ES2367918T5 - Procedimiento de fabricación de vacunas - Google Patents

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Description

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DESCRIPCIÓN
Procedimiento de fabricación de vacunas
La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para llevar a cabo las reacciones de condensación de carbodiimida. En particular, se refiere a la conjugación de sacáridos y proteínas mediante condensación de carbodiimida. También se refiere a composiciones inmunogénicas que se pueden producir que comprenden los conjugados de sacáridos y proteínas de la invención.
El uso de polisacáridos capsulares bacterianos ha sido ampliamente utilizado en inmunología durante muchos años para la prevención de enfermedades bacterianas. Un problema con dicho uso, sin embargo, es la naturaleza independiente de células T de la respuesta inmune. Estos antígenos son muy poco inmunogénicos en niños pequeños. Este problema ha sido superado por medio de la conjugación de los antígenos de polisacáridos a un vehículo proteico (una fuente de epítopos para células T ayudantes) que puede a continuación utilizarse para provocar una respuesta inmunitaria dependiente de células T, incluso en el primer año de vida.
En la técnica se conocen diversas técnicas de conjugación. Los conjugados también se pueden preparar mediante procedimientos de aminación reductora directa como se describe en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). En los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508 se describen otros procedimientos. El procedimiento de conjugación puede alternativamente depender de la activación de los grupos hidroxilo del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. Así el sacárido activado se puede acoplar directamente o a través de un grupo espaciador (conector) a un grupo amino en la proteína vehículo. Por ejemplo, el éster de cianato se puede acoplar con hexanodiamina o dihidrazida de ácido adípico (ADH o AH) y el sacárido derivatizado con un grupo amino se conjuga a la proteína vehículo usando química de la carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a través de un grupo carboxilo en el vehículo proteico. Esos conjugados se describen en la solicitud PCT publicada WO 93/15760 de la Universidad de Servicios Uniformados y en los documentos WO 95/08348 y WO 96/29094. Véase también Chu C. y col. Infect. Immunity, 1983, 245-256. El documento WO 99/18121 describe un procedimiento para la unión covalente de polisacárido a moléculas de proteínas.
En general pueden usarse los siguientes tipos de grupos químicos en un vehículo proteico para acoplamiento/conjugación:
A) Carboxilo (por ejemplo a través de ácido aspártico o ácido glutámico) que puede conjugarse a grupos amino naturales o derivatizados en restos de sacáridos usando química de la carbodiimida;
B) Grupo amino (por ejemplo a través de lisina) que puede conjugarse a grupos carboxilo naturales o derivatizados en restos sacárido usando química de la carbodiimida;
C) Sulfhidrilo (por ejemplo a través de cisteína);
D) Grupo hidroxilo (por ejemplo a través de tirosina);
E) Grupo imidazolilo (por ejemplo a través de histidina);
F) Grupo guanidilo (por ejemplo a través de arginina); y
G) Grupo indolilo (por ejemplo a través de triptófano).
En un sacárido, en general pueden utilizarse los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Los grupos aldehído pueden generarse tras utilizar diferentes tratamientos conocidos en la técnica, tales como: peryodato, hidrólisis ácida, peróxido de hidrógeno, etc.
Enfoques de acoplamiento directo:
Sacárido-OH + CNBr o CDAP -----> éster de cianato + NH2-Prot ----> conjugado sacárido-aldehído + NH2-Prot ----> base de Schiff + NaCNBH3 ----> conjugado sacárido-COOH + NH2-Prot + EDAC ----> conjugado sacárido-NH2 + COOH-Prot + EDAC ----> conjugado
Enfoques de acoplamiento indirecto por medio de un espaciador (conector)
Sacárido-OH + CNBr o CDAP ---> éster de cianato + NH2----NH2 ----> sacárido-NH2 + COOH-Prot + EDAC -----> conjugado
Sacárido-OH + CNBr o CDAP ----> éster de cianato + NH2-----SH -----> sacárido----SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida después de la modificación de grupos amino de la proteína por SPDP por ejemplo) -----> sacárido-S-S-Prot
Sacárido-OH + CNBr o CDAP ---> éster de cianato + NH2----SH -------> sacárido----SH + maleimida-Prot
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(modificación de grupos amino) ----> conjugado
Sacárido-COOH + EDAC + NH2-----NH2 ---> sacárido------NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado
Sacárido-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido----SH + SH-Prot (proteína nativa con una cisteína expuesta u obtenida tras la modificación de grupos amino de la proteína por SPDP por ejemplo) -----> sacárido-S-S-Prot
Sacárido-COOH + EDAC+ NH2----SH -----> sacárido----SH + maleimida-Prot (modificación de grupos amino) ----> conjugado
Sacárido-aldehído + NH2-----NH2 ----> sacárido---NH2 + EDAC + COOH-Prot ----> conjugado
Como puede observarse, la química de la carbodiimida (por ejemplo utilizando EDAC) es muy conveniente para las reacciones de conjugación ya que hace uso de grupos en los sacáridos y/o proteínas que pueden estar presentes de manera natural o que pueden fácilmente insertarse por derivatización. También une de manera conveniente restos a través de un enlace peptídico.
Las carbodiimidas (RN=C=NR’) son compuestos insaturados con una estructura de aleno (Nakajima and Ikada, 1995, Bioconjugate Chem. 6: 123-130; Hoare and Koshland, 1967, JBC 242: 2447-2453). El compuesto químico es relativamente inestable en su pH de reacción (4,5-6,5) y por lo tanto en la técnica se suelen añadir todos los componentes de la reacción de conjugación de sacárido/proteína/carbodiimida juntos.
Los presentes inventores han encontrado que dependiendo de la naturaleza del sacárido y la proteína a conjugar, se pueden lograr mejores características del conjugado final para el uso en vacunas añadiendo lentamente un componente determinado de la reacción a la mezcla. Al hacerlo pueden obtenerse una o más ventajas/mejoras tales como: rendimiento del sacárido en el conjugado, filtrabilidad estéril del conjugado, mejor control de la conjugación, mayor facilidad de reproducibilidad, y/o prevención de la formación de enlaces de reticulación intra-resto.
Por consiguiente, en una forma de realización se proporciona un procedimiento para fabricar una composición inmunogénica que comprende conjugar un sacárido a un vehículo proteico usando química de condensación de la carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo y en el que el vehículo proteico comprende, o ha sido derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de:
I) -Si el vehículo proteico comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacárido comprende bien grupos amino o bien grupos carboxilo:
a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación y
b) añadir la alícuota de vehículo proteico necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota se añade en la segunda mitad del período;
II) -Si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos amino o carboxilo:
a) mezclar el vehículo proteico y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación y
b) añadir la alícuota de sacárido necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota se añade en la segunda mitad del período;
III) -Si el sacárido comprende tanto grupos amino como grupos carboxilo y el vehículo proteico comprende tanto grupos amino como grupos carboxilo:
a) mezclar el vehículo proteico y el sacárido y
b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación en un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota se añade en la segunda mitad del período;
y en el que:
la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida por mg de sacárido;
el sacárido está presente en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b);
el vehículo proteico está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b);
la proporción inicial de vehículo proteico a sacárido es de 5:1 a 1:5 (p:p);
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la concentración de sal presente en la etapa b) es de 0-2 M;
el pH de la reacción en la etapa b) es de pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) está presente un compuesto que mantiene el intermedio de reacción estable; y
la temperatura de la reacción en la etapa b) es de 4-37 ºC.
Descripción detallada
Se puede utilizar cualquier carbodiimida adecuada con la condición de que sea capaz de conjugar sacáridos y proteínas en un medio acuoso. En una forma de realización, la carbodiimida puede ser EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) [también conocida como EDC] o puede ser una carbodiimida diferente de EDAC.
El término “sacárido” en la presente memoria descriptiva puede indicar polisacáridos u oligosacáridos e incluye ambos. Puede indicar lipopolisacárido (LPS) o lipooligosacárido (LOS). Antes de su uso los polisacáridos (tales como los polisacáridos bacterianos) pueden aislarse de una cepa fuente (por ejemplo de bacterias) o pueden aislarse a partir de la cepa fuente y se alteran sus tamaños en algún grado mediante procedimientos conocidos (véanse por ejemplo los documentos EP 497524 y EP 497525; Shousun Chen Szu y col., Carbohydrate Research Vol. 152, páginas 7-20 (1986)) por ejemplo por microfluidización. Los polisacáridos se pueden alterar en tamaño para reducir la viscosidad en las muestras de polisacáridos y/o mejorar la filtrabilidad de los productos conjugados. Los oligosacáridos tienen una serie baja de unidades de repetición (normalmente 5-30 unidades de repetición) y normalmente son polisacáridos hidrolizados.
El término “vehículo proteico” se desea que se refiera tanto a pequeños péptidos como a polipéptidos grandes (> 10 kDa). Los polipéptidos claramente grandes tienen más probabilidades de contener tanto grupos amino como carboxilo reactivos sin ninguna modificación.
A los objetos de la invención, “polisacárido nativo” se refiere a un sacárido que no ha sido sometido a ningún proceso, cuyo objetivo sea reducir el tamaño del sacárido. Se puede reducir ligeramente el tamaño de un polisacárido durante los procedimientos normales de purificación. Tal sacárido es todavía nativo. Solo si el polisacárido ha sido sometido a técnicas de alteración del tamaño el mismo no será considerado nativo.
Para los objetos de la invención, “alterado en tamaño por un factor de hasta x2” significa que el sacárido se somete a un procedimiento previsto para reducir el tamaño del sacárido pero para retener un tamaño superior a la mitad del tamaño del polisacárido nativo. X3, x4, etc. se deben interpretar de la misma forma es decir el sacárido se somete a un procedimiento previsto para reducir el tamaño del polisacárido pero para retener un tamaño superior a un tercio, un cuarto, etc., del tamaño del polisacárido nativo.
El período de 1 minuto a 6 horas en la etapa b) del procedimiento para la adición de la alícuota completa del componente final puede ser de 1 minuto a 4 horas, de 2 minutos a 3 horas, de 3 minutos a 2 horas, de 4 a 60 minutos, de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos. Puede ser de 1 minuto a 5 horas, de 10 minutos a 4 horas, de 20 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 2 horas, de 40 a 90 minutos, o de 50 a 70 minutos. Este tiempo se puede ajustar según el sacárido y la proteína específicos que se conjugan.
En una forma de realización, la alícuota del componente final (por ejemplo de carbodiimida, sacárido o proteína) se añade a la mezcla de reacción a una velocidad constante durante el período de tiempo (esto se logra de manera conveniente mediante una bomba que funciona a una velocidad constante). Como alternativa se puede añadir en etapas durante el período de tiempo. Aunque esto puede hacerse de muchas maneras, en general se deben añadir partes de la alícuota durante todo el período. Según la invención al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota se añade en la segunda mitad del período. La cantidad total de la alícuota 'a' medida, por ejemplo, en ml o mg puede añadirse en 4-100 etapas ('e') durante todo el período. En una forma de realización las etapas se organizan de modo tal que una cantidad exacta (a/e) se introduce en todas las etapas. En una forma de realización las etapas son espaciadas uniformemente durante todo el período 'p' (en segundos). Por consiguiente si una etapa tiene lugar en el tiempo cero del período 'p', a continuación cada etapa posterior tendrá lugar en un tiempo que es p/(e-1). El volumen de la alícuota del componente final añadido en la etapa b) puede ajustarse en términos de facilidad de adición de la alícuota a la reacción en el plazo de tiempo deseado. La carbodiimida puede añadirse en forma de una solución acuosa (normalmente tamponada a pH 7,5 antes de ser añadida a la reacción) o como un polvo sólido (EDAC por ejemplo es muy soluble en medios acuosos). Por supuesto si la carbodiimida es el último componente añadido a la reacción (situación III, etapa b)), se puede utilizar una carbodiimida de solución lenta de manera que toda la alícuota de polvo se añade a la reacción de una vez pero se disuelve a una velocidad coherente con el período deseado durante el que la alícuota se pone a disposición de la reacción.
Si la proteína y/o el sacárido no tiene grupos amino o carboxilo (o solo tiene uno de estos), los mismos pueden derivatizarse para incorporarles uno (o para incorporarles el otro si aún no lo tienen). Por ejemplo para un sacárido que solo comprende grupos hidroxilo reactivos (por ejemplo el sacárido capsular del meningococo serogrupo A), se debe utilizar tal grupo para derivatizarlo y convertirlo en grupos amino o carboxilo para que la condensación con EDAC pueda llevarse a cabo. Esto puede tener lugar dentro de una subunidad de repetición, o puede ser un grupo
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que solo está presente al final de la molécula de sacárido.
Debe señalarse que cuando tiene lugar la derivatización, puede resultar beneficioso derivatizar solo parcialmente el resto. Para sacáridos con subunidades de repetición, el epítopo diana puede estar presente en cada repetición. Por lo tanto si tiene lugar la derivatización parcial (por esto se entiende que se derivatizan realmente del 0,5 al 20, del 1 al 15, del 3 al 12 o del 5 al 10% de los grupos reactivos diana) esta puede tener la ventaja de conservar la mayoría de los epítopos y evitar demasiada reticulación.
Si un sacárido o proteína ya tiene grupos amino o carboxilo únicamente (por ejemplo el sacárido Vi de Salmonella typhi que naturalmente tiene grupos carboxilo pero no tiene grupos amino), la derivatización puede tener lugar para incorporarle el otro tipo de grupo (es decir grupos amino para Vi). Debe señalarse, no obstante, que como la derivatización puede ser parcial esta acción puede cambiar la reacción preferida de la invención de una tipo I a una tipo III. Por ejemplo si se conjuga el sacárido Vi a un vehículo proteico que comprende tanto grupos amino como carboxilo la situación I añade la alícuota de proteína lentamente en la etapa b). Si el grupo carboxilo del sacárido Vi se derivatiza parcialmente con grupos amino tendrá tanto grupos carboxilo como amino, por consiguiente la situación III de añadir lentamente la alícuota de carbodiimida en la etapa b) pasa a ser la más relevante.
La derivatización puede producirse mediante la adición de un conector hetero-u homo-bifuncional. Puede tener lugar con química similar a la descrita anteriormente para la etapa de conjugación de sacárido y proteína (por ejemplo química del CDAP o de la carbodiimida). El conector puede tener entre 4 y 20, entre 4 y 12, o entre 5 y 10 átomos de carbono. Puede tener dos grupos amino reactivos, dos grupos carboxilo reactivos, o uno de cada uno (por ejemplo, hexano diamina, ácido 6-aminocaproico o dihidrazida del ácido adípico). Normalmente la derivatización tiene lugar a través de la reacción de un exceso del conector con el sacárido y/o el vehículo proteico a derivatizar. Esto permite que la derivatización tenga lugar con mínima reticulación intra-resto (que de otro modo podría ser posible si por ejemplo un grupo carboxilo de un sacárido se estuviera derivatizando con grupos amino usando condensación de la carbodiimida). El exceso de conector se elimina fácilmente utilizando técnicas tales como la diafiltración.
En una forma de realización el sacárido comprende un grupo hidroxilo reactivo como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo amino del conector (por ejemplo con la química del CDAP). En otra forma de realización el sacárido comprende un grupo amino reactivo como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo carboxilo del conector (por ejemplo con la química de la carbodiimida). En una forma de realización más el sacárido comprende un grupo carboxilo reactivo como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo amino del conector (por ejemplo con la química de la carbodiimida).
La alícuota de carbodiimida requerida para realizar la conjugación (si está presente en la etapa a) o b) de la reacción de la invención) es de 0,01 a 3, de 0,05 a 2 o de 0,09 a 1 mg de carbodiimida/mg de sacárido. Aunque estos números se calcularon con respecto a EDAC como la carbodiimida, estos números pueden ajustarse si se utiliza cualquier otra carbodiimida multiplicando los números del intervalo por: (peso molecular de otra carbodiimida)/(peso molecular de EDAC).
El sacárido está presente en los procedimientos de la invención en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b). Esto dependerá del tamaño y de la naturaleza del sacárido y del alcance de cualquier derivatización. Por ejemplo para los oligosacáridos será necesaria una mayor concentración, pero para los polisacáridos grandes resultará más apropiada una concentración mucho menor. Si está presente hacia el extremo superior del parcialmente derivatizado con grupos amino o carboxilo puede ser adecuada una concentración menor para reducir la posibilidad de reticulación. El vehículo proteico está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b).
La relación inicial de vehículo proteico a sacárido en los procedimientos de la invención es de 5:1 a 1:5, de 4:1 a 1:1
o de 3:1 a 2:1 (p/p). Nuevamente, esto dependerá del tamaño y de la naturaleza del sacárido y del alcance de cualquier derivatización.
Las condiciones de salinidad (por ejemplo de NaCl) también pueden variar de acuerdo con la naturaleza del sacárido/proteína. Por lo general puede estar presente NaCl alrededor de 0,2 M en la etapa b) de los procedimientos de la invención, pero puede ser de 0-2, de 0,1-1 o de 0,2-0,5 M. La concentración de sal presente en la etapa b) es de 0-2 M.
En términos de pH en la etapa b) de los procedimientos de la invención, el pH de la reacción es cualquier pH en el que la carbodiimida esté activada -que es un pH de 4,5-6,5, 4,7-6,0 o 5-5,5. Este pH normalmente se mantiene a lo largo de la reacción por medio de la adición de ácido/base según sea necesario. EDAC es generalmente estable a pH 7,5, aunque si es necesario realizar la conjugación a compuestos de pH superiores que se sabe que mantienen el intermedio de reacción estable (tal como N-hidroxisuccinimida) también pueden estar presentes en la reacción en la etapa b), en cuyo caso el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene en un pH de 4,5-7,5.
La temperatura de reacción durante la etapa b) de los procedimientos de la invención es de 4-37, 10-32, 17-30 o 2227 ºC y normalmente se mantiene a lo largo de la reacción.
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En los procedimientos de la invención, una vez que se ha añadido toda la alícuota en la etapa b) la reacción se mantiene normalmente durante otros 10 minutos a 72 horas, 20 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas, 40 minutos a 12 horas, 50 minutos a 6 horas, o 1-3 horas. Una vez finalizada la reacción se ajusta el pH hasta 7,5-9 (hacia el extremo superior de este si está presente N-hidroxisuccinimida) para volver al intervalo de pH en el que es estable la carbodiimida.
Una vez conjugado, el conjugado de sacárido-proteína puede purificarse de: componentes sin reaccionar, sacáridos libres, etc. mediante la inyección del mismo en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (por ejemplo, Sephacryl S400HR, Pharmacia). Esto se realiza normalmente a 2-8 ºC. El conjugado puede filtrarse estéril y se puede almacenar a continuación. Finalmente se puede formular una dosis eficaz (por ejemplo 1-20, 2-15 o 3-10 μg de sacárido/dosis) del conjugado de sacárido-proteína con un excipiente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo una sal o adyuvante) para la fabricación de una composición inmunogénica o vacuna.
En términos de los sacáridos de la invención, se puede conjugar cualquier sacárido de origen viral, fúngico, bacteriano o eucariota por medio de los procedimientos de la invención. Puede ser el sacárido Vi de Salmonella typhi, o un sacárido diferente de Vi. Puede ser el sacárido capsular Hib de H. influenzae tipo b, o puede ser un sacárido diferente de Hib. En una forma de realización el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo (MenA), B (MenB), C (MenC), W135 (MenW) o Y (MenY), Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae o
H. influenzae tipo b.
El peso molecular promedio en peso del sacárido puede ser de 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 o 100000-200000. El peso molecular o peso molecular promedio de un sacárido en el presente documento se refiere al peso molecular (Mw) promedio en peso del sacárido medido antes de la conjugación y se mide por medio de MALLS. La técnica de MALLS se conoce bien en la técnica y se suele llevar a cabo como se describe en el ejemplo 2. Para los análisis por MALLS de sacáridos, se pueden usar dos columnas (TSKG6000 y 5000PWxl) en combinación y los sacáridos se eluyen en agua. Los sacáridos se detectan usando un detector de dispersión de luz (por ejemplo Wyatt Dawn DSP equipado con un láser de argón de 10 mW a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (por ejemplo Wyatt Otilab DSP equipado con una célula P100 y un filtro rojo a 498 nm). En una forma de realización, la polidispersidad del sacárido es de 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 o 1-1,05 y después de la conjugación a una proteína vehículo, la polidispersidad del conjugado es de 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,0-1,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 o 1,5-2,0. Todas las mediciones de polidispersidad se realizan por MALLS.
El sacárido puede ser bien un polisacárido nativo o bien puede haberse alterado en tamaño por un factor de no más de 2, 4, 6, 8, 10 o 20 veces (por ejemplo por microfluidización [por ejemplo por medio del aparato Emulsiflex C-50] u otra técnica conocida [por ejemplo por procedimientos de calor, químicos, de oxidación, de sonicación]). Los oligosacáridos pueden haberse alterado en tamaño considerablemente más [por ejemplo por procedimientos conocidos de calor, químicos o de oxidación].
Se conocen las estructuras de la mayoría de estos sacáridos (y por lo tanto si tienen naturalmente cualesquiera grupos amino o carboxilo para la química de la carbodiimida, o cualquier otro grupo reactivo que pueda ser derivatizado con grupos amino o carboxilo (véase la tabla a continuación)).
Grupo NH2 natural
Grupo COOH natural Otro grupo reactivo
S. aureus
PS5
No Sí OH
PS8
No Sí OH
N. meningitidis
MenA
No No OH
MenC
No Sí OH
MenW135
No Sí OH
MenY
No Sí OH
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(continuación)
Grupo NH2 natural
Grupo COOH natural Otro grupo reactivo
MenB
No (se puede generar por des-Nacetilación) Sí OH/N-propilo
Grupo B de Streptococcus
Ia, Ib
No Sí OH
II
No Sí OH
III
No Sí OH
IV
No Sí OH
V
No Sí OH
VI
No Sí OH
VII
No Sí OH
S. typhi
Vi
No Sí No
S. pneumoniae
PS1
Sí Sí OH
PS3, 4, 5, 8, 9, 12F
No Sí OH
Vibrio cholerae
Sacárido capsular
Sí No OH
Hib de H. influenzae B
No No OH
LOS
Nmen/ Mcat/ Hi
Sí en PEA Sí en KDO OH
El sacárido puede ser un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano (véase la tabla anterior), por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: Neisseria meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis. El LOS puede ser del inmunotipo meningocócico L2, L3 o L10. Se puede destoxificar por tratamiento alcalino de su resto lípido A.
En una forma de realización, el sacárido capsular MenA, está al menos parcialmente O-acetilado de modo que al
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menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una posición. La O-acetilación está presente por ejemplo al menos en la posición O-3 de al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una forma de realización, el sacárido capsular MenC, está al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición NeuNAc unidas por (α2 →9) están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La Oacetilación está presente por ejemplo en la posición O-7 y/o en la posición O-8 de al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una forma de realización, el sacárido capsular MenW, está al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está presente por ejemplo en la posición O-7 y/o en la posición O-9 de al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. En una forma de realización, el sacárido capsular MenY, está al menos parcialmente O-acetilado de modo que al menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición están O-acetiladas en al menos una o dos posiciones. La O-acetilación está presente en la posición 7 y/o 9 de al menos el 20%, 30%, 40%, 50%. 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de las unidades de repetición. El porcentaje de O-acetilación se refiere al porcentaje de unidades de repetición que contienen O-acetilación. Esto puede medirse en el sacárido antes de la conjugación y/o después de la conjugación.
El vehículo proteico puede ser cualquier péptido o proteína. Puede comprender uno o más epítopos de células T ayudantes. En una forma de realización de la invención el vehículo proteico se selecciona del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D de H. influenzae, PhtD del neumococo y neumolisina del neumococo. Una proteína vehículo puede ser el toxoide del tétanos (TT), el fragmento C del toxoide del tétanos, mutantes no tóxicos de la toxina tetánica [nótese que todas esas variantes de TT se considera que son el mismo tipo de proteína vehículo a los efectos de la presente invención], el toxoide de la difteria (DT), CRM 191, otros mutantes no tóxicos de la toxina de la difteria [tales como CRM 176, CRM 197, CRM 228, CRM 45 (Uchida y col. J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 y CRM 107 y otras mutaciones descritas por Nicholls y Youle en Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleciones o mutaciones de la Glu-148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones dadas a conocer en el documento US 4709017
o US 4950740; la mutación de al menos uno o más residuos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones dadas a conocer en el documento US 5917017 o en el documento US 6455673; o un fragmento dado a conocer en el documento US 5843711] (nótese que todas esas variantes de DT se considera que son el mismo tipo de proteína vehículo a los efectos de la presente invención), la neumolisina de neumococo (Kuo y col. (1995) Infect Immun 63; 2706-2713), la OMPC (proteína de la membrana externa de meningococo -normalmente extraída del serogrupo B de N. meningitidis– documento EP 0372501), péptidos sintéticos (documentos EP 0378881, EP 0427347), proteínas de choque térmico (documentos WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas de pertussis (documentos WO 98/58668, EP 0471177), citocinas, linfocinas, factores de crecimiento u hormonas (documento WO 91/01146), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas procedentes de antígenos derivados de diversos patógenos (Falugi y col. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) tales como la proteína N19 (Baraldoi y col. (2004) Infect Immun 72; 4884-4887), la proteína superficial de neumococo PspA (documento WO 02/091998), proteínas de captación de hierro (documento WO 01/72337), toxina A o B de C. difficile (documento WO 00/61761), proteína D de H. influenzae (documentos EP 594610 y WO 00/56360), PhtA del neumococo (documento WO 98/18930, también denominada Sp36), PhtD del neumococo (dada a conocer en el documento WO 00/37105 y también se denomina Sp036D), PhtB del neumococo (dada a conocer en el documento WO 00/37105 y también se denomina Sp036B) o PhtE (dada a conocer en el documento WO 00/30299 y se denomina BVH-3).
En un aspecto adicional de la invención se proporciona un conjugado de sacárido y vehículo proteico (o una composición inmunogénica o vacuna) que puede obtenerse u obtenido por el procedimiento de la invención.
Además se proporciona un uso de la composición inmunogénica o vacuna de la invención en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades y un procedimiento para evitar o tratar la enfermedad que comprende la etapa de administrar una dosis eficaz de la composición inmunogénica o vacuna de la invención a un paciente que necesita la misma. El uso o el procedimiento pueden ser tales que la enfermedad esté causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Streptococcus de Grupo B, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli y H. influenzae.
Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender una vacuna DTPa o DTPw (por ejemplo una que contiene DT, TT y bien una vacuna de células completas de pertussis (Pw) o bien una vacuna acelular de pertussis (Pa) (que comprende por ejemplo toxoide de pertussis, FHA, pertactina y opcionalmente, aglutinógenos 2 y 3)). Tales combinaciones también pueden comprender una vacuna contra la hepatitis B (por ejemplo puede comprender antígeno de superficie de la hepatitis B [HepB], opcionalmente adsorbido en fosfato de aluminio). En una forma de realización la composición inmunogénica de la invención comprende conjugados de sacáridos Hib, MenA y MenC, conjugados de sacáridos Hib y MenC, o conjugados de sacáridos Hib, MenC y MenY,
o conjugados de sacáridos MenA, MenC, MenW y MenY, en la que al menos uno, dos o todos los conjugados de sacáridos se generan según el procedimiento de la invención.
Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden opcionalmente antígenos virales adicionales que
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confieren protección contra la enfermedad causada por el sarampión, las paperas y/o la rubéola y/o la varicela. Por ejemplo, la composición inmunogénica de la invención contiene antígenos de sarampión, paperas y rubéola (MMR) o de sarampión, paperas, rubéola y varicela (MMRV). En una forma de realización, estos antígenos virales están presentes de manera opcional en el mismo recipiente que el (los) conjugado(s) de sacáridos de meningoco y/o Hib presentes en la composición. En una forma de realización, estos antígenos virales están liofilizados.
En una forma de realización, la composición inmunogénica de la invención además comprende un antígeno de N. meningitidis serogrupo B. El antígeno es opcionalmente una preparación de vesículas de membrana externa de N. meningitidis serogrupo B como se describe en los documentos EP301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 y WO 04/14419.
En general, la composición inmunogénica de la invención puede comprender una dosis de cada conjugado de sacáridode entre 0,1 y 20 µg, 2 y 10 µg, 2 y 6 µg o 4 y 7 µg de sacárido.
“En torno” o “aproximadamente” se definen como dentro del 10% superior o inferior de la cifra dada para los efectos de la invención.
En una forma de realización, la composición inmunogénica de la invención se tampona o se ajusta a, o se ajusta a entre pH 7,0 y 8,0, pH 7,2 y 7,6 o en torno o exactamente a pH 7,4.
La composición inmunogénica o vacunas de la invención opcionalmente se liofilizan en presencia de un agente estabilizante por ejemplo un poliol tal como sacarosa o trehalosa.
Opcionalmente, la composición inmunogénica o vacuna de la invención contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria al inmunógeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a, sales de aluminio (fosfatos de aluminio o hidróxido de aluminio), mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, monofosforil lípido A, derivados del ácido micólico, tensioactivos de copolímeros en bloque no iónicos, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados y complejos inmunoestimuladores (ISCOM) tales como los descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344: 873-875.
Para combinaciones de N. meningitidis o de HibMen, puede ser ventajoso no utilizar ningun adyuvante de sal de aluminio o ningún adyuvante en general.
Como ocurre con todas las composiciones inmunogénicas o vacunas, las cantidades inmunológicamente eficaces de los inmunógenos se deben determinar empíricamente. Los factores a considerar incluyen la inmunogenicidad, si el inmunógeno se complejará con o se unirá covalentemente a un adyuvante o proteína vehículo u otro vehículo, o no, la vía de administraciones y el número de dosificaciones inmunizadoras a administrarse.
El agente activo puede estar presente en concentraciones variables en la composición farmacéutica o vacuna de la invención. Normalmente, la concentración mínima de la sustancia es una cantidad necesaria para conseguir su uso previsto, mientras que la concentración máxima es la cantidad máxima que permanecerá en solución o se suspenderá de manera homogénea dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad mínima de un agente terapéutico es opcionalmente una que proporcionará una única dosificación terapéuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentración mínima es una cantidad necesaria para la bioactividad tras la reconstitución y la concentración máxima se encuentra en el punto en el que no se puede mantener una suspensión homogénea. En el caso de unidades de monodosis, la cantidad es la de una sola aplicación terapéutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-100 μg de antígeno de proteína, opcionalmente 5-50 μg o 5-25 μg. Por ejemplo, las dosis de sacáridos bacterianos son de 10-20 μg, 10-5 μg, 2,5-5 μg o 1-2,5 μg de sacárido en el conjugado.
Las preparaciones de vacuna de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero (por ejemplo un paciente humano) susceptible de infección, por medio de la administración de dicha vacuna a través de una vía sistémica o de mucosa. Un paciente humano es opcionalmente un bebé (menor de 12 meses de edad), un niño pequeño (de 12 a 24, 12 a 16 o 12 a 14 meses de edad), un niño (de 2 a 10, de 3 a 8 o de 3 a 5 años de edad), un adolescente (de 12 a 21, de 14 a 20 o de 15 a 19 años de edad) o un adulto. Estas administraciones pueden incluir la inyección a través de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración por vía mucosal en los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Se prefiere la administración por vía intranasal de vacunas para el tratamiento de neumonía u otitis media (puesto que se puede evitar más eficazmente el transporte nasofaríngeo de neumococos, atenuando así la infección en su fase más temprana). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar en forma de dosificación única, sus componentes también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo si los sacáridos están presentes en una vacuna estos se pueden administrar por separado al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración de una vacuna de proteínas bacterianas para la coordinación óptima de las respuestas inmunitarias entre sí). Además de una sola vía de administración, se pueden usar dos vías de administración diferentes. Por ejemplo, los antígenos virales se pueden administrar ID (por vía intradérmica), mientras que las proteínas bacterianas se pueden administrar IM (por vía intramuscular) o IN (por vía intranasal). Si están presentes los sacáridos, se pueden administrar IM (o ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar IN (o ID). Además, las vacunas de la invención se pueden administrar IM para primeras dosis e IN para dosis de refuerzo.
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La preparación de vacuna se describe, en general, en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (eds. Powell M.F. y Newman M.J.) (1995) Plenum Press Nueva York). El encapsulamiento dentro de liposomas está descrito por Fullerton, Patente de EE.UU. N.º: 4.235.877.
Otro aspecto de la invención es un proceso para generar la composición inmunogénica o vacuna de la invención, que comprende la etapa de mezclar los sacáridos MenA y MenC de la invención producidos por el procedimiento de la invención, con MenW y MenY que no se han producido según la invención y con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los términos “que comprende”, “comprenden” y “comprende” en el presente documento está previsto por los autores de la invención que sean sustituibles de manera opcional con los términos “que consiste en”, “consiste en” y “consisten en”, respectivamente, en cada caso.
La invención se ilustra en los ejemplos siguientes. Los ejemplos siguientes se llevaron a cabo usando técnicas habituales, que son muy conocidas y rutinarias para los expertos en la materia, salvo cuando se describa en detalle de otra manera. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitativos de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 – Preparación de conjugados de polisacáridos
Ejemplo 1a – Preparación de conjugado de polisacárido capsular de meningococo Men A y MenC según la invención
Los conjugados MenC-TT se produjeron usando polisacáridos nativos (de más de 150 kDa según la medición por medio de MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados MenA-TT se produjeron bien usando polisacárido nativo o bien polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa según la medición por medio del procedimiento MALLS del ejemplo 2. La alteración de tamaños fue por microfluidización usando un aparato homogenizador Emulsiflex C-50. A continuación los polisacáridos se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm.
Para conjugar el polisacárido capsular MenA al toxoide del tétanos a través de un espaciador, se usó el siguiente procedimiento. La unión covalente del polisacárido y el espaciador (ADH) se llevó a cabo mediante química de acoplamiento por la que el polisacárido se activa en condiciones controladas mediante un agente cianilante, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP). El espaciador reacciona con el PS cianilado a través de los grupos hidrazino, para formar un enlace isourea estable entre el espaciador y el polisacárido.
Se trató una solución de 10 mg/ml de MenA (pH 6,0) [3,5 g] con una solución de 100 mg/ml recién preparada de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una relación CDAP/MenA de 0,75 (p/p). Después de 1,5 minutos, el pH se incrementó hasta pH 10,0. Tres minutos más tarde, se añadió ADH para obtener una relación de ADH/MenA de 8,9. El pH de la solución se redujo hasta 8,75 y la reacción prosiguió durante 2 horas manteniendo este pH (manteniendo la temperatura en 25 ºC).
La solución PSAAH se concentró hasta un cuarto de su volumen inicial y a continuación se diafiltró con 30 volúmenes de NaCl 0,2 M usando una membrana Filtron Omega con un límite de filtración de 10k Da y se filtró el retenido.
Antes de la reacción de conjugación (condensación de la carbodiimida), la solución de TT purificada y la solución de PSAAH se diluyeron hasta alcanzar una concentración de 10 mg/ml para el PSAAH y 10 mg/ml para la TT.
Se añadió EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) a la solución de PSAH (2 g de sacárido) para alcanzar una relación final de 0,9 mg de EDAC/mg de PSAAH. El pH se ajustó a 5,0. El toxoide del tétanos purificado se añadió con una bomba peristáltica (en 60 minutos) hasta alcanzar los 2 mg de TT/mg de PSAAH. La solución resultante se dejó 60 minutos a +25 ºC en agitación para obtener un periodo de acoplamiento final de 120 minutos. La solución se neutralizó añadiendo Tris-HCl 1 M pH 7,5 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a +25 ºC y a continuación durante la noche a una temperatura de +2 ºC a +8 ºC.
El conjugado se aclaró usando un filtro de 10 μm y se purificó usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibró en Tris-HCl 10 mM (pH 7,0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aproximadamente 660 ml) se cargó en la columna (+2 ºC a + 8 ºC). La combinación de elución se seleccionó en función de la densidad óptica a 280 nm. La recogida comenzó cuando la absorbancia aumentó hasta 0,05. La recogida continuó hasta que Kd alcanzó el valor 0,30. El conjugado se esterilizó por filtración a +20 ºC, a continuación se almacenó a una temperatura de +2 ºC a +8 ºC. El conjugado resultante tenía una relación de polisacárido:proteína de 1:2-1:4 (p/p).
Para conjugar el polisacárido capsular MenC al toxoide tetánico a través de un espaciador, se utilizó el siguiente procedimiento. La unión covalente del polisacárido y el separador (ADH) se llevó a cabo por una química de acoplamiento por la que se activó el polisacárido según condiciones controladas por medio de un agente de cianilación, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio (CDAP). El espaciador reaccionó con el PS cianilado a través de sus grupos hidrazino, formando un enlace de isourea estable entre el espaciador y el polisacárido.
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Se trató una solución de 20 mg/ml de MenC (pH 6,0) (3,5 g) con una solución recién preparada de 100 mg/ml de CDAP en acetonitrilo/agua (50/50 (v/v)) para obtener una relación de CDAP/MenC de 1,5 (p/p). Después de 1,5 minutos, el pH se elevó hasta pH 10,0. En el pH de activación se añadió NaCl 5 M hasta lograr una concentración final de NaCl 2 M. Tres minutos más tarde, se añadió ADH para obtener una relación de ADH/MenC de 8,9. El pH de la solución se redujo hasta 8,75 y la reacción prosiguió durante 2 horas (mantenida a 25 ºC).
La solución de PSCAH se concentró hasta un mínimo de 150 ml y a continuación, se diafiltró con 30 volúmenes de NaCl 0,2 M utilizando una membrana Filtron Omega con un límite de filtración de 10 kDa y se filtró el retenido.
Antes de la reacción de conjugación, se diluyó la solución purificada de TT y la solución PSCAH (escala de 2 g) en NaCl 0,2 M para llegar a una concentración de 15 mg/ml para PSCAH y de 20 mg/ml para TT.
Se añadió el toxoide tetánico purificado a la solución de PSCAH para llegar a 2 mg de TT/mg de PSCAH. El pH se ajustó a 5,0. Se añadió EDAC (16,7 mg/ml en Tris 0,1 M, pH 7,5) con una bomba peristáltica (en 10 minutos) hasta llegar a una relación final de 0,5 mg de EDAC/mg de PSCAH. La solución resultante se dejó durante 110 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación se neutralizó la solución por la adición de Tris-HCl 1 M, pH 9,0 (1/10 del volumen final) y se dejó 30 minutos a + 25 ºC y durante la noche a una temperatura de + 2 ºC a + 8 ºC.
El conjugado se aclaró usando un filtro de 10 μm y se purificó usando una columna de Sephacryl S400HR (Pharmacia, Suecia). La columna se equilibró en Tris-HCl 10 mM (pH 7.0), NaCl 0,075 M y el conjugado (aproximadamente 460 ml) se cargó en la columna (+2 ºC a + 8 ºC). La combinación de elución se seleccionó en función de la densidad óptica a 280 nm. La recogida comenzó cuando la absorbancia aumentó hasta 0,05. La recogida continuó hasta que Kd alcanzó el valor 0,20. El conjugado se esterilizó por filtración a +20 ºC, a continuación se almacenó a una temperatura de +2 ºC a +8 ºC. El conjugado resultante tenía una relación de polisacárido:proteína de 1:2-1:4 (p/p)
Se realizaron varios experimentos añadiendo EDAC durante 10-45 minutos -en todos los casos el resultado fueron conjugados de MenC de buena calidad. Sin embargo si se añadía el vehículo de TT último lentamente a la mezcla de MenC-ADH + EDAC se obtenía un gel -un conjugado que no podía ser purificado.
También se realizaron experimentos añadiendo la EDAC toda a la vez en la reacción pero la relación final de TT/PS (2,7/1) (p/p) del conjugado fue inferior a la del conjugado obtenido a través de la reacción donde la EDAC se añadió durante 10 minutos (3,3/1); además, tanto la antigenicidad de αTT como la de αPS fue inferior a la medida en comparación con el conjugado obtenido por la reacción en la que la EDAC se añadió durante 10 minutos.
Nota sobre el % aproximado de derivatización de los polisacáridos
MenCAH: tras el tratamiento con CDAP y con ADH aproximadamente el 3,47% de los grupos hidroxilo se derivatizaron con ADH (con una estimación de dos grupos hidroxilo disponibles por subunidad de repetición). Para MenA: aproximadamente el 11,5% de los grupos hidroxilo se derivatizaron con ADH (considerando que solo hay un grupo hidroxilo disponible por unidad de repetición).
Ejemplo 1b – preparación del conjugado de polisacárido capsular de neumococo PS 3
1) Proceso de PS03-TTAH: PS03-TTAH208
Alteración detamaños por medio de Emulsiflex
Se pesó el PS sobre la base de un contenido de humedad teórico del 10%. Se disolvió el PS nativo durante la noche en NaCl 2 M a una concentración inicial de 3 mg/ml. Antes de la alteración de tamaños, se aclaró la solución de PS nativo en un filtro con límite de filtración de 5 µm.
Se utilizó un aparato homogenizador EMULSIFLEX C-50 para reducir el peso molecular y la viscosidad del polisacárido antes de la etapa de activación. La eficiencia de la alteración de tamaños depende de la presión del circuito, la presión de alimentación del émbolo y del número total de ciclos. A fin de mejorar la eficiencia de la alteración de tamaños (y por consiguiente reducir el número total de ciclos), se sustituyó la celda de homogenización del Emulsiflex con una celda con una geometría fijada (Microfluidics F20Y-cámara de interacción de 0,75 µm). El objetivo de la alteración de tamaños era reducir el peso molecular y la viscosidad del PS sin una disminución importante de su antigenicidad.
La reducción de tamaño se realizó a 4.080 y 3.400 kPa y se hizo el seguimiento intra-proceso por medio de la medición de la viscosidad. La alteración de tamaños se detuvo cuando se alcanzó el objetivo de 2,0 ± 0,2 cP.
Filtración del PS alterado en tamaño en 0,22 µm
El PS alterado en tamaño se filtró en una membrana Millipak (límite de filtración de 0,22 mm) a un caudal de 10 ml/min.
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Derivatización de TT
La etapa de derivatización se realizó a 25 ºC en agitación continua en un baño de agua de temperatura controlada. El TT se diluyó en NaCl 0,2 M para obtener una concentración final de TT de 25 mg/ml. Se añadió la ADH en forma sólida a la solución de TT hasta llegar a una concentración final de 0,2 M. Después de la solución completa de ADH, se ajustó el pH de la solución en pH 6,2 +/-0,1 con HCl.
A continuación se añadió EDAC a la solución de TT/ADH para llegar a una concentración final de 0,02 M. El pH se ajustó en 6,2 +/-0,1 con HCl y se mantuvo con regulación del pH durante 1 hora. Después de la etapa de derivatización, el pH se elevó hasta pH 9,5 con NaOH para detener la reacción. La solución se dejó durante 2 horas con regulación de pH antes de la etapa de diafiltración.
Diafiltración
El derivado TTAH se diafiltró para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltración se realizó en una membrana Centramate (0,09 m2, límite de filtración de 10 kDa). La solución se dializó contra 20 volúmenes de NaCl 0,2 M.
El seguimiento de la etapa de diafiltración se realizó por medio de una cuantificación de ADH (ensayo TNBS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración.
Filtración en 0.22 µm
El TTAH finalmente se filtró en la membrana de límite de filtración de 0,22 µm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuación el TTAH filtrado se almacenó a -70 ºC.
Conjugado de PS3-TTAH
Las condiciones del proceso fueron las siguientes:
Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relación inicial de TTAH/PS3 de 1,5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0,5 mg/mg PS y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.
Se diluyeron 50 mg de PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución purificada de TTAH se diluyó en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentración de 10 mg/ml. Se ajustó el pH de la solución de PS3 a pH 5 con HCl.
Se añadió la EDAC en forma sólida a la solución de PS3 para llegar a una concentración final de 0,5 mg de EDAC/mg de PS. El pH se ajustó a 5,0 ± 0,05 con HCl y se añadió TTAH manualmente en 11 minutos (alícuotas/min). La solución resultante se incubó durante 109 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación, se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejó 30 minutos a + 25 ºC. Finalmente se aclaró el conjugado en una membrana de 5 µm y se inyectó en una columna de Sephacryl S400HR.
2) Proceso de PS03-TTAH : PS03AH-TT215
Alteración detamaños por medio de Emulsiflex
Como anteriormente.
Filtración del PS alterado en tamaño en 0,22 µm
Como anteriormente.
Derivatización de PS3
La etapa de derivatización se realizó a 25 ºC en agitación continua en un baño de agua de temperatura controlada. Se diluyó el PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentración final de PS de 3 mg/ml. La solución de PS se ajustó a pH 6,0 antes de la adición de CDAP (PS 0,25 mg/mg, solución a 100 mg/ml de una mezcla de acetonitrilo/WFI). El pH se aumentó a pH 9,5 con NaOH antes de la adición de ADH (8,9 mg de ADH/mg de PS, solución a 100 mg/ml en NaCl 0,2 M). El pH se mantuvo en 9,5 y se reguló durante 60 minutos. El porcentaje de derivatización correspondió al 2,4% (2,4 mg de ADH/100 mg de PS). Esto puede medirse con técnicas conocidas: TNBS para la estimación de ADH; y DMAB o resorcinol (Monsigny y col., (1988) Anal. Biochem. 175, 525-530) para la cuantificación de PS. En este caso, la determinación de TNBS fue de 228 µg/ml y dosificación de PS: 5250 µg/ml.
Dado que el Mw de ADH es de 174,2 y el Mw de la unidad de repetición de PS3 es 338,27 (con 1 grupo COOH y 4 grupos OH), hay 1,3 µmoles de ADH/15,52 µmoles de unidad de repetición, o 1,3 µmoles de ADH/62,08 µmoles de grupo reactivo hidroxilo. El 2,09% de los grupos hidroxilo de PS3 eran grupos hidroxilo modificados con ADH.
Diafiltración
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El derivado PS3AH se diafiltró para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de CDAP. La diafiltración se realizó en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, límite de filtración de 30 kDa). La solución se dializó contra 20 volúmenes de NaCl 0,2 M.
El seguimiento de la etapa de diafiltración se realizó por medio de una cuantificación de ADH (ensayo TNBS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración.
Filtración en 0,22 µm
El PSAH finalmente se filtró en la membrana de límite de filtración 0,22 µm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuación el PS3AH filtrado se almacenó a 4 ºC.
Conjugado PS3AH-TT
Las condiciones del proceso fueron las siguientes:
Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relación inicial de TT/PS3AH de 1,5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0,5 mg/mg de PS y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.
Se diluyeron 50 mg de PS3AH en NaCl 0,2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución de TT purificada se diluyó en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentración de 10 mg/ml. Se ajustó el pH de la solución de PS3AH a pH 5 con HCl.
Se añadió la EDAC en forma sólida a la solución de PS3AH para llegar a una concentración final de 0,5 mg de EDAC/mg de PS. El pH se ajustó a 5,0 ± 0,05 con HCl y se añadió la TT en 10 minutos usando una bomba peristáltica. La solución resultante se incubó durante 110 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,5 y se dejó 30 minutos a + 25 ºC. Finalmente se aclaró el conjugado en una membrana de 5 µm y se inyectó en una columna de Sephacryl S400HR.
3) Proceso de PS03AH-TT: PS3AH-TT217 Alteración detamaños por medio de Emulsiflex
Como anteriormente.
Filtración del PS alterado en tamaño en 0,22 µm
Como anteriormente.
Derivatización de PS3
Como para el conjugado 215.
Diafiltración
Como para el conjugado 215. Filtración en 0,22 µm Como para el conjugado 215.
Conjugado PS3AH-TT
Las condiciones del proceso fueron las siguientes:
Una concentración inicial de PS3 de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relación inicial de TT/PS3AH de 1,5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0,5 mg/mg de PS y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.
Se diluyeron 50 mg de PS3AH en NaCl 0,2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución de TT purificada se diluyó en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentración de 10 mg/ml. Se mezclaron las disoluciones de PS3AH y TT y se ajustó el pH a 5 con HCl.
Se disolvió la EDAC en un tampón Tris 1 M, pH 7,5. Se añadieron 40 µl de EDAC cada minuto (10 minutos para llegar a la relación de EDAC/PS (0,5 mg de EDAC/mg de PS)). La solución resultante se incubó durante 110 minutos a + 25 ºC en agitación y con regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejó 30 minutos a + 25 ºC. Finalmente se aclaró el conjugado en una membrana de 5 µm y se inyectó en una columna de Sephacryl S400HR.
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4) Proceso de PS03AH-TT: PS3AH-TT218
Alteración detamaños por medio de Emulsiflex
Como anteriormente.
Filtración del PS alterado en tamaño en 0,22 µm
Como anteriormente.
Derivación de PS3
La etapa de derivación se realizó a 25 ºC en agitación continua en un baño de agua de temperatura controlada. Se diluyó el PS3 en NaCl 2 M para obtener una concentración final de PS de 3 mg/ml. Se añadió la EDAC en forma sólida hasta llegar a una relación de EDAC/PS de 0,1 mg/mg de PS. Tras completarse la solución, se ajustó el pH de la solución a 5. A continuación se añadió ADH (8,9 mg de ADH/mg PS, solución a 100 mg/ml en NaCl 0,2 M) usando una bomba peristáltica en 44 minutos (aunque de ese modo estaba presente un exceso de ADH, la adición directa también habría sido aceptable). El pH se mantuvo en 5,0 +/-0,1 y se reguló durante 120 minutos (44’ + 76’). La reacción se detuvo al aumentar el pH hasta 7,5 usando hidróxido de sodio. El porcentaje de derivación correspondió al 3,7% (mg de ADH/mg de PS). La determinación de TNBS fue de 220 µg/ml y la determinación de PS fue de 5902 µg/ml, por consiguiente hay 1,26 µmoles de ADH/17,44 µmoles de unidad de repetición (= µmoles de grupos reactivos COOH). Por consiguiente, el 7,22% de los grupos carboxilo de PS3 eran grupos COOH derivados con ADH.
Diafiltración
El derivado PS3AH se diafiltró para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltración se realizó en una membrana UFP-30-C-H24LA (42 cm2, límite de filtración de 30 kDa). La solución se dializó contra 23 volúmenes de NaCl 0,2 M
El seguimiento de la etapa de diafiltración se realizó por medio de una cuantificación de ADH (ensayo TNBS) en el permeado después de 5, 10, 15 y 20 volúmenes de diafiltración.
Filtración en 0,22 µm
El PSAH finalmente se filtró en la membrana de límite de filtración 0,22 µm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuación, el PS3AH filtrado se almacenó a 4 ºC.
Conjugado PS3AH-TT
Las condiciones del proceso fueron las siguientes:
Una concentración inicial de PS3AH de 2 mg/ml en NaCl 2 M, una relación inicial de TT/PS3AH de 1,5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0,5 mg/mg de PS y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,15 M.
Se diluyeron 50 mg de PS3AH en NaCl 0,2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml. La solución de TT purificada se diluyó en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentración de 10 mg/ml. Se mezclaron juntas las disoluciones de PS3AH y TT.
Se ajustó el pH a 5,0 ± 0,05 con HCl y se añadió la EDAC manualmente en 10 minutos (se añadieron alícuotas iguales cada minuto). La solución resultante se incubó durante 110 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 120 minutos. A continuación, se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejó 30 minutos a + 25 ºC. Finalmente se aclaró el conjugado en una membrana de 5 µm y se inyectó en una columna de Sephacryl S400HR.
Conclusiones
Se produjeron diferentes conjugados mediante la química de la carbodiimida en la etapa de conjugación. El último componente añadido en la solución de reacción puede ser la proteína TT o el reactivo EDAC. El tiempo de adición puede tener un efecto sobre los conjugados resultantes.
Conjugados PS3AHTT215 y 217:
Se utilizaron los mismos componentes y las mismas condiciones para preparar ambos conjugados. La forma en que se añadió el último componente fue diferente. El conjugado PS3AHTT217 dio lugar a un producto que cumplió los criterios in vitro. Este se preparó mediante la adición de EDAC en 10 minutos.
El conjugado PS3AHTT215, sin embargo, no pudo ser filtrado en la membrana estéril. Para este, el último componente añadido en el medio de reacción fue la TT (en 10 minutos).
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Las relaciones finales de TT/PS fueron muy diferentes para ambos conjugados. (0,98/1 frente a 0,50/1). Si se añade EDAC primero al PSAH (teniendo ambos grupos reactivos amino y carboxilo), esto puede dar lugar a reticulación interna de los grupos carboxílico e hidrazina presentes en los polisacáridos, por consiguiente podría dar lugar a un conjugado más reticulado con una relación final más débil tras la adición de TT en 10 minutos.
5 Este efecto no se observa para el conjugado PS3AHTT217. La incorporación de TT funcionó mejor mediante la adición de EDAC en 10 minutos, tal vez debido a la menor reticulación interna y a la mejor reticulación entre los grupos de hidrazina del PS3AH y los grupos carboxílico de la proteína.
En el caso del conjugado 218, como la derivación de PS3 con EDAC solo modifica parcialmente el polisacárido (para mantener la mayoría de los epítopos del polisacárido intactos), nuevamente están presentes ambos grupos
10 reactivos, amino y carboxilo, es por ello que la adición lenta de EDAC en una etapa final de conjugación también es ventajosa.
La lenta incorporación de TT en la etapa final de conjugación fue ventajosa (sin embargo) para el conjugado 208 en el que la TT se derivatizó por medio de ADH (y comprende grupos amino y carboxilo), mientras que el PS3 se dejó con sus grupos reactivos –OH y -COOH nativos como parte de su subunidad de repetición. La adición de EDAC al
15 PS3 no tuvo el efecto de reticulación anterior y la lenta incorporación de la TT derivada dio un conjugado con buenas características in vitro -véase a continuación.
Caracterización in vitro:
Conj.
Derivación/Química Conjugación/Química Adición del componente final
208
TT/ADH → EDAC PS-TTAH → EDAC TTAH añadido en 11 minutos
215
PS3/ ADH → CDAP PSAH -TT → EDAC TT añadido en 10 minutos
217
PS3/ ADH → CDAP PSAH -TT → EDAC EDAC añadido en 10 minutos
218
PS3/ ADH → EDAC PSAH -TT → EDAC EDAC añadido en 10 minutos
Conj.
PS [PS] (mg/ml) [TT] (mg/ml) Relación inicial TT/PS (p/p) [EDAC] (mg/mg dePS) Tiempo de acoplamiento (min)
208
C6302 2,0 10 (TTAH), bomba 1,5/1 0,5/1 120
215
3AH001 (CDAP) 2,0 10 bomba 1,5/1 0,5/1 120
217
3AH001 (CDAP) 2,0 10 1,5/1 0,5/1 (Fracciones) 120
218
3AH002 (CDAP) 2,0 10 1,5/1 0,5/1 (Fracciones) 120
Conj.
Relación final TT/PS (p/p) Rendimiento de PS rec (%) Rendimiento filtrado rec (%) PS libre (%) Antigenicidad αPS/aPS (%) Antigenicidad αTT/aPS (%)
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1,84/1 69 95 10,2 99 103 100*
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0,98/1 66 100 0,7 17 103 100*
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0,88/1 74 101 11,0 34 222 216*
* en comparación con el conjugado 208
Ejemplo 1c -preparación del conjugado de polisacárido Vi de S. typhi Vi de la invención
Alteración de tamaños por medio de Emulsiflex
Se pesó el PS sobre la base de un contenido de humedad teórico del 15%. Se disolvió el PS nativo durante la noche en WFI a una concentración inicial de 7 mg/ml. Antes de la alteración de tamaños, se aclaró la solución de PS nativo en un filtro con límite de filtración de 10 µm a un caudal de 50 ml/min. Se utilizó un aparato homogenizador EMULSIFLEX C-50 para reducir el peso molecular y la viscosidad del polisacárido antes de la etapa de activación. La eficiencia de la alteración de tamaños depende de la presión del circuito, la presión de alimentación del émbolo y del número total de ciclos. A fin de mejorar la eficiencia de la alteración de tamaños (y por consiguiente reducir el número total de ciclos), se sustituyó la celda de homogenización del Emulsiflex con una celda con una geometría fijada (Microfluidics F20Y-cámara de interacción de 0,75 µm). El objetivo de la alteración de tamaños era reducir el peso molecular y la viscosidad del PS sin una disminución importante de su antigenicidad.
La reducción de tamaño se realizó a 102 MPa ± 3.400 kPay se hizo el seguimiento intra-proceso por medio de la medición de la viscosidad. La alteración de tamaños se detuvo cuando se alcanzó el objetivo de 5,0 ± 0,3 cP.
Filtración del PS alterado en tamaño en 0,22 µm
El PS alterado en tamaño se filtró en una membrana Millipak 40 (límite de filtración de 0,22 mm) a un caudal de 10 ml/min. El PS alterado en tamaño se almacenó a -20 ºC.
Derivatización del polisacárido Vi
Se disolvieron 1,5 g de PS Vi alterado en tamaño a 25 ºC en EPI en agitación (5 mg/ml). Se añadieron 13,35 g de ADH (8,9 mg de ADH/mg de PS) a la solución de PS. Después de la solución completa, se ajustó el pH a 5,0 ± 0,05 con HCl 1N. Se añadió la EDAC (0,1 mg/mg de PS) en forma sólida. La solución se dejó 60 minutos a 25 ºC. A continuación, se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejó al menos 30 minutos a 25 ºC (como máximo 2 horas). Se estimó que el nivel de derivatización era del 4,55% con la determinación de TNBS (mg de ADH/100 mg de PS). La determinación de TNBS fue de 200 µg/ml y la determinación de PS fue de 4034 µg/ml; por consiguiente, 0,0697 µmoles de ADH/16,46 µmoles de unidad de repetición (Mw 245). 1,3 µmoles de ADH/16,46 µmoles de grupo reactivo COOH en Vi, por consiguiente el 7% de los grupos COOH de Vi eran grupos COOH modificados con ADH.
Diafiltración
El derivado PSViAH se diafiltró para eliminar la ADH sin reaccionar y los subproductos de EDAC. La diafiltración se realizó en una membrana Centramate (0,09 m2, límite de filtración de 10 kDa). La solución se dializó contra 20 volúmenes de NaCl 0,2 M.
El seguimiento de la etapa de diafiltración se realizó por medio de una cuantificación de ADH (ensayo TNBS) en el permeado después de 3, 5, 10 y 20 volúmenes de diafiltración.
Filtración en 0,22 µm
El PSViAH finalmente se filtró en la membrana de límite de filtración 0,22 µm (Millipack 40) a un caudal de 10 ml/min. A continuación, el PSViAH filtrado se almacenó a -2/-8 ºC durante un máximo de 4 días.
Conjugados PSViAH-TT
Las condiciones del proceso fueron las siguientes:
Una concentración inicial de PSViAH de 2 mg/ml en NaCl 0,2 M, una relación inicial de TT/PSViAH de 2,5/1 (p/p), una concentración de EDAC de 0,25 mg/mg de PS y una concentración de TT de 10 mg/ml en NaCl 0,2 M.
Se diluyó 1 g de PSViAH en NaCl 0,2 M para obtener una concentración final de PS de 2 mg/ml (determinación por medio de ácido urónico). La solución de TT purificada se diluyó en NaCl 0,2 M hasta llegar a una concentración de 10 mg/ml.
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Se añadió la TT a la solución de PSViAH para llegar a una relación final de 2,5 mg de TT / mg de PS El pH se ajustó a 5,0 ± 0,05 con HCl 1N. La solución de EDAC (7,5 mg/ml en Tris 0,1 M, pH 7,5) se añadió a continuación (en 10 minutos con una bomba peristáltica) para llegar a 0,25 mg de EDAC/mg de PSViAH. La solución resultante se incubó durante 50 minutos a + 25 ºC con agitación y regulación del pH para obtener un tiempo de acoplamiento final de 60 minutos. A continuación, se neutralizó la solución por medio de la adición de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 y se dejó 30 minutos a + 25 ºC. El conjugado se transfirió a 4 ºC y se dejó durante la noche en agitación continua lenta antes de la etapa de cromatografía.
Purificación
Antes a la elución en Sephacryl S400HR, el conjugado se aclaró por medio de un filtro Kleenpak de 10 µm. El caudal se fijó en 100 ml/min. A continuación, se inyectó el conjugado en la columna de Sephacryl S400HR y la combinación de recogida se basó en un valor de Kd. Se utilizó el siguiente criterio para la combinación de recogida: la recogida se inició desde una DO = 0,05 a 280 nm y terminó cuando Kd = 0,22.
Esterilización por filtración
Antes de la filtración, la mayor parte del producto se llevó nuevamente a temperatura ambiente. Posteriormente, el conjugado se filtró en una membrana de esterilización Opticap de 10,2 cm (4 pulgadas). El caudal se fijó en 30 ml/min.
Datos analíticos
El conjugado resultante tenía una relación final de TT/PS (p/p) de 2,44/1, un contenido de PS libre del 3,7% y una antigenicidad de αPS/αPS del 58%.
Ejemplo 1d – preparación de otros conjugados de polisacáridos
La unión covalente del polisacárido PRP de Haemophilus influenzae (Hib) a TT se llevó a cabo mediante una química de acoplamiento desarrollada por Chu y col. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). El polisacárido PRP de Hib se activó añadiendo CNBr e incubando a pH 10,5 durante 6 minutos. El pH se redujo hasta pH 8,75 y se añadió la dihidrazida del ácido adípico (ADH) y se prosiguió con la incubación durante 90 minutos más. El PRP activado se acopló al toxoide del tétanos purificado mediante la condensación con carbodiimida usando 1-etil-3-(3dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC). La EDAC se añadió al PRP activado hasta alcanzar una relación final de 0,6 mg de EDAC/mg de PRP activado. El pH se ajustó a 5,0 y se añadió al toxoide del tétanos purificado hasta alcanzar los 2 mg de TT/mg de PRP activado. La solución resultante se dejó durante tres días con agitación suave. Después de la filtración a través de una membrana de 0,45 μm, el conjugado se purificó sobre una columna de Sephacryl S500HR (Pharmacia, Suecia) equilibrada en NaCl 0,2 M.
Los conjugados MenC-TT se produjeron usando polisacáridos nativos (de más de 150 kDa según la medición por medio de MALLS) o se microfluidizaron ligeramente. Los conjugados MenA-TT se produjeron usando polisacárido nativo o polisacárido ligeramente microfluidizado de más de 60 kDa según la medición por medio del procedimiento MALLS del ejemplo 2. Los conjugados MenW y MenY-TT se produjeron usando polisacáridos alterados en tamaños en torno a 100-200 kDa según la medición por medio de MALLS (véase ejemplo 2). La alteración de tamaños fue por microfluidización usando un aparato homogenizador Emulsiflex C-50. A continuación los polisacáridos se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm.
La activación y el acoplamiento directo se llevaron a cabo como se describe en los documentos WO 96/29094 y WO 00/56360. Resumiendo, el polisacárido a una concentración de 10-20 mg/ml en NaCl 2 M a pH 5,5-6,0 se mezcló con una solución de CDAP (100 mg/ml recién preparada en acetonitrilo/WFI, 50/50) hasta una relación final de CDAP/polisacárido de 0,75/1 o 1,5/1. Después de 1,5 minutos, el pH se incrementó con hidróxido de sodio hasta pH 10,0. Después de tres minutos se añadió el toxoide del tétanos hasta alcanzar una relación de proteína/polisacárido de 1,5/1 para MenW, 1,2/1 para MenY, 1,5/1 para MenA o 1,5/1 para MenC. La reacción prosiguió durante una a dos horas.
Después de la etapa de acoplamiento, se añadió glicina hasta una relación final de glicina/PS (p/p) de 7,5/1 y el pH se ajustó a pH 9,0. La mezcla se dejó durante 30 minutos. El conjugado se aclaró usando un filtro Kleenpak de 10 μm y a continuación se cargó sobre una columna de Sephacryl S400HR usando un tampón de elución de NaCl 150 mM o Tris 5 mM a pH 7,5. Los lotes clínicos se filtraron sobre una membrana de esterilización Opticap 4. Los conjugados resultantes tenían una relación promedio de polisacárido:proteína de 1:1-1:5 (p/p).
Ejemplo 2 -Determinación del peso molecular usando MALLS
Los detectores se acoplaron a una columna de HPLC de exclusión por tamaños desde la que se eluyeron las muestras. Por una parte, el detector de dispersión de luz láser midió las intensidades luminosas dispersadas en 16 ángulos por la solución macromolecular y por otra parte, un refractómetro interferométrico situado en línea permitió la determinación de la cantidad de muestra eluida. A partir de estas intensidades, se puede determinar el tamaño y la forma de las macromoléculas en solución.
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El peso molecular promedio en peso (Mw) se define como la suma de los pesos de todas las especies multiplicado por sus respectivos pesos moleculares y dividido por la suma de pesos de todas las especies.
a) Peso molecular promedio en peso: -Mw
imagen1
b) Peso molecular promedio en número: -Mn–
imagen2
c) Raíz cuadrada del radio medio: -Rw-y R2w es el radio al cuadrado definido por:
imagen3
(-mi-es la masa de un centro de dispersión i y -ri-es la distancia entre el centro de dispersión i y el centro de gravedad de la macromolécula).
d) La polidispersidad se define como la relación -Mw/Mn-.
Los polisacáridos de meningococos se analizaron por MALLS cargando en dos columnas de HPLC (TSKG6000 y 5000PWxl) usadas en combinación. Se cargaron 25 μl de polisacáridos en la columna y se eluyó con 0,75 ml de agua filtrada. Los polisacáridos se detectaron usando un detector de dispersión de luz (Wyatt Dawn DSP equipado con un láser de argón de 10 mW a 488 nm) y un refractómetro inferométrico (Wyatt Otilab DSP equipado con una célula P100 y un filtro rojo a 498 nm).
Las polidispersidades de pesos moleculares y las recuperaciones de todas las muestras se calcularon mediante el procedimiento de Debye usando un ajuste polinómico de orden 1 en el software Astra 4.72.
Ejemplo 3 – Ensayo clínico para evaluar el efecto de un conector en MenA en una vacuna de conjugado MenACWY
Se administró una única dosis de diferentes formulaciones de vacuna MenACWY a adolescentes de 15 a 19 años de edad en 5 grupos de 25 sujetos en un ensayo aleatorizado 1:1:1:1:1. Las formulaciones probadas fueron:
F1 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (ADH) (preparado según el ejemplo 1) -5/5/5/5 µg
F2 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) – 2,5/5/2,5/2,5 µg
F3 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) -5/5/2,5/2,5 µg
F4 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico sin ningún espaciador en ningún conjugado -5/5/5/5 µg grupo de control -ACWY Mencevax™
En el día 30 después de la inoculación, se extrajo una muestra de sangre de los pacientes.
Las muestras de sangre se utilizaron para calcular el porcentaje de pacientes con respuesta a los ensayos con suero bactericida ESB-MenA, ESB-MenC, ESB-MenW 135 y ESB-MenY un mes después de la dosis de la vacuna. Una respuesta a la vacuna se definió como: 1) para pacientes inicialmente seronegativos – un valor de anticuerpos posterior a la vacunación ≥ 1/32 en 1 mes o 2) para pacientes inicialmente seropositivos – un valor de anticuerpos de ≥ 4 veces el valor de anticuerpos anterior a la vacunación.
Resultados
Según se muestra en la siguiente tabla, el uso de un espaciador en el conjugado de MenA dio lugar a una mayor respuesta inmune contra MenA. El porcentaje de pacientes con respuesta pasó del 66% al 90-95% cuando se añadió el espaciador de AH. Esto se reflejó en un aumento de la media geométrica de las valoraciones en ensayos con suero bactericida MGV ESB (del inglés, SBA GMT) de 4335 a 10000 y un aumento de la media geométrica de la concentración MGC (del inglés, GMC) de 5 a 20-40. Sorprendentemente, el uso de un espaciador de AH también dio lugar a una mayor respuesta inmune contra MenC, según puede verse por un aumento en el porcentaje de pacientes con respuesta y un aumento de la MGV ESB. También se pudo ver un aumento en la MGV ESB contra
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MenY (6742-7122) y contra MenW (4621-5418) cuando se introdujo un espaciador.
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenA % MGV ESB-MenA MGC anti-PSA µg/ml ELISA
F1 5AH/5/5/5
90,9 9805 20,38
F2 2,5AH/5/2,5/2,5
75 8517 29,5
F3 5AH/5/2,5/2,5
95,5 10290 47,83
F4 5/5/5/5
66,7 4335 5,46
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85,7 8022 27,39
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenC % MGV ESB-MenC MGC anti-PSC µg/ml ELISA
F 1 5AH/5/5/5
69,6 3989 12,11
F2 2,5AH/5/2,5/2,5
81,8 3524 12,78
F3 5AH/5/2,5/2,5
81,8 3608 8,4
F4 5/5/5/5
73,9 2391 8,84
Mencevax™
90,0 5447 38,71
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenW % MGV ESB-MenW MGC anti-PSW µg/ml ELISA
F 1 5AH/5/5/5
95 5418 9,65
F2 2,5AH/5/2,5/2,5
85 4469 14,55
F3 5AH/5/2,5/2,5
95,5 4257 6,39
F4 5/5/5/5
95,5 4621 10,7
Mencevax™
86,4 2714 13,57
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenY % MGV ESB-MenY MGC anti-PSY µg/ml ELISA
F 1 5AH/5/5/5
91,3 7122 16,3
F2 2,5AH/5/2,5/2,5
87,5 5755 12,52
F3 5AH/5/2,5/2,5
80 5928 8,88
F4 5/5/5/5
91,3 6742 13,88
Mencevax™
91,7 4854 21,02
Ejemplo 4 – Ensayo clínico para evaluar el efecto de un conector en conjugados MenA y MenC en una vacuna de conjugado MenACWY
Se administró una única dosis de diferentes formulaciones de vacuna MenACWY a adolescentes de 15 a 19 años de edad en 5 grupos de 25 sujetos en un ensayo aleatorizado 1:1:1:1:1. Las formulaciones probadas fueron:
E06754611
04-11-2014
F1 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) – 2,5/2,5/2,5/2,5 µg
F2 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) – 5/5/2,5/2,5 µg
5 F3 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo los conjugados MenA y MenC un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) -5/5/5/5 µg
F4 -MenACWY conjugada con toxoide tetánico conteniendo el conjugado MenA un espaciador de AH (preparado según el ejemplo 1) -5/5/5/5 µg
Grupo de control -ACWY Mencevax™
10 En el día 30 después de la inoculación, se extrajo una muestra de sangre de los pacientes.
Las muestras de sangre se utilizaron para calcular el porcentaje de pacientes con respuesta a los ensayos con suero bactericida ESB-MenA, ESB-MenC, ESB-MenW 135 y ESB-MenY un mes después de la dosis de la vacuna. Una respuesta a la vacuna se definió como: 1) para pacientes inicialmente seronegativos – un valor de anticuerpos posterior a la vacunación ≥ 1/32 en 1 mes o 2) para pacientes inicialmente seropositivos – un valor de anticuerpos
15 de ≥ 4 veces el valor de anticuerpos anterior a la vacunación.
Resultados
La introducción de un espaciador de AH en el conjugado MenC dio lugar a un aumento en la respuesta inmune contra MenC como se muestra en la siguiente tabla. Esto queda demostrado por un aumento en la MGV ESB de 1943 a 4329 y un aumento en la MGC de anti-PSC de 7,65 a 13,13. Se mantuvieron buenas respuestas inmunes
20 contra MenA, MenW y MenY.
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenA % MGV ESB-MenA MGC anti-PSA µg/ml ELISA
F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5
75 8417 20,23
F2 5AH/5AH/2,5/2,5
72 6299 16,07
F3 5AH/5AH/5/5
87 9264 27,26
F4 5AH/5/5/5
77,3 9632 20,39
Mencevax™
78,3 8284 12,93
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenC % MGV ESB-MenC MGC anti-PSCµg/ml ELISA
F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5
88 3619 12,82
F2 5AH/5AH/2,5/2,5
88 2833 13,32
F3 5AH/5AH/5/5
95,8 4329 13,13
F4 5AH/5/5/5
95,8 1943 7,65
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenW % MGV ESB-MenW MGC anti-PSW µg/ml ELISA
Mencevax™
91,7 1567 16,55
F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5
100 5656 7
E06754611
04-11-2014
F2 5AH/5AH/2,5/2,5
96 4679 5,4
F3 5AH/5AH/5/5
91,3 4422 4,45
F4 5AH/5/5/5
88 4947 7,67
Mencevax™
96 3486 11,93
Formulación
Pacientes con respuesta a ESB MenY % MGV ESB-MenY MGC anti-PSY µg/ml ELISA
F1 2,5AH/2,5AH/2,5/2,5
75 3891 17,81
F2 5AH/5AH/2,5/2,5
92 3968 11,96
F3 5AH/5AH/5/5
79,2 2756 9,51
F4 5AH/5/5/5
80 3914 16,76
Mencevax™
88 3056 21,41

Claims (44)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
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    04-11-2014
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de fabricación de una composición inmunogénica que comprende conjugar un sacárido a un vehículo proteico usando química de condensación de la carbodiimida, en el que el sacárido comprende (por ejemplo, como parte de su unidad de repetición), o ha sido derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo y en el que el vehículo proteico comprende, o ha sido derivatizado para comprender, grupos amino y/o carboxilo, que comprende las etapas de:
    I) -si el vehículo proteico comprende tanto grupos amino como carboxilo y el sacárido comprende grupos amino o carboxilo:
    a) mezclar el sacárido y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación y b) añadir la alícuota del vehículo proteico necesaria durante un período de 5 minutos a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota es añadida durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período;
    II) -si el sacárido comprende tanto amino grupos como carboxilo y el vehículo proteico comprende grupos amino o carboxilo:
    a) mezclar el vehículo proteico y la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación y b) añadir la alícuota de sacárido necesaria durante un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota es añadida durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período;
    III) -si el sacárido comprende tanto grupos amino como carboxilo y el vehículo proteico comprende tanto grupos amino como carboxilo:
    a) mezclar el vehículo proteico y el sacárido y b) añadir la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación en un período de 1 minuto a 6 horas, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota en la segunda mitad del período;
    y en el que: la alícuota de carbodiimida es de 0,01 a 3 mg de carbodiimida por mg de sacárido; el sacárido está presente en una concentración final de 0,5-50 mg/ml en la etapa b); el vehículo proteico está presente en una concentración final de 1-50 mg/ml en la etapa b); la proporción inicial de vehículo proteico a sacárido es de 5:1 a 1:5 (p:p); la concentración de sal presente en la etapa b) es de 0-2 M; el pH de la reacción en la etapa b) es de pH: 4,5-6,5, o pH: 4,5-7,5 si en la etapa b) está presente un compuesto que
    mantiene el intermedio de reacción estable; y la temperatura de la reacción en la etapa b) es de 4-37 ºC.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa b) el período es de 5 a 50 minutos, de 6 a 40 minutos, de 7 a 30 minutos o de 8 a 20 minutos.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa b) el período es de 10 minutos a 4 horas, de 20 minutos a 3 horas, de 30 minutos a 2 horas, de 40 a 90 minutos o de 50 a 70 minutos.
  4. 4.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que la carbodiimida es EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) o una carbodiimida diferente de EDAC.
  5. 5.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-4, en el que la alícuota de carbodiimida necesaria para llevar a cabo la conjugación es de 0,05 a 2 o de 0,09 a 1 mg/mg de sacárido.
  6. 6.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-5, en el que el sacárido y/o el vehículo proteico se han derivatizado para comprender grupos amino o carboxilo.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la derivatización es a través de la adición de un conector heterou homo-bifuncional.
    22 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
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    04-11-2014
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el conector tiene entre 4 y 12 átomos de carbono.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene dos grupos reactivos amino.
  10. 10.
    La composición inmunogénica de las reivindicaciones 7-9, en la que el conector es ADH.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene dos grupos reactivos ácido carboxílico.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 7 u 8, en el que el conector tiene un grupo reactivo amino en un extremo y un grupo reactivo ácido carboxílico en el otro extremo.
  13. 13.
    El procedimiento de las reivindicaciones 7-12, en el que la derivatización tiene lugar a través de la reacción de un gran exceso de conector con el sacárido y/o el vehículo proteico a derivatizar.
  14. 14.
    El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo hidroxilo como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo amino del conector.
  15. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que el sacárido se derivatiza parcialmente con la química del CDAP.
  16. 16.
    El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo amino como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo carboxilo del conector.
  17. 17.
    El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el sacárido se derivatiza parcialmente con la química de condensación de la carbodiimida.
  18. 18.
    El procedimiento de las reivindicaciones 7-13, en el que el sacárido comprende un grupo reactivo carboxilo como parte de su unidad de repetición que se derivatiza parcialmente a través de un grupo amino del conector.
  19. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el sacárido se derivatiza parcialmente con la química de la carbodiimida.
  20. 20.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-19, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o vehículo proteico se añade a una velocidad constante usando una bomba.
  21. 21.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-19, en el que en la etapa b) la alícuota de carbodiimida, sacárido o vehículo proteico se añade en etapas durante el período.
  22. 22.
    El procedimiento de la reivindicación 21, en el que al menos una cuarta parte de la alícuota se añade durante la primera mitad del período y al menos una cuarta parte de la alícuota durante la segunda mitad del período.
  23. 23.
    El procedimiento de la reivindicación 21 o 22, en el que la alícuota ’a’ se añade en 4-100 etapas ’e’.
  24. 24.
    El procedimiento de la reivindicación 23, en el que se añade a/e de la alícuota en cada etapa.
  25. 25.
    El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que si una etapa tiene lugar en el tiempo cero del período ’p’, cada etapa posterior tiene lugar en un tiempo que es p/(e-1).
  26. 26.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-25, en el que la relación inicial de vehículo proteico a sacárido es de
    4:1 a 1:1 o de 3:1 a 2:1 (p/p).
  27. 27.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-26, en el que la concentración de sal, por ejemplo NaCl, presente en la etapa b) es de 0,1-1 o 0,2-0,5 M.
  28. 28.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-27, en el que el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene en pH 4,7-6,0 o 5-5,5.
  29. 29.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-27, en el que N-hidroxisuccinimida también está presente en la reacción en la etapa b) y el pH de la reacción en la etapa b) se mantiene en pH 4,5-7,5.
  30. 30.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-29, en el que la temperatura de la reacción en la etapa b) se mantiene en 10-32, 17-30 o 22-27 °C.
  31. 31.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-30, en el que después de que se ha añadido toda la alícuota en la etapa b) la reacción se mantiene durante otros 10 minutos a 72 horas, 20 minutos a 48 horas, 30 minutos a 24 horas, 40 minutos a 12 horas, 50 minutos a 6 horas o 1-3 horas.
  32. 32.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-31, en el que una vez que la reacción se ha completado, el pH se ajusta a 7,5-9.
    23 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
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    04-11-2014
  33. 33.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-32, que comprende una etapa c) posterior, en la que el conjugado de sacárido-proteína se purifica en una columna de cromatografía de exclusión por tamaños.
  34. 34.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-33, que comprende una etapa d) posterior, en la que el conjugado de sacárido-proteína se esteriliza por filtración.
  35. 35.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-34, que comprende una etapa e) posterior, en la que se formula una dosis eficaz del conjugado de sacárido-proteína con un excipiente farmacéuticamente aceptable para fabricar una composición inmunogénica o vacuna.
  36. 36.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-35, en el que el sacárido es un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupos A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi), Vibrio cholerae o H. influenzae tipo b.
  37. 37.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-36, en el que el peso molecular promedio en peso del sacárido es de 1000-2000000, 5000-1000000, 10000-500000, 50000-400000, 75000-300000 o 100000-200000.
  38. 38.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-37, en el que el sacárido es un polisacárido nativo o está alterado en tamaño por un factor no mayor a x10 (por ejemplo por microfluidización).
  39. 39.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-35, en el que el sacárido es un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano, por ejemplo procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis.
  40. 40.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-39, en el que el vehículo proteico comprende uno o más epítopos de células T ayudantes.
  41. 41.
    El procedimiento de las reivindicaciones 1-40, en el que el vehículo proteico es seleccionado del grupo que consiste en: TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, proteína D de H. influenzae, PhtD del neumococo y neumolisina del neumococo.
  42. 42.
    Una composición inmunogénica o vacuna que puede obtenerse por el procedimiento de las reivindicaciones 141, en la que el sacárido es un sacárido capsular bacteriano procedente de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis serogrupo A, B, C, W135 o Y, Streptococcus pneumoniae serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F o 33F, Grupo B de Streptococcus grupos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI o VII, Staphylococcus aureus tipo 5, Staphylococcus aureus tipo 8, Salmonella typhi (sacárido Vi) o Vibrio cholerae, o en la que el sacárido es un lipooligosacárido o lipopolisacárido bacteriano derivado de una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, H. influenzae, E. coli, Salmonella o M. catarrhalis y en la que se formula una dosis eficaz del conjugado de sacárido-proteína con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  43. 43.
    Uso de la composición inmunogénica o vacuna de la reivindicación 42 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad.
  44. 44.
    El uso de la reivindicación 43, en el que la enfermedad está causada por una bacteria seleccionada de una lista que consiste en: N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae, M. catarrhalis, Grupo B de Streptococcus, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, E. coli y H. influenzae.
    24
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