ES2372239B2 - Método para producir celulas troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método. - Google Patents

Abstract

Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método.#La presente invención describe un método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma; aislamiento de las células troncales mesenquimales; cultivo y expansión in vitro; caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso. La muestra de tejido adiposo se mantiene a temperatura ambiente antes de ser sometida a digestión enzimática, manteniendo la mezcla en reposo y evitando el filtrado. Las células obtenidas, y en particular, las de fenotipo osteogénico pueden utilizarse para regeneración ósea.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES DERIVADAS DE TEJIDO ADIPOSO, ASÍ COMO LAS CÉLULAS TRONCALES MESENQUIMALES OBTENIDAS POR DICHO MÉTODO.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Método para producir células troncales mesenquimales deri vadas de tej ido adiposo, así como las células troncales

mesenquimales

obtenidas por dicho método. Dicho método

comprende

las fases de obtención de la muestra de tejido

adiposo,

purificación y fragmentación de la misma;

aislamiento de las células troncales mesenquimales; cultivo y expansión in vitro; y caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tej ido adiposo, óseo o cartilaginoso. La muestra de tej ido adiposo se mantiene a temperatura ambiente antes de ser sometida a digestión enzimática, manteniendo la mezcla en reposo y evitando el filtrado. Las células obtenidas, y en particular, las de fenotipo osteogénico pueden utilizarse para regeneración ósea.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para producir células troncales mesenquimales (ADMSCs ) derivadas de tejido adiposo, así como las células troncales mesenquimales obtenidas por dicho método, para su posible utilización en reparación ósea.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN

El sistema óseo presenta una gran capacidad regenerativa que, sin embargo, es limitada. Las estrategias terapéuticas actuales en relación con la reparación ósea, cuando es necesaria ante defectos esqueléticos de diferente naturaleza, se refieren al empleo de injertos y sustitutivos óseos, que muestran propiedades particulares y, derivadas de ellas,

ventajas e inconvenientes para su uso. La terapia celular y las técnicas de ingeniería tisular se han desarrollado en los últimos años como alternativa a algunas de las limitaciones de aquellos procedimientos. En este contexto, la terapia con células troncales de naturaleza mesenquimal está adquiriendo cada vez más importancia en el tratamiento de diferentes patologías óseas.

Desde que Phemister, en 1947, utilizara la inyección de células troncales mesenquimales de médula ósea (BMMSCs) en pacientes con pseudoartrosis (Phemister MD. Treatment of ununited fractures by onlay bone grafts without screw or tie fixation and without breaking down of the fibrous union. J Bone Joint Surg, 1947;29:946-60) y, en las décadas posteriores, Burwell definiera la capacidad regenerativa de la médula ósea de la cresta iliaca (Burwell RG. Studies in the transplantation of bone. VII. The fresh composite homograft-autograft of cancellous bone; an analysis of factors leading to osteogenesis in marrow transplants and in marrow-containing bone grafts. J Bone Joint Surg 1964; 4 6B: 110-4O), el implante de células mesenquimales para el tratamiento de diferentes tipos de lesiones óseas ha ido adquiriendo cada vez más importancia. Se han ensayado con éxito como tratamiento percutáneo de necrosis óseas y en fracturas; y se continúa investigando para utilizarlas en la reparación de defectos óseos mayores con técnicas de

ingeniería

tisular. Estas técnicas comprenden la utilización

combinada

de grandes poblaciones celulares, andamiaj es que

actúen

como vector para las células y factores de

crecimiento.

En

los últimos años se han descrito nuevos orígenes

tisulares a partir de los que poder aislar células troncales mesenquimales con un potencial similar al de la médula ósea. Es el caso de la placenta, el cordón umbilical o el tej ido adiposo, siendo éste la alternativa más interesante dada su

abundancia y accesibilidad, en contraste con la limitada cantidad de tej ido medular que se puede obtener y con la

dificultad y morbilidad asociadas a su extracción. Por otra parte, parecen no existir diferencias significativas entre las ADMSCs y las BMMSCs en cuanto a rendimiento de células adherentes, cinética de crecimiento, senescencia celular y capacidad de diferenciación; existiendo incluso investigaciones recientes que afirman que a partir del tejido adiposo se obtiene un mayor número de células madre mesenquimales y con mayor capacidad proliferativa que las que se aíslan de la médula ósea. Algunas publicaciones en relación con la utilización de células de origen adiposo son:

Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH. Human adipose

tissue

is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell,

2002,13:4279-4295.

Fraser

JK, Wulur 1, Alfonso Z, Hedrick MH. Fat tissue: an

underappreciated

source of stem cells for biotechnology.

Trends

Biotechnol 2006; (24) :150-4;

Kern

S, Eichler H, Stoeve J, Klüter K, Bieback K.

Comparative Analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells 2006;24:1294-301.

Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7:211-28

En la misma línea, se ha demostrado que las ADMSCs son capaces de adquirir fenotipos de hueso, cartílago, grasa o miocardio, además de piel y neuronas, dependiendo del microambiente que se cree mediante la adición in vitro de determinados factores de crecimiento y proteínas.

Aunque las técnicas de obtención y diferenciación osteoblástica de las ADMSCs han sido bastante estudiadas en

los últimos años, la mayoría de los estudios in vitro utilizan células procedentes de lipoaspirados humanos (Dragoo JL, Choi JY, Lieberman JR, Huang J, Zuk PA, Zhang J, Hedrick MH, Benhaim P. Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fato J Orthop Res 2003;21:622-9), en tanto que los estudios in vivo lo hacen con animales de experimentación pequeños, fundamentalmente roedores y lagomorfos (Wu L, Wu Y, Lin Y, Jing W, Nie X, Qiao J, Liu L, Tang W, Tian W. Osteogenic differentiation of adipose derived stem cells promoted by overexpression of osterix. Mol Cell Biochem 2007;301:83-92; Peptan IA, Hong L, Mao JJ. Comparison of osteogenic potentials of visceral and subcutaneous adipose-derived cells of rabbits. Plast Reconstr Surg, 2006;117:1462-70)

Son conocidos también algunos estudios relacionados con la necesidad de trabajar con modelos animales de mayor tamaño, más próximos al humano por razones de peso, estructura y capacidad de regeneración ósea (Cancedda R, Giannoni P, Mastrogiacomo M. A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice. Biomaterials 2007; 28: 4240-50; Reichert JC, Saifzadeh S, Wullschleger ME, Epari DR, Schütz MA, Duda GN, Schell H, van Griensven M, Redl H, Hutmacher DW. The challenge of establishing preclinical models for segmental bone defect research. Biomaterials 2009;30:2149-63).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En vista de las circunstancias descritas anteriormente, el objeto de la presente invención es un método para producir células troncales mesenquimales (ADMSCs) derivadas de tej ido adiposo para su posible utilización en reparación ósea. El método comprende las fases de obtención del tej ido adiposo, purificación y fragmentación, aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células troncales de tejido adiposo a otras de tipo adiposo, condrogénicas o osteogénicas que podrían usarse en estudios preclínicos utilizando como modelo experimental mamíferos como por ejemplo ovejas, con las que los estudios realizados hasta la fecha han sido escasos.

Es objeto de la presente invención que las poblaciones

celulares

aisladas mediante el método descrito, bajo

condiciones

de cultivo específicas, sean capaces de mostrar

características

específicas de las células óseas

(mineralización de la matriz extracelular), cartilaginosas (morfología condrocítica y síntesis de proteoglicanos ácidos) y adiposas (acumulación intracelular de lípidos), lo que la Sociedad Internacional de Investigación con Células Madre (ISSCR) considera fundamental para que las células troncales

mesenquimales sean consideradas como tales.

Para la presente invención se definen las células troncales mesenquimales como células estromales no hematopoyéticas que muestran las siguientes propiedades: son adherentes en cultivo; expresan los antígenos CD73, CD90 y CDIOS en ausencia de antígenos hematopoyéticos, como CD34, CD4 S, marcadores de monocitos, macrofagos y linfocitos B; y son capaces de diferenciarse in vitro hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos baj o condiciones standard de cultivo. Adicionalmente, muestran la posibilidad de autorrenovarse, de desarrollarse en múltiples líneas celulares y de proliferar sin límite.

Se ha realizado un método para la producción de células troncales mesenquimales de tejido adiposo (ADMSCs) de ovejas de raza Asaaf con el fin de obtener células diferenciadas aptas para su aplicación en técnicas de ingeniería tisular en investigación preclínica. Sobre los rendimientos celulares obtenidos tras el procesamiento de las muestras adiposas, se estudiaron las siguientes variables: temperatura de

preservación, concentración enzimática, agitación y filtración de la digestión final. También se estudió el

comportamiento de estas células en cultivo y la tasa de expansión de las mismas, así como su capacidad para dar lugar a células maduras de diferentes estirpes celulares (grasa, hueso y cartílago) .

En relación con la temperatura de preservación de las muestras de tejido adiposo de las que obtener células diferenciadas, hasta su procesamiento, generalmente se asume que el frío ralentiza el metabolismo celular y que, en consecuencia, retrasa la muerte celular tras la toma de los tej idos. Matsumoto y cols., de hecho, así lo corroboraron comparando los rendimientos celulares obtenidos a partir de lipoaspirados humanos preservados a 4° C, 80° C y temperatura ambiente durante periodos de tiempo que fueron desde 1 hora hasta 1 mes (Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Inoue K, Suga H, Kato H, Aoi N, Murase S, Gonda K, Yoshimura

K. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg 2 O 07; 12 O(6) : 15107). Sin embargo, en la presente invención, se obtuvieron mayores rendimientos celulares tras la digestión de las muestras preservadas a temperatura ambiente que cuando se hizo en condiciones de hipotermia, dejando transcurrir un tiempo no superior a 8 horas desde la toma del tej ido del animal hasta su procesamiento. Se considera temperatura ambiente una temperatura de 15° o superior, siendo la temperatura preferente entre 18°C y 22°C. Al contrario que en el estudio de Matsumoto y cols., las muestras fueron extraídas mediante resección quirúrgica y no por liposucción. Se ha comprobado igualmente que la preservación en frío de los fragmentos grasos puede llevar al endurecimiento de los

mismos,

dificultando la posterior digestión enzimática y

afectando

así al rendimiento celular alcanzado, traduciéndose

esto

en un menor rendimiento celular.

Con respecto a la digestión del tej ido adiposo, aunque las condiciones generales para el aislamiento de ADMSCs

empleadas en la mayoría de las publicaciones derivan del protocolo original desarrollado por Zuk y cols. en 2001 (Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001; 7: 211-28), se introdujeron algunas variaciones. Así, por ejemplo, se ha considerado que la agitación de la muestra durante la digestión y el filtrado de la solución obtenida

son

procedimientos contraproducentes a la hora de tratar de

obtener

mayores rendimientos celulares, y por tanto, se

evitaron para

la realización de la invención.

La presente invención describe un método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de: a) obtención de la muestra de tej ido adiposo, purificación y fragmentación de la misma; b) aislamiento de las células troncales mesenquimales; c) cultivo y expansión in vitro; d) caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tej ido adiposo, óseo o cartilaginoso; caracterizado porque la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente y no en condiciones de hipotermia, sometiendo posteriormente la muestra a digestión enzimática con colagenasa y manteniendo la mezcla en reposo.

En una realización preferente, la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente igual o superior a 15°C, más preferentemente entre 18°C-22°C, ambos inclusive.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente caracterizado porque la

digestión enzimática de la muestra es con colagenasa tipo 1,

preferentemente con una concentración de 2mg/ml.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo obtenido de mamíferos descrito anteriormente caracterizado porque el mamífero es no humano. En una realización más preferente el mamífero de la invención es una oveja.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente donde la muestra de tejido adiposo se obtiene en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.

En una realización preferente, la muestra de tejido adiposo se obtiene de la cola del mamífero no humano en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia. En una realización más preferente, la muestra de tej ido adiposo anteriormente descrita se obtiene de la cola de la ovej a en un único tiempo quirúrgico baj o estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.

Tras el aislamiento de la población de ADMSCs presentes en el tejido graso, se estableció un cultivo primario, con una densidad de siembra que puede oscilar desde las 3,5 x 103

2 106 2

células/ cm, hasta las 1 x células / cm, y se utilizó un tamaño de la superficie plástica sobre la que la siembra se lleva a cabo, que puede oscilar entre 2 y 225 cm2 En la realización concreta objeto de descripción se optó por una densidad de siembra de 3 x 104 células/cm2 en pocillos de 2 cm2 , lo que asegura el cultivo primario y permite obtener tasas de expansión medias de 4 veces el número original de células y 20 veces tras el subcultivo celular a una densidad de 5 x 103 células/cm2 • Así, se consigue gran cantidad de células en pases tempranos y se evitan subcultivos prolongados de las poblaciones celulares, que se desaconsejan

por la posibilidad de la transformación de las células. Por otra parte, densidades inferiores a 3 x 104 células/cm2 podrían ser demasiado bajas como para que los cultivos

llegaran

al estado de preconfluencia en un tiempo menor a 15

días,

lo cual podría llevar a la pérdida del cultivo.

Mediante

el método de aislamiento, cultivo y

diferenciación descrito se consiguieron obtener, a partir del tejido adiposo de mamíferos como por ejemplo ovejas, células troncales mesenquimales que se caracterizaron por su capacidad de adhesión a superficies plásticas adquiriendo una morfología fusiforme, que proliferaron de manera significativa y fueron capaces de diferenciarse hacia diferentes estirpes celulares de origen mesodérmico que podrían utilizarse en modelos de investigación preclínica.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo descrito anteriormente donde las muestras de tejido adiposo digerido se centrifugan a 2000 rpm y, tras desechar el sobrenadante, la fracción del estroma vascular

(SVF) es resuspendida en medio de cultivo de ADMSCs del tipo DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 1% de Penicilina/Estreptomicina, un 1% de Glutamina y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente, donde las suspensiones celulares obtenidas tras la fase de aislamiento se siembran en pocillos de 2 cm2 a una densidad de 30.000 células/cm2 , e incubadas a 37 0 C y 5% de CO2 en a tmós fera húmeda, sometiéndose después los cultivos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocitario, quedando en los pocillos únicamente las células capaces de adherirse a ellos (ADMSCs); cambiando cada 2-3 días el medio de cultivo y,

tripzinizando cultivos una vez alcanzado el estado de

preconfluencia.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo adipocítico, mediante su cultivo en medio adipogénico del tipo DMEM, 10% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 1pM dexametasona, 0,5mM IBMX 10pM insulina y 200pM indometacina.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo condrogénico mediante su cultivo en medio condrogénico del tipo DMEM, 1% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 50 pg/ml ácido ascórbico, 6,25 pg/ml insulina y 10 ng/ml TGF El.

En otro aspecto la invención se relaciona con el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo descrito anteriormente donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo osteogénico mediante su cultivo en medio osteogénico del tipo DMEM, 5% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 10pM dexametasona, 150mM ácido L-ascórbico y 10mM Eglicerolfosfato, completando la inducción con la adición al medio de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2)

En otro aspecto la invención se relaciona con las células troncales mesenquimales derivadas de tej ido adiposo obtenidas según el método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo descrito anteriormente.

La preservación de las muestras atemperatura ambiente favoreció la liberación de ADMSCs de las muestras grasas,

frente a la preservación de las mismas a 4°C como se viene haciendo de forma generalizada. La digestión a una concentración enzimática de 2 mg/ml resultó ser la concentración de colagenasa óptima. Sin embargo, la agitación de las muestras durante la digestión y el filtrado de las suspensiones resultantes disminuyeron considerablemente los rendimientos celulares alcanzados. Las poblaciones celulares

aisladas

con el método establecido se multiplicaron

rápidamente

en cultivo y fueron capaces de diferenciarse

hacia

células de fenotipo adipocítico, osteoblástico y

condrocítico.

BREVE

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Secuencia de la extracción de tejido adiposo de la cola de la oveja y depósito en un recipiente estéril en una solución de suero fisiológico con antibiótico y antifúngicos

(A-D); Y de la digestión mecánica (E-G) y enzimática (H) de la muestra. En el tubo de centrifugado se identifican 3 estratos, de arriba abajo: el componente graso, la solución de digestión y la fracción del estroma vascular, que contiene las ADMSCs (H). Figura 2. En la fila superior, ADMSCs en cultivo (A); células de fenotipo adipocítico (B); y células de diferenciación condrogénica en matriz de fibrina teñidas con Azul Alción

(C). En la fila inferior, células de diferenciación osteogénica (D) y fases de mineralización progresiva de la matriz extracelular en cultivo osteogénico con tinción Alizarin Red (E). Figura 3. Izquierda, representación gráfica del número de células aisladas de las muestras de tejido graso preservadas a temperatura ambiente y a 4 oC. Derecha, según distintas concentraciones de colagenasa en el aislamiento celular. Figura 4. Izquierda, representación gráfica del número de células aisladas de las muestras de tejido graso sometidas y

no a agitación. Derecha, según que se filtraran o no tras la

digestión. Figura 5. Crecimiento de las ADMSCs en cultivo. Figura 6. Tasa de expansión de las ADMSCs en cultivo.

5 MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra adicionalmente con el siguiente ejemplo, el cual no pretende ser limitativo de su alcance.

Se realizó un estudio experimental utilizando 40 ovejas

10 sanas de raza Asaaf, con un rango de peso comprendido entre 50 y 70 kg Y un rango de edad entre 4 y 6 años, sin otro criterio de exclusión. Se obtuvieron las muestras de tej ido adiposo; se procesaron, aislaron y expandieron las ADMSCs; y, finalmente, se realizó un estudio de multipotencialidad de

15 las células mediante inducción adipogénica, condrogénica y osteogénica (tabla 2) .

MEDIO DE CULTIVO

COMPOSICIÓN TIEMPO INDUCCIÓN TÉCNICA REVELADO

ADIPOGÉNICO OSTEOGÉNICO

DMEM, 10% Suero bovino fetal, 1% Penicilina/Estreptomicina, 1% L-Glutamina, 1pM Dexametasona, 10pM Insulina, 0,5 mM IBMX, 200 pm Indometacina DMEM, 5% Suero bovino fetal, 1% Penicilina/Estreptomicina, 1% L-Glutamina, 150 Mm ácido ascórbico, 10pM Dexametasona, 10 mM ~ Glicerol fosfato, 10 ng/ml BMP-2 DMEM, 1% Suero bovino fetal, 1% 7 Y 14 días Tinción Oil Red O 21 días Tinción Alcian Blue 7, 14 Y 21

CONDROGENICO

Penicilina/Estreptomicina, Glutamina, 50 pg/ml ácido 6,25 pg/ml insulina, 10 mM fosfato, 10 ng/ml TGF ~1 1% Lascórbico, ~ Glicerol días Tinción Alizarin Red

Tabla 2

En la fase de aislamiento de las ADMSCs se evaluó el rendimiento celular en función de la concentración de 5 colagenasa tipo 1, la temperatura de preservación, la

agitación y la filtración de las muestras.

Los resultados de los rendimientos celulares se

presentan como mediana, para disminuir la dispersión de los

datos, al ser una muestra pequeña. Para determinar la

10 normalidad se utilizó la prueba de Shapiro-Wilks y Kolmogorov-Smirnov, aceptándose el supuesto de normalidad si p ~ 0,05 Y demostrándose una distribución no normal. Por ello y debido al tamaño muestral de los grupos (n=5) se utililizaron pruebas no paramétricas U de Mann-Whitney y P

15 Wilcoxom para la comparación de las medias de los rendimientos celulares en los diferentes grupos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS

17.0.

20 Obtención de muestras de tejido adiposo Las muestras de tej ido adiposo fueron obtenidas de la cola de la oveja en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia. Con el animal en decúbito lateral sobre la mesa quirúrgica se realizó una

25 incisión cutánea longitudinal paramedial a nivel de la cola de aproximadamente 6 cm de longitud. Expuesto el tejido celular subcutáneo se procedió a la extracción de 10-20 gramos de grasa, fragmentándose para facilitar su posterior procesamiento. Las muestras fueron recogidas en recipientes

estériles (en una solución de suero fisiológico, antibióticos y antifúngicos, en la que permanecieron al menos 6 horas para asegurar la descontaminación del tejido) y transportadas inmediatamente al laboratorio de cultivos celulares. (Figura 1A-D).

Selección de parámetros óptimos para el aislamiento de ADMSCs

Las muestras de tejido graso fueron sometidas a sucesivos lavados con suero salino tamponado con fosfato (PBS-Sigma-) estéril para eliminar el componente sanguíneo en la medida de lo posible. Posteriormente, el tejido graso fue troceado en fragmentos de 0,5 cm2 aproximadamente (Figura 1EG) Y sometidas a diges tión enz imática con colagenasa tipo 1 (Sigma) en DMEM (PAA Laboratorios GMBH) a 37° C y a distintas concentraciones (0,5 mg/ml; 1 mg/ml; y 2 mg/ml) ,

(obteniéndose una media de 121 ± 129 células por cada miligramo de tejido digerido). Cuando el tejido estuvo totalmente digerido las muestras fueron centrifugadas a 2000 rpm (720 g) durante 10 minutos (Figura 1H)-y, tras desechar el sobrenadante, la fracción del estroma vascular (SVF) fue resuspendida en medio de cultivo de ADMSCs, consistente en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SbFLinus-), 1% de Penicilina/Estreptomicina (PAA Lab.), un 1% de Glutamina (PAA Lab) y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico (Sigma). Para evaluar la viabilidad de las suspensiones celulares obtenidas se utilizó el método Azul Tripán. Las condiciones óptimas para el aislamiento de ADMSCs se estudiaron analizando las variables reseñadas y especificadas en la tabla l.

VARIABLE

DESCRIPCION SUBGRUPOS

lo Concentració n enzimática para la

Comprobación del rendimiento celular obtenido tras la 1.1. Concentración de 0,5 mg/ml 1. 2. Concentración

digestión tejido del

completa digestión de 5 muestras de tej ido graso con colagenasa tipo 1 en DMEM diferentes concentraciones. a de 1 mg/ml 1.3. Concentración de 2 mg/ml

2. Temperatura de preservación del tej ido hasta su procesamiento

Comprobación del rendimiento celular tras la preservación de 5 muestras entre 6 y 8 horas en DMEM estéril con un 10% de solución antibiótica (vancomicina -Normontobramicina -Braunsulfametoxazol Amirallanfotericina B y Bristol-Myers-) y digestión con colagenasa tipo 1 a una concentración de 2 mg/ml. 2.1. Preservación a 2.2. Preservación a temperatura ambiente

3. Efecto de la agitación durante digestión la

Comprobación del rendimiento celular tras la digestión de 5 muestras de tej ido graso con agitación y sin 3.1. Con agitación suave 3.2. Sin agitación

4. Efecto filtrado de del la muestra digerida

Comprobación rendimiento del celular tras la filtración, o no, de las muestras grasas digeridas, a través de un filtro de 40 pm de poro 4.1. Con filtración 4.2. Sin filtración

(Falcon) .

Tabla 1

Cultivo primario y expansión de ADMSCs

Tras la selección de los parámetros óptimos para el aislamiento de las ADMSCs se estudiaron los rendimientos obtenidos tras el procesamiento de 20 muestras de tejido adiposo ovino con la intención de obtener cantidades celulares suficientes para su posible aplicación en técnicas de ingeniería tisular. Las suspensiones celulares obtenidas fueron sembradas en pocillos de 2 cm2 a una dens idad de

30.000 células/cm2 , constituyendo el cultivo primario (OP), e incubadas a C y 5% de CO2 en a tmós fera húmeda. Transcurridas 48 horas, los cultivos fueron sometidos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocitario, quedando en los pocillos únicamente las células capaces de adherirse a ellos (ADMSCs). Cada 2-3 días se cambió el medio de cultivo y, cuando los cultivos alcanzaron el estado de preconfluencia, fueron tripsinizados (Tripsina-EDTA-PAA Lab. ) y estimada la viabilidad celular mediante el método Azul Tripán. Para posteriores estudios los cultivos secundarios (lP Y 2P) se sembraron a una densidad de 5.000 células/cm2 •

Para estudiar el comportamiento de las células en cultivo se establecieron curvas de crecimiento en placas de 24 pocillos, que se tripsinizaron por duplicado cada 48 horas , evaluándose el número de células mediante el método Azul Tripán. Para estudiar la tasa de expansión se cultivaron las células en frascos de 25 cm2 hasta el estado de preconfluencia, momento en el que se tripsinizaron y evaluó el número de células mediante el método Azul Tripán.

Multipotencialidad de ADMSCs

Para el estudio de la multipotencialidad de las

poblaciones

celulares aisladas se procedió a la inducción

adipogénica,

condrogénica y osteogénica de las células

mediante

su cultivo en medios específicos y la posterior

caracterización mediante tinciones bás icas (Figura 2) .

Inducción adipogénica. Para la diferenciación de las ADMSCs hacia células de fenotipo adipocítico, éstas se cultivaron en medio adipogénico (DMEM, 10% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina -PAA Lab.-, 1pM dexametasona -Sigma-, 0,5mM 1 BMX -Sigma-, 10pM insulina Sigma-y 200pM indometacina -Sigma-) y, posteriormente, se realizó la tinción Oil Red O (Sigma) para evidenciar la formación intracelular de vacuolas con contenido lipídico

(marcador característico de adipocitos) -tabla 2-.

Inducción condrogénica. Para inducir la diferenciación condrogénica de ADMSCs, las células fueron cultivadas en medio condrogénico (DMEM, 1% suero bovino fetal, 1% penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 50 pg/ml ácido ascórbico, 6,25 pg/ml insulina y 10 ng/ml TGF .B 1 -Sigma-) durante 21 días. Se probaron diversas estrategias de cultivo: en monocapa, en pellet y en matriz de fibrina. Para el cultivo en monocapa las células fueron sembradas sobre superficies plásticas y cultivadas con medio condrogénico. Para el cultivo en pellet, 1 x 106 células fueron centrifugadas y cultivadas adicionando el medio condrogénico sin provocar la resuspensión del pellet. Para el cultivo en matriz de fibrina, 1 x 106 células fueron sembradas en 100 pI de fibrina elaborada a partir de plasma ovino, como se describió en el apartado correspondiente. La caracterización de la diferenciación condrogénica se realizó mediante la observación al microscopio de la morfología celular y mediante tinción con Azul Alcián, que tiñe de azul los proteoglicanos típicos de la matriz cartilaginosa (tabla 2) .

Inducción

osteogénica. Para inducir células

osteogénicas,

las ADMSCs fueron cultivadas en medio

osteogénico

(DMEM, 5% suero bovino fetal, 1%

penicilina/estreptomicina, 1% L-glutamina, 10pM dexametasona, 150mM ácido L-ascórbico -Biomedia-y 10mM B-glicerolfosfato Sigma-), completando la inducción con la adición al medio durante las primeras 48 horas de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2) -Sigma-o Tras 7, 14 Y 21 días de inducción se realizó una tinción con Alizarin Red (Sigma), que tiñe de rojo la matriz mineralizada (marcador característico de diferenciación osteogénica) -tabla 2-.

Puesta a punto del método de aislamiento de ADMSCs

Los datos de los rendimientos celulares realizados en los 4 grupos se exponen en las figuras 3 y 4. En el primer grupo, las muestras digeridas con concentraciones de colagenasas tipo 1 de 2 mg/ml demostraron un mayor rendimiento celular en comparación con los otros dos grupos, con diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) Figura 3-. En el segundo grupo, donde se comparaba la temperatura de preservación (T a ambiente, 4°C), se observó un mayor rendimiento celular a temperatura ambiente, no existiendo diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p>0,05) -Figura 3-. En el tercer y cuarto grupo, donde se evaluaba el rendimiento celular en función de la agitación y la filtración de las mues tras , respectivamente, se observaron diferencias estadísticamente significativas en los grupos donde ni se agitó ni se filtró la muestra (p<0,05) -Figura 4-.

Aislamiento y Expansión de ADMSCs

El rendimiento celular tras el procesamiento de 20 muestras con el método de preservación y digestión que

estimamos como óptimo deparó una media de 172 ± 132

células/mg de tejido digerido.

En relación con la densidad de siembra del cultivo primario para obtener cultivos celulares viables, cuando aquélla fue baja los cultivos celulares no siempre consiguieron alcanzar el estado de preconfluencia. Cuando la densidad de siembra fue de 30.000 células/cm2 se aseguró el cultivo primario en todos los casos, alcanzando éstos el estado de preconfluencia al cabo de 9 días de media, con células de morfología fusiforme (Figura 2A) .

La realización de subcultivos a partir de densidades iniciales de siembra de 5.000 células/cm2 dio lugar a patrones de crecimiento similares (Figura 5) Las células entraban rápidamente en fase exponencial de crecimiento, salvo en cultivo primario, en el que permanecían más tiempo en fase de latencia, alcanzando la fase estacionaria al cabo de 8-10 días. Posteriormente se observó un repunte en el crecimiento celular debido a que las células se retrajeron en grumos y nuevas células ocuparon la superficie plástica libre, aunque en pocos días la mayoría de las células se soltaron y murieron.

La tasa media de expansión de las células en cultivo tras la realización del cultivo primario fue de 4 veces el número original de células a los 9 días. En subcultivos posteriores se observaron tasas de expansión de 20 veces el número de células sembradas en tan solo 8 días (Figura 6).

Multipotencialidad de ADMSCs

Las

poblaciones celulares mantuvieron su capacidad de

diferenciación

hacia diferentes estirpes celul ares tras la

expansión

in vitro.

Adipogénesis: Al cabo de 3 días de inducción adipogénica se observó un cambio en la morfología de las células en cultivo, que pasaron de mostrar una morfología fusiforme con finas prolongaciones a una morfología más estrellada. Tras 7 días de cultivo en medio adipogénico la tinción Oil Red O puso en evidencia la formación de vacuolas lipídicas en el interior de las células (Figura 2B)

Condrogénesis: El cultivo en monocapa no indujo la diferenciación de las ADMSCs hacia células de fenotipo

condrocítico, dado que éstas mantuvieron su morfología original y no secretaron proteoglicanos a la matriz extracelular. El cultivo en pellet resultó de difícil manejo, poco estable y reproducible, por lo que fue sustituido por el cultivo tridimensional en matriz de fibrina. En estas condiciones, al cabo de 21 días de cultivo en medio condrogénico, las células comenzaron a mostrar una morfología redondeada, se dispusieron en lagunas dentro de la matriz y la tinción Azul Alcián puso de manifiesto la presencia de proteoglicanos en las zonas de la matriz cercanas a las células diferenciadas (Figura 2C) .

Osteogénesis: El cultivo de ADMSCs en medio osteogénico provocó un cambio en el patrón de crecimiento y distribución de las células en cultivo que se traduj o en la formación de

nódulos

que mostraron signos de mineralización tras la

tinción

con Alizarin Red (Figura 2D) La mineralización

comenzó

a ser evidente a los 7 días de inducción y fue más

intensa

a los 14 y 21 días de cultivo en medio osteogénico

(Figura 2E)

.

Aplicación industrial.

La aplicación industrial de esta patente estaría enfocada al campo de la ingeniería tisular. La finalidad sería la obtención de células óseas para implantar posteriormente en aquellas situaciones donde la propia naturaleza no pueda regenerarlo de forma independiente. Serían situaciones de politraumatizados o traumatismos de

alta energía, en patología tumoral o fallo de la consolidación ósea, lo que se conoce como pseudoartrosis.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo obtenido de mamíferos que comprende las fases de:

   a) obtención de la muestra de tejido adiposo, purificación y fragmentación de la misma;

   b) aislamiento de las células troncales mesenquimales;

   e) cultivo y expansión in vitro;

   d) caracterización y diferenciación de la población celular por inducción adipogénica, osteogénica o condrogénica para promover su diferenciación hacia células de tejido adiposo, óseo o cartilaginoso;

   caracterizado por que la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente igual o superior a 15°C, sometiendo la muestra a digestión enzimática con colagenasa tipo I con una concentración de 2mg/ml en condiciones de reposo y evitando el filtrado de la muestra digerida; y el aislamiento de las células troncales mesenquimales se realiza mediante centrifugación a 2000 rpm y, tras desechar el sobrenadante, resuspensión de la fracción del estroma vacular (SVF) en medio de cultivo de ADMSCs del tipo DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 1 % de Penicilina/Estreptomicina, un 1 % de Glutamina y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento fibroblástico.

2. 2.

   Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicación 1, caracterizado por que la muestra de tejido adiposo obtenida se preserva a temperatura ambiente entre 18°C-22°C.

3. 3.

   Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado por que el mamífero es no humano.

4. 4.

   Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado por que el mamífero es una oveja.

5. 5.

   Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido

   5 adiposo de mamífero según reivindicaciones anteriores caracterizado por que la muestra de tejido adiposo se obtiene en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.
6. 6. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones 4 y 5 caracterizado por que la muestra de

   10 tejido adiposo se obtiene de la cola del mamífero en un único tiempo quirúrgico bajo estrictas condiciones de esterilidad y asepsia.
7. 7. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las suspensiones celulares obtenidas tras la fase de aislamiento se siembran

   15 en pocillos de 2 cm2 a una densidad de 30.000 células/cm2 , e incubadas a 37° C y 5% de CO2 en atmósfera húmeda, sometiéndose después los cultivos a un lavado con PBS para eliminar el componente eritrocitario, quedando en los pocillos únicamente las células ADMSCs capaces de adherirse a ellos; cambiando cada 2-3 días el medio de cultivo y,

   20 tripzinizando cultivos una vez alcanzado el estado de preconfluencia.
8. 8. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado por que las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo adipocítico, mediante su cultivo en medio adipogénico del tipo DMEM, 10% suero bovino fetal,

   25 1 % penicilina/estreptomicina, 1 % L-glutamina, 1JJM dexametasona, 0,5 mM IBMX,

   10 JJM insulina y 200 JJM indometacina.
9. 9. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores donde las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo condrogénico mediante su cultivo en medio condrogénico del tipo DMEM, 1 % suero bovino fetal, 1 % penicilina/estreptomicina, 1 % L-glutamina, 50 1-1 g/m I ácido ascórbico, 6,25 1-1 g/m I insulina y 1 Ong/ml TGF ~1.

   5 10. Método para producir células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo según reivindicaciones anteriores caracterizado por que las ADMSCs son diferenciadas hacia células de fenotipo osteogénico mediante su cultivo en medio osteogénico del tipo DMEM, 5% suero bovino fetal, 1 % penicilina/estreptomicina, 1 % L-glutamina, 101-1 M

   10 dexametasona, 150mM ácido L-ascórbico y 1OmM ~-glicerolfosfato, completando la inducción con la adición al medio de 10 ng/ml de proteína morfogenética 2 (BMP2).
10. 11. Células troncales mesenquimales derivadas de tejido adiposo

    caracterizado por que son obtenidas según el método de acuerdo a las 15 reivindicaciones anteriores.

    Figura 1

    Figura 2 Figura 3

    120,00 :g 100,00 í el ~ 80,00 ., :¡; ~ 60,00 1Z W ~ 40,00 z w ce 20,00 TEMPERATURA PRESERVACiÓN 105.000 O,OO--'-----'----~-----.l.-4 oc T. AMBIENTE

    400,00 "O ~ 300,00 el ~ ., ~ 200,00o 1Z W :¡¡ e z ~ 100,00 CONCENTRACiÓN DE COLAGENASAS 400.000 0,00--'-----,-----0,5 mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml

    AGITACiÓN MAGNÉTICA

    FILTRACiÓN
11. 125.000

    500,00
12. 467.000 125,00

    :g 400,00

    :g 100,00 í

    í

    el el

    ~

    ., ~ 75,00~ 300,00

    :¡; :¡;

    !¿ !¿

    o o

    Z

    w 200,00 z w 50,00

    :¡¡ :¡¡

    e e

    z z

    w w

    ce ce

    100,00 25,00

    0,00 0,00

    CON AGITACION SIN AGITACION CON FIL TRACION SIN FIL TRACION

    Figura 4

    CURVAS DE CRECIMIENTO
13. 200.000

    ....

    10 _

    ,,".",,-OP

    c3~

    ----m-----1P

    -

    oC/)

    1O.!2

    -

    o:::l

    "¡¡; ::¡ji

    c: (.)

    ~

    Figura 5

    TASAS DE EXPANSiÓN CELULAR

    Figura 6