电位瓦解中显示出不同的效力水平。如下表I所示，N-结构(N-motif)的侧链降低EC50约多达1000倍。
表 I
亚甲基蓝及其衍生物防止HT-22细胞中谷氨酸盐诱导的细胞死亡、ROS产生和线粒体膜电位瓦解的EC50
亚甲基蓝衍生物 防止细胞死亡(EC50) 防止ROS产生(EC50) 防止线粒体膜电位瓦解(EC50)
2-氯吩噻嗪 4.57 nM 84.1 nM 45.1 nM
吩噻嗪 19.0 nM 57.2 nM 21.2 nM
甲苯胺蓝 1.75 nM 0.106 nM 1.54 nM
亚甲基蓝 18.8 nM 20.4 nM 17.7 nM
氯丙嗪 2.19 μM 2.15 μM 3.27 μM
异丙嗪 2.06 μM 9.69 μM 214 nM
中性红 5.84 μM 15.8 μM 8.96 μM
亚氨基芪(Iminostilbene) 189 nM 484 nM 61.7 nM
丙咪嗪 51.9 μM 84.6 μM 29.1 μM
如图10所示，N-结构的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低该保护作用的潜能和效力。此外，S-结构(S-motif)也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。类似地，图11显示亚甲基蓝及其衍生物对HT-22细胞中谷氨酸盐诱导的活性氧物种产生的影响，显示N-结构的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低该保护作用的潜能和效力。此外，S-结构也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。图12显示MB及其衍生物对HT-22细胞中谷氨酸盐诱导的线粒体膜电位瓦解的影响，显示N-结构的侧链(氯丙嗪、异丙嗪、丙咪嗪)显著地降低该保护作用的潜能和效力。此外，S-结构也是至关重要的，由于将S替换为N(中性红)显著地降低该保护作用的潜能和效力。
如实施例部分所示，本发明的示例性组合物显示出成功地治疗和改善动物模型的CNS相关的实验疾病状态，即在鱼藤酮诱导的帕金森病动物模型和大脑中动脉闭塞诱导的缺血性中风动物模型中，通过减弱在其不同阶段的疾病进展，如由动物模型的病理状态的定性观察所测得的。
因此，本文所述的组合物的每一个可在本发明的任一方面以其药学上可接受的盐、前药、溶剂化物和/或水合物的形式被利用。
短语“药学上可接受的盐”是指母体化合物的带电荷物种及其反离子，其典型地用于改变母体化合物的溶解特性和/或减轻母体化合物对有机体的任何显著的刺激，同时不会消除所给予化合物的生物活性和性能。
术语“前药”是指在体内转变为活性化合物(活性母体药物)的药剂。前药典型地可用于促进母体药物的给予。它们可以例如通过口服给药而可被生物利用，而母体药物不能。与母体药物相比，前药在药物组合物中还具有高溶解性。前药还常常用于获得活性化合物在体内的持续释放。前药的实例(但不限于)将是具有一个或多个羧酸部分的亚甲基蓝化合物或类似物，其以酯形式(“前药”)给予。这种前药在体内被水解，由此提供游离化合物(母体药物)。所选择的酯可以影响该前药的溶解特性和水解速度。
术语“溶剂化物”是指可变化学计量(例如，二-、三-、四-、五-、六-等)的复合物，其由溶质和溶剂形成，使得溶剂不妨碍溶质的生物活性。合适的溶剂包括例如乙醇、乙酸等。
术语“水合物”是指上文所定义的溶剂化物，其中溶剂是水。
本文所述的组合物的有益特性使这种化合物非常适合用于治疗下面列出的若干医学疾病状态，所有所述医学疾病状态均涉及作为功能缺失的第一或决定性标志的线粒体功能障碍：
运动障碍：帕金森病(PD)；亨廷顿氏病；弗里德里希共济失调(FRDA)；共济失调毛细血管扩张症(AT)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；脆性X相关的震颤/共济失调综合征(FXTAS)
认知性痴呆：阿尔茨海默病；额颞叶变性；血管性痴呆；唐氏综合征；轻度认知障碍(MCI)和年龄相关的认知衰退。
快速损伤：脑外伤；脑中风和功能恢复；氰化物/单氧化物中毒
视觉系统疾病：青光眼；Leber遗传性视神经病变(LHON)；卡恩斯-塞尔综合征；进行性外眼肌麻痹(PEO)
外周疾病：心脏病发作；心力衰竭、糖尿病、感染/脓毒性休克
能量利用障碍：糖尿病、潮热、体重和食欲抑制；代谢综合征；例如因为潮热是由大脑不能吸收和利用葡萄糖作为能量来源而引起。结果是，重新指引(re-direct)线粒体内电子的化合物可能益于在绝经后的妇女中提供生物形式的能量ATP。
此外，本发明的组合物从而可以有益地用于治疗各种氧化应激相关的疾病或病症和/或相关的疾病状态，包括但不限于动脉粥样硬化、缺血/再灌注损伤、再狭窄、高血压、癌症、炎性疾病或病症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、炎性肠病(IBD)、皮肤和/或眼部炎症、关节炎、代谢疾病或病症和糖尿病。
本发明的组合物还可以有益地用于治疗各种CNS相关的疾病、病症或创伤和/或相关疾病状态，包括但不限于神经退行性疾病或病症、中风、脑损伤和/或创伤、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿氏病、帕金森病、阿尔茨海默病、自身免疫性脑脊髓炎、AIDS相关的痴呆、癫痫、精神分裂症、疼痛、焦虑、记忆损伤、认知和/或智力功能下降、行动和步态退化、改变的睡眠模式、减少的感官输入、自主神经系统不平衡、抑郁、痴呆、精神错乱、紧张症和谵妄。
如本文所用，短语“治疗有效量”描述将在某种程度上缓解一种或多种正在治疗的病症症状的正被给予的化合物的量，本文中该医学疾病状态如上文详述。更具体地说，治疗有效量是指可充分和有效预防、减轻或改善医学疾病状态的一些或全部症状或延长所治疗患者的存活的本发明组合物的量。
本文所述的组合物可例如通过口服、直肠、静脉内、心室内、局部、鼻内、腹膜内、肠、肠胃外、眼内、皮内、经皮、皮下、肌内、经粘膜、吸入和/或鞘内导管给药。
通过非常有益于治疗某些医学疾病状态，本文所述的组合物可有效地用于制备治疗上述医学疾病状态的药物。
在本发明的任一方面，可使用单独的或与任何其它活性剂组合的本文所述的组合物本身，或作为药物组合物的一部分来使用。
由此，根据本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含一种或多种上述组合物作为活性成分和药学上可接受的载体。
药物组合物可进一步包含能够治疗上文详述的医学疾病状态的其它活性成分。
如本文所用，“药物组合物”或“药物”是指一种或多种本文所述的组合物与其它化学组分(例如，药学上可接受的和合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是便于将化合物给予有机体。
下文中，术语“药学上可接受的载体”是指不会对有机体产生显著刺激、并且不会消除所给予化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。载体的实例(但不限于)为：丙二醇、环糊精、生理盐水、乳液和有机溶剂与水的混合物以及固体(例如，粉状的)和气体载体。
本文中，术语“赋形剂”是指加入到药物组合物中以进一步便于给予化合物的惰性物质。赋形剂的实例包括(但不限于)碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
在“Remington's Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co., Easton, Pa.)最近版本中可以得到配制和给予药物的技术，将其结合到本文中作为参考。
可以利用本领域众所周知的方法来制备本发明的药物组合物，例如，利用常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制备、研磨、乳化、形成胶囊、包埋或冷冻干燥方法。
由此，可以用常规方式使用一种或多种药学上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)来配制按照本发明使用的药物组合物，便于将亚甲基蓝化合物加工为可药学上使用的制剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。
对于注射，可以将本发明的组合物配制在水溶液中，优选配制在生理学相容的缓冲液中，例如Hank's溶液、Ringer's溶液，或含有或不含有机溶剂例如丙二醇、聚乙二醇的生理盐水缓冲液中。
对于经粘膜给药，在制剂中使用渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的。
对于口服给药，可以容易地通过亚甲基蓝或类似化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体混合来配制本发明的组合物。这种载体能够使本发明的组合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬浮剂等，用于患者口服摄入。口服使用的药理学制剂可以使用固体赋形剂制备，任选将得到的混合物研磨，并将颗粒的混合物加工(如果需要的话，在加入合适的助剂之后)，得到片剂或糖衣丸核。尤其合适的赋形剂是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理学上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
可以口服使用的药物组合物包括推入配合的明胶制成的胶囊剂，以及由明胶和塑化剂(例如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊剂。推入配合的胶囊剂可以含有活性组分与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选稳定剂的混合物。在软胶囊中，组合物可以溶解或悬浮在合适液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有的口服给药制剂应该具有适合于所选择的给药途径的剂量。口服给药制剂优选进一步包括保护涂层，以保护或减缓该制剂在GI道中的酶降解。
对于颊给药，组合物可以采取常规方式配制的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，根据本发明所使用的组合物可以方便地使用合适的喷射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)以来自加压的包装或喷雾器的喷雾制剂形式(其典型地包括粉状、液化和/或气态载体)提供。在加压喷雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送可计量的数量来确定。用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒可被配制成含有本发明的组合物和合适的粉末基质(例如但不限于乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以将本文所述的组合物配制为用于肠胃外给药，例如通过快速浓注或连续输注。注射用制剂可以被呈现于单位剂型中，例如安瓿或多剂量容器(任选加入防腐剂)。组合物可以是在油或含水溶媒中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以包含调配试剂，例如悬浮、稳定和/或分散剂。
肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的亚甲基蓝制剂的水溶液。另外，可以制备本发明组合物的悬浮液作为合适的含油注射悬浮液和乳液(例如，油包水型乳液、水包油型乳液或油包水型油乳液)。合适的亲脂性溶剂或溶媒包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯、甘油三酯、脂质体或Cremophor.RTM.和各种Cremophor类化合物(通过蓖麻油或其它油类与环氧乙烷以各种摩尔比反应所产生的非离子增溶剂和乳化剂)。含水注射悬浮液可以含有能够提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮剂也可以含有合适的稳定剂或能够提高组合物溶解性的试剂，以便制备高浓度溶液。
或者，组合物可以以粉末形式存在，在使用之前，与合适的溶媒(例如无菌无热原的水)进行组合。
本文所述的药物组合物还可含有合适的固体凝胶相载体或赋形剂。所述载体或赋形剂的实例包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
适合用于本发明背景的药物组合物包括这样的组合物：其中包含的活性成分数量可有效获得预定目的，在上文中描述为治疗有效量。
治疗有效量的确定恰好在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文所提供的详细公开内容来看。
对于在本发明的方法中所使用的组合物，可以从动物活性试验来初始估算治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中调配剂量(如接下来的实施例部分所示)以达到包括如活性试验所测定的IC50的循环浓度范围。
当然，给予的组合物的数量将取决于所治疗的患者、疾病的严重程度、给药方式、处方医生的判断等。
因此，根据本发明的优选实施方案，本文所述的药物组合物用于治疗医学疾病状态，其选自下列医学疾病状态组成的组：CNS相关的疾病或病症或创伤、氧化应激相关的疾病或病症、神经保护有益的疾病或病症和通过本发明的组合物可至少部分治疗的医学疾病状态。
在检查本文的实施例后，本发明的其它目的、优点和新特征对于本领域技术人员而言是显而易见的，其并不意图限制。另外，上文叙述的和下文权利要求书部分所要求保护的本发明各种实施方案和方面中的每一个得到说明书的支持。

Claims (14)

1.一种药物组合物，该组合物包含治疗有效量的可作为替代的电子载体起作用的化合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述化合物是亚甲基蓝。
3.权利要求1的组合物，其中所述化合物是亚甲基蓝类似物。
4.权利要求1的组合物，其中所述亚甲基蓝类似物是无色亚甲基蓝或乙酰亚甲基蓝。
5.权利要求1的组合物，除亚甲基蓝外还包含至少一种药学活性剂。
6.一种治疗患有至少一种神经退行性疾病状态的受试者的方法，该方法包括给予该受试者如1中所定义的组合物。
7.权利要求6的方法，其中该治疗与化合物对电子传递链的影响相关。
8.权利要求6的方法，其中至少一种神经退行性疾病状态选自帕金森病(PD)；亨廷顿氏病；弗里德里希共济失调(FRDA)；共济失调毛细血管扩张症(AT)；肌萎缩性侧索硬化症(ALS)；脆性X相关的震颤/共济失调综合征(FXTAS)、阿尔茨海默病；额颞叶变性；血管性痴呆；唐氏综合征；脑外伤；脑中风和功能恢复；氰化物/单氧化物中毒、轻度认知障碍(MCI)和年龄有关的认知衰退及其组合。
9.一种治疗患有至少一种视觉系统疾病的受试者的方法，该方法包括给予该受试者如1中所定义的组合物。
10.权利要求9的方法，其中至少一种视觉系统疾病选自青光眼；Leber遗传性视神经病变(LHON)；卡恩斯-塞尔综合征；进行性外眼肌麻痹(PEO)。
11.一种治疗患有至少一种外周疾病的受试者的方法，该方法包括给予该受试者如1中所定义的组合物。
12.权利要求9的方法，其中至少一种外周疾病选自心脏病发作；心力衰竭、糖尿病、感染/脓毒性休克。
13.一种治疗患有至少一种能量利用障碍的受试者的方法，该方法包括给予该受试者如1中所定义的组合物。
14.权利要求9的方法，其中至少一种能量利用障碍选自糖尿病、潮热、体重和食欲抑制；和代谢综合征。
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