IT202100006065A1 - Composto per l’uso nel metodo di trattamento delle malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi i, ii, iii della catena respiratoria - Google Patents

Description

COMPOSTO PER L?USO NEL METODO DI TRATTAMENTO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI DA DISFUNZIONE DEI COMPLESSI I, II, III DELLA CATENA RESPIRATORIA.

DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne un composto ciclatore redox per l?uso nel trattamento di una malattia selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria.

La presente invenzione riguarda inoltre una composizione farmaceutica comprendente tale composto ciclatore redox ed almeno un eccipiente e l?uso della suddetta composizione farmaceutica nel metodo di trattamento delle malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria.

STATO DELL?ARTE

I mitocondri sintetizzano l?ATP necessario per la maggior parte delle funzioni cellulari. Una riduzione della sintesi di ATP pu? essere dovuta ad un deficit funzionale dei componenti della catena respiratoria (RC), ossia i complessi I, II, III, IV (OXPHOS). Le malattie mitocondriali sono causate da difetti genetici che causano una riduzione del flusso di elettroni che porta alla riduzione della sintesi di ATP e danno luogo ad ulteriori alterazioni metaboliche, che caratterizzano la patofisiologia complessiva. I pazienti con deficit funzionale del complesso III (CIII) sviluppano scompensi neurologici multipli e progressivi e vanno incontro a morte prematura (Ghezzi, D. & Zeviani, doi:10.1042/ebc20170099). Tali difetti sono stati associati a mutazioni in parecchi geni (Ghezzi, D. & Zeviani, doi:10.1042/ebc20170099; Ghezzi, D. et al, doi:10.1038/ng.76; Bottani, E. et al, doi:10.1016/j.molcel.2017.06.001). Ad esempio, le mutazioni nonsenso e missenso in tre fattori, TTC19 (Ghezzi, D. et al. doi:10.1038/ng.761), LYRM7 (Invernizzi, F. et al. doi:10.1002/humu.22441) e BCS1L (De Lonlay, P. et al. doi:10.1038/ng706), causano difetti nell?assemblaggio/stabilit? e, conseguentemente, nell?attivit? funzionale del CIII, con diminuzione dell?attivit? ubichinolo:citocromo c ossidoreduttasica. Le mutazioni nonsenso nel gene che codifica la proteina TTC19 portano all?insorgenza di uno spettro sindromico eterogeneo, costituito da diversi segni di insufficienza neurologica (Ghezzi, D. et al. doi:10.1038/ng.76), fra cui encefalomiopatia progressiva, severi sintomi psichiatrici, sindrome di Leigh ed atassia cerebellare (Ghezzi, D. & Zeviani, doi:10.1042/ebc20170099; Ghezzi, D. et al, doi:10.1038/ng.761). In particolare, LYRM7 e BCS1L sono proteine di accompagnamento, o ?chaperon?, coinvolte nella biogenesi di CIII. Un piccolo numero di modelli animali che riepilogano le malattie da deficit di CIII sono stati utilizzati per studiarne la patofisiologia. Un modello di Drosophila melanogaster caratterizzato dall?ablazione (?knock-out?; KO) di TTC19 mostra una deficienza di attivit? CIII associata negli uomini a sintomi neurologici multipli (Ghezzi, D. et al. doi:10.1038/ng.761). Un modello di repressione trascrizionale di TTC19 (?knock-down?, KD) nel pesce zebra (zebrafish; Danio rerio) mostra alterazioni ovvie dello sviluppo e quindi della morfologia embrionale (Costa, R. et al. doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050) .

Recentemente ? stato ottenuto anche un topo KO per TTC19, che mostra una riduzione di circa il 50% dell?attivit? del complesso III e un fenotipo caratterizzato da progressiva neurodegenerazione con l?insorgenza di deficit motori multipli (Bottani, E. et al. doi:10.1016/j.molcel.2017.06.001). Pubblicazioni recenti descrivono come l?Ossidasi Alternativa (AOX) di Ciona intestinalis espressa in cellule con deficit di CIII e CIV (citocromo c ossidasi, COX) (Leveen, P. et al, doi:10.1002/hep.24031; Fernandez-Ayala, D. J. et al, doi:10.1016/j.cmet.2009.03.004) si sostituisca a CIII e CIV, trasferendo elettroni direttamente dal ?pool? ubichinonico all?ossigeno molecolare, senza ?pompare? protoni dalla matrice allo spazio intermembrana. Si ritiene che lo sblocco del flusso elettronico, ed il conseguente riavvio del pompaggio protonico da parte del CI, operato dall?espressione di AOX, possa aumentare la produzione di ATP in cellule con deficit di CIII o CIV (Fernandez-Ayala, D. J. et al. doi:10.1016/j.cmet.2009.03.004). Tuttavia, la possibile utilizzazione di AOX come terapia nei deficit di CIII o CIV ? controversa (Dogan, S. A. et al. doi:10.1016/j.cmet.2018.07.012).

Sono stati testati anche una serie di composti che stimolano la mitocondriogenesi promuovendo l?azione di PGC1-?, il principale coattivatore trascrizionale del programma biogenetico mitocondriale (Viscomi, C. et al, doi:10.1016/j.cmet.2011.04.011; Cerutti, R. et al, doi:10.1016/j.cmet.2014.04.001; Khan, N. A. et al, doi:10.1002/emmm.201403943). Fra questi AICAR, l?agonista di AMPK, agisce aumentando la fosforilazione di PGC1-?, modifica che ne promuove l?attivazione, e i livelli di nicotinamide riboside (NR), un precursore del NAD<+>, il substrato (e attivatore) di Sirtuina 1, una deacetilasi nucleare che a sua volta attiva PGC1-?. Tuttavia, la sua somministrazione non ha indotto un recupero della respirazione cellulare n? prolungato la vita di animali con deficit di CIII (Purhonen, J. et al. doi:10.1096/fj.201800090R), mentre la dieta chetogenica, anch?essa proposta come attivatrice della biogenesi mitocondriale, ha prodotto solo un modesto beneficio (Purhonen, J. et al. doi:10.1038/s41598-017-01109-4).

Scopo della presente invenzione quindi ? quello di fornire una classe di nuovi composti atti a determinare l?aumento della produzione di ATP nei deficit di CI-CIII che caratterizzano le malattie mitocondriali.

Ulteriore scopo della presente invenzione ? che tali composti presentino un buon profilo di sicurezza.

? anche scopo dell?invenzione fornire una composizione farmaceutica per l?uso nelle malattie mitocondriali da deficit di CI-CIII.

Questi scopi sono ottenuti mediante un composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile per l?uso nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria, in accordo con la rivendicazione indipendente 1.

In particolare, gli scopi dell?invenzione sono raggiunti dall?uso di un composto ciclatore redox con potenziale standard di riduzione compreso tra -0,15 e 0,25 Volt.

Gli scopi sono inoltre raggiunti da una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di almeno un composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile e, inoltre, dall?uso di tale composizione farmaceutica nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione del complesso I, II, III della catena respiratoria, in accordo rispettivamente alle rivendicazioni 15 e 16.

Ulteriori caratteristiche dell?invenzione vengono descritte nelle rivendicazioni dipendenti.

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione saranno evidenti dalla descrizione dettagliata di seguito riportata, e dagli esempi realizzativi forniti a titolo illustrativo e non limitativo.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

Come gi? detto, la presente invenzione riguarda un composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile per uso nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria.

Il composto ciclatore redox o un suo sale ha un potenziale standard di riduzione compreso tra -0,15 e 0,25 Volt.

Con il termine ?ciclatori redox? si intendono composti che effettuano cicli di riduzione e ossidazione, in particolare l?acquisizione di un elettrone (riduzione) per formare specie radicaliche che possono poi reagire con un accettore (ossidazione), rigenerando la molecola originale.

Come ? noto nell?arte, il potenziale standard di riduzione misura la propensione di una specie chimica o biologica ad acquisire o perdere elettroni mediante ionizzazione (Lu Y., Marshall N.M. https://doi.org/10.1007/978-3-642-16712-6_19). Una reazione ossidoriduttiva pu? infatti essere divisa in due semi reazioni: una in cui una specie chimica si ossida ed una in cui una specie chimica si riduce. Il potenziale standard di riduzione di un composto ? il potenziale misurato in condizioni standard mediante un elettrodo a idrogeno. Nei sistemi biologici, il potenziale standard di riduzione ? definito a pH 7, utilizzando un elettrodo ad idrogeno ad una pressione parziale di idrogeno di 1bar.

Senza voler essere legati ad alcuna teoria, dagli esiti delle sperimentazioni condotte, gli inventori ritengono che i composti ciclatori redox aventi un potenziale elettrochimico standard vicino a quello della coppia ubichinolo/ubichinone (Manago, A. et al. doi:10.1089/ars.2014.5979), siano in grado di accettare elettroni dall?ubichinolo e agire da ?trasportatori di elettroni? trasferendo tali elettroni al citocromo c e in parte, direttamente all?ossigeno. In tal modo viene aumentata la respirazione con conseguente miglioramento dei fenotipi legati alle malattie mitocondriali da deficit dei complessi I-III della catena respiratoria.

Secondo un aspetto dell?invenzione, si prevede di somministrare ad un soggetto affetto dalla malattia mitocondriale una quantit? terapeuticamente efficace del composto ciclatore redox o di un suo sale farmaceuticamente accettabile.

Preferibilmente, tale quantit? terapeuticamente accettabile ? tale da dare concentrazioni nominali sub-micromolari, sufficientemente basse da non causare un forte stress ossidativo.

Gli inventori hanno infatti scoperto che alte concentrazioni di composti ciclatori redox, in alcuni casi, possono causare stress ossidativo e risultare addirittura tossiche per l?organismo (Manago, A. et al. doi:10.1089/ars.2014.5979), come nel caso del composto piocianina (Jayaseelan, S. et al. doi:10.1007/s11274-013-1552-5) (descritta successivamente).

Sorprendentemente invece, l?uso di concentrazioni nel range sub micromolare, preferibilmente nell?intervallo di concentrazioni ?1?M, permette di aumentare la respirazione e migliorare i fenotipi clinici in vivo, come risulta chiaramente dagli esperimenti realizzati in moscerini della frutta e pesci zebra affetti da deficit in TTC19.

Preferibilmente inoltre, il suddetto composto ciclatore redox ? somministrato per via orale al soggetto.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? coniugato ad almeno un gruppo mitocondriotropico.

Tale coniugazione pu? essere di tipo reversibile o irreversibile.

Con il termine ?gruppo mitocondriotropico? si intende un?entit? chimica, solitamente un catione, in grado di dirigersi e concentrarsi nei mitocondri evitando modificazioni metaboliche durante il transito attraverso il citoplasma.

Preferibilmente, tale gruppo mitocondriotropico ? trifenilfosfonio.

Il trifenilfosfonio pu? essere coniugato al composto ciclatore redox mediante una catena appropriata (linker) come a titolo di esempio non limitativo, catene alifatiche, catene aromatiche, catene presentanti eteroatomi, come catene OEG/PEG ecc. La scelta della natura e della lunghezza della catena verosimilmente influenza il grado di idrofobicit? del coniugato ciclatore-gruppo mitocondriotropico.

Un esperto del settore ? in grado di valutare la natura e la lunghezza appropriata della catena al fine di ottenere un composto ciclatore coniugato che si possa accumulare in modo rapido e abbondante nei mitocondri, spinto dal potenziale di membrana mitocondriale e, inoltre, di scegliere il metodo pi? appropriato tra quelli noti (Leanza, L. et al. doi:10.1016/j.ccell.2017.03.003) per effettuare la coniugazione tra tale gruppo mitocondriotropico e il composto ciclatore redox dell?invenzione.

Non si esclude che, secondo varianti dell?invenzione, tale gruppo mitocondriotropico sia diverso dal trifenilfosfonio oppure che tale gruppo mitocondriotropico non sia presente.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? selezionato nel gruppo costituito da piocianina, blu di metilene, un naftochinone, azure C, azure B, azure A, indigo, indigo carmine, 2,6-dicloroindofenolo, 2-cloroindofenolo, indofenolo e blu di indofenolo. Il naftochinone ? scelto preferibilmente tra plumbagina e juglone.

Preferibilmente, il composto ciclatore redox ? selezionato nel gruppo costituito da piocianina, blu di metilene ed un naftochinone.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? piocianina.

La piocianina (PYO), nome IUPAC 5-metilfenazin-1-one, ? una molecola secreta dal batterio Pseudomonas aeruginosa, nota per essere una molecola tossica a concentrazioni elevate (50-100 ?M) e determinante stress ossidativo (Jayaseelan, S. et al. doi:10.1007/s11274-013-1552-5). Il basso peso molecolare e le caratteristiche zwitterioniche della PYO rendono questa molecola particolarmente idonea ad attraversare facilmente le membrane cellulari e la barriera emato-encefalica (Jayaseelan, S. et al. doi:10.1007/s11274-013-1552-5).

In particolare, gli inventori hanno sorprendentemente scoperto che basse concentrazioni <1?M di PYO non sono tossiche nelle cellule e in vivo e, al contrario, aumentano la respirazione e migliorano i fenotipi clinici e morfologici osservati in moscerini della frutta e pesci zebra affetti da deficit in TTC19.

Gli inventori hanno infatti scoperto che PYO pu? accettare elettroni sia da NADH che da ubichinolo e pu? a sua volta cedere elettroni, preferenzialmente al citocromo c, ma anche all?ossigeno molecolare. Ci? spiega in parte il rilascio di ROS mitocondriali e quindi la tossicit? di PYO quando usata ad alte concentrazioni.

Tuttavia, dagli esperimenti condotti dai richiedenti ? risultato che gli effetti stimolatori benefici sulla respirazione prodotti dalla PYO a concentrazioni <1?M prevalgono nettamente sull?induzione di ROS, portando ad un aumento di ATP fino al 300% in modelli in vivo di malattie mitocondriali dovute a disfunzioni dei complessi della catena respiratoria, in particolare disfunzione di CIII.

PYO ? risultata inoltre in grado di migliorare il profilo bioenergetico in fibroblasti ottenuti da cinque pazienti con disfunzioni in tre diversi fattori coinvolti nell?assemblaggio e/o nella stabilizzazione del complesso III, ossia TTC19, BSC1L e LYRM7.

Oltre che in questi sistemi cellulari, effetti benefici sono stati osservati anche in organismi completi come Drosophila melanogaster e Danio rerio.

PYO ha dimostrato inoltre di esercitare un effetto positivo sulla morfologia dei mitocondri, che ? strettamente legata all?efficienza bioenergetica di questi organuli.

Come visibile dalle figure, PYO causa un aumento dell?espressione di Mfn2, una proteina cruciale per la fusione mitocondriale, e associata all?attivazione del metabolismo mitocondriale.

L?induzione da parte di PYO sia di un aumento istantaneo della respirazione che di un effetto pi? duraturo e dilazionato (dopo tre giorni di trattamento), indica che basse concentrazioni non citotossiche di PYO possono promuovere il mantenimento dell?omeostasi mitocondriale, possibilmente mediante la blanda produzione di ROS e la conseguente attivazione della mito-ormesi. Un moderato stress ossidativo pu? inoltre indurre un aumento della fusione e biogenesi mitocondriali per ristabilire le appropriate velocit? di respirazione e di produzione di ATP, controllando in questo modo l?adattamento metabolico.

Il recupero delle funzioni mitocondriali grazie all?uso del composto ciclatore redox PYO ? evidenziato da: (i) stabilizzazione del potenziale di membrana, (ii) aumento dei livelli di Mfn2 e della fusione mitocondriale, (iii) aumento dell?espressione di PGC-1?.

Un aumento della biogenesi mitocondriale pu? avvenire anche attraverso l?effetto della PYO sulla segnalazione della via Wnt, visto che esso porta ad un aumento dei livelli di PGC1? (Dott, W. et al. doi:10.1016/j.redox.2013.12.028).

PYO ? dunque in grado di aumentare i livelli di ATP prodotto dal OXPHOS senza causare eccessivo stress ossidativo in cellule sia umane che di altri organismi.

Il meccanismo ipotizzato ? dunque che PYO recuperi la funzionalit? mitocondriale trasportando elettroni da NADH e/o ubichinolo al citocromo c ?saltando? il CIII, agendo quindi direttamente sulla produzione di ATP, mediante il ripristino dell?efficienza bioenergetica dei mitocondri.

Ancora vantaggiosamente, il trattamento a lungo termine di topi con basse concentrazioni di PYO non ha causato effetti tossici o aumento significativo di stress ossidativo.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? blu di metilene.

Il blu di metilene, nome IUPAC cloruro di 3,7-bis(dimetilammino)fenazationio, presenta potenziale standard di riduzione compreso tra -0,15 e 0,15?0,16 V.

Dissolto in soluzione acquosa esso ? considerato tradizionalmente un composto tossico utilizzato a volte nel trattamento della malaria.

I richiedenti hanno invece dimostrato (vedi figure) che l?uso di blu di metilene su fibroblasti umani da pazienti con mutazioni in TTC19 aumenta la produzione di ATP con miglioramento della funzionalit? della catena respiratoria.

Non si esclude che, secondo forme alternative dell?invenzione, il composto ciclatore redox sia il blu di metilene almeno parzialmente demetilato.

Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? un naftochinone.

Preferibilmente, tale naftochinone ? selezionato tra plumbagina e juglone.

Non si esclude che tale naftochinone sia diverso da quanto indicato purch? il suo potenziale standard di riduzione sia compreso tra -0,15 e 0,25.

A titolo di esempio da non considerarsi limitativo, altri composti ciclatori redox naftochinonici idonei all?uso della presente invenzione sono il 2,3-bis(2-idrossietiltio)naftalen-1,4-dione (NSC 95397) e il ?lapacone (2,2-dimetil-3,4-diidro-2H-benzo[h]cromene-5,6-dione).

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? plumbagina.

Plumbagina, nome IUPAC 5-idrossi-2-metil-naftalene-1,4-dione, ? un naftochinone avente potenziale standard di riduzione di circa -0,15. ? utilizzato tradizionalmente come farmaco antimalarico.

I richiedenti hanno scoperto che l?uso di plumbagina su fibroblasti umani da pazienti con mutazioni in TTC19 aumenta la produzione di ATP portando ad un miglioramento della funzionalit? della RC.

Secondo un altro aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox naftochinone ? juglone.

Lo juglone, nome IUPAC 5-idrossi-naftalen-1,4-dione, ? un composto organico aromatico presente in natura nella foglia, radice e corteccia di alberi della famiglia delle Juglandaceae e pu? essere ottenuto mediante tecniche note.

Il potenziale standard di riduzione dello juglone ? circa -0,09.

I richiedenti hanno scoperto che l?uso di juglone su fibroblasti umani da pazienti con mutazioni in TTC19 genera un aumento nella produzione di ATP conseguente al miglioramento della funzionalit? della catena respiratoria.

Secondo un aspetto della presente invenzione, il composto ciclatore redox ? un composto antrachinonico.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? azure C, il cui nome IUPAC ? 7-metiliminofenotiazin-10-io-3-amino cloruro. Il potenziale standard di riduzione di azure C ? circa 0,09 V. Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox dell?invenzione ? azure B, il cui nome IUPAC in inglese ? dimethyl-[7-(methylamino)phenothiazin-3-ylidene]azanium;chloride.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? azure A, il cui nome IUPAC in inglese ? (7-aminophenothiazin-3-ylidene)-dimethylazanium;chloride. Il potenziale standard di riduzione di azure A ? circa 0,06.

Azure A ? un derivato del blu di metilene, ed ? sotto valutazione come possibile farmaco per la malattia di Alzheimer.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? indigo, il cui nome IUPAC in inglese ? 2-(3-hydroxy-1H-indol-2-yl)indol-3-one.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? indigo carmine, il cui nome IUPAC in inglese ? disodium;2-(3-hydroxy-5-sulfonato-1H-indol-2-yl)-3-oxoindole-5-sulfonate. Il potenziale standard di riduzione di indigo carmine ? circa -0,13 V.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? scelto tra 2,6-dicloroindofenolo e 2-cloroindofenolo, preferibilmente 2,6-dicloroindofenolo. Il potenziale standard di riduzione di 2,6-dicloroindofenolo ? circa 0,217 V. Il potenziale standard di riduzione di 2-cloroindofenolo ? circa 0,23 V.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? indofenolo, il cui nome IUPAC ? 4-(4-idrossifenil)iminocicloesa-2,5-dien-1-one.

Secondo un aspetto dell?invenzione, il composto ciclatore redox ? blu di indofenolo, il cui nome IUPAC in inglese 4-[4-(dimethylamino)phenyl]iminonaphthalen-1-one.

? evidente dalla descrizione precedente e dagli esempi di seguito, che il composto ciclatore redox della presente invenzione ? particolarmente idoneo per l?uso nel metodo di trattamento delle malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria.

In particolare, tali malattie comprendono la sindrome di Leigh (LS), varie altre encefalomiopatie mitocondriali, mitocondriopatia con acidosi lattica ed episodi ictus-simili (MELAS), neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), cardiomiopatia e acidosi lattica infantile fatale, macrocefalia con leucodistrofia progressiva, encefalopatie non specificate, distonie, miopatie sporadiche o ereditate per via materna, sindrome da deficit di complesso SDH (SCD), sindrome da paraganglioma/feocromocitoma ereditario, sindrome da paraganglioma familiare, sindrome di Carney-Stratakis, atrofia ottica progressiva, atassia, miopatia, leucoencefalopatia infantile con mutazioni SDHAF1 e SDHB, miopatia con o senza mioglobinuria, tubulopatia, epatopatia ed encefalopatia, sindrome GRACILE, acidosi metabolica congenita, tubulopatia, insufficienza epatica, encefalopatia/encefalomiopatia, encefalopatia lentamente progressiva/insufficienza neurologica rapidamente progressiva, atassia cerebellare, displasia setto-ottica, epatopatia familiare e coma chetoacidotico, rabdomiolisi e mioglobinuria, epilessia, anemia, disturbi multisistemici, ipoacusia neurosensoriale mitocondriale, cardiomiopatia ipertrofica, malattia di Alpers-Huttenlocher, disordini neurologici da deficit del complesso III, epatopatia, cardioencefalomiopatia, leucodistrofia e tubulopatia.

Preferibilmente, il composto ciclatore redox dell?invenzione ? usato nel metodo di trattamento delle malattie mitocondriali da disfunzione del complesso III della catena respiratoria.

Tali malattie mitocondriali da disfunzione del complesso III preferibilmente comprendono miopatia con o senza mioglobinuria, tubulopatia, epatopatia ed encefalopatia, sindrome GRACILE, acidosi metabolica congenita, insufficienza epatica, encefalopatia/encefalomiopatia, encefalopatia lentamente progressiva/insufficienza neurologica rapidamente progressiva, sindrome di Leigh, atassia cerebellare, miopatia sporadica, displasia setto-ottica e cardiomiopatia.

Fa parte della presente invenzione anche una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di almeno un composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile, come definito precedentemente, comprese le varianti, ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

Con il termine "eccipiente farmaceuticamente accettabile" si intende un composto o una sua miscela ottimale per l'utilizzo in una composizione allestita per il trattamento e/o la prevenzione di una malattia, in particolare delle malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria.

Eccipienti idonei a tale utilizzo sono edulcoranti, diluenti, disaggreganti, glidanti, coloranti, leganti, lubrificanti, stabilizzanti, adsorbenti, conservanti, tensioattivi, umettanti, aromi, ammorbidenti, sostanze filmogene, emulsionanti, bagnanti, ritardanti di rilascio, colloidi, composti non permeanti e loro miscele, e altri di per s? noti nel settore farmaceutico.

L?esperto del settore ? in grado di stabilire se e quanto determinati eccipienti farmaceutici possano servire ad una o pi? funzioni in relazione a quanto essi siano presenti nella composizione, a quali altri eccipienti siano presenti e alla via di somministrazione della composizione.

Preferibilmente, la composizione farmaceutica della presente invenzione ? formulata in una forma adatta alla somministrazione orale.

Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione orale sono compresse, capsule, polveri, sciroppi, elisir, sospensioni, soluzioni, emulsioni, bustine e cachets o formulazioni adatte per inalazione come aerosol, soluzioni o polveri.

Non si esclude che la composizione della presente invenzione sia formulata in una forma adatta alla somministrazione parenterale.

Esempi non limitativi di una forma adatta alla somministrazione parenterale sono soluzione tampone acquosa e sospensione oleosa. Si specifica che per somministrazione parenterale si intende la somministrazione per via intramuscolare, endovenosa, intradermica, sottocutanea, intraperitoneale, intrasplenica.

Secondo un aspetto dell?invenzione, la composizione farmaceutica ? usata nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione del complesso I-III della catena respiratoria, preferibilmente tra le malattie mitocondriali da disfunzione del complesso III della catena respiratoria.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

- Figura 1: Concentrazioni subletali di piocianina recuperano la produzione di ATP e la respirazione cellulare in fibroblasti embrionali murini privi del fattore TTC19 di assemblaggio del CIII. 1A) La vitalit? di MEF TTC19<+/- >e <-/- >? stata valutata mediante saggio MTS dopo 24 ore di trattamento, per determinare l?intervallo utile di concentrazioni sub-letali di PYO. Staurosporina 4 ?M ? stata usata come controllo positivo. Sono presentate medie di percentuali ? SEM (errore standard della media) dell?assorbanza di MTS misurata a 490 nm, riferite al controllo non trattato (n=9). 1B) Velocit? di riduzione di citocromo c (espressa come ?A550nm) in mitocondri isolati in cui i complessi I, III e IV sono inibiti da rotenone (2 ?M), antimicina A (2 ?g/ml), e NaN3 (2,5 mM) rispettivamente. PYO ? stata aggiunta, alle concentrazioni indicate, dopo l?aggiunta di decilubichinolo (75 ?M). La velocit? di riduzione del citocromo c in presenza di PYO ? stata normalizzata rispetto alla velocit? in condizioni di controllo, presa come riferimento (1,0) (n=5 per ogni concentrazione di PYO; sono mostrati i valori medi ? SEM). Gli asterischi denotano differenze statisticamente significative. 1C) La velocit? di consumo d?ossigeno (Oxygen Consumption Rate, OCR) di MEF TTC19<+/- >e <-/- >misurata in presenza di PYO 1,5 ?M (valori medi ? SEM, n=3). I valori sono stati rapportati alla respirazione basale registrata prima dell?aggiunta di PYO, considerata come 100%. 1D) I parametri bioenergetici sono stati calcolati usando valori di OCR misurati dopo l?aggiunta sequenziale di modulatori della funzione mitocondriale: oligomicina (2 ?g/ml); FCCP (600 nM); antimicina A (1 ?M)(n=3). 1E) Quantificazione dell?attivit? del complesso respiratorio III in mitocondri isolati da MEF TTC19<+/- >e <-/->. L?attivit? del CIII ? stata valutata in condizioni basali e in presenza di PYO, e normalizzata all?attivit? della citrato sintetasi (medie ? SEM, n=3). 1F) OCR misurata su MEF TTC19<+/- >e <-/- >per paragonarne le capacit? respiratorie basali. I valori sono medie ? SEM (n=8). 1G) L?OCR ? stata saggiata in MEF TTC19<+/- >per valutare la capacit? della PYO di recuperare la respirazione cellulare dopo l?inibizione di CIII con Antimicina A. I valori sono stati rapportati alla respirazione basale misurata prima dell?aggiunta di Antimicina A, posta come 100% (medie ? SEM; n=4). 1H-J) Livelli di OCR misurati in campioni di fegato di topi TTC19<wt >e <-/->. La capacit? della PYO di aumentare l?OCR ? stata valutata sia in condizioni basali (1H) che dopo il completo blocco di CIII con Antimicina A (1J) (medie ? SEM; n=3). 1K) Il contenuto di ATP di origine mitocondriale ? stato misurato in MEF TTC19<+/- >e <-/- >dopo trattamento con PYO. Preparazioni trattate con oligomicina sono state usate come controlli. Lo stesso numero di cellule adese ? stato trattato in mezzo di coltura fresco contenente 5,5 mM 2-deossiglucosio (2DG) invece di glucosio, per inibire la glicolisi. I valori sono presentati come percentuale del segnale emesso dalla luciferasi in cellule MEF TTC19<+/->, per paragonare le quantit? di ATP di origine mitocondriale nelle due linee cellulari. I dati sono medie ? SEM (n=4-5). Per tutti i pannelli ? stata calcolata la significativit? statistica delle differenze (ANOVA o t-test di Student; *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001).

- Figura 2: Concentrazioni subletali di piocianina non sono tossiche in vitro. 2A) La produzione mitocondriale di ROS da cellule MEF TTC19<+/- >(a sinistra) e <-/- >(a destra) ? stata determinata misurando l?intensit? della fluorescenza di MitoSox<?>. Le cellule sono state trattate o meno con 1,5 ?M PYO. Antimicina A e Rotenone sono stati usati come controlli positivi per la produzione di ROS. I valori sono espressi come percentuale del valore basale di fluorescenza misurato prima delle aggiunte, e sono mostrati come medie ? SEM (n=4). 2B-C) Quantificazione della perossidazione lipidica osservata in MEF TTC19<+/- >e <-/->, trattati o meno con 1,5 ?M PYO per 72 h (2B) o per 2 mesi (2C). Idroperossido di cumene (2C) ? stato usato come controllo positivo. Medie ? SEM (n=11-14 campi da 3 diverse repliche biologiche). 2D-E) Quantificazione dell?ossidazione di proteine rilevata mediante Oxyblot in MEF TTC19<+/- >e <-/->, trattati o meno con 1,5 ?M PYO per 72 h (2D) o 2 mesi (2E) (medie ? SEM, n=3). 2F) Il potenziale mitocondriale di MEF TTC19<-/- >? stato determinato monitorando l?intensit? della fluorescenza di TMRM dopo aggiunta di 1,5 ?M PYO. I valori sono espressi come percentuali della fluorescenza basale misurata prima dei trattamenti e sono medie ? SEM (n=4).

- Figura 3: PYO migliora la morfologia mitocondriale in fibroblasti embrionali di topo TTC19<-/->. 3A) Immagini TEM rappresentative. MEF TTC19<+/- >e <-/- >non trattati o trattati per 72 ore con 1,5 ?M PYO. Dopo i trattamenti, le cellule sono state fissate, le immagini sono state acquisite, e l?area sezionale media di 400 mitocondri ? stata calcolata per ognuna delle linee cellulari e condizioni usando il programma Image J. La quantificazione ? presentata nella parte destra della figura. 3B-C) Espressione delle proteine Mitofusina 2 (3B) e PGC1 alfa (3C) immunovisualizzata mediante Western Blot. MEF TTC19<+/- >e -/- non sono stati trattati o sono stati trattati per 24, 48 o 72 ore con 1,5 ?M PYO come illustrato in figura. Nella parte superiore si riporta la quantificazione per densitometria (medie ? SEM) da 4-8 esperimenti indipendenti, mentre la parte inferiore mostra WB rappresentativi. Come controllo di caricamento sono state usate Na<+>K<+ >ATPasi, ?-actina o Vinculina. 3D) La PYO aumenta significativamente il segnale Wnt in un ceppo reporter di pesce zebra esposto a 100 nM PYO, una concentrazione non letale, per 24 ore (n?30). Per tutti i pannelli ? stata calcolata la significativit? statistica delle differenze (ANOVA o t-test di Student; *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001).

- Figura 4: PYO aumenta la respirazione e la produzione di ATP, e porta al recupero della morfologia mitocondriale in fibroblasti umani da pazienti con mutazioni nel gene TTC19. 4A) Saggi di vitalit? (MTS) sono stati eseguiti su fibroblasti umani normali e fibroblasti da un paziente affetto da mutazione del gene TTC19 (fibroblasti umani, pt#1). Le cellule sono state trattate con o senza diversi dosaggi di PYO per 24 ore per determinare quale fosse la massima concentrazione di PYO senza effetti negativi sulla sopravvivenza cellulare. Staurosporina 4 ?M ? stata usata come controllo positivo. I dati sono riportati come medie ? SEM di percentuali di assorbanza MTS a 490 nm rispetto al campione non trattato, indicato nel grafico come ?ref? (n=3-4). 4B) Il contenuto di ATP di origine mitocondriale ? stato misurato in fibroblasti umani normali e in fibroblasti di pazienti dopo trattamento con PYO. L?oligomicina ? stata usata come controllo. Le cellule sono state trattate per 1 ora in mezzo fresco in cui il glucosio era stato sostituito con 5,5 mM 2-deossiglucosio (2DG) per inibire la glicolisi. I valori sono riportati come percentuali del segnale della luciferasi rispetto ai fibroblasti umani normali non trattati (in grigio). I valori sono medie ? SEM (n=4-5). 4C) La velocit? del consumo d?ossigeno (OCR) ? stato misurato in fibroblasti da pazienti. I dati sono stati rapportati alla respirazione basale misurata prima dell?aggiunta di antimicina A, posta come 100%, e sono medie ? SEM (n=3).

- Figura 5: PYO recupera la morfologia mitocondriale in fibroblasti umani da pazienti con mutazioni nel gene TTC19, senza causare tossicit? ossidativa. 5A) Quantificazione delle immagini TEM di fibroblasti umani normali e di fibroblasti dal paziente #1, non trattati o trattati per 72 ore con 0,8 ?M PYO. Analisi eseguita come in 3A.

- Figura 6: Caratterizzazione di moscerini dTTC19 KO trattati con PYO. 6A) I livelli totali di ATP sono stati misurati in moscerini maschi di 5 giorni (dTTC19 KO) e in controlli (w<1118>), dopo 12 o 24 ore di digiuno (3 gruppi di 10 individui ciascuno). La differenza fra KO e controlli ? risultata significativa per il digiuno di 24 ore (**p<0,01). 6B) La tossicit? della PYO ? stata valutata in moscerini maschi selvatici (w<1118>) dopo iniezione di PYO (da 1,0 a 200 pmol) nell?emolinfa (50 individui in gruppi di 10). La percentuale di sopravvivenza ? stata valutata a 24, 48 e 72 ore dopo l?iniezione. 6C) I livelli di ATP totale sono stati misurati in moscerini di 5 giorni di controllo (w<1118 >e dTTC19 KO) o trattati con PYO (w<1118 >PYO e dTTC19 KO PYO), dopo 24 ore di digiuno (3 gruppi di 10 individui ciascuno). Il trattamento con PYO ha riportato al livello del controllo w<1118 >la produzione di ATP nei moscerini dTTC19 KO (t-test di Student: **p<0,01). 6D) PYO induce un parziale recupero della sensibilit? allo stress meccanico (?bang sensitivity?) in moscerini di 12 giorni con attivit? locomotoria compromessa. La sensibilit? al test di ?bang sensitivity? ? stata valutata in moscerini KO di 12 giorni dopo iniezione di 1 pmol PYO (dTTC19 KO PYO) e paragonata a quella dei controlli (w<1118>; moscerini w<1118 >di controllo per l?iniezione, e moscerini dTTC19 KO di controllo per l?iniezione). n?80 individui maschi per genotipo. Le percentuali di moscerini (e gli intervalli di confidenza, CI, al 95%) che raggiungono le quote-soglia (2,8, 5,6, 8,4, 11,2 cm) sono mostrate per i genotipi menzionati, con e senza iniezione di PYO. 6E) La tossicit? di iniezioni ripetute (1 pmol di PYO o soluzione di controllo per iniezioni) ? stata valutata in moscerini maschi selvatici w<1118 >(60 individui). La percentuale di moscerini sopravvissuti ? stata determinata a 24, 48 e 72 ore dopo la seconda iniezione.

- Figura 7: Caratterizzazione di pesci zebra KO per TTC19 trattati con PYO. 7A) La velocit? di consumo d?ossigeno (OCR) ? stata analizzata in pesci zebra CtrlMO (morfolino di controllo), KD TTC19 e KD TTC19 trattati con 100 nM PYO. La capacit? respiratoria di pesci di 72 hpf (hours post-fertilization) ? stata analizzata con la tecnologia Oxygraph. Valori di ?[pmolO2] /pesce x min per i pesci CtrlMO, Ttc19spMO e Ttc19spMO trattati, rispettivamente. Per l?analisi statistica si ? usato il t-test per dati indipendenti (*=p<0,05, **=p<0,01). Le barre indicano l?errore standard della media (SEM).

7B) Sopravvivenza di pesci zebra di 72 hpf in funzione della concentrazione di PYO. I pesci sono stati esposti al farmaco, alle concentrazioni indicate, per 24 ore. Sono state valutate la vitalit? e la risposta evocata dal tocco (ETR). 7C) Saggi di fuga evocata dal tocco in pesci zebra di 72 hpf. La valutazione dei movimenti degli embrioni ? stata effettuata misurando la distanza (cm) fra le posizioni iniziale (centro della piastra di Petri) e finale dell?embrione considerata come distanza lineare percorsa partendo dal centro. Analisi statistica: t-test per dati indipendenti (*=p<0,05, ***=p<0,001). Il grafico riporta medie e mediane. 7D) Tracciati dei movimenti di 40 pesci/piastra di Petri (cerchio). I pesci sono stati posti al centro della piastra e stimolati con un tocco alla coda. Quelli trattati con 100 nM PYO mostrano un parziale recupero del movimento. 7E) La riduzione dell?espressione (knock-down) di TTC19 induce accorciamento del corpo e malformazione della coda in paragone a controlli fraterni non trattati. PYO 100 nM, somministrata nell?acqua a 12 hpf, determina un parziale recupero delle malformazioni e diminuisce la mortalit?. 7F) Il Sistema nervoso periferico ? stato studiato in Tg(mnx1:mGFP), in cui la GFP colora specificamente i motoneuroni in vivo. La repressione trascrizionale di TTC19 riduce l'espressione di GFP e il numero di motoneuroni nella regione dell'estensione del tuorlo (N/Area). L'aggiunta di PYO non complementa questi parametri deficitari. Tuttavia PYO aumenta lo sviluppo assonale rispetto a embrioni trattati con DMSO. I valori sono medie ? SEM. Quantificazione del numero e lunghezza dei motoneuroni nella regione dell'estensione del tuorlo sono mostrati in figura. I numeri degli embrioni manipolati e il numero dei motoneuroni contati in ciascuna condizione sono presentati nell'immagine. La significativit? statistica ? stata determinata mediante t-test di Student a due code (*= p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001).

- Figura 8: PYO non ? tossica in vivo per topi selvatici. 8A) Effetto della PYO (10 nmol/gpc) sul peso corporeo dei topi. Misure settimanali del peso dei topi (grammi). Si mostrano le medie ? deviazione standard (SD). Topi C57BL6/J maschi (n=4) e femmine (n=4). 8B) I livelli plasmatici di citochine infiammatorie (TNF-?, IL-1?, IL-6) non sono significativamente alterati dal trattamento con piocianina 10 nmol/gpc. Sono messi in grafico i dati individuali. Le barre indicano le medie ? SEM. 8C) Immagini TEM rappresentative di sezioni di fegato di topi non trattati o trattati con PYO (10 nmol/gpc). Non sono state riscontrate alterazioni visibili a carico di nuclei, mitocondri, reticolo endoplasmico e altri organuli. La barra dimensionale (scala) ? presente in ogni foto.

- Figura 9. PYO aumenta l?efficienza energetica nei fibroblasti di due ulteriori pazienti con mutazioni in TTC19. 9A) L?ATP di origine mitocondriale ? stato misurato in fibroblasti dai pazienti #2 (n=11 repliche biologiche indipendenti) e #3 (n=7 repliche tecniche biologiche indipendenti) dopo trattamento con PYO. 9B) La produzione mitocondriale di ROS da fibroblasti dei pazienti #2 e #3 ? stata determinata misurando l?intensit? della fluorescenza Mitosox<?>. I dati sono medie ? SEM (n=4 repliche biologiche indipendenti).

- Figura 10. PYO aumenta l?efficienza bioenergetica in fibroblasti di un paziente con mutazione omozigote patogena di LYRM7. 10A-B) ATP di origine mitocondriale ? stato misurato in fibroblasti umani di controllo e in fibroblasti da un paziente portatore di una mutazione omozigote nel gene codificante LYRM7 (paziente #4), con o senza trattamento con PYO. Cellule trattate con oligomicina sono state usate come controlli. Le cellule sono state trattate per un?ora in un mezzo fresco in cui il glucosio ? stato sostituito da 5,5 mM 2-deossiglucosio (2DG). I valori sono riportati come percentuali del segnale luciferasico rispetto a fibroblasti umani di controllo non trattati (in grigio) (n=4 repliche biologiche indipendenti). I valori sono medie ? SEM. 10B) La OCR da fibroblasti del paziente #4 ? stata misurata in presenza o assenza di 0,8 ?M PYO. I valori sono stati normalizzati contro la respirazione basale registrata prima dell?aggiunta del composto, preso come valore pari al 100%, e sono medie ? SEM (n=3 repliche biologiche indipendenti). La respirazione massima ? riportata a destra nella figura. I valori sono medie ? SEM con riferimento al campione non trattato (n=3 repliche biologiche indipendenti).

- Figura 11. PYO recupera la funzione mitocondriale in fibroblasti di un paziente con una mutazione omozigote patogena di BCS1L. 11A) Saggi MTS di vitalit? sono stati eseguiti su fibroblasti umani da un paziente portatore di una mutazione omozigote nel gene BCS1L (paziente #5), come nella figura 4A. 11B) L'ATP mitocondriale ? stato misurato in fibroblasti umani di controllo e in fibroblasti dal paziente #5, come nella figura 4B. I valori sono medie ? SEM (n=5 repliche biologiche indipendenti). 11C) Respirazione stimolata di fibroblasti del paziente #5. I valori sono medie ? SEM riferite ad un campione non trattato (n=4 repliche biologiche indipendenti). 11D) Immunovisualizzazione mediante Western blot e quantificazione relativa dei livelli di espressione delle proteine indicate in fibroblasti umani di controllo e in fibroblasti del paziente #5, trattati e non trattati con 0,8 ?M PYO per 72 h (medie ? SEM, per anti-PGC1? n=4 repliche biologiche indipendenti, per anti-catalasi n=6 repliche biologiche indipendenti, anti-SOD-1 n=5 repliche biologiche indipendenti).

- Figura 12. Effetti della plumbagina, dello juglone e del metilene blu. La vitalit? di MEF TTC19<+/- >e MEF TTC19<-/- >? stata valutata mediante saggio MTS dopo 24 ore di trattamento, per determinare l?intervallo utile di concentrazioni sub-letali di plumbagina (12A), juglone (12D) e blu di metilene (12G). Staurosporina 4 ?M ? stata usata come controllo positivo. I valori riportati sono medie di percentuali ? SEM (errore standard della media) dell?assorbanza di MTS misurata a 490 nm, riferite al controllo non trattato. 12B, 12C, 12E, 12F, 12H) Il contenuto di ATP di origine mitocondriale ? stato misurato in MEF TTC19<+/- >e MEF TTC19<-/- >dopo trattamento con plumbagina (12B, 12C), juglone (12E, 12F) e blu di metilene (12H). Oligomicina ? stata usata per controllo. Lo stesso numero di cellule adese ? stato trattato in mezzo di coltura fresco contenente 5,5 mM 2-deossiglucosio (2DG) invece di glucosio, per inibire la glicolisi. I valori sono presentati come percentuale del segnale emesso dalla luciferasi in cellule MEF TTC19<+/->, per paragonare le quantit? di ATP di origine mitocondriale nelle due linee cellulari. I dati sono medie ? SEM.

ESEMPI

Gli esempi seguenti vengono riportati al fine di fornire all?esperto del settore una completa pubblicazione e descrizione di come i composti e le composizioni della presente invenzione sono stati valutati. Tali esempi sono da intendersi puramente esemplificativi e non limitativi. Esempio 1. Materiali e metodi

Esempio 1.1. Reagenti

Piocianina, oligomicina, staurosporina, rotenone, antimicina A, NaN3, FCCP sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. Tutti i composti sono stati sciolti in DMSO. Per gli esperimenti su Drosophila melanogaster la piocianina ? stata sciolta in EtOH. Per ogni lotto, la concentrazione di piocianina ? stata controllata mediante analisi HPLC.

Esempio 1.2 Colture cellulari

Le varie linee cellulari sono state coltivate in DMEM, supplementato con 10% siero fetale bovino, 10 mM HEPES, 100 U/ml penicillina e 100 U/ml streptomicina, 1X amminoacidi non essenziali. Le cellule di pazienti sono state ottenute dalla BioBanca dell?Istituto Besta, Milano. Tutte le cellule sono state mantenute a 37?C in un?atmosfera con 5% CO2.

Esempio 1.3 Stock di moscerini e loro mantenimento

I moscerini sono stati allevati con una dieta standard di farina di mais, a 23?C, 70% umidit? relativa, con un ciclo di 12 ore luce/buio (LD 12:12). Per gli esperimenti di digiuno, i moscerini sono stati mantenuti su 1% agar. La linea mutante dTTC19 KO ? stata generata eliminando l?intera sequenza codificante (CDS) del gene CG15173 usando il sistema CRISPR/Cas9 (WellGenetics, Taipei City, Taiwan). Il ceppo per iniezioni w1118 ? stato usato come controllo.

Esempio 1.4 Linee di pesci zebra e modelli morfolino

Pesci zebra selvatici sono del ceppo T?bingen (T?) e sono allevati presso il servizio zebrafish dell?Universit? di Padova. Gli embrioni di zebrafish sono stati analizzati usando un microscopio Leica M165FC e le immagini acquisite con una fotocamera digitale Nikon DS-F12. Ttc19spMO sono stati ottenuti come descritto in Costa, R. et al, doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050.

Esempio 1.5 Cura e manipolazione degli animali

Gli esperimenti con animali e la loro cura hanno seguito le linee-guida delle autorit? istituzionali, e sono stati approvati dalle autorit? italiane preposte. Topi C57BL6/J di entrambi i sessi sono stati usati per gli esperimenti sulla tossicit?: il PYO ? stato somministrato 5 giorni alla settimana per 9 settimane.

Esempio 1.6 Isolamento di mitocondri e saggio di riduzione del citocromo c

Il fegato di topo espiantato ? stato immediatamente immerso in mezzo di isolamento (250mM saccarosio, 5mM HEPES, 2mM EGTA; pH 7,5) alla temperatura del ghiaccio fondente. Il tessuto epatico ? stato omogeneizzato nella stessa soluzione e i mitocondri sono stati isolati per centrifugazione differenziale, come descritto in Leanza, L. et al, doi:10.1016/j.ccell.2017.03.003. Per misurare l?attivit? del CIII e di PYO in vitro, ? stato seguito il protocollo descritto in Manago, A. et al, doi:10.1089/ars.2014.5979.

Esempio 1.7 Saggio MTS e determinazione della concentrazione di ATP

Per misurare la vitalit? delle cellule e la determinazione della concentrazione di ATP, gli esperimenti sono stati eseguiti come descritto in Costa, R. et al, doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050.

Esempio 1.8 Misurazione del consumo d?ossigeno

La velocit? di consumo d?ossigeno (OCR; respirazione) ? stata misurata usando un Analizzatore di Flusso Extracellulare XF24 (Seahorse, Bioscience) e l?analisi dei dati ? stata eseguita come riportato in Dott, W. et al, doi:10.1016/j.redox.2013.12.028. La respirazione ? stata misurata in piccoli campioni di fegati di topi WT e TTC19<-/- >a 37?C in camerette da 2 ml di respirometri a due canali Oroboros Oxygraph, con software DatLab.

Esempio 1.9 Produzione di ROS e morfologia mitocondriale

Le cellule sono state incubate per 30 min a 37?C e al buio con 1 ?M MitoSox<?>, e la produzione di ROS ? stata misurata come in Leanza, L. et al, doi:10.1016/j.ccell.2017.03.003. La microscopia elettronica in trasmissione ? stata eseguita come descritto in Leanza, L. et al, doi:10.1016/j.ccell.2017.03.003.

Esempio 1.10 Western blotting

50 ?g di proteine sono stati caricati in ogni corsia di gel prefabbricati 4%?12% NuPage Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific). I seguenti anticorpi primari, tutti diluiti in latte scremato 5% preparato in TBS sono stati usati come in Costa, R. et al, doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050: mitofusina-2 (1:1000 in 5% latte scremato - Abnova); PGC1? (1:1000 in TBS 5% BSA - Merck Millipore); ND2 (1:500 in TTBS ? Thermo Fisher Scientific); CAT (1:1000 in TBS 5% BSA - Abcam).

Esempio 1.11 Procedura d?iniezione nei moscerini

Come descritto in Ghezzi, D. et al, doi:10.1038/ng.761, moscerini maschi di 4 giorni sono stati anestetizzati con CO2 (per massimo 5 min.), e inoculati usando aghi da iniezione collegati ad un iniettore per cellule e ad un micromanipolatore. ? stata somministrata da 1 a 200 pmol di piocianina diluita in soluzione di Ringer oppure Ringer con il colorante Blu Brillante FCF. La percentuale di moscerini sopravvissuti ? stata determinata a 24, 48 e 72 ore dopo la seconda iniezione.

Esempio 1.12 Bang test sui moscerini

1 ora prima dell?esperimento, i moscerini maschi sono stati trasferiti in provette di plastica (10 moscerini per provetta), come descritto in Merkling, S. et al, doi:10.1038/nprot.2015.071. Lo stimolo meccanico ? stato ottenuto ponendo la provetta su un Vortex da banco funzionante a massima potenza per 10 sec. La provetta con i moscerini ? stata poi posta verticalmente in un cilindro graduato di fronte ad una videocamera collegata ad un computer. Si ? contato il numero di moscerini in grado di arrampicarsi fino ad un?altezza predefinita (2,8, 5,6, 8,4, 11,2 cm) entro 30 secondi. Moscerini w1118 e dTTC19 KO a cui era stata iniettata soluzione di Ringer e acqua sono stati usati come controllo. Moscerini w1118 non trattati hanno costituito un ulteriore controllo.

Esempio 1.13 Trattamento degli embrioni di pesce zebra in vivo 20 pesci zebra selvatici sono stati distribuiti in una piastra a 6 pozzetti e trattati con DMSO (veicolo) oppure PYO per 24 ore, iniziando a 24 hpf (termine dell?esperimento a 48 hpf). I farmaci sono stati somministrati in 4 ml di ?Fish water?. L?analisi degli embrioni ? stata eseguita usando un microscopio Leica M165FC. L?esperimento ? stato ripetuto tre volte. Per le metodiche degli esperimenti sulla segnalazione Wnt si veda Costa, R. et al, doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050.

Esempio 1.14 Reazione di fuga evocata da tocco in pesci zebra

Il saggio della reazione di fuga evocata da un tocco pu? essere utilizzato per valutare la prestazione muscolare e la percezione di stimoli (Granato, M. et al. 123, 399-413 (1996)). Uno zebrafish di 72 hpf tipicamente sfugge ad uno stimolo tattile seguendo nella maggior parte dei casi un percorso lineare centrifugo fino a raggiungere il bordo della piastra di Petri. La reazione di fuga evocata ? stata indotta con una singola leggera stimolazione sulla coda delle larve, usando una sottile punta in polipropilene di pipetta da 200 ?l. In un singolo breve scatto, l?embrione raggiunge la nuova posizione definitiva. Le registrazioni video sono state ottenute con una normale videocamera digitale. L?esperimento ? stato ripetuto tre volte, ed ogni prova ha coinvolto pi? di 20 embrioni. I dati sono stati elaborati con il programma Davinci Resolve.

Esempio 1.15 Trattamenti dei topi in vivo

A topi WT C57BL/6J ? stata iniettata PYO 10 nmol/gpc. Le iniezioni sono state eseguite 5 volte alla settimana per un periodo di 2 mesi.

Poi i topi sono stati sacrificati e i loro organi espiantati e immediatamente congelati in azoto liquido. Campioni degli organi sono stati usati per verificare gli eventuali effetti della PYO in vivo. L?istologia ? stata eseguita come descritto in Leanza, L. et al, doi:10.1016/j.ccell.2017.03.003.

Esempio 1.16 Saggio immuno-assorbente legato ad un enzima (ELISA)

Le concentrazioni di TNF-?, IL-1? e IL-6 in campioni di plasma murino sono state determinate con la tecnica ELISA (DuoSet ELISA R&D Systems) seguendo le istruzioni del produttore. La determinazione si ? basata sui valori di assorbanza dello standard murino ricombinante. Esempio 1.17 Quantificazione e analisi statistica

La significativit? statistica delle differenze ? stata valutata per ogni trattamento usando l?analisi della varianza (ANOVA) a una via con il post-test di Dunnett o il t-test. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite usando software GraphPad Prism.

Esempio 2. Risultati

Esempio 2.1 Effetti della PYO in fibroblasti embrionali murini recanti la delezione di TTC19, fattore di stabilizzazione del complesso III Sono stati inizialmente utilizzati fibroblasti embrionali murini (MEF) da topi TTC19<-/- >(Bottani, E. et al. doi:10.1016/j.molcel.2017.06.001). MEF TTC19<+/- >? stato usato come controllo. A concentrazioni elevate (50-100 ?M), simili a quelle riscontrate in infezioni di Pseudomonas, la PYO ? tossica, a causa della sua attivit? redox. ? stato quindi individuato preliminarmente l?ambito di concentrazione non tossico per le linee cellulari TTC19<+/- >e <-/->: l?esposizione a [PYO] ? 3?M non ha effetti sulla sopravvivenza di queste cellule, almeno entro 24 ore (Fig. 1A)

Come passaggio successivo ? stato verificato, usando mitocondri isolati, se la PYO, a queste concentrazioni non tossiche, fosse in grado di fare le veci del CIII, ossia accettare elettroni dall?ubichinolo trasferendoli al citocromo c, ricostituendo in questo modo il flusso elettronico lungo la catena respiratoria. Sono stati usati allo scopo mitocondri di fegato di topo permeabilizzati con alameticina. La funzionalit? a livello del CIII ? stata valutata misurando la riduzione del citocromo c in presenza di inibitori dei complessi I, III e IV della catena respiratoria (rotenone, antimicina A e NaN3, rispettivamente). A seguito dell?aggiunta di decilubichinolo e 0,8 o 1,5 ?M PYO si ? registrata una maggior riduzione del citocromo c (come indicato da un aumento dell?assorbanza a 550 nm, attribuita alla riduzione chimica di questo trasportatore mobile di elettroni), anche in presenza di tutti gli inibitori (Fig. 1B). Questi risultati indicano che la PYO pu? accettare elettroni dal decilubichinolo e usarli per ridurre il citocromo c, vicariando in questo modo le funzioni ossido-riduttive di CIII. Coerentemente, 1,5 ?M PYO causa un evidente aumento della respirazione sia basale che stimolata (Fig. 1C-D), misurata come velocit? di consumo mitocondriale di ossigeno. In accordo con la diminuzione dell?espressione proteica di una subunit? del CIII e dell?attivit? del complesso (Fig. 1E), la respirazione risulta essere inferiore nelle cellule MEF TTC19<-/- >rispetto alle eterozigote MEF TTC19<+/- >usate come controllo (Fig. 1F).

Ad ulteriore dimostrazione che la PYO ? in grado di far aumentare la respirazione anche in assenza di CIII funzionante, ? stato bloccato il complesso III in MEF TTC19<+/- >con antimicina A, e successivamente aggiunto PYO. ? importante notare qui che la respirazione indotta dalla PYO diminuisce in presenza di inibitori del complesso IV (Fig. 1G). Per verificare se la PYO possa avere un effetto positivo non solo su cellule in coltura, ma anche in tessuti particolarmente colpiti dalla malattia, ? stato isolato il fegato da topi selvatici e TTC19<-/->, ed ? stata misurata la respirazione mediante un ossigrafo ad alta risoluzione. Il consumo di ossigeno, ridotto nei mitocondri TTC19<-/->rispetto ai controlli TTC19<+/- >(Fig. 1H) (Costa, R. et al. doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050) , ? stato aumentato dalla PYO, sia in condizioni basali (Fig. 1I) che in presenza di Antimicina A, Fig. 1J). Questo aumento ? risultato essere sensibile all?inibizione del CIV, confermando che la PYO trasferisce elettroni in gran parte al citocromo c piuttosto che direttamente all?ossigeno.

Ad una respirazione pi? elevata dovrebbe corrispondere una maggiore sintesi di ATP. Per misurare i livelli di ATP mitocondriale le cellule sono state coltivate in presenza di 5,5 mM 2-deossiglucosio (2-DG) per eliminare il contributo della glicolisi alla sintesi dell?ATP cellulare. Rapportando i dati ai livelli di ATP nei MEF TTC19<+/->, si osserva una riduzione nelle cellule TTC19<-/- >(Fig. 1K), come prevedibile data la diminuita attivit? del CIII osservata in vari tessuti (Granato, M. et al. 123, 399-413 (1996)). L?incubazione delle cellule TTC19<-/- >con 0,8 o 1,5 ?M PYO porta approssimativamente al raddoppio del livello di ATP di origine mitocondriale.

La PYO pu? cedere elettroni non solo al citocromo c, ma anche all?ossigeno molecolare. ? per questo che, ad alte concentrazioni, essa induce produzione di ROS ai mitocondri, deplezione di ATP e infine morte cellulare. D?altra parte, a basse concentrazioni la PYO aumenta la formazione di ROS mitocondriali solamente di circa il 10% in entrambe le linee cellulari, un aumento moderato che non compromette la sopravvivenza delle cellule (Fig. 2A). Inoltre questi livelli di ROS non inducono perossidazione lipidica, n? dopo 72 ore di incubazione (Fig. 2B) n? dopo trattamento delle cellule per 2 mesi (Fig. 2C). Analogamente, non ? risultata aumentata l?ossidazione delle proteine (Fig. 2D e per i dati dopo 72 ore, Fig. 2E per il trattamento di 2 mesi). La PYO inoltre stabilizza il potenziale transmembrana dei mitocondri ed ha un effetto iperpolarizzante (Fig.2H).

Le manifestazioni di patologia cellulare e tissutale legate al deficit della fosforilazione ossidativa sono spesso associate ad alterazioni ultrastrutturali delle cristae mitocondriali. ? stato quindi verificato se la morfologia mitocondriale fosse modificata in cellule TTC19<-/- >vs. TTC19<+/- >e se la PYO a basse concentrazioni avesse effetti sulla struttura degli organuli. Il confronto delle dimensioni e forma dei mitocondri in immagini TEM (microscopia elettronica a trasmissione) di cellule TTC19<-/- >(vs. TTC19<+/->) ha dimostrato che in cellule omozigoti non trattate i mitocondri sono pi? frammentati, e con un?area complessiva nelle immagini significativamente minore (Fig. 3A). Il trattamento con PYO per 72 ore porta ad una normalizzazione quasi completa delle dimensioni degli organuli. Coerentemente, l?espressione di Mitofusina 2 (Mfn2), una proteina cruciale per la fusione mitocondriale, aumenta nelle cellule trattate con PYO (Fig. 3B). Per chiarire se la biogenesi mitocondriale fosse aumentata a seguito del trattamento con PYO, sono stati misurati i livelli di PGC-1?, il principale orchestratore del processo. ? risultato che l?espressione relativa di PGC-1? (Fig. 3C) era maggiore nelle cellule trattate con PYO, il che suggerisce che la PYO induca sia fusione che biogenesi mitocondriale.

? noto che le cellule con difetti del complesso III sono caratterizzate da una riduzione del segnale nella via Wnt a causa del deficit di sintesi di ATP mitocondriale. ? stato quindi verificato se la PYO, che come appena detto aumenta i livelli di ATP, fosse in grado di recuperare anche il segnale nella via Wnt. A questo scopo ? stata usata la linea di zebrafish (Danio rerio) Tg(7xTCFX.lasiam:EGFP)ia4, una linea reporter della segnalazione canonica di Wnt (Costa, R. et al. doi:10.1016/j.celrep.2019.07.050). PYO, usata a basse concentrazioni, si ? dimostrata capace di indurre questo recupero in zebrafish (Fig. 3D).

Esempio 2.2 La PYO aumenta la respirazione e i livelli di ATP mitocondriale in fibroblasti umani da pazienti con mutazioni in TTC19, un fattore di controllo di qualit? del CIII

Sono stati osservati gli effetti della PYO su fibroblasti umani ottenuti da tre diversi pazienti portatori di mutazioni patogene di TTC19. Analogamente a quanto osservato nei MEF, concentrazioni sub-letali di PYO determinano un aumento del contenuto di ATP in fibroblasti umani, sia nelle cellule sane, di controllo, che in quelle recanti una forma tronca di TTC19 (Fig. 4A). Il contenuto di ATP delle cellule dei pazienti ? inferiore a quello delle cellule sane (Fig. 4B), ma l?incubazione con 0,4 o 0,8 ?M PYO riporta l?ATP mitocondriale agli stessi livelli dei fibroblasti di controllo. L?esposizione a concentrazioni sub-letali di PYO si associa ad un lieve aumento della respirazione basale, come nel caso dei MEF TTC19<-/- >(Fig.4C).

I mitocondri di fibroblasti umani mutanti presentano frammentazione del loro reticolo rispetto ai fibroblasti di controllo, ma la PYO pu? ricostituire il fenotipo allungato (Fig. 5A).

Esempio 2.3 PYO aumenta il livello di ATP in vivo e compensa l?insufficienza motoria nel modello di Drosophila KO per TTC19 Sono stati inoltre saggiati gli effetti della PYO sull?attivit? locomotoria in vivo. In primo luogo ? stata usata una linea di Drosophila melanogaster non esprimente TTC19. Questi moscerini hanno una ridotta attivit? di CIII e mostrano una forte sensibilit? al ?bang test?, cio? una ridotta attivit? neuromotoria (Cerutti, R. et al. doi:10.1016/j.cmet.2014.04.001). I moscerini adulti dTTC19 KO, ottenuti con la tecnologia CRISP/Cas9, dimostrano anch?essi una forte sensibilit? al bang e una produzione di ATP mitocondriale marcatamente ridotta dopo 24 ore di digiuno (Fig. 6A). Prima del suo utilizzo, la tossicit? della PYO ? stata valutata in moscerini selvatici (w<1118>) per definire la gamma di dosaggi non tossici in Drosophila. ? stato dimostrato che l?iniezione di <50 pmol PYO/moscerino nell?emolinfa non ha effetti tossici (Fig. 6B). E? stato inoltre osservato che il trattamento di moscerini dTTC19 KO dell?et? di 5 giorni con 1,0 pmol di PYO/moscerino d? luogo ad un forte aumento del contenuto di ATP (Fig. 6C) e riduce la sensibilit? al bang test (e cio? aumenta l?attivit? locomotoria) e ristabilisce l?attivit? di moscerini di 12 giorni, quasi completamente paralizzati (Fig. 6D). Paragonando le percentuali di moscerini che dimostrano un recupero dal bang test nei set sperimentali costituiti dai moscerini selvatici a cui era stata iniettata soluzione salina per controllo e dai moscerini KO trattati analogamente, sempre come popolazione di controllo, le differenze risultano essere significative per tutte le quote di arrampicata sia per i moscerini giovani che per quelli anziani. In conclusione, PYO determina un aumento del livello di ATP dei moscerini dTTC19 KO, e permette il recupero di fenotipi biochimici e comportamentali simili a quelli dei moscerini wild-type, senza causare tossicit? in vivo (Fig 6E).

Esempio 2.4 PYO aumenta la respirazione e recupera la motilit? in zebrafish knock-down per TTC19

Oltre che nel sistema modello di Drosophila, ? stato dimostrato l?effetto benefico di PYO nel corrispondente modello di patologia del CIII in Danio rerio. Riducendo l?espressione del gene TTC19 con un oligomero Morpholino (Merkling, S. et al, doi:10.1038/nprot.2015.071 (knockdown; KD), ? stata osservata una riduzione della respirazione (Fig. 7A). Il consumo mitocondriale d?ossigeno ? aumentato significativamente a seguito dell?aggiunta di PYO all?acqua dei pesci (Fig. 7A). La PYO, aggiunta 6 ore dopo la fertilizzazione (hours postfertilization, hpf), ? stata sostituita due volte al giorno fino a 72 hpf. La concentrazione usata ? stata 100 nM, che non ? tossica per lo zebrafish (Fig. 7B). Analogamente a Drosophila, anche Danio rerio ? stato in grado di recuperare, per quanto solo parzialmente, la capacit? di muoversi. In particolare, la risposta evocata da un tocco (evoked touch response, ETR) (ossia la capacit? degli embrioni di nuotare in risposta ad una stimolazione meccanica) ? quasi completamente assente nei pesciolini KD per TTC19. Alcuni individui hanno completamente recuperato la risposta dopo il trattamento con 100 nM PYO, e un miglioramento dell?ETR si ? osservato nella maggior parte dei rimanenti individui trattati (Fig. 7C e 7D). Inoltre, nei pesci trattati con PYO si ? verificato un miglioramento dei parametri morfologici alterati negli animali KD per TTC19: accorciamento dell?asse sagittale, deformit? cranio-facciale e della coda, pigmentazione ridotta (Fig. 7E) e un aumento del numero di giunzioni assonali (7F).

Esempio 2.5 Assenza di tossicit? nel topo del trattamento a lungo termine con PYO in vivo

E? stato inoltre verificato se la somministrazione di PYO per tempi pi? lunghi possa provocare effetti tossici legati a stress ossidativo. Sono state dunque somministrate a topi selvatici adulti (n=8) iniezioni intraperitoneali di PYO (10 nmol/gpc) una volta al giorno, per due mesi. Questo non ha causato un arresto della crescita degli animali (Fig. 8A) o segni di malessere, e perfino questo trattamento a lungo termine non ha causato un fenotipo infiammatorio (Fig. 8B). Inoltre, l?esame istologico (colorazione con ematossilina-eosina) di vari tessuti non ha evidenziato marcate alterazioni e l?ultrastruttura dei nuclei e mitocondri nel fegato (Fig. 8C) di questi topi non ? risultata alterata.

Esempio 2.6. PYO causa gli stessi effetti benefici in fibroblasti di pazienti con mutazioni diverse che portano al deficit di CIII.

Per stabilire se la PYO possa essere usata efficacemente nel trattamento di malattie mitocondriali da deficit di CIII dovute a mutazioni di altri importanti fattori, oltre a TTC19 (Fig. 9A, 9B dati con altri pazienti con mutazione TTC19), studi analoghi a quelli appena descritti sono stati compiuti anche su fibroblasti ottenuti da un paziente con una mutazione omozigote in LYRM7 (Figure 10 A, B) e da uno mutante in BCS1L (Figure 11 A-D). I risultati sono stati paragonabili a quelli ottenuti con i pazienti con deficit in TTC19, indicando che la PYO a concentrazioni sub-letali agisce con le stesse modalit?, portando ad un significativo miglioramento della funzionalit? mitocondriale.

Esempio 2.7 Plumbagina, juglone e blu di metilene aumentano i livelli di ATP mitocondriale in fibroblasti di topi con mutazioni in TTC19 Similmente a PYO, altri ciclatori redox con potenziale redox nell?intervallo di -0,15 e 0,25 Volt (plumbagina, juglone e blu di metilene) sono in grado di aumentare il livello di ATP a concentrazioni non tossiche (Fig. 12 A-H).

Claims (16)

RIVENDICAZIONI

1) Composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile per uso nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione dei complessi I, II, III della catena respiratoria, detto composto ciclatore redox o un suo sale avendo un potenziale standard di riduzione compreso tra -0,15 e 0,25 Volt.

2) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto metodo di trattamento prevede di somministrare ad un soggetto affetto da detta malattia mitocondriale una quantit? terapeuticamente efficace di detto composto ciclatore redox o di un suo sale farmaceuticamente accettabile.

3) Composto ciclatore redox secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta malattia mitocondriale ? una malattia mitocondriale da disfunzione del complesso III della catena respiratoria.

4) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detta malattia mitocondriale ? selezionata nel gruppo costituito da miopatia con o senza mioglobinuria, tubulopatia, epatopatia ed encefalopatia, sindrome GRACILE, acidosi metabolica congenita, tubulopatia, insufficienza epatica, encefalopatia/encefalomiopatia, encefalopatia lentamente progressiva /insufficienza neurologica rapidamente progressiva, sindrome di Leigh, atassia cerebellare, miopatia sporadica, displasia setto-ottica e cardiomiopatia.

5) Composto ciclatore redox secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto composto ciclatore redox ? somministrato per via orale a detto soggetto.

6) Composto ciclatore redox secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto composto ciclatore redox ? coniugato ad almeno un gruppo mitocondriotropico.

7) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto gruppo mitocondriotropico ? trifenilfosfonio.

8) Composto ciclatore redox secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di essere selezionato nel gruppo costituito da piocianina, blu di metilene, un naftochinone, azure C, azure B, azure A, indigo, indigo carmine, 2,6-dicloroindofenolo, 2-cloroindofenolo, indofenolo e blu di indofenolo, detto naftochinone essendo preferibilmente scelto tra plumbagina e juglone.

9) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto di essere selezionato nel gruppo costituito da piocianina, blu di metilene e un naftochinone.

10) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto composto ciclatore redox ? piocianina.

11) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detto composto ciclatore redox ? blu di metilene.

12) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione 9, caratterizzato dal fatto che detto composto ciclatore redox ? un naftochinone

13) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione precedente, caratterizzato dal fatto che detto naftochinone ? plumbagina.

14) Composto ciclatore redox secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto naftochinone ? juglone.

15) Composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace di una combinazione di almeno un composto ciclatore redox o un suo sale farmaceuticamente accettabile, come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 14, ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile.

16) Composizione farmaceutica come definita in rivendicazione 15 per uso nel metodo di trattamento di una malattia mitocondriale selezionata tra le malattie mitocondriali da disfunzione del complesso I, II, III della catena respiratoria, preferibilmente tra le malattie mitocondriali da disfunzione del complesso III della catena respiratoria.