ES2366613T3 - Composiciones antimicrobianas. - Google Patents

Abstract

Una composición antimicrobiana que comprende ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico o una sal del mismo y otros dos ácidos orgánicos seleccionados entre ácido butírico, ácido láctico, ácido fórmico y ácido propiónico

Description

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere generalmente a la provisión de una composición antimicrobiana y de procedimientos de control del crecimiento de, prevención del crecimiento de o combate de organismos microbianos. En particular, la invención se refiere a una composición antimicrobiana que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico y otros dos ácidos orgánicos seleccionados de ácido butírico, láctico, fórmico y propiónico, a su preparación y a su uso en la inhibición o combate de salmonela en alimentos.

Antecedentes de la invención

[0002] El control de bacterias en pienso para animales es un desafío continuo para la industria, incluso cada vez más a medida que los consumidores se centran en la salud y la seguridad de la carne con la que alimentan a sus familias. Se desea el control de bacterias para proteger la salud del animal para el que está destinado el pienso. Las bacterias del intestino en el animal compiten por los nutrientes y pueden ser perjudiciales para la salud y el rendimiento del animal. Segundo, y de importancia cada vez mayor, la reducción de bacterias en piensos es una parte importante en la reducción y el control de enfermedades transmitidas por los alimentos.

[0003] El uso de antibióticos en pienso para animales está recientemente siendo analizado minuciosamente, en parte debido a las preocupaciones de que el abuso de antibióticos puede producir resistencia a los antibióticos en los animales tratados. Adicionalmente, tras el consumo de animales tratados con antibióticos, los seres humanos pueden experimentar problemas debidos a alergias a los antibióticos, o que también se hacen resistentes a los antibióticos. Por tanto, existe la necesidad de medios alternativos para inhibir bacterias en pienso para animales.

[0004] Dos alternativas principales están actualmente disponibles para el control de bacterias en piensos: procedimientos térmicos y químicos. El tratamiento por calor del pienso es costoso, pero eficiente. Sin embargo, el tratamiento por calor solo no evita la recontaminación del pienso entre el momento en el que el pienso se trata y es consumido por el animal.

[0005] Los tratamientos químicos implican principalmente el uso de formaldehído o un ácido orgánico en el pienso. El formaldehído se ha usado generalizadamente en el Reino Unido, aunque su uso sigue siendo analizado minuciosamente por la comisión de la UE.

[0006] Por otra parte, los ácidos orgánicos tienen mundialmente muchas aplicaciones en la industria de piensos para animales. Durante muchos años, los nutricionistas han usado ácidos orgánicos en dietas de lechones para su efecto positivo efecto sobre la salud y el crecimiento. Por ejemplo, el ácido fórmico se usa para descontaminar materiales de partida, y el ácido propiónico se usa para controlar moho. Otros ácidos orgánicos comúnmente usados incluyen ácido fumárico, cítrico y láctico. Los ácidos orgánicos también son conocidos por modificar la flora gastrointestinal.

[0007] Las autorizaciones para el uso de antibióticos no terapéuticos en pienso para animales se han retirado en varios países y la práctica de dar de comer promotores del crecimiento a baja dosis está casi desapareciendo mundialmente. Ahora, los productores que quieren vender en el mercado libre de fármacos están buscando sustituciones no farmacéuticas a los antibióticos para piensos. La mayoría de los datos sugieren que el efecto promotor del crecimiento de antibióticos puede atribuirse por completo a su actividad antimicrobiana y a las repercusiones fisiológicas de ésta. Por tanto, la búsqueda de sustituciones se ha basado en moléculas que se producen naturalmente con actividad antimicrobiana conocida.

[0008] El efecto primario de los antibióticos es antimicrobiano; todo sobre la digestibilidad y los efectos de rendimiento puede explicarse por su impacto sobre la microflora gastrointestinal y la reducción resultante en la estimulación inmunitaria. Los ácidos orgánicos tienen actividad antimicrobiana; sin embargo, parece que hay efectos de ácidos orgánicos más allá de aquellos atribuidos a la actividad antimicrobiana. Las reducciones en ciertas especies de bacterias están asociadas a ácidos orgánicos para alimentación animal, que son particularmente eficaces contra especies intolerantes a ácidos como E. coli, Salmonella y Campylobacter. Tanto los antibióticos como los ácidos orgánicos mejoran la digestibilidad de proteínas y de energía reduciendo la incidencia de la estimulación inmunitaria de fondo y la síntesis y secreción resultante de mediadores inmunitarios reduciendo la producción de amoniaco y otros metabolitos microbianos que reducen el crecimiento y quizás reduciendo la carga microbiana global. A diferencia de los antibióticos, la actividad antimicrobiana de ácidos orgánicos depende del pH. Los ácidos orgánicos tienen un beneficio evidente y significativo en lechones destetados, y se ha observado que benefician el rendimiento de las aves de corral. Los ácidos orgánicos tienen varios efectos adicionales que van másallá de los de los antibióticos. Éstos incluyen reducción en el pH del digesto y aumento de la secreción pancreática.

[0009] Los cerdos son susceptibles a tensiones por destete (separación de las cerdas, cambios medioambientales y efectos físicos de pienso sólido) y una variedad de patógenos tales como E. coli y rotavirus. Estos patógenos se reducen en animales adultos por la reducción del pH en el estómago, pero los cerdos jóvenes tienen menor secreción de ácido clorhídrico del estómago. Además, la ineficacia en acidificar contenidos gástricos acoplada a baja secreción de enzimas pancreáticas puede conducir a una digestión insuficiente de nutrientes y también a aumentar la susceptibilidad de cerdos de destete a enfermedades entéricas.

[0010] Varios estudios han documentado los efectos de ácidos orgánicos sobre el rendimiento en cerdos jóvenes, particularmente lechones recientemente destetados. Una publicación reciente por Partanen (“Organic acids: their efficacy and modes of action in pigs” en Gut Environment of Pigs, pág. 201, Piva, A. y col., eds, Nottingham University Press, Nottingham, RU (2001)) revisa la bibliografía en este área y proporciona los resultados de un metanálisis de datos existentes. Sólo se consideran estudios usando ácidos individuales en ausencia de antibióticos y cobre. En el análisis de ensayos de 46 lechones destetados y 23 cerdos de engorde se observaron mejoras significativas de pienso con respecto a ganancia con ácido fórmico, fumárico y cítrico y también con diformiato de calcio. Los efectos del aumento de peso y el consumo de pienso fueron significativos para ácido fórmico y diformiato. El autor concluye que los ácidos alimenticios tienen un efecto beneficioso, especialmente en lechones destetados, es decir, principalmente asociado a cambios en la microflora gastrointestinal. Véase Eidelsburger y col., J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 68: 82-92 (1992).

[0011] Sin limitarse a una teoría particular, se cree que un mecanismo para la acción de ácidos orgánicos como antimicrobianos es del siguiente modo. El ácido cambia las poblaciones microbianas según su espectro antimicrobiano de actividad. Una vez dentro de la célula, el cambio en el pH produce la disociación de estos ácidos débiles. Los múltiples efectos de los ácidos orgánicos son debidos a esta disociación intracelular y a la respuesta celular a ella. La actividad antimicrobiana es un resultado de los efectos perjudiciales del protón libre y quizás el anión libre sobre la célula bacteriana o fúngica. Se cree que la disociación en los enterocitos del intestino produce la síntesis de secretina, una hormona que estimula la secreción pancreática. Por tanto, los ácidos orgánicos tienen beneficios que van más allá de la actividad antimicrobiana. Para piensos domina la actividad para controlar el crecimiento fúngico, mientras que en el intestino, las poblaciones que están afectadas son principalmente las bacterias cuyo crecimiento está más afectado por las condiciones ácidas. Sin embargo, debe enfatizarse que el mecanismo de acción de ácidos orgánicos es bastante diferente de, y además de, el de ácidos inorgánicos tales como HCl. Véase, por ejemplo, Eidelsburger y col., antes. La importancia del bajo pH sobre la actividad antimicrobiana de ácidos orgánicos puede explicarse por su efecto sobre la disociación del ácido. A bajo pH, más del ácido orgánico estará en la forma sin disociar. Los ácidos orgánicos sin disociar son lipófilos y pueden difundir a través de las membranas celulares que incluyen las de bacterias y mohos. Véase Huyghebaert, Report: CLO-DVV (1999) y Eidelsburger y col., antes. Una vez en la célula bacteriana, el pH más alto de su citoplasma produce la disociación del ácido, y la reducción en el pH resultante de los contenidos celulares tendrá los efectos de interrupción de reacciones enzimáticas y sistemas de transporte de nutrientes. Véase Cherrington y col., Adv. Microb. Physio., 32:87-108 (1991). Además, el procedimiento de transportar el protón libre fuera de la célula requiere energía y esto contribuye a una disponibilidad reducida de energía para la proliferación, produciendo algún grado de bacteriostasis. Se cree que esta actividad antimicrobiana directa es responsable de los efectos de salubridad de los piensos y los alimentos que contribuyen al uso de ácidos orgánicos como conservantes.

[0012] La mayoría de los animales de producción de alimentos, especialmente cerdos, aves de corral y ganado, requieren metionina suplementaria en sus dietas para el crecimiento y la reproducción apropiado. El ácido 2-hidroxi4-(metiltio)butanoico (HMBA, comercializado bajo el nombre comercial Alimet® por Novus International, Inc. (St. Louis, Missouri)) es una fuente popular de metionina suplementaria para dietas animales. Alimet® se ha convertido en una fuente preferida con respecto d,1-metionina en polvo (DLM) para fábricas de piensos que quieren resolver los problemas comunes asociados al aumento de la capacidad de producción debido a las ventajas de eficiencia de la forma física de líquidos. La manipulación más sencilla de la masa, dosificación precisa, eliminación de envasado con su disposición y las cuestiones de reducción del inventario, además de la reducción de polvo, son características populares. Alimet® contiene el 88% de actividad de metionina, mientras que la DLM líquida sólo contiene el 40% de actividad de metionina. Este bajo nivel de actividad relativa en DLM significa que el agua toma la posición de energía valiosa y componentes proteínicos en los piensos, reduciendo la densidad de nutrientes.

[0013] La prevención o el retraso del crecimiento de moho en composiciones para piensos para animales es beneficioso porque se pierde menos pienso por degradación, y pueden evitarse las enfermedades asociadas a los mohos o toxinas que producen.

[0014] El moho en raciones de pienso puede hacer que los piensos no sean aptos para el consumo. El pienso mohoso puede disminuir la digestibilidad y/o palatabilidad del pienso, pudiendo ambos afectar adversamente la producción y la salud del animal. Adicionalmente, muchos mohos producen micotoxinas que afectan el valor nutritivo de los piensos, o que pueden ser peligrosas para la salud de los animales, incluyendo ganado y seres humanos. La micotoxina B1 de Aspergillus aflatoxin es un potente carcinógeno del hígado; ciertas micotoxinas de Penicillium afectan a la función hepática o renal; y especies de moho de Fusarium están asociadas a edema pulmonar en cerdos, cáncer de hígado en ratas y desarrollo óseo anómalo en pollitos y cerdos. United States Department of Agriculture, “Grain Fungal Diseases & Mycotoxin Reference”, disponible en http://www.usda.gov/gipsa/pubs/pubs.htm. Los cerdos son particularmente sensibles a la presencia de micotoxinas de Fusarium, especialmente deoxinivalenol (DON), también conocida como vomitoxina.

[0015] La desintoxicación de pienso que ha sido contaminado con micotoxinas puede ser bastante difícil, y frecuentemente sólo se lleva a cabo sometiendo el pienso a condiciones extremas de procesamiento. Por ejemplo, el maíz contaminado con aflatoxina, una micotoxina producida por las especies de Aspergillus de moho, puede desintoxicarse tratando el maíz a presión con amoniaco húmedo caliente. Por tanto, existe la necesidad de una forma para prevenir la formación de moho y que puedan producirse las micotoxinas.

[0016] El crecimiento de moho en piensos almacenados sin tratar es especialmente frecuente en condiciones húmedas cálidas. Temperaturas más altas aumentan la probabilidad del crecimiento de moho, particularmente cuando se acoplan a altos niveles de humedad en el pienso. En pienso para pollos, el crecimiento de moho se produce raramente en granos que contienen menos del 14-15% de humedad. Sin embargo, incluso piensos con un bajo nivel de humedad promedio pueden tener bolsas con altos niveles de humedad, produciendo microclimas ideales para el crecimiento de moho. Este se produce frecuentemente en climas más cálidos, especialmente en los que las frías temperaturas de la noche producen la condensación dentro de silos o graneros en los que se almacenan los granos o el pienso. Estas bolsas relativamente pequeñas de crecimiento de moho pueden ser incluso problemáticas; las micotoxinas pueden ser problemáticas para las aves a niveles de partes por millón (por ejemplo, tricotecenos producidos por especies de Fusarium y aflatoxinas producidas por especies de Aspergillus).

[0017] Se sabe que ciertos aditivos para piensos previenen el crecimiento de moho (es decir, actúan de antifúngicos) o se unen a micotoxinas existentes. Tales aditivos se usan frecuentemente cuando el control de humedad en grano o pienso mixto es logísticamente difícil. Se conoce el uso de ciertos ácidos orgánicos, que incluyen ácido propiónico y acético, como inhibidores de moho. Los adsorbentes para unirse a micotoxinas incluyen aluminosilicatos y productos de franco arcilloso cuya estructura química permite la captura de aflatoxina, y quizás otras micotoxinas. Los adsorbentes de micotoxinas tienen eficacia variable, debido en parte a sus características de unión variables. El uso de un inhibidor de moho separado o adsorbente de moho aumenta los costes asociados al pienso para animales.

[0018] Un estudio previo (Doerr y col., Poultry Science, 74(1), 23 (1995)) sugirió que Alimet® podría reducir el crecimiento de moho en muestras de caldo de dextrosa Sabouraud, agar de dextrosa de patata o maíz molido (19% de humedad) tratado con tanto Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus como Fusarium moniliforme, y en maíz molido (17,5% de humedad) con su flora fúngica que se produce naturalmente.

[0019] La potenciación de la palatabilidad de alimento para animales en un empeño interminable por los fabricantes de alimentos. Se desea la adición de palatantes al alimento como un medio para aumentar la aceptación por los animales, produciendo salud mejorada del animal, aumento de peso, etc. Los palatantes se usan frecuentemente en alimentos para caninos, felinos y acuicultura.

Resumen de la invención

[0020] La presente invención proporciona una composición antimicrobiana que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico y otros dos ácidos orgánicos seleccionados de ácido butírico, ácido láctico, ácido fórmico y ácido propiónico.

[0021] En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición antimicrobiana que comprende mezclar ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico C, denominado en lo sucesivo el compuesto de fórmula (I), con otros dos ácidos orgánicos seleccionados de ácido butírico, ácido láctico, ácido fórmico y ácido propiónico.

[0022] La invención también proporciona el uso de una composición antimicrobiana como se define anteriormente para inhibir o combatir salmonela en alimentos.

Breve descripción de los dibujos

[0023] La Figura 1A es una gráfica que ilustra el efecto de dosis variables (0,108, 0,3 y 0,83 g/l) de ácido fórmico y Alimet® a pH 4,5 y 6,75 sobre el número de unidades formadoras de colonias de S. enteritidis después de 4 horas.

[0024] La Figura 1B es una gráfica que ilustra el efecto de dosis variables (0,108, 0,3 y 0,83 g/l) de ácido fórmico y Alimet® a pH 4,5 y 6,75 sobre el número de unidades formadoras de colonias de E. coli después de 4 horas.

[0025] La Figura 1C es una gráfica que ilustra el efecto de dosis variables (0,108, 0,3 y 0,83 g/l) de ácido fórmico y Alimet® a pH 4,5 y 6,75 sobre el número de unidades formadoras de colonias de L. plantarum después de 6 horas.

[0026] La Figura 1D es una gráfica que ilustra el efecto de dosis variables (0,108, 0,3 y 0,83 g/l) de ácido fórmico y Alimet® a pH 4,5 y 6,75 sobre el número de unidades formadoras de colonias de C. jejuni después de 6 horas.

[0027] La Figura 2A es una gráfica que ilustra el efecto antibacteriano dependiente de pH de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de S. enteritidis.

[0028] La Figura 2B es una gráfica que ilustra el efecto antibacteriano dependiente de pH de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de E. coli.

[0029] La Figura 2C es una gráfica que ilustra el efecto antibacteriano dependiente de pH de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de L. plantarum.

[0030] La Figura 2D es una gráfica que ilustra el efecto antibacteriano dependiente de pH de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de C. jejuni.

[0031] La Figura 3 es una gráfica que ilustra el efecto de dosis variables (1, 3 y 5 g/l) de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de S. enteritidis después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75.

[0032] La Figuras 4A y 4B son gráficas que ilustran el efecto de dosis variables de una combinación de ácido fórmico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de S. enteritidis después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75.

[0033] La Figura 5 es una gráfica que compara los efectos de ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido láctico y Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de E. coli con el tiempo a pH 4 y 7,3.

[0034] La Figura 6 es una gráfica que muestra el efecto del nivel de humedad sobre el número de unidades formadoras de colonias de Salmonella en premezcla de harina de carne.

[0035] La Figura 7 es una gráfica que muestra la recuperación en porcentaje de Salmonella para diferentes niveles de Alimet® en premezcla de harina de carne que contiene 20% de humedad.

[0036] La Figura 8 es una gráfica que muestra el efecto de Alimet® sobre el número de unidades formadoras de colonias de Salmonella en premezcla de harina de carne que contiene 20% de humedad.

[0037] La Figura 9 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 16,8% que no tiene ni DLM ni Alimet®; con 0,2% de DLM; y con 0,2% de Alimet®.

[0038] La Figura 10 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 14,8% que no tiene ni DLM ni Alimet®; con 0,2% de DLM; y con 0,2% de Alimet®.

[0039] La Figura 11 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 12,8% que no tiene ni DLM ni Alimet®; con 0,2% de DLM; y con 0,2% de Alimet®.

[0040] La Figura 12 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 14,8% que no tiene ni DLM ni Alimet®; con 0,2% de Alimet®; con 2 lb/ton de ácido propiónico al 65% más 0,2% de DLM; con 1,5 lb/ton de ácido propiónico al 65% más 0,2% de DLM; y con 1,0 lb/ton de ácido propiónico al 65% más 0,2% de DLM.

[0041] La Figura 13 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 14,8% con 2 lb/ton de ácido propiónico al 65%; con 1,0 lb/ton de ácido propiónico al 65%; y con 1,0 lb/ton de ácido propiónico al 65% más 0,2% de Alimet®.

[0042] La Figura 14 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación con un nivel de humedad del 14,8% con 2 lb/ton de ácido propiónico al 65%; con 1,5 lb/ton de ácido propiónico al 65%; y con 1,5 lb/ton de ácido propiónico al 65% más 0,2% de Alimet®.

[0043] La Figura 15 es una gráfica que ilustra el % de CO2 en el espacio de cabeza para un pienso molido de iniciación tratado con ácido propiónico y ácido propiónico más 0,2% de Alimet® con un nivel de humedad del 16,8%, 14,8%, 12,8%.

Descripción detallada

[0044] Sales representativas del compuesto de fórmula I incluyen las sales de amonio, magnesio, calcio, litio, sodio, potasio, selenio, hierro, cobre y cinc. En una realización preferida, el compuesto de fórmula I está en forma de la sal de calcio. Amidas representativas del compuesto de fórmula (I) incluyen metilamida, dimetilamida, etilmetilamida, butilamida, dibutilamida, butilmetilamida, éster alquílico de N-acilmetionatos (por ejemplo, Nacetilmetionatos de alquilo). Ésteres representativos del compuesto de fórmula (I) incluyen los ésteres metílico, etílico, n-propílico, isopropílico, butílico, concretamente los ésteres n-butílico, sec-butílico, isobutílico y t-butílico, ésteres pentílicos y ésteres hexílicos, especialmente ésteres n-pentílico, isopentílico, n-hexílico e isohexílico.

[0045] Preferentemente, la concentración del compuesto de fórmula I en las composiciones de pienso descritas en este documento está entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 5%. En diversas realizaciones preferidas, la concentración está entre el 0,01% y aproximadamente el 4%; entre el 0,02% y aproximadamente el 3%; entre el 0,03% y aproximadamente el 2%; entre el 0,04% y aproximadamente el 1%; entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 0,6%; y entre aproximadamente el 0,06% y aproximadamente el 0,525%. En diversas realizaciones particularmente preferidas, la concentración es aproximadamente el 0,075%; aproximadamente el 0,125%; aproximadamente el 0,15%; aproximadamente el 0,225%; aproximadamente el 0,25%; aproximadamente el 0,3%; aproximadamente el 0,375%; y aproximadamente el 0,5%.

[0046] Los microbios en pienso para animales pueden inhibirse tratando dicho pienso con un compuesto de fórmula I y otros dos ácidos orgánicos como se definen anteriormente.

[0047] Preferentemente, la concentración combinada del compuesto de fórmula I y la mezcla de ácidos orgánicos en las composiciones antimicrobianas descritas en este documento para mezclar con alimentos está entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 5%. En diversas realizaciones preferidas, la concentración combinada está entre aproximadamente el 0,015% y aproximadamente el 4%; entre aproximadamente el 0,02% y aproximadamente el 3%; entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 2,5%; entre aproximadamente el 0,075% y aproximadamente el 2%; entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 1,5%; entre aproximadamente el 0,15% y aproximadamente el 1%; entre aproximadamente el 0,4% y aproximadamente el 0,9%; entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 0,8%; entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 5%; entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 4,5%; entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 4%; entre aproximadamente el 0,08% y aproximadamente el 3%; entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 2,5%; entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 0,8%; entre aproximadamente el 0,01% y aproximadamente el 0,5%; entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 0,6%; y entre aproximadamente 0,06% y aproximadamente el 0,525%.

[0048] En una realización preferida de la presente invención, la composición antimicrobiana comprende además un acidulante. Un acidulante es normalmente un ácido fuerte, preferentemente un ácido mineral. Ejemplos de tales acidulantes incluyen ácido fosfórico, ácido fosforoso, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido nítrico. En una realización, el acidulante es ácido fosfórico.

[0049] Preferentemente, el pH del pienso está entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8. Incluso más preferentemente, el pH está entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7. Todavía más preferentemente, el pH está entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 6,75. El pH puede medirse colocando una cantidad conocida del pienso y colocándola en una cantidad conocida de agua destilada. El pH de la disolución resultante, después de sedimentarse, puede medirse por cualquier medio estándar para medir el pH.

[0050] En una realización preferida, el ácido orgánico anteriormente mencionado es una mezcla de ácido fórmico y ácido propiónico en la que el ácido fórmico comprende de aproximadamente el 95% a aproximadamente el 5% de la mezcla de ácidos orgánicos y el ácido propiónico comprende de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 95% de la mezcla orgánica. Preferentemente, ácido fórmico comprende de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 15% de la mezcla de ácidos orgánicos y el ácido propiónico comprende de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 85% de la mezcla de ácidos orgánicos. En otra realización preferida, el ácido fórmico comprende de aproximadamente el 85% a aproximadamente el 65% de la mezcla de ácidos orgánicos y el ácido propiónico comprende de aproximadamente el 15% al 35% de la mezcla de ácidos orgánicos. En otra realización preferida, el ácido fórmico comprende aproximadamente el 75% de la mezcla de ácidos orgánicos y el ácido propiónico comprende aproximadamente el 25% de la mezcla de ácidos orgánicos. Esta mezcla de ácido fórmico/propiónico puede entonces combinarse con el compuesto de fórmula I según las relaciones descritas anteriormente.

[0051] En una realización preferida, las composiciones antimicrobianas pueden comprender adicionalmente uno o más componentes seleccionados de un tercer ácido orgánico y un acidulante. Preferentemente, el tercer ácido orgánico se selecciona del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido benzoico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido mandélico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido sórbico, ácido bórico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico y ácido glutárico. Preferentemente, el acidulante se selecciona del grupo que consiste en ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fosforoso, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido nítrico.

[0052] Se ha descubierto que ciertas composiciones antimicrobianas de la invención tienen un olor mejorado en comparación con composiciones similares sin Alimet®. Por ejemplo, las mezclas que comprenden ácido fórmico tienen un olor acre. En tales mezclas sin Alimet®, este olor es más fácilmente detectable que en las mismas mezclas que contienen Alimet®. Sin limitarse a una teoría particular, se cree que Alimet® en las mezclas puede reducir la presión de vapor de los otros ácidos orgánicos en las mezclas. Alternativamente, Alimet® puede enmascarar los olores desagradables.

[0053] Las bacterias en ensilaje pueden inhibirse tratando dicho ensilaje con una composición antibacteriana que comprende un compuesto de fórmula I y uno o más ácidos orgánicos como se han descrito anteriormente. Preferentemente, el compuesto de fórmula I y el (los) otro(s) ácido(s) orgánico(s) se añaden al ensilaje a aproximadamente 2 lb/ton a 125 lb/ton de forraje fresco combinado. En una realización, el compuesto de fórmula I y los otros ácidos orgánicos se añaden al ensilaje a aproximadamente 4 lb/ton a 100 lb/ton de forraje fresco combinado. En otra realización, el compuesto de fórmula I y los otros ácidos orgánicos se añaden al ensilaje a aproximadamente 5 lb/ton a 90 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 7 lb/ton a 80 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 8 lb/ton a 70 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 9 lb/ton a 60 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 10 lb/ton a 55 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 12 lb/ton a 50 lb/ton de forraje fresco combinado, más preferentemente a aproximadamente de 15 lb/ton a 30 lb/ton de forraje fresco combinado. Opcionalmente, las composiciones pueden comprender adicionalmente un acidulante como se describe en este documento.

[0054] La composición antimicrobiana de la invención puede inhibir bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Campylobacter o Lactobacillaceae. Por ejemplo L. plantarum o C. jejuni. En una realización particularmente preferida, la bacteria es de la familia Enterobacteriaceae. En una realización incluso más preferida, la bacteria es del género Salmonella o Escherichia. En una realización todavía más preferida, la bacteria es S. enteritidis o E. coli.

[0055] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos anteriormente mencionados pueden usarse en un procedimiento para inhibir bacterias en pienso para animales que comprende calcular la concentración en dicho pienso del compuesto de fórmula I y la mezcla de ácidos orgánicos necesaria para inhibir las bacterias presentes en dicho pienso para animales y aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicho pienso en una cantidad suficiente para lograr dicha concentración.

[0056] En otra realización de la presente invención, el compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos anteriormente mencionados pueden usarse en un procedimiento de procedimiento para inhibir moho en pienso para animales que comprende poner directamente o indirectamente a disposición información para calcular la concentración en dicho pienso de dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos necesarios para inhibir las bacterias presentes en dicho pienso para animales, y poner directamente o indirectamente a disposición información para aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicho pienso en una cantidad suficiente para lograr dicha concentración.

[0057] Los piensos para animales anteriormente mencionados pueden tratarse por calor, tanto antes como después de la administración del compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos.

[0058] El tratamiento de las composiciones de pienso para animales con el compuesto de fórmula I y con los otros ácidos orgánicos desvelados en este documento puede hacerse mezclando el compuesto de fórmula I y los otros ácidos orgánicos con los otros ingredientes en el pienso tal como el maíz, harina de soja, premezcla de harina de carne, otros suplementos para piensos, etc., cuando el pienso está siendo formulado. Alternativamente, el compuesto de fórmula I y el (los) otro(s) ácido(s) orgánico(s) pueden aplicarse a un pienso pre-mezclado o prepeletizado. En cualquier caso, el compuesto de fórmula I y el (los) otro(s) ácido(s) orgánico(s) se añaden preferentemente como líquidos y se dispersan uniformemente por la masa de la composición de pienso cuando se aplica. Preferentemente, dicho compuesto de fórmula I y dichos otros ácidos orgánicos se mezclan juntos antes de la aplicación a los piensos para animales. El compuesto pre-mezclado de fórmula I/mezcla de ácidos orgánicos puede aplicarse a los ingredientes del pienso para animales durante la formulación de las composiciones de pienso,

o puede aplicarse a pienso pre-mezclado o pre-peletizado.

[0059] El moho en pienso para animales puede inhibirse tratando dicho pienso con una cantidad antifúngicamente eficaz de un compuesto de fórmula I y uno o más ácidos orgánicos como se han descrito anteriormente, en la que

[0060] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos anteriormente mencionados pueden usarse en un procedimiento para retrasar la formación de moho en una composición de pienso para animales, comprendiendo el procedimiento aplicar un compuesto de fórmula I y uno o más ácidos orgánicos a dicha composición de pienso, comprendiendo dicha composición de pienso maíz y soja. En otra realización, el contenido de humedad es al menos el 10%.

[0061] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos anteriormente mencionados pueden usarse en un procedimiento para inhibir la formación de moho en una composición de pienso para animales, comprendiendo el procedimiento aplicar un compuesto de fórmula I y uno o más ácidos orgánicos a dicha composición de pienso, teniendo dicha composición de pienso un contenido de humedad de aproximadamente el 17% o menos. Preferentemente, el contenido de humedad es al menos el 0,01%. En otra realización, el contenido de humedad es al menos el 1%. En otra realización, el contenido de humedad es al menos el 5%. En otra realización, el contenido de humedad es al menos el 10%.

[0062] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos pueden usarse en un procedimiento para inhibir el crecimiento de moho en una composición de pienso para animales, comprendiendo el procedimiento calcular la concentración en dicho pienso del compuesto de fórmula I y la mezcla de ácidos orgánicos necesarios para inhibir el crecimiento de moho en dicha composición de pienso; y aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicha composición de pienso en dicha concentración.

[0063] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos pueden usarse en un procedimiento para inhibir el crecimiento de moho en pienso para animales que comprende calcular la concentración en dicho pienso del compuesto de fórmula I y la mezcla de ácidos orgánicos necesaria para inhibir el crecimiento de moho en dicho pienso para animales; y aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicho pienso en dicha concentración.

[0064] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y dichos ácidos orgánicos pueden usarse en un procedimiento para mejorar la resistencia al moho de una composición de pienso para animales, comprendiendo el procedimiento suspender el uso de DL-metionina como suplemento para piensos; calcular la concentración en dicho pienso del compuesto de fórmula I y la mezcla de ácidos orgánicos necesaria para inhibir el crecimiento de moho en dicho pienso para animales; y aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicho pienso en dicha concentración.

[0065] El compuesto anteriormente mencionado de fórmula I y los ácidos orgánicos pueden usarse en un procedimiento para inhibir moho en pienso para animales poniendo directamente o indirectamente a disposición información para calcular la concentración en dicho pienso de dicho compuesto de fórmula I y la concentración de dicha mezcla de ácidos orgánicos necesaria para inhibir el moho presente en dicho pienso para animales; y poniendo directamente o indirectamente a disposición información para aplicar dicho compuesto de fórmula I y dicha mezcla de ácidos orgánicos a dicho pienso en dicha concentración.

[0066] En diversas realizaciones preferidas, las composiciones o combinaciones comprenden además un acidulante seleccionado del grupo que consiste en ácidos minerales seleccionados preferentemente del grupo que consiste en ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fosforoso, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido nítrico; y/o un tercer ácido orgánico seleccionado del grupo que consiste en ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido benzoico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido mandélico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido sórbico, ácido bórico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico y ácido glutárico.

[0067] En una realización todavía más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido fórmico, ácido propiónico y ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% de la suma del contenido de HMBA, ácido fórmico, ácido propiónico y ácido fosfórico; el contenido de ácido fórmico es de aproximadamente el 65% a aproximadamente el 85% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 10% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es aproximadamente el 75% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es aproximadamente el 5% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 10% de dicha suma. Alternativamente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de dicha suma, el contenido de ácido fórmico es de aproximadamente el 45% a aproximadamente el 65% de dicha suma, el contenido de ácido propiónico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 20% de dicha suma, y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% de dicha suma; incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 30% de dicha suma, el contenido de ácido fórmico es aproximadamente el 55% de dicha suma, el contenido de ácido propiónico es aproximadamente el 10% de dicha suma y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 5% de dicha suma.

[0068] En otra realización más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido butírico, ácido láctico y ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de la suma del contenido de HMBA, ácido butírico, ácido láctico y ácido fosfórico; el contenido de ácido butírico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 30% de dicha suma; el contenido de ácido butírico es aproximadamente el 20% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es aproximadamente el 20% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 30% de dicha suma. Alternativamente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de dicha suma del contenido de ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico, ácido butírico, ácido láctico y ácido fosfórico, el contenido de ácido butírico es de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 25% de dicha suma, el contenido de ácido láctico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 45% de dicha suma; más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 30% de dicha suma, el contenido de ácido butírico es aproximadamente el 15% de dicha suma, el contenido de ácido láctico es aproximadamente el 20% de dicha suma y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 35% de dicha suma.

[0069] En otra realización más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido butírico, ácido fórmico, ácido láctico y ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de la suma del contenido de HMBA, ácido butírico, ácido fórmico, ácido láctico y ácido fosfórico; el contenido de ácido butírico es de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 22% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 28% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 20% de dicha suma; el contenido de ácido butírico es aproximadamente el 12% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es aproximadamente el 30% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es aproximadamente el 18% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 20% de dicha suma.

[0070] En otra realización más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido butírico, ácido láctico, ácido propiónico, y ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de la suma del contenido de HMBA, ácido butírico, ácido láctico, ácido propiónico y ácido fosfórico; el contenido de ácido butírico es de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 22% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es de aproximadamente el 8% a aproximadamente el 28% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 20% de dicha suma; el contenido de ácido butírico es aproximadamente el 12% de dicha suma; el contenido de ácido láctico es aproximadamente el 18% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es aproximadamente el 30% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 20% de dicha suma.

[0071] En otra realización más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido butírico, ácido fórmico, ácido propiónico y ácido fosfórico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 20% de la suma del contenido de HMBA, ácido butírico, ácido fórmico, ácido propiónico y ácido fosfórico; el contenido de ácido butírico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es de aproximadamente el 65% a aproximadamente el 85% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 10% de dicha suma; el contenido de ácido butírico es aproximadamente el 5% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es aproximadamente el 75% de dicha suma; el contenido de ácido propiónico es aproximadamente el 5% de dicha suma; y el contenido de ácido fosfórico es aproximadamente el 5% de dicha suma.

[0072] En otra realización más preferida, las composiciones y combinaciones descritas en este documento comprenden HMBA, ácido fórmico y ácido propiónico. Preferentemente, el contenido de HMBA es de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40% de la suma del contenido de HMBA, ácido fórmico y ácido propiónico; el contenido de ácido fórmico es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60% de dicha suma; y el contenido de ácido propiónico es de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30% de dicha suma. Incluso más preferentemente, el contenido de HMBA es aproximadamente el 30% de dicha suma; el contenido de ácido fórmico es aproximadamente el 50% de dicha suma; y el contenido de ácido propiónico es aproximadamente el 20% de dicha suma.

[0073] Los microbios en un sujeto pueden inhibirse o combatirse para tratar dicho sujeto con una composición o combinación como se describe en este documento. En una realización preferida, el sujeto que va a tratarse es agua

o alimento preferentemente seleccionado del grupo que consiste en alimento para seres humanos, alimento para ganado, alimento para mascotas o alimento para acuicultura.

[0074] Los animales a los que pueden proporcionarse el alimento, los ingredientes para alimentos y/o las composiciones de pienso descritos en este documento incluyen seres humanos, rumiantes tales como vacas lecheras, vacas lecheras lactantes, terneros lecheros, ganado vacuno, ovejas y cabras; acuicultura tal como peces y crustáceos (incluyendo, pero no se limitan a, salmón, langostino, carpa, tilapia y marisco); ganado tal como cerdos y caballos; aves de corral tales como pollos, pavos y crías recién eclosionadas de los mismos; y animales de compañía tales como perros y gatos.

[0075] La formulación exacta de la composición de pienso para animales anteriormente mencionada no es crítica para la presente invención. Los ingredientes del pienso se seleccionan según los requisitos nutritivos del animal particular para el que se prevé el pienso; estos requisitos dependen, entre otras cosas, de la edad y el estado de desarrollo del animal, el sexo del animal y otros factores. Los ingredientes del pienso pueden agruparse en ocho clases basándose en su composición y su uso en dietas de formulación: forrajes secos y fibras; pasturas, plantas para pastos y forrajes frescos; ensilajes; piensos energéticos; suplementos proteicos; suplementos minerales; suplementos vitamínicos; y aditivos. Véase National Research Council (U.S.) Subcommittee on Feed Composition, United States-Canadian Tables and Feed Composition, 3ª rev., National Academy Press, pág. 2, 145 (1982). Estas clases son, hasta un cierto grado, arbitrarias ya que algunos ingredientes del pienso podrían clasificarse en más de una clase. Normalmente, una formulación de pienso también dependerá de los costes asociados a cada ingrediente, siendo la formulación preferida la composición menos cara de ingredientes que da los nutrientes necesarios.

[0076] El ensilaje es un producto de forraje que se produce a partir de la cosecha, el almacenamiento y la fermentación de cosechas de forraje verdes tales como maíz y plantas de sorgo en grano. Estas cosechas se cortan, tallos y todo, antes de que el grano esté listo para recogerse. El material vegetal se almacena en silos, bolsas de almacenamiento, tolvas o pilas cubiertas haciendo que el material fermente, reduciéndose así el pH y preservándose el material vegetal hasta que pueda darse de comer. El forraje ensilado está sometido a cambios en pH, temperatura y niveles de oxígeno.

[0077] Como se observa anteriormente, las formulaciones de pienso dependen en parte de la edad y del estado de desarrollo del animal que va a alimentarse. Leeson y Summers (Nutrition of the Chicken, 4ª ed., pág. 502-510, University Books (2001)) describen varias dietas para aves de corral representativas para pollas, gallinas ponedoras, pollos de engorde y reproductoras de pollos de engorde. Por ejemplo, la mayoría de las dietas para pollos contienen concentrados energéticos tales como maíz, avena, trigo, cebada o sorgo; fuentes de proteínas tales como harina de soja, otras harinas de semillas oleaginosas (por ejemplo, cacahuete, sésamo, alazor, girasol, etc.), harina de semilla de algodón, fuentes de proteínas animales (harina de carne y hueso, suero seco, harina de pescado, etc.), legumbres de grano (por ejemplo, judías secas, guisantes forrajeros, etc.), y alfalfa; y suplementos vitamínicos y minerales, si fuera necesario (por ejemplo, la harina de carne y hueso es rica en calcio y fosforo y, por tanto, estos minerales no necesitan complementarse en una ración de pienso que contiene harina de carne y hueso). Las cantidades relativas de los diferentes ingredientes en pienso para aves de corral depende en parte de la etapa de producción del ave. Las raciones de iniciación son más ricas en proteína, mientras que los piensos de engorde y de terminación pueden ser más pobres en proteína ya que las aves más viejas requieren menos proteína. También están disponibles dietas modelo para cerdos y otros animales y pueden modificarse según las necesidades particulares del (de los) animal(es) que va(n) a alimentarse.

[0078] El término “inhibir” cuando se usa en este documento en términos tales como “bacterias inhibidoras” significa cualquiera o más de (a) combate de bacterias o moho; (b) cualquier disminución en el crecimiento de las bacterias o moho que pueda medirse en términos de recuentos de colonias; (c) cualquier disminución en la concentración de bacterias o moho; o (d) la incapacidad de las bacterias o moho para crecer sobre un medio de selección particular. Cada uno de éstos puede determinarse, por ejemplo, comparando los recuentos de colonias bacterianos o fúngicos o la concentración de bacterias o moho presente en ausencia de la aplicación de los procedimientos descritos en este documento con los recuentos de colonias bacterianos o fúngicos o concentración de bacterias o moho después de la aplicación de los procedimientos de la presente invención. La aplicación de bactericidas o fungicidas adecuados mostrará una diferencia de diez veces en recuentos de colonias.

[0079] Ciertos procedimientos descritos en este documento requieren calcular, por ejemplo, la concentración de un compuesto de fórmula I en un pienso para animales necesario para inhibir bacterias o moho presentes en un pienso para animales, o la concentración de un compuesto de fórmula I y otro ácido orgánico o ácidos necesarios para inhibir bacterias o moho presentes en un pienso para animales. En este documento se proporcionan los Ejemplos y Ejemplos comparativos 1-24 que ilustran cantidades del compuesto de fórmula I y/u otros ácidos orgánicos que son suficientes para inhibir bacterias o moho. También se proporcionan anteriormente en este documento y más adelante en este documento intervalos aceptables de cantidades de compuesto de fórmula I y/u otros ácidos orgánicos y relaciones entre los dos que son adecuados para su uso en los procedimientos de la presente invención. Según se necesite pueden determinarse otras concentraciones, intervalos y relaciones adecuadas.

[0080] El término “ufc” representa unidades formadoras de colonias.

[0081] Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

EJEMPLO comparativo 1

[0082] Se estudiaron los efectos de aumentar las cantidades de ácido fórmico y/o Alimet® sobre los recuentos de

5 colonias de cuatro bacterias (E. coli, S. enteritidis, L. plantarum y C. jejuni). Se añadieron individualmente cantidades variables de ácido fórmico o Alimet® a los cultivos de estas bacterias a pH 4,5 ó 6,75 y los cultivos se incubaron durante un periodo de tiempo tras el cual se realizaron los recuentos de colonias.

[0083] El cultivo de S. enteritidis para el estudio in vitro contuvo una mezcla de ID-Lelystad de S. enteritidis (cepa

10 resistente a ácido nalidíxico) y S. enteritidis (97.07773 RIVM, aislada de aves de corral). El cultivo de E. coli contuvo una mezcla de O149K91K88 de E. coli (VA2000-08915, patógeno del cerdo) y ATCC 25922 de E. coli. El cultivo de

L. plantarum estudiado fue Bd 99.00553 de L. plantarum. El cultivo de C. jejuni estudiado fue C356 de C. jejuni, antiguamente ID-Lelystad.

15 [0084] S. enteritidis y E. coli de cultivos frescos durante la noche en caldo de infusión de cerebro y corazón se incubaron aeróbicamente en disolución salina (8,5 g/l de NaCl) tamponada con fosfato (0,11 M) con peptona (1 g/l), excepto S. enteritidis a pH 4,5. Para este cultivo, el medio 5 se usó como caldo y el cultivo se incubó aeróbicamente durante 4 horas a 37ºC. Los recuentos de colonias se realizaron según procedimientos de operación convencionales.

20 [0085] Los cultivos frescos durante la noche de L. plantarum en caldo de infusión de cerebro y corazón se usaron para inocular el medio 5. Los tubos de ensayo se incubaron bajo atmósfera de oxígeno reducido durante 6 horas a 37ºC. Se realizaron los recuentos de colonias.

25 [0086] Para la inoculación se usó C. jejuni cultivado en agar selectivo sin sangre para Campylobacter. Se incubó caldo Preston bajo atmósfera de oxígeno reducido durante 6 horas a 37ºC. Se realizaron los recuentos de colonias.

[0087] Se añadieron ácido fórmico y Alimet® a los cultivos bacterianos en concentraciones de 0,108 g/l, 0,30 g/l y 0,83 g/l. Estas dosificaciones se eligieron basándose en el uso comercial de Alimet® y una dilución aproximada de 10

30 veces en el tracto digestivo proximal.

[0088] Un resumen de los resultados obtenidos con ácido fórmico y Alimet® en S. enteritidis y E. coli se facilita en las Tablas 1 y 2, yen L. plantarum y C. jejuni en las Tablas 3 y 4; los resultados se ilustran en las Figuras 1-4.

Tabla 1 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de S. enteritidis después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,23 log ufc/ml

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

5,03 -0,20 6,62 1,42

0,108

- 4,92 -0,31 6,71 1,51

0,30

- 4,96 -0,27 6,63 1,43

0,83

- 4,93 -0,30 6,53 1,33

-

0,108 5,04 -0,19 6,79 1,59

-

0,30 4,96 -0,27 6,77 1,57

-

0,83 4,86 -0,38 6,72 1,52

Tabla 2 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de E. coli después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,24 log ufc/ml

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

5,36 0,12 7,47 2,23

0,108

- 5,45 0,21 7,33 2,09

0,30

- 5,25 0,01 7,36 2,12

0,83

- 3,96 -1,28 7,39 2,15

-

0,108 5,19 -0,05 7,48 2,24

-

0,30 4,96 -0,28 7,50 2,26

-

0,83 5,08 -0,16 7,49 2,25

Tabla 3 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de L. plantarum después de 6 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,04 log ufc/ml Δ log = logmuestra - loginicial

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

5,67 0,63 6,10 1,06

0,108

- 5,67 0,63 6,09 1,05

0,30

- 5,57 0,53 6,20 1,16

0,83

- 5,74 0,70 5,70 0,66

-

0,108 5,75 0,71 5,88 0,84

-

0,30 5,74 0,70 6,23 1,19

-

0,83 5,56 0,52 6,19 1,15

Tabla 4 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de C. jejuni después de 6 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,23 log ufc/ml

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

3,70 -1,53 6,54 1,31

0,108

- 0,108 4,07 -1,16 6,44

0,30

- 0,30 3,95 -1,28 6,40

0,83

- 0,83 2,80 -2,43 6,34

-

0,108 3,86 -1,37 6,27 1,04

-

0,30 2,63 -2,60 6,38 1,15

-

0,83 < 1,30 < -3,93 6,25 1,02

[0089] S. enteritidis: Antes de la inoculación, los cultivos de S. enteritidis tuvieron un recuento de colonias de 5,03

5 log ufc/ml a pH 4,5, y de 6,62 a pH 6,75. Los resultados obtenidos a ambos valores de pH fueron similares para Alimet® y ácido fórmico: a pH 4,5 ninguno tuvo un efecto significativo sobre la inhibición del crecimiento de S. enteritidis; a pH 6,75 no se observó inhibición de S. enteritidis.

[0090] E. coli: Antes de la inoculación, a pH 4,5, los cultivos de E. coli tuvieron un recuento de colonias de 5,36 log

10 ufc/ml; a pH 6,75 fue 7,47. 0,83 g/l de Alimet® dieron aproximadamente una reducción logarítmica de 1,3 del crecimiento de E. coli a pH 4,5 en comparación con la reducción logarítmica de aproximadamente 0,1 por la misma concentración de ácido fórmico a pH 4,5. Concentraciones inferiores de tanto Alimet® como de ácido fórmico mostraron poca o ninguna inhibición. Ni Alimet® ni el ácido fórmico inhibieron E. coli a pH 6,75.

15 [0091] L. plantarum: Antes de la inoculación, a pH 4,5, los cultivos de L. plantarum tuvieron un recuento de colonias de 5,67 log ufc/ml; a pH 6,75 fue 6,10. Ni Alimet® ni el ácido fórmico inhibieron L. plantarum a ningún pH estudiado.

[0092] C. jejuni: Antes de la inoculación, a pH 4,5, los cultivos de C. jejuni tuvieron un recuento de colonias de 3,70

20 log ufc/ml; a pH 6,75 fue 6,54. Todas las dosis de Alimet® inhibieron C. jejuni a pH 4,5. 0,83 g/l de Alimet® dieron aproximadamente una reducción logarítmica de 2,4 del crecimiento de C. jejuni a este pH. Dosificaciones inferiores de Alimet® (0,108 g/l y 0,30 g/l) dieron aproximadamente reducciones logarítmicas de 1,1 y 1,2, respectivamente. El ácido fórmico demostró inhibición comparable. No se mostró actividad antibacteriana contra C. jejuni a pH 6,75 para ninguna concentración de Alimet® ni de ácido fórmico estudiada.

25 [0093] Estos resultados se demuestran gráficamente en las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D. Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D demuestran los efectos dependientes del pH de ácido fórmico y Alimet®. Ninguna de las cuatro bacterias estudiadas se inhibieron por ningún ácido fórmico ni Alimet® a pH de 6,75; en realidad, a este pH aumentó el recuento de unidades formadoras de colonias de cada bacteria, aumentando el que más el recuento de E. coli y

30 aumentando el que menos el de L. plantarum.

EJEMPLO comparativo 2

[0094] El efecto de mayores dosificaciones de Alimet® y ácido fórmico sobre el recuento de colonias de cultivos de

35 S. enteritidis se estudió siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Los resultados obtenidos se facilitan en la Tabla 5 y se ilustran en la Figura 3.

Tabla 5 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de S. enteritidis después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,23 log ufc/ml

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

5,15 -0,09 6,92 1,69

1

- 5,02 -0,21 6,61 1,38

3

- 4,76 -0,48 5,97 0,74

5

- 2,37 -2,86 5,43 0,20

-

1 5,01 -0,22 6,92 1,69

-

3 4,55 -0,68 6,58 1,35

-

5 3,83 -1,41 6,10 0,87

[0095] Antes de la inoculación, los cultivos de S. enteritidis tuvieron un log ufc/ml de 5,15 a pH 4,5 y de 6,92 a pH 6,75. A pH 6,75, la adición de 5 g/l de ácido fórmico o 3 g/l de Alimet® dio aproximadamente una inhibición del crecimiento de 1 log ufc/ml. Una adición de 5 g/l de Alimet® detiene el crecimiento de S. enteritidis. A pH 4,5, 5 g/l de

5 Alimet® reducen el crecimiento de S. enteritidis aproximadamente 2,8 log ufc/ml. Concentraciones inferiores de Alimet® dan un efecto menor. El ácido fórmico a 5 g/l reduce el crecimiento de S. enteritidis aproximadamente 1,3 log ufc/ml. Por tanto, a los intervalos de dosis estudiados, el efecto antibacteriano de Alimet® contra S. enteritidis es mayor que el de ácido fórmico. Estos resultados se demuestran gráficamente en la Figura 3.

10 EJEMPLO comparativo 3

[0096] Se estudiaron combinaciones de Alimet® y ácido fórmico siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo

1. Los resultados obtenidos se facilitan en la Tabla 6 y se ilustran en las Figuras 4A y 4B.

Tabla 6 Efecto de ácido fórmico y Alimet® sobre la población de S. enteritidis después de 4 horas a pH 4,5 y 6,75 recuento de colonias inicial: 5,15 log ufc/ml)

Ácido (g/l)

pH = 4,5 pH = 6,75

Alimet®

Fórmico log ufc/ml Δ log log ufc/ml Δ log

-

-

4,99 -0,17 6,87 1,80

3

- 4,76 -0,39 5,89 0,82

5

- 2,07 -3,08 5,45 0,38

-

3 4,57 -0,58 6,51 1,44

-

5 3,94 -1,21 6,19 1,12

0,75

2,25 4,78 -0,37 6,27 1,20

1,25

3,75 4,01 -1,14 5,94 0,88

1,50

1,50

4,73 -0,42 6,11 1,04

2,25

0,75 4,78 -0,37 5,97 0,90

2,50

2,50

2,48 -2,67 5,74 0,67

3

5 1,15 -4,00 5,31 0,24

3,75

1,25 2,11 -3,04 5,54 0,47

15 [0097] Las combinaciones de Alimet® y ácido fórmico que tienen una concentración combinada de 5 g/l inhiben el crecimiento de S. enteritidis a un mayor grado que las combinaciones que tienen una concentración combinada de 3 g/l. Se prepararon tres combinaciones de 5 g/l que tienen relaciones de Alimet® con respecto a ácido fórmico de 1:3,

1:1 y 3:1.

20 [0098] A pH 4,5, el tratamiento con 3 g/l de Alimet® solo dio una reducción de aproximadamente 0,4 log ufc/ml en el crecimiento de S. enteritidis. El tratamiento a ese pH con 5 g/l de ácido fórmico dio una reducción de aproximadamente 1,2 log ufc/ml. Sorprendentemente, el tratamiento con una combinación de 3 g/l de Alimet® y 5 g/l de ácido fórmico dio una reducción de 4 log ufc/ml, que fue superior a la esperada dados los resultados individuales

25 con Alimet® y ácido fórmico a esos niveles. Los resultados obtenidos sugieren que a pH 4,5 las combinaciones de 2,5 g/l de Alimet® y 2,5 g/l de ácido fórmico, y con 3 g/l de Alimet® y 5 g/l de ácido fórmico, pueden tener un efecto sinérgico. La última combinación da los mejores resultados de todas las combinaciones probadas: a pH 4,5, esta combinación da una reducción logarítmica de 4 log (casi completa) de S. enteritidis.

30 EJEMPLO comparativo 4

[0099] Se estudiaron los efectos de mezclas de ácido orgánico (butírico, cítrico, fórmico, láctico y propiónico) y Alimet® sobre los recuentos de colonias de E. coli (ATCC 25922) cultivados en caldo de soja tripticasa a 35ºC según las instrucciones del fabricante. Se estudiaron mezclas de ácido orgánico : Alimet® de 2:1 y 5:1 a una concentración total (ácido orgánico + Alimet®) de 6 g/l.

[00100] El pH de las disoluciones se ajustó originalmente a pH 5 mediante la adición de HCl y/o NaOH según se

5 necesitara. Las disoluciones del cultivo de E. coli activadas se transfirieron a caldo de soja fresco dos veces a intervalos de 24 horas antes de la adición de la mezcla de ácido orgánico : Alimet®. Las disoluciones del cultivo de E. coli se centrifugaron; el sedimento producido se resuspendió en tampón Butterfield y las disoluciones resultantes se diluyeron a aproximadamente 107 ufc de E. coli/ml.

10 [00101] Las botellas se inocularon con 100 µl de suspensión bacteriana preparada y una mezcla de ácido orgánico : Alimet®. Las muestras se tomaron después de cinco y 24 horas de incubación, se diluyeron seriadamente y se sembraron en placa por extensión sobre agar de soja tripticasa, y se incubaron a 35ºC durante 24 horas. Las poblaciones de E. coli se informan en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7 Efecto de mezclas de Alimet®/ácido sobre poblaciones de E. coli en caldo de soja tripticasa recuento de colonias inicial: 4,97 log ufc/ml

Ácido

Relación acido:Alimet® pH original log ufc/ml

t = 4 h

t = 24 h

Control

- - 7,18 9,22

HCl

- - 7,85 8,34

Láctico

5:1 aprox. 4,2 4,68 3,98

2:1

4,1 4,87 4,45

Fórmico

5:1 3,1 4,95 <1

2:1

3,56 4,95 1,00

Cítrico

5:1 4,75 6,38 8,59

2:1

4,59 5,90 8,66

Butírico

5:1 4,62 4,77 3,70

2:1

4,6 4,85 3,80

Propiónico

5:1 4,54 4,79 4,57

2:1

4,53 4,83 4,53

15 [00102] Las mezclas con ácido fórmico fueron las más eficaces entre las mezclas probadas para controlar E. coli tanto a 5:1 como a 2:1 de mezclas de ácido fórmico : Alimet®. Tras la exposición prolongada (después de 5 horas), ambas relaciones dieron una reducción casi completa de E. coli. Las mezclas de ácido láctico, butírico y propiónico con Alimet® suprimieron el crecimiento de E. coli, pero no redujeron la población bacteriana en 24 horas.

20 EJEMPLO comparativo 5

[00103] Se estudiaron los efectos de ácido clorhídrico, ácido fórmico, ácido láctico o Alimet® sobre los recuentos de colonias de E. coli. Las cantidades de ácido fórmico, ácido láctico o Alimet® se añadieron a cultivos de E. coli, se

25 cultivaron en un caldo de soja, a pH 4 ó 7,3. Los cultivos se incubaron y los recuentos de colonias se realizaron a tiempos crecientes.

[00104] Los resultados se ilustran en la Figura 5. El ácido fórmico y láctico, y Alimet®, disminuyeron los recuentos de colonias de E. coli mejor que el ácido clorhídrico. Como en el Ejemplo 1, Alimet® mostró una mejor reducción de

30 los recuentos de colonias de E. coli con respecto a ácido fórmico, y mostró una reducción comparable en comparación con ácido láctico.

EJEMPLO comparativo 6

35 [00105] Se estudió el efecto de Alimet® sobre Salmonella en una premezcla de harina de carne según el protocolo expuesto por Smyser y Snoeyenbos (Poultry Sci. 58 (1979) 50-54). La premezcla de harina de carne (Papillon Ag Products, Inc., Easton, MD) que contiene aproximadamente 77% de proteína cruda se usó en los ensayos. Se midieron diez gramos de muestra de prueba de premezcla para cada concentración de Alimet® estudiada en un tubo estéril (tres repeticiones por muestra). Se añadió agua estéril (1 ml) a cada tubo para asegurar la humedad

40 adecuada para la multiplicación de salmonela. Se logró un nivel final de humedad del 20% después de la inoculación. Cada muestra de prueba se inoculó con 1,0 ml de un cultivo de caldo de TSB diluido de salmonela resistente a ácido nalidíxico (NA) (aproximadamente 103,5 células/g como se determina a partir de los recuentos en placa por extensión del cultivo). Las muestras inoculadas se mezclaron con un depresor lingual estéril o herramienta equivalente y se incubaron a 37ºC durante la duración del ensayo.

45 [00106] Los recuentos de Salmonella se determinaron usando agar verde brillante que contenía nalidixato de sodio en los días 1, 2 y 3. Se tomó una muestra de prueba de 1 g de cada tubo y se transfirió a 9 ml de agua estéril. Esta muestra de prueba se incubó a 4ºC durante aproximadamente 4 horas, luego se agitó durante 60-90 segundos. Cada muestra de prueba se diluyó seriadamente en proporciones de 1:10, 1:100 y 1:1000, y 100 µl de muestra de prueba sin diluir, muestra diluida 1:10, muestra diluida 1:100 y muestras diluidas 1:1000 se sembraron en placas de agar verde brillante que contenían nalidixato de sodio. La recuperación en porcentaje de Salmonella para diferentes

5 niveles de Alimet® se informa en la Tabla 8 y la Figura 7.

Tabla 8 Recuperación de Salmonella en premezcla de harina de carne con 20% de humedad; dilución 1:10

Alimet® conc. (informado)

Alimet® conc. (hallado) % de Salmonella recuperada

día 0

día 1 día 2 día 3

control (0%)

100% 1990% 971% 267%

0,275%

0,056% 100% 102% 67% < 3%*

0,18%

0,140% 100% 190% 65% 11%

0,25%

0,188% 100% 476% 139% 25%

0,36%

0,192% 100% 114 % 62% 4%

0,40%

0,220% 100% 343% 267% 53%

0,69%

0,631% 100% 5% < 3%* < 3%*

* por debajo del límite de detección

[00107] La muestra de control (sin Alimet® añadido) mostró un pronunciado aumento inicial en la población de Salmonella un día después de la inoculación, que indica multiplicación de las bacterias. Esta multiplicación fue

10 seguida por un descenso gradual en los recuentos bacterianos en los días 2 y 3. Los resultados del mayor nivel de Alimet® probado sugieren que Alimet® es bactericida para Salmonella en harina de carne y hueso. Como ilustra la Figura 8, Alimet® a este nivel proporciona resultados comparables al tratamiento con ácido fórmico al 1,65% (15 kg/ton). Véase Liu, “Using Organic Acids to Control Salmonella in Poultry Production” Kemin Industries (Asia) Pte Limited, Singapur, disponible en http://www.kemin.com.

15 [00108] Asimismo, Alimet® en el intervalo del 0,14-0,22% mostró efecto anti-Salmonella y no parece ser dependiente de la dosis en este intervalo. Sin embargo, cada muestra fue de diferentes lotes de MBM, que puede ser responsable de la falta de dosis-respuesta. La multiplicación inicial observada en el control fue significativamente reducida tras la adición de Alimet® a estos niveles. La posterior disminución se produjo más rápidamente para estos

20 menores niveles de Alimet® en comparación con el control.

EJEMPLO comparativo 7

[00109] El crecimiento fúngico en pienso molido de iniciación basal se estudió en composiciones complementadas

25 con DLM o Alimet® como fuente de metionina. El crecimiento microbiano total se monitorizó midiendo la formación de dióxido de carbono (CO2) en recipientes cerrados a 28ºC con el tiempo. La medición de la formación de CO2 no distingue entre crecimiento bacteriano y de mohos; sin embargo, es muy conocida la capacidad del moho para crecer a actividades de agua mucho menores, en comparación con las bacterias, y tanto el moho como las bacterias desempeñan una parte en la degradación de piensos.

30 [00110] La técnica de usar un sistema cerrado y medir la formación de CO2 se ha verificado como una aproximación de las condiciones halladas en graneros para el almacenamiento de grano. Véase, por ejemplo, Muir y col., Trans. ASAE, 28(5) 1673-1675 (1985), cuyo contenido se incorpora por este documento por referencia en su totalidad.

35 [00111] Un pienso molido de iniciación (formulación mostrada en la siguiente Tabla 9) se subdividió en tres grupos: basal (control), 0,2% de DLM o 0,2% de Alimet®. El pienso estudiado no tenía inhibidores de moho comerciales añadidos y es representativo de un pienso típico para pollos de engorde.

[00112] La humedad inicial del pienso fue el 10,8%. Después de la adición de Alimet® o DLM, la humedad de las

40 muestras se ajustó mediante la adición del 2%, 4% u 6% de agua destilada estéril para promover el crecimiento de moho consiguiéndose tres grupos de humedad: 83,2% de materia seca/12,8% de humedad; 85,2% de materia seca/14,8% de humedad; y 87,2% de materia seca/16,8% de humedad.

[00113] Para cada estudio se mezclaron cuatro muestras repetidas de cada grupo de humedad y 600 g de la

45 mezcla se colocaron en recipientes de 1 l, se cerraron y se pusieron a 28ºC en una habitación de temperatura controlada. Se usaron tubos detectores Draeger (medición de CO2, obtenidos de Fisher Scientific) para medir el CO2 desarrollado en diferentes días tras el cierre del recipiente (se hicieron dos mediciones por semana). Los tubos detectores Draeger Short-Term son tubos de vidrio llenos de un vehículo inerte y un reactivo indicador. El reactivo produce una indicación colorimétrica en presencia de un gas particular (CO2). La concentración de gas se lee

50 directamente de la alteración del color en la escala impresa en el tubo.

[00114] No se identificaron las especies de moho específicas presentes. El análisis estadístico se llevó a cabo usando la prueba de rango múltiple de Duncan (SAS). Letras diferentes en momentos de tiempo individuales en las Figuras 9-11 indican diferencias estadísticas de P < 0,05.

Tabla 9 Formulación de pienso molido de iniciación basal

Ingrediente

% en peso de la mezcla total

Maíz

60,551

Harina de soja

32,254

Grasa, animal

3,665

Dical940224PhosfromD (fosfato de dicalcio)

1,861

Caliza

0,811

Premezcla de vitaminas/minerales Novus fabricada por Trouw Nutrition (Highland, Illinois)

0,350

Sal

0,340

HCl de L-lisina al 78%

0,097

Treonina

0,051

Antioxidante conservante Santoquin-mix6 comercializado por Solutia Inc. (St. Louis, Missouri)

0,019

Sulfato de cobre

0,003

5 [00115] Como se muestra en la Figura 9, Alimet® inhibió eficazmente el crecimiento de moho durante hasta siete días al mayor nivel de humedad probado (83,2% de materia seca/16,8% de humedad), mientras que DLM fue el menos eficaz y, en realidad, mostró crecimiento de moho en el transcurso de dos días. En realidad, el pienso molido de iniciación tratado con DLM mostró el crecimiento de moho más rápido que el pienso molido basal (es decir,

10 pienso sin metionina o análogo de metionina añadidos) y más rápido que el pienso molido tratado con Alimet® para todos los niveles de humedad probados.

[00116] Como se demuestra en la Figura 10, el pienso tratado con Alimet® mostró una menor tasa de crecimiento de moho en pienso con 85,2% de materia seca/14,8% de humedad que el pienso tratado con DLM.

15 [00117] Para pienso que tiene 87,2% de materia seca/12,8% de humedad, el pienso tratado con Alimet® muestra bajos niveles de moho durante hasta sesenta días, mientras que el pienso tratado con DLM muestra un repentino aumento en el crecimiento de moho después de sólo veinte días (véase la Figura 11).

20 [00118] Las Figuras 9, 10 y 11 ilustran cada una que es más probable que el pienso molido tratado con DLM desarrolle moho que tanto el pienso deficiente en metionina como el pienso tratado con Alimet®, y que Alimet® era más eficaz en la inhibición del crecimiento de moho que en comparación con pienso sin tratar, o pienso complementado con DLM.

25 EJEMPLO comparativo 8

[00119] El experimento descrito anteriormente en el Ejemplo 7 se repitió con mezclas de 2,0 lb/ton, 1,5 lb/ton, 1,0 lb/ton o 0,5 lb/ton de ácido propiónico al 65% y tanto 2% de Alimet® como 2% de DLM. Las mezclas se prepararon según la matriz explicada resumidamente en la Tabla 8, más adelante. El ácido propiónico al 65% se tamponó con

30 hidróxido de amonio a un pH de 5,5.

Tabla 10 Mezclas antifúngicas de Aliment® o DLM con ácido propiónico

Ensayo nº

Alimet® (%) Propiónico (lb/ton) DLM (%)

1

0,2 - -

2

- 2 0,2

3

- 1,5 0,2

4

- 1,0 0,2

5

- 0,5 0,2

6

- - 0,2

7

0,2 2 -

8

0,2 1,5 -

9

0,2 1,0 -

10

0,2 0,5 -

[00120] El análisis estadístico se llevó a cabo usando la prueba de rango múltiple de Duncan (SAS). Letras diferentes en momentos de tiempo individuales en las gráficas indican diferencias estadísticas de P<0,05.

[00121] Como se muestra en la Figura 12, la dieta basal que tiene 85,2% de materia seca y que contiene 0,2% de Alimet® retrasó la aparición del crecimiento de moho 5 días; el efecto de 2,0 lb/ton, 1,5 lb/ton y 1,0 lb/ton de ácido propiónico al 65% es aproximadamente 11 días, es decir, no se observó diferencia significativa cuando se añadió ácido propiónico más allá de 1 lb/ton.

5 [00122] Las combinaciones de Alimet® y ácido propiónico se compararon con pienso tratado con ácido propiónico solo, y los resultados se muestran en las Figuras 13-15. Los resultados indican que, para todos los niveles de humedad estudiados, el pienso basal que contiene Alimet® más ácido propiónico mostró una inhibición de moho mejorada en comparación con pienso que sólo contiene ácido propiónico.

10 EJEMPLO comparativo 9

[00123] Se estudió el efecto de los ácidos fórmico, butírico y láctico sobre poblaciones de Salmonella en pienso de iniciación basal basado en maíz-soja para determinar los niveles de estos ácidos requeridos para bactericida

15 completo.

[00124] Las pruebas se llevaron a cabo usando 1 g de pienso (molido desmenuzado) con 6% de harina de carne y hueso (“MBM”). Se prepararon disoluciones acuosas al 25% de ácidos fórmico, butírico y láctico. Las disoluciones de ácido se añadieron al pienso como se indica más adelante; se añadieron agua (1 ml) y HCl 150 mM (1,8 ml) para

20 llevar el pH a 4,0. Se añadió Salmonella resistente a ácido nalidíxico (proporcionada por Dr. Stan Bailey, USDA/ARS, Athens, Georgia) (recuento de colonias inicial = 40.000 ufc/g) y las disoluciones de pienso se incubaron a 37ºC durante 90 min. Cada muestra se diluyó con 6 ml de H2O, se sembró en placa y se contó al siguiente día. Los recuentos de colonias se informan en la siguiente Tabla 11.

Tabla 11 Efecto de ácido fórmico, butírico o láctico sobre poblaciones de Salmonella en piensos [Δ log = logmuestra - logcontrol]

Ácido

g/l vol. (µl) pH final log ufc/g Δ log

control

4,47 5,0 -

fórmico

2,5 10 4,28 4,3 0,7

5,0

20 4,18 3,6 1,4

7,5

30 4,1 1,0 4,0

10

40 4 1,0 4,0

butírico

10 40 4,31 4,3 0,7

30

120 4,17 1,0 4,0

50

200 4,04 1,0 4,0

láctico

10 40 4,2 4,1 0,9

30

120 3,92 1,0 4,0

50

200 3,68 1,0 4,0

control

4,44

25 [00125] Se observó bactericida completo a las dos mayores dosis probadas para los tres ácidos (7,5 y 10 g/l para ácido fórmico; 30 y 50 g/l para ácidos butírico y láctico).

EJEMPLO 10

30 [00126] Siguiendo el procedimiento expuesto en el Ejemplo 9 se estudió el efecto de mezclas de ácido fórmico, butírico y/o láctico, con y sin Alimet®, sobre los recuentos de Salmonella en pienso de iniciación basal para pollos de engorde basado en maíz-soja (descrito en la Tabla 9, anteriormente, piensos desmenuzados con 6% de MBM). Las mezclas estudiadas se describen en la Tabla 12 y los resultados obtenidos en el estudio in vitro se informan en las

35 Tablas 13-15.

Tabla 12 Formulaciones de mezclas de ácido (concentraciones informadas en g/l)

Mezcla

Ácido fórmico Ácido láctico Ácido butírico Alimet®

A1

5 - - -

A2

4 4 - -

A3

4 - 4 -

A4

3 - 8 -

A5

3 4 4 -

A6

3 8 - -

A7

2 - 12 -

A8

2 4 8 -

A9

2 8 4 -

Tabla 12 Formulaciones de mezclas de ácido (concentraciones informadas en g/l)

Mezcla

Ácido fórmico Ácido láctico Ácido butírico Alimet®

A10

2 12 - -

A11

1 - 16 -

A12

1 4 12 -

A13

1 8 8 -

A14

1 12 4 -

A15

1 16 - -

A16

- - 20 -

A17

- 4 16 -

A18

- 8 12 -

A19

- 12 8 -

A20

- 16 4 -

A21

- 20 - -

A22

5 - - 1

A23

4 4 - 1

A24

4 - 4 1

A25

3 - 8 1

A26

3 4 4 1

A27

3 8 - 1

A28

2 - 12 1

A29

2 4 8 1

A30

2 8 4 1

A31

2 12 - 1

A32

1 - 16 1

A33

1 4 12 1

A34

1 8 8 1

A35

1 12 4 1

A36

1 16 - 1

A37

- - 20 1

A38

- 4 16 1

A39

- 8 12 1

A40

- 12 8 1

A41

- 16 4 1

A42

- 20 - 1

A43

5 - - 2,27

A44

4 4 - 2,27

A45

4 - 4 2,27

A46

3 - 8 2,27

A47

3 4 4 2,27

A48

3 8 - 2,27

A49

2 - 12 2,27

A50

2 4 8 2,27

A51

2 8 4 2,27

A52

2 12 - 2,27

A53

1 - 16 2,27

A54

1 4 12 2,27

A55

1 8 8 2,27

A56

1 12 4 2,27

A57

1 16 - 2,27

A58

- - 20 2,27

A59

- 4 16 2,27

A60

- 8 12 2,27

A61

- 12 8 2,27

A62

- 16 4 2,27

A63

- 20 - 2,27

Tabla 13 Efecto de mezclas de fórmico/butírico/láctico sin Alimet® sobre poblaciones de Salmonella en pienso

Mezcla

pH final log ufc/g Reducción de Δ log

A1

4,12 3,1 1,6

A2

4,13 2,9 1,8

A3

4,18 3,1 1,6

A4

4,18 3,0 1,7

A5

4,18 3,2 1,5

A6

4,15 2,6 2,1

A7

4,15 2,8 1,9

A8

4,18 2,8 1,9

A9

4,16 2,5 2,2

A10

4,12 1,8 2,9

A11

4,16 2,7 2,0

A12

4,17 2,7 2,0

A13

4,16 2,8 1,9

A14

4,14 2,9 1,8

A15

4,1 2,6 2,1

A16

4,16 2,7 2,0

A17

4,21 2,7 2,0

A18

4,18 2,5 2,2

A19

4,16 1,7 3,0

A20

4,13 2,7 2,0

A21

4,05 1,8 2,9

control

4,33 4,7 -

Tabla 14 Efecto de mezclas de fórmico/butírico/láctico con 1 g/l de Alimet® añadido sobre poblaciones de Salmonella en pienso

Mezcla

pH final log ufc/g Reducción de Δ log

A22

4,09 3,5 1,0

A23

4,09 2,1 2,4

A24

4,09 2,9 1,6

A25

4,12 2,2 2,3

A26

4,11 2,3 2,2

A27

4,1 1,9 2,6

A28

4,11 2,3 2,2

A29

4,14 2,3 2,2

A30

4,1 1,9 2,6

A31

4,06 1,6 2,9

A32

4,15 2,4 2,1

A33

4,15 2,3 2,2

A34

4,15 1,4 3,1

A35

4,11 1,7 2,8

A36

4,06 1,8 2,7

A37

4,13 2,0 2,5

A38

4,16 2,0 2,5

A39

4,13 1,8 2,7

A40

4,12 1,8 2,7

A41

4,08 1,7 2,8

A42

4,06 1,7 2,8

control

4,33 4,7 0,2

control

4,36 4,5 -

Tabla 15 Efecto de mezclas de fórmico/butírico/láctico con 2,27 g/l de Alimet® añadido sobre poblaciones de Salmonella en pienso

Mezcla

pH final log ufc/g Reducción de Δ log

A43

4,21 2,8 0,7

A44

4,17 2,8 0,7

A45

4,18 3,0 0,5

A46

4,18 2,8 0,7

A47

4,15 3,7 -0,2

A48

4,11 2,0 1,5

A49

4,19 2,7 0,8

A50

4,19 2,8 0,7

A51

4,16 2,8 0,7

A52

4,13 2,4 1,1

A53

4,2 2,8 0,7

A54

4,2 2,7 0,8

A55

4,14 2,3 1,2

A56

4,13 1,7 1,8

A57

4,08 1,0 2,5

A58

4,21 2,3 1,2

A59

4,23 2,7 0,8

A60

4,17 2,0 1,5

A61

4,14 2,0 1,5 5

A62

4,12 0,7 2,8

A63

4,07 0,7 2,8

control

4,37 3,5 0

control

4,45 3,5 -

[00127] La adición de 1 g/l de Alimet® a la mezcla dio resultados mejorados en dieciséis de las mezclas probadas. 5 [00128] Las formulaciones de las mezclas usadas en los Ejemplos 11-13 se exponen en la Tabla 16.

Tabla 16 Formulaciones de mezclas de ácido orgánico/Alimet®

Mezcla

Alimet® Fos.1 Butírico Fórmico Láctico Prop.2

A64

30 30 20 - 20 -

A65

30 - - 50 - 20

A66

20 20 12 30 18 -

A67

10 10 - 75 - 5

A68

30 35 15 - 20 -

A69

30 5 - 55 - 10

A70

20 20 12 - 18 30

A71

10 5 5 75 - 5

A72

- - - 50 - 50

A73

- - - 75 - 25

1 Ácido fosfórico 2 Ácido propiónico

EJEMPLO 11

10 [00129] Los efectos de mezclas de ácido orgánico sobre los recuentos de colonias de Salmonella en una dieta basada en maíz-soja expuesta en la Tabla 9, anteriormente, (DLM al 0,2%) se estudiaron siguiendo el procedimiento explicado resumidamente en el Ejemplo 9. Los resultados se informan en la Tabla 17.

Tabla 17 Efecto de mezclas de ácido sobre poblaciones de Salmonella en dieta basada en maíz-soja

Mezcla

g/kg después de 60 min

ufc/g1,2

log ufc/g Reducción de Δ log

control

40.000 4,6 -

A64

5 29.700 4,5 0,1

10

2.300 3,4 1,2

Tabla 17 Efecto de mezclas de ácido sobre poblaciones de Salmonella en dieta basada en maíz-soja

A65

5 3.100 3,5 1,1

10

40 1,6 3,0

A66

5 10.000 4,0 0,6

10

40 1,6 3,0

A67

5 3.000 3,5 1,1

10

40 1,6 3,0

control

13.900 4,1 -

Mezcla

g/kg después de 90 min pH final

ufc/g1,2

log ufc/g Reducción de Δ log

control

46.000 4,7 - 4,68

A64

5 19.300 4,3 0,4 4,45

10

2.400 3,4 1,3 4,32

A65

5 200 2,3 2,4 4,44

10

40 1,6 3,1 4,25

A66

5 13.500 4,1 0,6 4,37

10

40 1,6 3,1 4,22

A67

5 200 2,3 2,4 4,33

10

40 1,6 3,1 4,02

control

38.800 4,6 - 4,68

140 ufc/g (nivel de detección mínimo) informado cuando no se detectó Salmonella.

2 Única lectura para cada tratamiento.

[00130] Tres de las cuatro mezclas probadas mostraron bactericida completo a 10 g/kg (1%) de aplicación. Tanto las mezclas A65 como A67 mostraron bactericida significativo a la menor tasa de aplicación (0,5%)

5 EJEMPLO 12

[00131] Se estudió el efecto de las mezclas de ácido orgánico sobre los recuentos de Salmonella usando dietas modelo para aves de corral y cerdos. Las mezclas A70 y A71 se probaron usando la dieta basada en maíz-soja expuesta en la Tabla 9, anteriormente, con DLM añadida al 0,2%. La dieta modelo para aves de corral era una dieta

10 para ponedoras basada en maíz-soja, sin producto cárnico; los efectos de las mezclas A68 y A69 se probaron con esta dieta.

[00132] Las mezclas se añadieron a 1 g de muestra de pienso. Se añadió Salmonella (200 µl, 40.000 ufc) a cada muestra de pienso y se mezcló. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente, luego se diluyeron 1:10 con 15 agua y se sembraron en una placa BG. Los resultados se informan en la Tabla 18.

Tabla 18 Efecto de mezclas de ácido sobre poblaciones de Salmonella en dieta basada en maíz-soja

mezcla

g/kg pH final después de 1 h después de 24 h

ufc/g

log ufc/g ufc/g log ufc/g

control (Dieta nº 1)

5,83 12.400 4,1 10.133 4,0

A70

2 5,53 15.000 4,2 3.300 3,5

5

5,32 3.900 3,6 1.200 3,1

7,5

5,08 3.400 3,5 700 2,8

10

4,94 1.500 3,2 100 2,0

A71

2 5,42 9.600 4,0 2.300 3,4

5

5,16 1.300 3,1 100 2,0

7,5

4,84 200 2,3 100 2,0

10

4,66 100 2,0 100 2,0

control (Dieta nº 2)

5,92 15.300 4,2 6.300 3,8

A68

2 5,70 10.400 4,0 5.600 3,7

5

5,67 6.300 3,8 4.200 3,6

7,5

5,54 9.900 4,0 2.600 3,4

10

5,36 8.300 3,9 1.300 3,1

A69

2 5,53 7.800 3,9 3.300 3,5

5

5,29 3.600 3,6 1.200 3,1

7,5

5,22 1.200 3,1 300 2,5

10

5,08 1.000 3,0 100 2,0

EJEMPLO 13

[00133] El efecto antibacteriano de dos mezclas de ácido orgánico/Alimet® se comparó con mezclas que contenían ácidos fórmico y propiónico, y sin Alimet®, siguiendo el procedimiento expuesto en el Ejemplo 12. Los resultados 5 después de 90 minutos se informan en la Tabla 19.

Tabla 19

Mezcla

g/kg ufc/g log ufc/g pH final

control

29.400 4,5 4,54

A65

2 140 2,1 4,56

5

80 1,9 4,45

10

1 0 4,32

A67

2 900 3,0 4,57

5

1.100 3,0 4,49

10

1 0 4,25

A72

2 2.100 3,3 4,5

5

90 2 4,39

10

1 0 4,15

A73

2 2,700 3,4 4,51

5

600 2,8 4,4

10

1 0 4,1

control

30.650 4,5 4,68

EJEMPLO comparativo 14

10 [00134] Se comparó el efecto antibacteriano de dos lotes diferentes de Alimet® sobe una dieta de maíz-soja (véase la Tabla 9, anteriormente). El primer lote era de edad desconocida y el segundo lote se preparó recientemente (inferior a dos semanas). Se usó el protocolo expuesto en el Ejemplo 9 y los resultados se informan en la Tabla 20.

Tabla 20 Efecto de dos lotes diferentes de Alimet® sobre poblaciones de Salmonella en dieta basada en maíz-soja después de 90 min de incubación

Ácido

g/kg añadidos ufc/g log ufc/g pH

control

6.850 3,8 4,80

Lote de Alimet® 1

2,3 800 2,9 4,72

5,7

50 1,7 4,66

8,5

120 2,1 4,58

11,4

0 - 4,57

Lote de Alimet® 2

2,3 3.900 3,6 4,68

5,7

300 2,5 4,54

8,5

20 1,3 4,61

11,4

20 1,3 4,57

control

14.850 4,2 4,80

15 [00135] El primer lote de Alimet® mostró efectos bactericidas ligeramente mejorados a menores concentraciones. Ambos lotes fueron bactericidas a mayores dosis.

EJEMPLO comparativo 15

20 [00136] Se estudió el efecto antibacteriano de ácidos secos (fumárico, tartárico y sórbico) solos y en combinación con mezclas de Alimet® según el protocolo del Ejemplo 9. Las formulaciones de las mezclas estudiadas se informan en la Tabla 21. Los resultados después de 90 minutos se informan en la Tabla 22.

Tabla 21

Mezcla

Concentración de ácido (g/kg)

Alimet®

Fumárico Tartárico Sórbico

A74

10 0 0 0

A75

0 10 0 0

A76

0 0 10 0

A77

0 0 0 10

A78

5 5 0 0

A79

5 0 5 0

A80

5 0 0 5

Tabla 22

Mezcla

ufc/g log ufc/g Reducción de Δ log

control

27900 4,4

A74

40 1,6 2,8

A75

30 1,5 3,0

A76

14450 4,2 0,3

A77

1150 3,1 1,4

A78

0 - 4,4

A79

4600 3,7 0,8

A80

170 2,2 2,2

control

13900 4,1

EJEMPLO comparativo 16

5 [00137] Se estudió el efecto de ácido fórmico sobre Lactobacillus plantarum. Como se demuestra en el Ejemplo 1, la adición de Alimet® a pH 3,5 a un caldo que contenía bacterias mostró un claro efecto letal sobre L. plantarum a dosis de 3 y 5 g/l. También se estudiaron concentraciones comparables de ácido fórmico (calidad técnica del 85%, antiguamente Franklin Products) y se compararon con Alimet®.

10 [00138] Se usa cultivo fresco durante la noche de L. plantarum en caldo de infusión de cerebro-corazón para inocular medio 5 a un log 4,1 ufc/ml a pH 3,5. Los tubos se incuban bajo atmósfera reducida en oxígeno durante 6 horas a 37ºC. Los recuentos de colonias se realizan según procedimientos convencionales. Todos los análisis se realizaron por duplicado y los resultados se informan en la Tabla 23.

Tabla 23 Efecto de Alimet® y ácido fórmico sobre recuentos de colonias de L. plantarum en caldo (después de 6 horas) log ufc/ml inicial = 5,61 Δ log = log6 horas - loginicial

Ácido

g/kg log ufc/ml Δ log

control

5,67 0,06

Alimet®

3 3,02 -2,59

5

0,83 -4,78

ácido fórmico

3 3,19 -2,42

5

-0,30 -5,91

15 EJEMPLO comparativo 17

[00139] Se estudiaron mezclas de diversos ácidos con Alimet® a pH 4,5. Se estudió el efecto de estas mezclas sobre recuentos de colonias de S. enteritidis en caldo usando el protocolo explicado en el Ejemplo 1. Los resultados 20 se informan en las Tablas 24-26.

Tabla 24 Efectos de mezclas de ácido y Alimet® sobre recuentos de colonias de S. enteritidis en caldo

Mezcla

Ácido Ácido g/l Alimet® g/l log ufc/ml

Control

5,04

Control (Alimet®)

-0,30

A81

fórmico 5 0 3,93

A82

4,5 0,5 0,74

A83

4 1 0,24

A84

3,75 1,25 0,15

A85

3,5 1,5 -0,15

A86

2,5 2,5 -0,30

A87

butírico 5 0 4,44

A88

4,5 0,5 3,56

A89

4 1 1,70

A90

3,75 1,25 1,44

A91

3,5 1,5 -0,15

A92

2,5 2,5 -0,30

A93

cítrico 5 0 4,74

A94

4,5 0,5 4,40

A95

4 1 4,34

A96

3,75 1,25 1,59

A97

3,5 1,5 1,19

A98

2,5

2,5 0,24

Tabla 25

Efectos de mezclas de ácido o formaldehído y Alimet® sobre recuentos de colonias de S. enteritidis en caldo

Mezcla Ácido

Ácido g/l

Alimet® g/l log ufc/ml

Control

5,02 Control (Alimet®)

0,00 A99

5

0

4,68 A100

4,5

0,5

4,65 A101

4

1 4,43fumáricoA102

3,75

1,25

4,38 A103

3,5

1,5

4,36 A104

2,5

2,5

2,32 A105

5

0

4,44 A106

4,5

0,5

4,48 A107

4

1 4,43lácticoA108

3,75

1,25

4,51 A109

3,5

1,5

4,75 A110

2,5

2,5

4,55 A111

5

0

5,01 A112

4,5

0,5

4,71 A113

4

1 4,77málicoA114

3,75

1,25

4,91 A115

3,5

1,5

4,96 A116

2,5

2,5 4,89

Tabla 26

Efectos de mezclas de ácido o formaldehído y Alimet® sobre recuentos de colonias de S. enteritidis en caldo

Mezcla Ácido

Ácido g/l

Alimet® g/l log ufc/ml

Control

4,95 Control (Alimet®)

0,63 A117

5

0

4,34 A118

4,5

0,5

4,34 A119

4

1 4,10propiónico A120

3,75

1,25

3,76 A121

3,5

1,5

3,30 A122

2,5

2,5

0,87 A123

5

0

4,68 A124

4,5

0,5

4,67 A125

4

1 4,56fosfóricoA126

3,75

1,25

4,62 A127

3,5

1,5

4,48 A128

2,5

2,5

3,30 A129

5

0

-0,30 A130

4,5

0,5

-0,30 A131

4

1 -0,30formaldehídoA132

3,75

1,25

-0,30 A133

3,5

1,5

-0,30 A134

2,5

2,5 -0,30

[00140] Los ácidos fosfórico, fumárico, láctico, málico y propiónico no muestran un efecto inhibidor significativo a 5

5 g/l. Las mezclas de estos ácidos con Alimet® dieron resultados similares, excepto la mezcla 50:50 de fumárico y Alimet®, que dio una reducción logarítmica superior a 2 en recuentos de colonias en comparación con 5 g/l de fumárico solo y la mezcla 50:50 de fosfórico y Alimet® que dio una reducción logarítmica de aproximadamente 1,3 en comparación con 5 g/l de fosfórico solo.

10 [00141] Las mezclas de ácido fórmico y Alimet® rindieron más favorablemente que el ácido fórmico solo para todas las mezclas estudiadas. Similarmente, las mezclas de ácido butírico y Alimet®, y ácido cítrico con Alimet®, dieron efectos bactericidas mejorados al aumentar la proporción de Alimet® añadida.

EJEMPLO 18

[00142] Se estudió el efecto antibacteriano de mezclas de ácido según el protocolo del Ejemplo 9. El ácido fosfórico (75%) se obtuvo de Astaris (St. Louis, MO), lote nº TK60. El ácido L-láctico (80%) se obtuvo de Purac America

5 (Lincolnshire, IL), lote nº 015703-A. El ácido butírico (99+%) se obtuvo de Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), lote nº 0.5110A. Las formulaciones de las mezclas estudiadas se informan en la Tabla 27. Los resultados se informan en la Tabla 28.

Tabla 27

Mezcla

Formulaciones de ácido (% del total)

Alimet®

Láctico Fosfórico Butírico

A135

0,33 0,67 - -

A136

0,317 0,633 0,05 -

A137

0,267 0,533 0,20 -

A138

0,25 0,50 0,25 -

A139

0,33 0,33 - 0,33

A140

0,317 0,317 0,05 0,317

A141

0,267 0,267 0,20 0,267

A142

0,25 0,25 0,25 0,25

A143

0,33 - - 0,67

A144

0,317 - 0,05 0,633

A145

0,267 - 0,20 0,533

A146

0,25 - 0,25 0,50

Tabla 28

Mezcla

ufc/g log ufc/g pH final

control

7.900 3,9 4,86

A135

20 1,3 4,49

A136

20 1,3 4,39

A137

340 2,5 4,52

A138

160 2,2 4,44

A139

80 1,9 4,50

A140

20 1,3 4,49

A141

160 2,2 4,42

A142

160 2,2 4,43

A143

160 2,2 4,48

A144

40 1,6 4,48

A145

240 2,4 4,53

A146

20 1,3 4,42

control

22.100 4,3 4,73

10 EJEMPLO 19

[00143] Se probaron los efectos de la mezcla A71 a pH neutro. La mezcla se añadió a 1 g de muestra de pienso. Se añadió Salmonella (40.000 ufc (65 ul)) a cada muestra de 1 g, se mezcló y se incubó a temperatura ambiente. Tras 15 la incubación, las muestras se diluyeron 1:10 con agua y se sembraron en una placa BG.

[00144] Se estudiaron dos dietas como se muestra en la Tabla 29. Los resultados se informan en la Tabla 30.

Tabla 29

Dieta 1 (dieta para cerdos)

ingredientes

% del total

Maíz

51,60

SBM, 48

30

Dairylac 80

8,50

Harina de pescado Menhaden (Select)

3,98

Grasa blanca de elección

3,00

Fosfato de dicalcio

1,24

Caliza

0,34

Lisina

0,26

DL-Metionina

0,13

Treonina

0,16

Tabla 29

Vitaminas, TM, sal y Mecadox

0,93

Almidón de maíz

hasta 100

Dieta 2 (dieta para pollos de engorde)

ingredientes

% de total

Maíz

60,551

SBM

32,254

Grasa, animal

3,665

Fosfato de dicalcio

1,861

Caliza

0,811

Premezcla de vitaminas/minerales

0,350

Sal

0,340

L-lisina HCl 78%

0,097

Treonina

0,051

Satoquin-mix6

0,019

Sulfato de cobre

0,003

DL-metionina

0,2

Tabla 30 Mezcla probada: A71

g/kg

1 hora 24 horas 48 horas pH final

ufc/g

log ufc/g log ufc/g log

Dieta 1

control

27.700 4,4 6.432 3,8 2.530 3,4 5,83

2

4.320 3,6 80 1,9 40 1,6 5,52

5

3.840 3,6 40 1,6 0 - 5,21

7,5

3.080 3,5 80 1,9 0 - 5,01

10

1.560 3,2 0 - 0 - 4,87

Dieta 2

control

25.000 4,4 6.160 3,8 2.570 3,4 6,06

2

8.080 3,9 40 1,6 40 1,6 5,67

5

7.000 3,8 40 1,6 40 1,6 5,31

7,5

4.400 3,6 40 1,6 0 - 5,1

10

900 3,0 0 - 0 - 4,82

EJEMPLO 20

5 [00145] Siguiendo el protocolo del Ejemplo 19 se probaron los efectos de la mezcla A69 a pH neutro. Se obtuvo ácido fórmico (85%) de BASF Corporation (Mt. Olive, NJ), producto nº 019723, lote nº 87656216KO. Se estudiaron dos dietas como se muestra en la Tabla 31. Los resultados se informan en la Tabla 32.

Tabla 31

Dieta 3

ingredientes

% del total

harina de soja

33,40

maíz

32,85

trigo duro rojo

20,00

harina orgánica de guisantes

5,00

grasa, animal

4,80

fosfato de dicalcio

1,81

caliza

0,98

sal

0,43

premezcla de vitaminas/minerales

0,35

treonina

0,10

Avizyme1502

0,10

Santoquin-mix6

0,02

Coban 60

0,05

sulfato de cobre

0,00

Dieta 4

ingredientes

% del total

maíz

60,50

harina de soja

28,46

caliza

7,76

fosfato de dicalcio

1,63

grasa animal

1,00

premezcla de vitaminas/minerales

0,35

sal

0,26

Santoquin-mix6

0,02

sulfato de cobre

0,00

Cl de colina al 60%

0,00

Tabla 32 mezcla probada: A69

g/kg

1 hora 24 horas 48 horas pH final

ufc/g

log ufc/g log ufc/g log

Dieta 3

control

68.000 4,8 2.470 3,4 880 2,9 6,05

2

5.600 3,7 120 2,1 40 1,6 5,67

5

8.900 3,9 40 1,6 40 1,6 5,46

7,5

4.600 3,7 40 1,6 80 1,9 5,28

10

10.600 4,0 40 1,6 0 - 5,13

Dieta 4

control

68.000 4,8 2.630 3,4 1.380 3,1 5,99

2

8.600 3,9 0 - 0 - 5,8

5

900 3,0 40 1,6 0 - 5,55

7,5

2.600 3,4 200 2,3 0 - 5,37

10

2.700 3,4 0 - 40 1,6 5,12

EJEMPLO 21

5 [00146] Siguiendo el protocolo del Ejemplo 9 se estudiaron los efectos de mezclas de Alimet®, ácido láctico, ácido fórmico y/o ácido butírico. Las formulaciones de mezclas se exponen en la Tabla 33. Se realizaron hasta cinco repeticiones, y los resultados se informan en las Tablas 34 y 35.

Tabla 33 formulaciones de ácido (g/kg)

Mezcla

A1 L2 F3 B4 Mezcla A1 L2 F3 B4

A147

0 0 0 10 A162 0 0 6,7 3,3

A148

2 0 0 8 A163 2 0 5,3 2,67

A149

7,5 0 0 2,5 A164 7,5 0 1,67 0,8

A150

3,3 0 0 6,7 A165 0 10 0 0

A151

2 2,67 0 5,33 A166 2 8 0 0

A152

7,5 0,8 0 1,67 A167 7,5 2,5 0 0

A153

0 0 3,3 6,7 A168 0 6,7 3,3 0

A154

2 0 2,67 5,3 A169 2 5,3 2,67 0

A155

7,5 0 0,8 1,67 A170 7,5 1,67 0,8 0

A156

0 6,7 0 3,3 A171 0 3,3 6,7 0

A157

2 5,3 0 2,67 A172 2 2,67 5,3 0

A158

7,5 1,67 0 0,8 A173 7,5 0,8 1,67 0

A159

0 3,3 3,3 3,3 A174 0 0 10 0

A160

2 2,67 2,67 2,67 A175 2 0 8 0

A161

7,5 0,8 0,8 0,8 A176 7,5 0 2,5 0

1 Alimet® 2 Ácido láctico 3 Ácido fórmico 4 Ácido butírico

Tabla 34

Ensayo:

Promedio 1 2 3 4

Mezcla

ufc/g log Δ log ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g

control

49.200 4,7 - 58.200 43.400 46.000 N/A

A147

18.800 4,3 0,4 22.200 15.400 N/A N/A

A148

15.700 4,2 0,5 19.800 11.600 N/A N/A

A149

70 1,8 2,8 80 200 0 0

A150

12.300 4,1 0,6 1.200 23.400 N/A N/A

A151

6.000 3,8 0,9 8.200 3.800 N/A N/A

A152

60 1,8 2,9 40 40 120 40

A153

1.600 3,2 1,5 3.200 0 N/A N/A

A154

20 1,3 3,4 40 40 0 0

A155

10 1,0 3,7 40 0 0 0

A156

11.300 4,1 0,6 6.000 16.600 N/A N/A

A157

2.900 3,5 1,2 1.000 4.800 N/A N/A

A158

400 2,6 2,1 800 0 N/A N/A

A159

0 - 4,7 0 0 0 0

A160

0 - 4,7 0 0 0 0

A161

20 1,3 3,4 40 40 0 0

control

63.133 4,8 - 56.800 64.000 68.600 N/A

N/A = repetición no realizada

Tabla 35

Ensayo:

Promedio 1 2 3 4

Mezcla

ufc/g log Δ log ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g

control

25.666 4,4 - 23.200 25.800 28.000 N/A

A162

0 - 4,4 0 0 0 0

A163

0 - 4,4 0 0 0 0

A164

0 - 4,4 0 0 0 0

A165

5.100 3,7 0,7 4.000 6.200 N/A N/A

A166

150 2,2 2,2 120 120 120 240

A167

30 1,5 2,9 40 80 0 0

A168

0 - 4,4 0 0 0 0

A169

0 - 4,4 0 0 0 0

A170

0 - 4,4 0 0 0 0

A171

0 - 4,4 0 0 0 0

A172

0 - 4,4 0 0 0 0

A173

0 - 4,4 0 0 0 0

A174

0 - 4,4 0 0 0 0

A175

0 - 4,4 0 0 0 0

A176

0 - 4,4 0 0 0 0

control

20000 4,3 - 20200 19800 N/A N/A

N/A = repetición no realizada

EJEMPLO 22

5 [00147] Siguiendo el protocolo del Ejemplo 9 se estudiaron los efectos de mezclas de Alimet®, ácido láctico, ácido propiónico (99%, obtenido de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, lote P-1386) y/o ácido butírico. Las formulaciones de mezclas se exponen en la Tabla 36. Se realizaron hasta cinco repeticiones y los resultados se informan en las Tablas 37 y 38.

10

Tabla 36 formulaciones de ácido (g/kg)

Mezcla

A1 L2 P3 B4 Mezcla A1 L2 P3 B4

A177

0 0 0 10 A193 2 0 5,3 2,67

A178

2 0 0 8 A194 7,5 0 1,67 0,8

A179

7,5 0 0 2,5 A195 0 10 0 0

A180

0 3,3 0 6,7 A196 2 8 0 0

A181

2 2,67 0 5,3 A197 7,5 2,5 0 0

A182

7,5 0,8 0 1,67 A198 0 6,7 3,3 0

A183

0 0 3,3 6,7 A199 2 5,3 2,67 0

A184

2 0 2,67 5,3 A200 7,5 1,67 0,8 0

A185

7,5 0 0,8 1,67 A201 0 3,3 6,7 0

A186

0 6,7 0 3,3 A202 2 2,67 5,3 0

A187

2 5,3 0 2,67 A203 7,5 0,8 1,67 0

A188

7,5 1,67 0 0,8 A204 0 0 10 0

A189

0 3,3 3,3 3,3 A205 2 0 8 0

A190

2 2,67 2,67 2,67 A206 7,5 0 2,5 0

A191

7,5 0,8 0,8 0,8 A207 10 0 0 0

A192

0 0 6,7 3,3

1 Alimet®

2 Ácido láctico

3 Ácido propiónico 4 Ácido butírico

Tabla 37

Ensayo:

Promedio 1 2 3

Mezcla

ufc/g log Δ log ufc/g ufc/g ufc/g

control

20.067 4,3 17.200 18.800 24.200

A177

6.333 3,8 0,5 5.400 7.000 6.600

A178

500 2,7 1,6 400 600 N/A

A179

400 2,6 1,7 200 600 N/A

A180

1.400 3,1 1,2 1.400 1.400 N/A

A181

1.500 3,2 1,1 2.000 1.000 N/A

A182

100 2,0 2,3 200 0 N/A

A183

6.000 3,8 0,5 9.600 2.400 N/A

A184

6.900 3,8 0,5 8.800 5.000 N/A

A185

1.300 3,1 1,2 1.400 1.200 N/A

A186

4.100 3,6 0,7 5.400 2.800 N/A

A187

2.400 3,4 0,9 600 4.200 N/A

A188

400 2,6 1,7 200 600 N/A

A189

4.700 3,7 0,6 1.000 8.400 N/A

A190

7.300 3,9 0,4 7.800 6.800 N/A

A191

300 2,5 1,8 600 0 N/A

control

18.733 4,3 20.000 22.800 13400

N/A = repetición no realizada

Tabla 38

Ensayo:

Promedio 1 2 3 4

Mezcla

ufc/g log Δ log ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g

control

7.800 3,9 - 9.800 7.200 6.400 N/A

A192

6.100 3,8 0,4 6.600 5.600 N/A N/A

A193

2.600 3,4 0,8 2.200 3.000 N/A N/A

A194

25 1,4 2,8 50 50 0 0

A195

400 2,6 1,6 800 0 N/A N/A

A196

300 2,5 1,7 200 400 N/A N/A

A197

0 - 4,2 0 0 0 0

A198

2.400 3,4 0,8 1.000 3.800 N/A N/A

A199

600 2,8 1,4 0 1.200 N/A N/A

A200

0 - 4,2 0 0 0 0

A201

3.800 3,6 0,6 3.200 4.400 N/A N/A

A202

900 3,0 1,2 1.000 800 N/A N/A

A203

0 - 4,2 0 0 0 0

Tabla 38

Ensayo:

Promedio 1 2 3 4

Mezcla

ufc/g log Δ log ufc/g ufc/g ufc/g ufc/g

A204

3.500 3,5 0,6 5.400 1.600 N/A N/A

A205

100 2,0 2,2 200 0 N/A N/A

A206

0 - 4,2 0 0 0 0

A207

0 - 4,2 0 0 0 0

control

30.600 4,5 - 41.600 19.400 30.800 N/A

N/A = repetición no realizada

EJEMPLO comparativo 23

[00148] Se estudió la capacidad de Alimet® y DLM para funcionar como palatantes para alimento para perros y

5 gatos. Alimet® y DLM se añadieron a alimento para perros y gatos de tipo premium en la mezcladora para probar la aceptación del alimento en comparación con alimento que carece de cualquier suplemento. El alimento usado comprendía proteína de buena calidad y tenía alto contenido de CP y grasa. También se añadió un palatante premium al alimento. Alimet® o DLM se añadió a la mezcladora antes de la extrusión. La formulación de la dieta felina se describe en la Tabla 39 y de la dieta canina en la Tabla 40. Los niveles de suplementación con

10 Alimet®/DLM y las relaciones de ingesta se describen en la Tabla 41. La relación de ingesta describe la incidencia relativa de seleccionar un alimento con respecto a otro.

[00149] Para el estudio canino se usaron veintiún perros (siete perros pequeños, siete medianos y siete grandes). Para el estudio felino se usaron veinte gatos adultos. A los animales se les dieron dos elecciones de alimentos,

15 colocadas en recipientes separados. Durante un periodo de dos días los perros tuvieron acceso a los alimentos durante 30 minutos; los gatos tuvieron acceso durante 22 horas. Se observó el alimento elegido y consumido primero.

Tabla 39 Dieta felina

Ingrediente

% de la dieta total

Maíz

14,7

Subproducto de aves de corral (bajo contenido de cenizas)

20

Harina de soja

12,5

Harina de gluten de maíz

12,2

Harina de carne y hueso

4

Grasa animal

11,4

Arroz para cerveza

19,4

Aroma

2

Harina de pescado

2

Huevos secos

0,5

Sal

0,5

KCl

0,5

Vitaminas

0,2

Colina

0,1

Taorina

0,1

Tocoferol

0,05

Minerales traza

0,05

Tabla 40 Dieta canina

Ingrediente

% de la dieta total

Maíz

33,0

Cebada

15,0

Subproducto de aves de corral (bajo contenido de cenizas)

13,0

Subproducto de aves de corral

12,0

Harina de soja

9,0

Grasa animal

8,0

Arroz para cerveza

5,0

Aroma

2,0

Huevos secos

1,0

Sal

0,5

Caliza

0,36

Vitaminas

0,2

Colina

0,1

Tocoferol

0,05

Minerales traza

0,05

Tabla 41

Alimentos comparados

Relación de ingesta

Canino

0,05% de Alimet frente al control

2,07:1

0,10% de Alimet frente al control

5,58:1

0,15% de Alimet frente al control

5,13:1

0,10% de DLM frente al control

5,32:1

0,15% de DLM frente al control

4,95:1

0,10% de Alimet frente a 0,05% de Alimet

2,54:1

0,15% de Alimet frente a 0,05% de Alimet

1,99:1

0,15% de Alimet frente a 0,10% de Alimet

2,54:1

0,15% de DLM frente a 0,10% de DLM

1,57:1

0,10% de DLM frente a 0,10% de Alimet

1,05:1

0,15% de DLM frente a 0,15% de Alimet

2,5:1

Felino

0,20% de Alimet® frente al control

1,67:1

0,25% de Alimet® frente al control

1,91:1

0,30% de Alimet® frente al control

1,85:1

0,25% de DLM frente al control

1,87:1

0,30% de DLM frente al control

1,63:1

0,25% de Alimet® frente a 0,20% de Alimet®

1,30:1

0,30% de Alimet® frente a 0,20% de Alimet®

1,26:1

0,30% de Alimet® frente a 0,25% de Alimet®

1,16:1

0,30% de DLM frente a 0,25% de DLM

1,04:1

0,25% de DLM frente a 0,25% de Alimet®

1,24:1

0,30% de DLM frente a 0,30% de Alimet®

1,47:1

EJEMPLO comparativo 24

5 [00150] Se estudió la aceptación de alimentos que contienen Alimet® o DLM para evaluar el consumo alimenticio bajo condiciones de no elección. El alimento se ofreció a los animales (18 perros: 6 pequeños, 6 medianos, 6 grandes; 15 gatos) durante una semana. También se monitorizó el pH de la orina de seis de los gatos.

[00151] Se usaron las dietas descritas en las Tablas 39 y 40 anteriores. Las dietas se complementaron con Alimet®

10 o DLM (0,1% para el estudio canino, 0,25% para el estudio felino). Se llevaron a cabo pruebas adicionales del pH de la orina con 0,3% de Alimet®.

[00152] Los resultados de los experimentos del pH de la orina se facilitan en las Tablas 42 y 43. Los resultados de la prueba de aceptación se facilitan en la Tabla 44.

15

Tabla 42

Nº de cat.

pH de la orina

Control

Alimet al 0,25% DL Met al 0,25%

452

6,35 6,45 6,39

453

6,44 6,2 6,38

457

6,29 6,56 6,39

460

6,25 6,03 6,36

465

6,22 6 6,1

475

6,56 6,44 6,36

Tabla 43

Nº de cat.

pH de la orina

Control

Alimet® al 0,3%

450

6,20 6,03

453

6,44 6,10

465

6,04 5,53

468

6,40 5,73

469

6,68 6,31

Tabla 44

Nivel de complementación

Gramos totales consumidos

control

alimento complementado

Canino

Alimet®

0,05% 5.046 10.420

0,1%

2.101 11.714

0,15%

2.419 12.978

DLM

0,1% 2.114 11.244

0,15%

2.734 13.542

Felino

Alimet®

0,2% 1.111 1.853

0,25%

955 1.827

0,3%

1.003 1.858

DLM

0,25% 985 1.842

0,3%

1.078 1.754

[00153] En vista de lo anterior se apreciará que los diversos objetos de la invención se logran y se obtienen otros 5 resultados ventajosos.

[00154] Como podrían hacerse diversos cambios en las raciones de pienso anteriores y los procedimientos sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en la descripción anterior y mostrada en el dibujo adjunto deba interpretarse como ilustrativa y no en un sentido limitante.

10 [00155] Cuando se introducen elementos de la presente invención o la(s) realización (realizaciones) preferida(s) de la misma, los artículos “un,” “una,” “el”, “la” y “dicho(a)” pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Los términos “que comprende”, “que incluye” y “que tiene” pretenden ser inclusivos y significan que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos enumerados.

15 [00156] A menos que se defina de otro modo, las cantidades expresadas como porcentajes son en porcentaje en peso.

20

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

imagen1

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición antimicrobiana que comprende ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico o una sal del mismo y otros dos ácidos orgánicos seleccionados entre ácido butírico, ácido láctico, ácido fórmico y ácido propiónico

2. 2.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además un acidulante seleccionado del grupo que consiste en ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fosforoso, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico y ácido nítrico.

3. 3.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende además al menos un ácido orgánico adicional seleccionado del grupo que consiste en ácido acético, ácido benzoico, ácido málico, ácido tartárico, ácido mandélico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido sórbico, ácido bórico, ácido succínico, ácido adípico, ácido glicólico y ácido glutárico.

4. 4.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico, ácido butírico y ácido láctico.

5. 5.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico, ácido butírico, ácido fórmico y ácido láctico.

6. 6.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico, ácido fosfórico, ácido butírico, ácido láctico y ácido propiónico.

7. 7.

   Una composición antimicrobiana de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende ácido 2-hidroxi-4(metiltio)butanoico; ácido fosfórico, ácido butírico, ácido fórmico y ácido propiónico.

8. 8.

   Un procedimiento para preparar una composición antibacteriana de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende mezclar ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico con otros dos ácidos orgánicos seleccionados entre ácido butírico, ácido láctico, ácido fórmico y ácido propiónico.

9. 9.

   Uso de una composición antibacteriana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para inhibir o eliminar Salmonella en alimentos.

10. 10.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 9 en el que el alimento se selecciona del grupo que consiste en alimento para seres humanos, alimento para ganado, alimento para mascotas o alimento para acuicultura.

11. 11.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en el que la composición antimicrobiana se mezcla con el alimento a medida que se formula.

12. 12.

    Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el que el alimento se le proporciona a un animal seleccionado del grupo que consiste en vacas lecheras, vacas lecheras lactantes, terneros lecheros, ganado vacuno, ovejas, cabras, peces, crustáceos, caballos, pollos, pavos, perros y gatos.

13. 13.

    Uso de acuerdo con la reivindicación 12 en el que el alimento se le proporciona a una animal rumiante.