ES2366306T3 - Antígeno p30 modificado por ingeniería genética, cóctel de antígenos mejorado y usos de los mismos. - Google Patents
Antígeno p30 modificado por ingeniería genética, cóctel de antígenos mejorado y usos de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
Description
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un antígeno P30 modificado por ingeniería genética, así como a una combinación
o mezcla de antígenos que pueden usarse en la detección de anticuerpos IgM y/o IgG contra Toxoplasma gondii. Además, la presente invención también se refiere a métodos de uso de este antígeno P30 modificado por ingeniería genética y de esta combinación de antígenos, a un método de producción de anticuerpos monoclonales generados contra este antígeno P30 modificado por ingeniería genética, así como a kits y vacunas que contienen el antígeno P30 modificado por ingeniería genética y antígenos presentes en la combinación.
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado que está clasificado entre los coccidios. Este parásito tiene un intervalo de hospedador relativamente amplio, infectando tanto a mamíferos como a aves. El organismo es ubicuo en la naturaleza y existe en tres formas: taquizoíto, quiste y ooquiste (Remington, J. S., McLeod, R., Desmonds, G., Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J. O. Klein, Eds.), págs. 140267, Saunders, Filadelfia (1995)). Los taquizoítos, que se encuentran durante la infección aguda, son la forma invasiva capaz de invadir todas las células de mamífero nucleadas. Después de la fase aguda de infección, se forman quistes tisulares denominados bradizoítos dentro de las células hospedadoras y persisten dentro del organismo hospedador durante toda la vida del hospedador. Los quistes son importantes en la transmisión de la infección, especialmente en seres humanos, ya que la ingestión de carne sin procesar o poco cocinada puede dar como resultado la ingestión de bradizoítos que pueden infectar al individuo dando como resultado una infección aguda. Los ooquistes representan una fase de reproducción sexual que se produce solamente en el revestimiento intestinal de la familia del gato, del que se excreta en las heces.
Una infección por T. gondii adquirida a través de carne contaminada o heces de gato en un adulto sano a menudo es asintomática. En mujeres gestantes y en pacientes inmunosuprimidos, el desenlace clínico puede ser muy grave. Una infección aguda con T. gondii adquirida durante la gestación, especialmente durante el primer trimestre, puede dar como resultado la transmisión intrauterina al feto no nato, dando como resultado complicaciones fetales y neonatales graves, incluyendo retraso mental y muerte fetal. El recrudecimiento de una infección por T. gondii previa
o una infección aguda en un individuo inmunosuprimido puede ser patógeno. La encefalitis toxoplásmica es una causa principal de morbilidad y mortalidad en pacientes con SIDA. La infección por toxoplasma también ha demostrado ser una causa significativa de coriorretinitis en niños y adultos.
El diagnóstico de la infección con T. gondii puede establecerse por aislamiento de T. gondii de sangre o fluidos corporales, demostración de la presencia del organismo en la placenta o los tejidos del feto, demostración de la presencia de antígeno por detección de secuencias de ácido nucleico específicas (por ejemplo, sondas de ADN), o detección de inmunoglobulinas específicas contra T. gondii sintetizadas por el hospedador en respuesta a la infección usando ensayos serológicos.
La detección de anticuerpos específicos contra T. gondii y la determinación del título de anticuerpos son herramientas importantes usadas en el diagnóstico de la toxoplasmosis. Los ensayos serológicos usados más ampliamente para el diagnóstico de la toxoplasmosis son el ensayo de colorante de Sabin-Feldman (Sabin, A. B. y Feldman, H. A. (1948) Science 108, 660-663), el ensayo de hemaglutinación indirecta (IHA) (Jacobs, L. y Lunde, M. (1957) J. Parasitol, 43, 308-314), el ensayo de IFA (Walton, B. C. et al. (1966) Am. J. Trop. Med. Hyg. 15, 149-152), el ensayo de aglutinación (Fondation Mérieux, Sérologie de l’Infection Toxoplasmique en Particulier a Son Début: Méthodes et Interpretation des Résultants, Lyon, pág. 182 (1975)) y el ELISA (Naot, Y. y Remington, J. S. (1980) J. Infect. Dis. 142, 757-766). El ensayo de ELISA es uno de los ensayos más sencillos de realizar y están disponibles en el mercado muchos ensayos serológicos automáticos para la detección de IgM e IgG específicas de Toxoplasma.
Los ensayos actuales para la detección de anticuerpos IgM e IgG en individuos infectados pueden variar ampliamente en su capacidad para detectar anticuerpos en suero. Por lo tanto, existe una variación interensayo significativa observada entre los kits disponibles en el mercado. Las diferencias observadas entre los diferentes kits comerciales están causadas principalmente por la preparación del antígeno usado para el ensayo serológico. La mayoría de los kits usan taquizoítos completos o sonicados cultivados en cultivo tisular o en ratones que contienen una alta proporción de material extraparasitario, por ejemplo, células de mamífero, componentes de cultivo tisular, etc. Debido a la ausencia de un antígeno purificado normalizado o método convencional para preparar el antígeno de taquizoíto, no es sorprendente que exista variabilidad interensayo, dando como resultado que diferentes ensayos tengan diferentes características de rendimiento en términos de sensibilidad y especificidad del ensayo.
Dadas las limitaciones de los ensayos serológicos que emplean el antígeno de taquizoíto, como se ha descrito anteriormente, así como los problemas persistentes respecto a la determinación del inicio de la infección, los antígenos recombinantes purificados obtenidos por biología molecular son una alternativa atractiva en el sentido de que pueden purificarse y normalizarse. En la bibliografía, se han clonado y expresado varios genes de Toxo en un hospedador adecuado para producir antígenos Toxo recombinantes inmunorreactivos. Por ejemplo, se han descrito los antígenos Toxo P22 (SAG2), P24 (GRA1), P25, P28 (GRA2), P29 (GRA7), P30 (SAG1), P35, P41 (GRA4), P54 (ROP2), P66 (ROP1) y Toxo P68 (Prince et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol 43, 97-106; Cesbron-Delauw et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 7537-7541; Johnson et al. (1991) Gene 99, 127-132; Prince et al. (1989) Mol. Biochem. Parasitol. 34, 3-13; Bonhomme et al. (1998) J. Histochem. Cytochem. 46, 1411-1421; Burg et al. (1988) J. Immunol. 141, 3584-3591; Knapp et al. (1989) EPA 431541A2; Mevelec et al. (1992) Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-238; Saavedra et al. (1991) J. Immunol. 147, 1975-1982); EPA 751 147).
Es plausible que ningún antígeno Toxo individual pueda sustituir al taquizoíto en un inmunoensayo de exploración inicial para la detección de inmunoglobulinas específicas contra Toxo. Esto puede deberse a varias razones. En primer lugar, los anticuerpos producidos durante la infección varían con la fase de infección, es decir, los anticuerpos producidos por un individuo infectado varían con el tiempo, reaccionando con diferentes epítopos. En segundo lugar, los epítopos presentes en un antígeno recombinante pueden ser diferentes o menos reactivos que el antígeno nativo preparado a partir del taquizoíto, dependiendo del hospedador usado para la expresión y del esquema de purificación empleado. En tercer lugar, pueden ser necesarios antígenos recombinantes diferentes para detectar las diferentes clases de inmunoglobulinas producidas en respuesta a una infección, por ejemplo, IgM, IgG, IgA e IgE.
Para superar las limitaciones del antígeno de taquizoíto en los términos de la especificidad y sensibilidad del ensayo, se realizó una búsqueda para antígenos Toxo que pudieran usarse en combinación para configurar nuevos ensayos para la detección de inmunoglobulinas específicas de Toxo. Maine et al. (en la Patente de Estados Unidos Nº
6.329.157 B1) desvelan cócteles de antígenos Toxo recombinantes para la detección de IgG e IgM específicas de Toxo. Se determinó que los cócteles de antígenos Toxo mencionados anteriormente podían mejorarse y potenciarse por expresión de Toxo P30 en E. coli como una proteína soluble con modificaciones por ingeniería genética. Este antígeno P30 modificado por ingeniería genética y el cóctel de antígenos mejorado se describirán en más detalle a continuación.
La presente invención incluye un antígeno P30 de Toxoplasma gondii modificado por ingeniería genética, así como una composición que comprende tanto antígeno P30 modificado por ingeniería genética como antígeno P35 de Toxoplasma gondii. Este antígeno modificado por ingeniería genética y esta composición pueden usarse como reactivo de diagnóstico, y el antígeno modificado por ingeniería genética y los antígenos dentro de esta composición pueden producirse de forma recombinante o de forma sintética.
En particular, la presente invención incluye una secuencia de nucleótidos aislada que comprende, o es complementaria a, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.
Además, la presente invención incluye un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
La presente invención también incluye una composición que comprende un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62. Esta composición puede usarse como reactivo de diagnóstico, y el polipéptido de la composición puede producirse por medios recombinantes o sintéticos.
Además, la presente invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62;
y b) detectar la presencia de complejos de polipéptido/anticuerpo IgM, en el que la presencia de los complejos indica la presencia de los anticuerpos IgM en la muestra de ensayo.
Además, la presente invención también incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM; b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que el conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar la presencia de anticuerpos IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por el compuesto generador de señal.
Además, la presente invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35; y b) detectar la presencia de complejos de antígeno/anticuerpo IgG, indicando la presencia de los complejos la presencia de dichos anticuerpos IgG en la muestra de ensayo.
La invención también incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgG; b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una a un anticuerpo unido, en el que el conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
Además, la presente invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgM durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM; b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, en el que el conjugado comprende un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar anticuerpos IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por el compuesto generador de señal.
Además, la presente invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgG con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgG durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG; b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una a un anticuerpo unido, en el que el conjugado comprende: 1) un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar anticuerpos IgG que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por cada uno de los compuestos generadores de señal.
La presente invención también incluye una vacuna que comprende: a) al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, y b) un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Además, la invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende una composición que comprende un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
Además, la presente invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende: una composición que comprende 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35; y un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
Además, la presente invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:
a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; y b) una composición que comprende un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
Además, la presente invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:
a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; y b) un conjugado que comprende: 1) una composición que comprende un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; unido a 2) un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
Además, la invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:
a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG; y b) una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35.
Otro kit de la presente invención incluye un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:
a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG;
b) un conjugado que comprende: 1) un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de
generar una señal detectable.
Además, la presente invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgM, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos anti-anticuerpo IgM; (b) añadir antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el antígeno se una al anticuerpo IgM unido, comprendiendo el antígeno un polipéptido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y (c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM/antígeno resultantes, comprendiendo el conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y (d) detectar los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de una señal generada por el compuesto generador de señal.
Además, la invención incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgG con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgG durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgG; (b) añadir antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el antígeno se una a un anticuerpo IgG unido, comprendiendo el antígeno una mezcla de 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35; (c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo el conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y (d) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de una señal generada por el compuesto generador de señal.
La presente invención también incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM e IgG con una composición que comprende 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM e IgG; (b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM y a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo IgM e IgG unido, en la que el conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por el compuesto generador de señal.
La invención también incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM e IgG con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgM y para los anticuerpos IgG durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de antianticuerpo/anticuerpo IgM y complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG; b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes y a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una a un anticuerpo unido, en el que el conjugado comprende una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de una señal generada por el compuesto generador de señal.
Además, la presente invención también incluye un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM e IgG con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgM y con un anti-anticuerpo específico para los anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/IgM y complejos de anti-anticuerpo/IgG; (b) añadir antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes y a los complejos de anti-anticuerpo/IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una a anticuerpo IgM e IgG unido, comprendiendo el antígeno una mezcla de: 1) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35; y (c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM/antígeno y a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo el conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y (d) detectar los anticuerpos IgG e IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de una señal generada por el compuesto generador de señal.
La presente invención también incluye un método de producción de anticuerpos monoclonales contra el polipéptido de la SEC ID Nº: 62, que comprende las etapas de:
a) inyectar a un mamífero no humano un polipéptido, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; b) fusionar esplenocitos del mamífero no humano con células de mieloma para generar hibridomas; y c) cultivar los hibridomas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que los hibridomas produzcan los anticuerpos monoclonales.
Además, la presente invención incluye el plásmido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61 (pMBP-c2X-ToxoP30MIX1).
En lo siguiente, las FIGURAS 1-30 y 32-36 no son realizaciones de la presente invención.
La FIGURA 1 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa). (El intervalo de aminoácidos entre paréntesis señalado aquí y a lo largo de toda la solicitud se refiere a la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, presente en el plásmido, proteína, etc.) que se ha obtenido del antígeno P30 nativo).
Las FIGURAS 2, 2A, 2B, 2C y 2D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 3] de los nucleótidos 1-7478 que codifican la secuencia de aminoácidos [SEC ID Nº: 4] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30(52-336aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa).
La FIGURA 3 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 5] de los nucleótidos 1-850 del gen de ToxoP30(52336aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 6] de la proteína gen de ToxoP30(52-336aa).
La FIGURA 4 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa).
Las FIGURAS 5, 5A, 5B, 5C y 5D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 7] de los nucleótidos 1-7553 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 8] de la proteína de fusión MBPToxoP30(52-336aa) de plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa).
La FIGURA 6 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa).
La FIGURA 7 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa).
Las FIGURAS 8, 8A, 8B, 8C y 8D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 10] de los nucleótidos 1-7442 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 11] de la proteína de fusión MBPToxoP30del1C(52-329aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa).
La FIGURA 9 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 12] de los nucleótidos 1-819 del gen de ToxoP30del1C(52-324) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 13] de la proteína ToxoP30del1C(52-324aa).
La FIGURA 10 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa).
Las FIGURAS 11, 11A, 11B, 11C y 11D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 15] de los nucleótidos 17403 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 16] de la proteína de fusión MBPToxoP30del2(52-311aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa).
La FIGURA 12 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 17] de los nucleótidos 1-780 del gen de ToxoP30del2(52-311aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 18] de la proteína ToxoP30del2(52-311aa).
La FIGURA 13 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa).
La FIGURA 14 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa).
Las FIGURAS 15, 15A, 15B, 15C y 15D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 20] de los nucleótidos 17370 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº. 21] de la proteína de fusión MBPToxoP30del3C(52-300aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa).
La FIGURA 16 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 22] de los nucleótidos 1-747 del ToxoP30del3(52300aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 23] de la proteína ToxoP30del3C(52-300aa).
La FIGURA 17 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa).
La FIGURA 18 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa).
Las FIGURAS 19, 19A, 19B, 19C y 19D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 25] de los nucleótidos 17352 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº. 26] de la proteína de fusión MBPToxoP30del4C(52-294aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa).
La FIGURA 20 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 27] de los nucleótidos 1-729 del gen de ToxoP30del4C(52-294aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 28] de la proteína ToxoP30del4C(52-294aa).
La FIGURA 21 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa).
Las FIGURAS 22, 22A, 22B, 22C y 22D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 30] de los nucleótidos 17259 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 31] de la proteína de fusión MBPToxoP30del4del8(83-294aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa).
La FIGURA 23 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 32] de los nucleótidos 1-636 del gen de ToxoP30del4del8(83-294aa) y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 33] de la proteína ToxoP30del4del8(83-294aa).
La FIGURA 24 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa).
Las FIGURAS 25, 25A, 25B, 25C y 25D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 35] de los nucleótidos 17322 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 36] de la proteína de fusión MBPToxoP30del10(52-284aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa).
La FIGURA 26 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 37] de los nucleótidos 1-699 del gen de ToxoP30del10(52-284aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 38] de la proteína ToxoP30del10(52-284aa).
La FIGURA 27 es un esquema de la construcción del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa).
Las FIGURAS 28, 28A, 28B, 28C y 28D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 40] de los nucleótidos 17112 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 41] de la proteína de fusión MBPToxoP30del11(52-214aa) del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa).
La FIGURA 29 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 42] de los nucleótidos 1-489 del gen de ToxoP30del11(52-214aa) y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 43] de la proteína ToxoP30del11(52-214aa).
La FIGURA 30 es un esquema de la construcción de los plásmidos pMBP-c2X-ToxoP30MIX1, pMBP-c2XToxoP30MIX3 y pMBP-c2X-ToxoP30MIX5.
Las FIGURAS 31, 31A, 31B, 31C y 31D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 61] de los nucleótidos 17370 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 62] de la proteína de fusión MBPToxoP30MIX1 del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1.
La FIGURA 32 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 63] de los nucleótidos 1-747 del gen de ToxoP30MIX1 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 64] de la proteína ToxoP30MIX1.
Las FIGURAS 33, 33A, 33B, 33C y 33D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 66] de los nucleótidos 17370 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 67] de la proteína de fusión MBPToxoP30MIX3 del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3.
La FIGURA 34 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 68] de los nucleótidos 1-747 del gen de ToxoP30MIX3 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 69] de la proteína ToxoP30MIX3.
Las FIGURAS 35, 35A, 35B, 35C y 35D representan la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 71] de los nucleótidos 17370 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 72] de la proteína de fusión MBPToxoP30MIX5 del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5.
La FIGURA 36 representa la secuencia de ADN [SEC ID Nº: 73] de los nucleótidos 1-747 del gen de ToxoP30MIX5 y la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente [SEC ID Nº: 74] de la proteína ToxoP30MIX5.
Las dificultades de ensayos conocidos para la detección de anticuerpos IgG e IgM contra T. gondii se han descrito en detalle anteriormente. Por lo tanto, existía la necesidad de descubrir inmunoensayos que pudieran detectar con precisión la presencia de dichos anticuerpos en suero o plasma positivo, eliminando de este modo el problema de ensayos falsos negativos o falsos positivos. La presente invención proporciona dichos inmunoensayos necesarios y, en particular, un antígeno y combinaciones de antígenos que detectan con precisión la presencia de anticuerpos IgG y/o IgM en sueros humanos.
En particular, la presente invención incluye una versión modificada por ingeniería genética del antígeno P30 denominada en la presente memoria “MBP-Toxo P30MIX1”, que contiene deleciones pequeñas y precisas en el extremo C-terminal que maximizan la inmunorreactividad a IgG e IgM anti-Toxo del antígeno P30 en un inmunoensayo, así como cinco restos de cisteína C-terminales cambiados a alanina.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica el antígeno MBP-ToxoP30MIX1 se muestra en la Figura 31 y está representada por la SEC ID Nº: 61. La secuencia de aminoácidos de este antígeno también se muestra en la Figura 31 y está representada por la SEC ID Nº: 62.
Debería señalarse que la presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que comprende, o es complementaria a, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.
Además, debería señalarse que la presente invención incluye una secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
Para los fines de la presente invención, la “complementariedad” se define como el grado de relación entre dos segmentos de ADN. Se determina por medición de la capacidad de la cadena con sentido de un segmento de ADN para hibridar con la cadena antisentido del otro segmento de ADN, en condiciones apropiadas, para formar una doble hélice. En la doble hélice, cuando aparece adenina en una cadena, aparece timina en la otra cadena. De forma similar, cuando se encuentra guanina en una cadena, se encuentra citosina en la otra. Cuando mayor sea la relación entre las secuencias de nucleótidos de dos segmentos de ADN, mayor será la capacidad para formar dúplex híbridos entre las cadenas de dos segmentos de ADN.
El término “identidad” se refiere a la relación de dos secuencias en base a nucleótido por nucleótido a lo largo de una ventana de comparación o segmento particular. Por lo tanto, la identidad se define como el grado de igualdad, correspondencia o equivalencia entre las mismas cadenas (con sentido o antisentido) de dos segmentos de ADN (o dos secuencias de aminoácidos). El “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de una región particular, determinando el número de posiciones en las que aparece la base o aminoácido idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de dichas posiciones por el número de total de posiciones en el segmento que se está comparando y multiplicando el resultado por 100. Pueden realizarse alineamientos de secuencia óptimos mediante el algoritmo de Smith y Waterman, Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), por el método de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988) y mediante programas informáticos que aplican los algoritmos pertinentes (por ejemplo, Clustal Macaw Pileup (http://cmgm.stanford.edu/biochem218/11Multiple.pdf; Higgins et al., CABIOS 5L151-153 (1989)), FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25: 3389-3402 (1997)), PILEUP (Genetics Computer Group, Madison, WI) o GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI). (Véase la Patente de Estados Unidos Nº: 5.912.120).
La “similitud” entre dos secuencias de aminoácidos se define como la presencia de una serie de restos aminoacídicos idénticos, así como conservados, en ambas secuencias. Cuanto mayor sea el grado de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, mayor será la correspondencia, igualdad o equivalente de las dos secuencias. (La “identidad” entre dos secuencias de aminoácidos se define como la presencia de una serie de restos aminoacídicos exactamente iguales o invariantes en ambas secuencias). Las definiciones de “complementariedad”, “identidad” y “similitud” son bien conocidas por los expertos en la materia.
El término “codificado por” ser refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia polipeptídica, en la que la secuencia polipeptídica, o una porción de la misma, contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 aminoácidos, más preferentemente al menos 8 aminoácidos, y aún más preferentemente al menos 15 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.
Una molécula de ácido nucleico es “hibridable” con otra molécula de ácido nucleico cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones de temperatura y fuerza iónica apropiadas (véase Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York)). Las condiciones de temperatura y fuera iónica determinan la “rigurosidad” de la hibridación. La “hibridación” requiere que dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias. Sin embargo, dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, pueden aparecer emparejamientos erróneos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación. Dichas variables son bien conocidas en la técnica. Más específicamente, cuando mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de la Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., anteriormente). Para la hibridación con ácido nucleicos más cortos, la posición de los emparejamientos erróneos se vuelve más importante, y la longitud de los oligonucleótidos determina su especificidad (véase Sambrook et al., anteriormente).
Como se usa en el presente documento, una “secuencia de ácido nucleico aislada” es un polímero de ARN o ADN que es mono-o bicatenario, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas.
Los nucleótidos (que habitualmente se encuentran en su forma 5’-monofosfato) se denominan por su designación de una sola letra de la forma siguiente: “A” para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), “C” para citidilato o desoxicitidilato, “G” para guanilato o desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A o G), “Y” para pirimidinas (C o T), “K” para G o T, “H” para A o C o T, “I” para inosina y “N” para cualquier nucleótido.
Las expresiones “fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente” y “fragmento o subfragmento funcionalmente equivalente” se usan indistintamente en la presente memoria. Estas expresiones se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en la que la capacidad para alterar la expresión génica o producir cierto fenotipo se conserva independientemente de que el fragmento o subfragmento codifique o no una enzima activa. Un fragmento o subfragmento que es funcionalmente equivalente a la secuencia polipeptídica original de la que procede se refiere a una secuencia que tiene las mismas propiedades (por ejemplo, unión, antigénicas, etc.) que el polipéptido original.
Los términos “homología”, “homólogo”, “sustancialmente similar” y “sustancialmente correspondiente” se usan indistintamente en la presente memoria. Se refieren a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, tales como deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante respecto al fragmento inicial no modificado.
El término “gen” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden “secuencias no codificantes 5’) y siguen (secuencias no codificantes 3’) a la secuencia codificante.
La expresión “gen nativo” se refiere a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. Por el contrario, la expresión “construcción quimérica” se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza. Por consiguiente, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que proceden de diferentes fuentes,
o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una forma diferente a la que se encuentra normalmente en la naturaleza. (El término “aislado” significa que la secuencia está retirada de su entorno natural).
La expresión “unido operativamente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante que es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras en una orientación con sentido o antisentido.
El término “expresión”, como se usa en la presente memoria, se refiere a la producción de un producto final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción del gen y la traducción del ARNm a una proteína precursora o madura. La “inhibición antisentido” se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana. La “cosupresión” se refiere a la producción de transcritos de ARN con sentido capaces de suprimir la expresión de genes endógenos o extraños idénticos o sustancialmente similares (Patente de Estados Unidos Nº 5.231.020).
Una proteína “madura” se refiere a un polipéptido procesado post-traduccionalmente; es decir, uno del que se han eliminado cualquier pre-o pro-péptido presente en el presente en el producto de traducción primario. La proteína “precursora” se refiere al producto primario de la traducción de ARNm, es decir, con pre-y pro-péptidos todavía presentes. Los pre-y pro-péptidos pueden ser, pero sin limitación, señales de localización intracelular.
Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante convencionales usadas en la presente memoria son bien conocidas en la técnica y se describen más completamente en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (en lo sucesivo “Sambrook”).
El término “recombinante” se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia de otro modo separados, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética.
La “PCR” o “Reacción en Cadena de la Polimerasa” es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos que consiste en una serie de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Típicamente, el ADN bicatenario se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios a los límites 3’ del segmento diana se hibridan a baja temperatura y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se denomina ciclo.
La reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”) es una técnica potente usada para amplificar el ADN millones de veces por replicación repetida de un molde en un corto periodo de tiempo. (Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273 (1986); Erlich et al., Solicitud de Patente Europea 50.424; Solicitud de Patente Europea 84.796; Solicitud de Patente Europea 258.017, Solicitud de Patente Europea 237.362; Mullis, Solicitud de Patente Europea 201.184, Mullis et al Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; Erlich, Patente de Estados Unidos Nº 4.582.788; y Saiki et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.683.194). El proceso utiliza conjuntos de oligonucleótidos específicos sintetizados in vitro para cebar la síntesis del ADN. El diseño de los cebadores depende de las secuencias de ADN que desea analizar. La técnica se lleva a cabo a través de muchos ciclos (habitualmente 20-50) de fusión del molde a alta temperatura; dejando que los cebadores hibriden con las secuencias complementarias dentro del molde y replicando después el molde con ADN polimerasa.
Como se ha señalado anteriormente, la presente invención también incluye una composición o mezcla que comprende los dos antígenos siguientes: P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35. Esta combinación o mezcla de antígenos puede utilizarse para la detección de IgG en sueros o plasma positivos para IgG (es decir, como reactivo de diagnóstico). Además, los antígenos pueden producirse de forma recombinante o de forma sintética.
Además, como se ha señalado anteriormente, la presente invención también incluye el antígeno P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62. Este antígeno puede usarse para la detección de IgM en sueros o plasma positivos para IgM (es decir, como reactivo de diagnóstico), y el antígeno puede producirse de forma recombinante o de forma sintética.
De hecho, si se desea medir tanto el título de IgM como de IgG en una muestra de suero o plasma, entonces puede utilizarse una composición o mezcla de antígenos tales como P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35 en un inmunoensayo. Dicha combinación de antígenos también se incluye dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención también incluye métodos de detección de IgM y/o IgG usando las combinaciones de antígeno descritas anteriormente. Más específicamente, hay dos tipos básicos de ensayos, competitivos y no competitivos (por ejemplo, inmunométricos y de tipo sándwich). En ambos ensayos, reactivos de anticuerpo o antígeno se unen covalentemente o no covalentemente a la fase sólida. Se conocen agentes de enlace para la unión covalente y pueden ser parte de la fase sólida o derivatizarse con la misma antes del revestimiento. Son ejemplos de fases sólidas usadas en inmunoensayos materiales porosos y no porosos, partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas, perlas, membranas, pocillos de microtitulación y tubos de plástico. La elección del material de fase sólida y del método de marcaje del reactivo de antígeno o anticuerpos se determinan basándose en las características de funcionamiento del formato de ensayo deseado. Para algunos inmunoensayos no es necesario un marcador. Por ejemplo, si el antígeno está en una partícula detectable tal como un eritrocito, la reactividad puede establecerse basándose en la aglutinación. Como alternativa, una reacción de antígeno-anticuerpo puede dar como resultado un cambio visible (por ejemplo, inmunodifusión radial). En la mayoría de los casos, uno de los reactivos de antígeno o anticuerpo usado en un inmunoensayo se une a un compuesto generador de señal o “marcador”. Este compuesto generador de señal o “marcador” es de por sí detectable o puede reaccionar con uno o más compuestos adicionales para generar un producto detectable (véase también la Patente de Estados Unidos Nº 6.395.472 B1). Los ejemplos de dichos compuestos generadores de señal incluyen cromógenos, radioisótopos (por ejemplo, 125I, 131I, 32P, 3H, 35S y 14C), compuestos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina), compuestos quimioluminiscentes, partículas (visibles o fluorescentes), ácidos nucleicos, agentes de formación de complejos o catalizadores tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidada de rábano picante, beta-galactosidasa y ribonucleasa). En el caso del uso de una enzima, la adición de un sustrato cromo-, fluoro-o luminogénico da como resultado la generación de una señal detectable. También son útiles otros sistemas de detección tales como fluorescencia de resolución temporal, fluorescencia de reflexión interna, amplificación (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa) y espectroscopía de Raman.
Hay dos formatos generales usados comúnmente para controlar el título y el tipo de anticuerpos específicos en seres humanos: (1) se presenta un antígeno en una fase sólida, como se ha descrito anteriormente, se deja que el fluido biológico humano que contiene los anticuerpos específicos reaccione con el antígeno, y después el anticuerpo unido al antígeno se detecta con un anticuerpo anti-humano acoplado a un compuesto generador de señal y (2) un anticuerpo anti-humano se une a la fase sólida, se deja que el fluido biológico humano que contiene anticuerpos específicos reaccione con el anticuerpo unido y después se añade antígeno unido a un compuesto generador de señal para detectar el anticuerpo específico presente en la muestra de fluido. En ambos formatos, el reactivo de anticuerpo anti-humano puede reconocer todas las clases de anticuerpo o, como alternativa, ser específico para una clase o subclase de anticuerpo particular, dependiendo del propósito deseado del ensayo. Se pretende incluir estos formatos de ensayo, así como otros formatos conocidos, dentro del alcance de la presente invención, y son bien conocidos por los expertos en la materia.
En particular, dos ejemplos ilustrativos de un inmunoensayo inmunométrico basado en captura de anticuerpos son los ensayos IMx de anticuerpo IgM contra Toxo e IgG contra Toxo fabricados por Abbott Laboratories (Abbott Park, IL). Ambos ensayos son Inmunoensayos Enzimáticos de Micropartículas (MEIA) automáticos que miden los anticuerpos contra Toxoplasma gondii (T. gondii) en suero o plasma humano (Safford et al. (1991) J. Clin. Pathol. 44: 238-242). Un ensayo mide cualitativamente anticuerpos IgM, indicativos de una exposición reciente o infección aguda, y el otro ensayo mide cuantitativamente IgG, indicativos de una infección crónica o pasada. Estos ensayos usan micropartículas revestidas con antígeno de T. gondii como fase sólida. En particular, se añade un espécimen a las micropartículas revestidas para permitir que se unan los anticuerpos específicos para T. gondii. Posteriormente, se añade un anti-IgM humana (o anti-IgG humana) conjugado con fosfatasa alcalina que se une específicamente a anticuerpos de clase IgM (o IgG) que están formando un complejo con los antígenos de T. gondii. Después de la adición de un sustrato adecuado (por ejemplo, fosfato de 4-metilumbeliferilo), se controla la velocidad de renovación catalizada por enzima basándose en la fluorescencia.
La mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35 puede usarse en el inmunoensayo de IgG Abbott, y el antígeno P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 en solitario puede utilizarse en el inmunoensayo de IgM Abbott. Además, una mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35 pueden utilizarse en cualquier ensayo, si se desea. Además, debe señalarse que también pueden utilizarse otros ensayos o plataformas distintas del Abbott con cada antígeno o combinación de antígenos para los fines de la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención incluye un método de detección de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62;
(b) detectar la presencia de anticuerpos IgM presentes en la muestra de ensayo. Más específicamente, la presente invención incluye un método de detección de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM; (b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, comprendiendo el conjugado un anticuerpo (dirigido contra la IgM) unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; (c) detectar la presencia del anticuerpo IgM que puede estar presente en la muestra de ensayo por detección de la señal generada por el compuesto generador de señal. También puede usarse un control o calibrador que se une a este antígeno. Además, el método también comprender el uso de P35 además de P30 modificado por ingeniería genética.
Además, la presente invención incluye además un método para detectar la presencia de IgM contra Toxoplasma gondii que pueda estar presente en una muestra de ensayo. Este método comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener los anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para la IgM en un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/IgM; (b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el conjugado se una al anticuerpo unido, comprendiendo el conjugado P30 modificado por ingeniería genética, que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62, unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y (c) detectar la presencia de los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la señal generada por el compuesto generador de señal. (Dichos anti-anticuerpos están disponibles en el mercado y pueden crearse, por ejemplo, por inmunización de un mamífero con cadena mu purificada del anticuerpo). Puede usarse un control o calibrador que comprenda un anticuerpo contra el anti-anticuerpo. Además, el conjugado también puede comprender P35, si se desea.
En cada uno de los ensayos anteriores, la IgG puede detectarse por sustitución del P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 con una mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35. Además, se usará un anti-anticuerpo específico para IgM. Además si se desea detectar anticuerpos tanto IgM como IgG, puede utilizarse P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35 en el inmunoensayo.
La presente invención también incluye un tercer método para detectar la presencia de IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo. Este método comprende las etapa de: (a) poner en contacto la muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para la IgM, en tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgM; (b) añadir antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que el antígeno se una al anticuerpo IgM unido, comprendiendo el antígeno el P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62; y (c) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM/antígeno resultantes, comprendiendo el conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de detectar una señal detectable, estando el anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra el antígeno; y (d) detectar la presencia de los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en la muestra de ensayo por detección de la señal generada por el compuesto generador de señal. De nuevo, puede usarse un control o calibrador que comprenda un anticuerpo contra el anti-anticuerpo. La mezcla de antígeno puede comprender además P35, si se desea.
En este método, la IgG puede detectarse por sustitución del antígeno P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 con una mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35, y utilización de un anti-anticuerpo específico para IgG. Sin embargo, si se desea detectar anticuerpos tanto IgM como IgG, puede utilizarse P30 modificado por ingeniería genética que tiene la SEC ID Nº: 62 y P35 en el inmunoensayo.
Debería señalarse que todos los métodos anteriores pueden usarse para detectar anticuerpos IgA (con un conjugado específico de alfa) y/o anticuerpos IgE (con un conjugado específico de épsilon) en caso de que se desee dicha detección.
Además, la presente invención también incluye una vacuna que comprende una mezcla de los antígenos P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna puede administrarse si se desea generar anticuerpos IgG en un mamífero. Además, esta vacuna debería administrarse si se desea generar anticuerpos tanto IgM como IgG en un mamífero.
También se incluyen kits dentro del alcance de la presente invención. Más específicamente, la presente invención incluye kits para determinar la presencia de IgG y/o IgM contra Toxoplasma gondii. En particular, un kit para determinar la presencia de IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo comprende a) P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62; y b) un conjugado que comprende un anticuerpo (dirigido contra IgM) unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable. El kit también puede contener un control o calibrador que comprende un reactivo que se une a P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62.
De nuevo, si se desea detectar IgG, más que IgM, el kit comprenderá una mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35, más que P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62, así como un anticuerpo dirigido contra IgG. Si se desea detectar tanto IgM como IgG, el kit comprenderá P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35.
La presente invención también incluye otro tipo de kit para detectar IgM y/o IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo. Si se utiliza para detectar la presencia de IgM, el kit puede comprender a) un anti-anticuerpo específico para IgM y b) P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62. También puede incluirse un control o calibrador que comprende un reactivo que se une a P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62. Más específicamente, el kit puede comprender a) un anti-anticuerpo especifico para IgM y B) un conjugado que comprende P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62, estando el conjugado unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable. De nuevo, el kit también puede comprender un control o calibrador que comprende un reactivo que se une a P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62.
Además, si se desea detectar IgGm más que IgM, el kit comprenderá una mezcla de P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35, más que P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 solamente, así como un anti-anticuerpo específico para IgG. Si se desea detectar tanto IgM como IgG, el kit puede comprender P30 modificado por ingeniería genética que tiene la secuencia de la SEC ID Nº: 62 y P35.
La presente invención puede ilustrarse mediante el uso de los siguientes ejemplos no limitantes:
Ejemplo 1
Metodología general
Materiales y fuentes
Las enzimas de restricción, la ADN ligasa T4 y el Sistema de Fusión y Purificación de Proteína pMAL™ se adquirieron en New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA).
Los patrones de peso molecular de ADN y proteínas, el kit de minipreparación de plásmidos, el bromuro de etidio y los geles de poliacrilamida premoldeados se adquirieron en BioRad Laboratories (Richmond, CA).
La maltosa se adquirió en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
El kit de Purificación de PCR QIAquick y el kit de Extracción de Gel QIAquick se adquirieron en Qiagen, Inc. (Valencia, CA).
Los oligonucleótidos sintéticos se adquirieron en Sigma Genosys (The Woodlands, TX).
Se obtuvieron células de E. coli supercompetentes EPICURIAN Coli™ XL-1 BLUE (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F’ proAB lacIq ZDM15 Tn10 (Tetr)]) en Stratagene Cloning Systems, Inc. (La Jolla, CA).
El kit de reactivo GeneAmp™ y la ADN polimerasa AmpliTaq™ se adquirieron en Perkin-Elmer Cetus (Norwalk, CT).
La agarosa GTG SeaKem se adquirió en BioWhittaker Molecular Applications (Rockland, ME).
La Bacto-Triptona, el Bacto-Extracto de Levadura, el Bacto-Agar ampicilina, los tampones, el isopropil-β-Dtiogalactósido (IPTG), la albúmina de suero bovino (BSA), el Sefacril S-300, el suero fetal de ternera (sin anticuerpos contra Toxo), la sacarosa, la azida sódica, la urea, el EDTA, el Triton X-100, la 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC), el ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), las sales inorgánicas, el dodecil sulfato sódico (SDS), el Tween 20, el glicerol, el fosfato de 4-metilumbeliferilo (MUP), el tris-(hidroximetil)aminometano (Tris), los reactivos del ensayo AxSYM Toxo IgG e IgM, los calibradores y los controles, las micropartículas derivatizadas con sulfato, la leche en polvo desnatada, el Nipasept, el A56620, el Brij-35, el suero de ratón, el manitol, el instrumento, los reactivos y productos AxSYM se adquirieron en Abbott Manufacturing, Inc. (Abbott Park, IL).
Medios, tampones y reactivos generales
El “Superbroth II” contenía triptona 11,25 g/l, extracto de levadura 22,5 g/l, fosfato potásico dibásico 11,4 g/l, fosfato potásico monobásico 1,7 g/l, glicerol 10 ml/l, con pH ajustado a 7,2 con hidróxido sódico.
Métodos generales
Todas las digestiones enzimáticas de ADN se realizaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se usaron al menos 5 unidades de enzima por microgramo de ADN y se dejó un tiempo de incubación suficiente para una digestión completa del ADN. Se siguieron lo protocolos del proveedor para los diversos kit usados en la manipulación del ADN y en la transformación del ADN en E. coli, para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y para la purificación de proteína de unión a maltosa (MBP) y proteínas de fusión con MBP. Se usaron procedimientos convencionales para la preparación de lisados de E. coli que contenían CMP-KDO sintetasa (CKS) (Patente de Estados Unidos Nº 6.329.157 B1), el análisis de restricción de ADN en geles de agarosa, la purificación de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa y la ligación de fragmentos de ADN con ADN ligasa T4. (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989)). El análisis de secuencia del ADN se realizó por Lark Technologies, Inc. (Houston, TX).
Ejemplo 2 (comparativo)
Construcción de vectores de expresión pMBP-ToxoP30
Para mejorar la inmunorreactividad de los cócteles de antígeno Toxo descritos en la Patente de Estados Unidos Nº
6.329.157 B1 en un inmunoensayo, se adquirió un sistema de expresión de proteína heteróloga adecuado que permitiría la producción de Toxo P30 soluble en E. coli. Se ha descubierto que el sistema de fusión y purificación de proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.643.758 es útil para la producción y purificación de proteínas de fusión solubles en E. coli. (En particular, los vectores descritos en la misma tienen secuencias que codifican el sitio de reconocimiento de una proteasa específica (por ejemplo, Factor Xa, enteroquinasa o Genenase™) de modo que la proteína de interés puede escindirse de MBP). Las proteínas de fusión con MBP aumentan su solubilidad en E. coli (Kapust y Waugh (1999) Protein Science 8, 1668-1674). Se generaron varias construcciones diferentes teniendo en cuenta la observación de que el Toxo P30 nativo se escinde post-traduccionalmente antes de su inserción en la membrana del taquizoíto (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591). Se desconocen los sitios de escisión exactos para el Toxo P30.
Se usó el plásmido pToxo-P30 descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 6.329.157 B1 como ADN de molde para una serie de reacciones de PCR para generar fragmentos de ADN que contienen diferentes porciones del gen de Toxo P30. Se preparó el ADN plasmídico de pToxo-P30 usando métodos convencionales. Los plásmidos pMAL-c2X (vector de expresión citoplasmática) y pMAL-p2X (vector de expresión periplásmica) se adquirieron en New England Biolabs, Beverly MA, y se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII en la preparación para la subclonación de los fragmentos génicos de Toxo P30.
Etapa A: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 1). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó con un kit de purificación de PCR Qiaquick. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que comenzaba en el nucleótido 1318 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 35843591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 2]
5’-CGCTGAAGCTTTCACGCGACACAAGCTGCGA-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 855 pares de bases que contenía el Toxo P30 se purificó con un kit de purificación de PCR Qiaquick. El fragmento de 855 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa) contenía el gen de Toxo P30 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 3] del plásmido pMBP-c2XToxoP30(52-336aa) se muestra en la Fig. 2 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 4] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30(52-336aa) también se muestra en la Fig. 2, en la que los restos aminoacídicos 392-676 de la SEC ID Nº: 4 corresponden a los aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 5] de ToxoP30(52-336aa) se muestra en la Fig. 3 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 6] de la proteína ToxoP30(52-336aa) también se muestra en la Fig. 3, en la que los restos aminoacídicos 1-285 de la SEC ID Nº: 6 corresponden a los aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa B: Construcción de pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa)
El plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-p2X (Fig. 4). El plásmido pMAL-p2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó con un kit de purificación de PCR Qiaquick. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1318 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 35843591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 2]
5’-CGCTGAAGCTTTCACGCGACACAAGCTGCGA-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de 855 pares de bases que contenía Toxo P30 se purificó con un kit de purificación de PCR Qiaquick. El fragmento de 855 pares de bases purificado se ligó con pMAL-p2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) contenía el gen de Toxo P30 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-p2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 7] del plásmido pMBP-p2XToxoP30(52-336aa) se muestra en la Fig. 5 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 8] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30(52-336aa) se muestra en la Fig. 5, en la que los restos aminoacídicos 417-701 de la SEC ID Nº: 8 corresponden a los aminoácidos 52-336 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa C: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa), un intermedio en la construcción del plásmido pMBP-c2XToxoP30del1C, se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 6). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1282 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 9]
5’-CAGGTCAAGCTTTCACACCATGGCAAAAATGGAAACGTG-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de 819 pares de bases que contenía el Toxo P30del1 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 819 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa) contenía el gen de Toxo P30del1 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa) y el análisis de la secuencia de aminoácidos correspondiente puso de manifiesto cambios de bases en el gen de P30 que daban como resultado dos cambios de aminoácido de la secuencia publicada (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591). Estas mutaciones estaban localizadas cadena abajo del sitio EcoRI sintético (nucleótido 464) y cadena arriba de un sitio BanI (nucleótido 1100), siguiendo la convención de numeración de Burg et al., citado anteriormente. Las mutaciones en el plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa) se corrigieron de la forma siguiente: El plásmido pMBP-c2XToxoP30del1C(52-324aa) se construyó por clonación de un fragmento EcoRI/BanI del plásmido pMBP-p2XToxoP30(52-336aa) que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, y un fragmento BanI/HindIII del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa), que contenía la porción 3’ del gen de Toxo P30del1, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 7). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se prepararon los ADN plasmídicos de pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del1(52-324aa) por métodos generales. Los plásmidos pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBPc2X-ToxoP30del1(52-324aa) se digirieron con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 819 pares de bases, que contenían el gen de Toxo P30, se purificaron en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases, que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, se purificó en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 819 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de 182 pares de bases, que contenía la porción 3’ del gen de Toxo P30del1, se purificó en un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y 182 pares de bases purificados se ligaron con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2XToxoP30del1C(52-324aa) contenía el gen de Toxo P30del1C clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 10] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa) se muestra en la Fig. 8 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 11] de la proteína de fusión MBPToxoP30del1C(52-324aa) también se muestra en la Fig. 8, en la que los restos aminoacídicos 392-664 de la SEC ID Nº: 11 corresponden a los aminoácidos 52-324 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 12] de ToxoP30del1C(52-324aa) se muestra en la Fig. 9 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 13] de la proteína ToxoP30del1C(52-324aa) también se muestra en la Fig. 9, en la que los restos aminoacídicos 1-273 de la SEC ID Nº: 13 corresponden a los aminoácidos 52-324 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa D: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del2 (52-311aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 10). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1243 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 14]
5’-CAGGTCAAGCTTTCAAGCCGATTTTGCTGACCCTGCAGCCC -3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 780 pares de bases que contenía el Toxo P30del2 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 780 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa) contenía el gen de Toxo P30del2 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 15] del plásmido pMBP-c2XToxoP30del2(52-311aa) se muestra en la Fig. 11 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 16] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del2(52-311aa) también se muestra en la Fig. 11, en la que los restos aminoacídicos 392-651 de la SEC ID Nº: 16 corresponden a los aminoácidos 52-311 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 17] de ToxoP30del2(52-311aa) se muestra en la Fig. 12 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 18] de la proteína ToxoP30del2(52-311aa) también se muestra en la Fig. 12, en la que los restos aminoacídicos 1-260 de la SEC ID Nº: 18 corresponden a los aminoácidos 52-311 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa E: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa), un intermedio en la construcción del plásmido pMBP-c2XToxoP30del3C(52-300aa), se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 13). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII, y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII, que comenzaba en el nucleótido 1210 del gen de P30 (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 19]
5’-CAGGTCAAGCTTTCACTCCAGTTTCACGGTACAGTG-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía el Toxo P30del3 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa) contenía el gen de Toxo P30del3 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa) y el análisis de la secuencia de aminoácidos correspondiente pusieron de manifiesto un cambio de una sola base en el gen de P30 que daba como resultado la sustitución de un aminoácido por un codón de terminación, conduciendo a una terminación prematura de la cadena de la proteína P30. Esta mutación estaba localizada cadena abajo del sitio EcoRI sintético (nucleótido 464) y cadena arriba de un sitio BanI (nucleótido 1100), siguiendo la convención de numeración de Burg et al. La mutación en el plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa) se corrigió de la forma siguiente:
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) se construyó por clonación de un fragmento EcoRI/BanI del plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, y un fragmento BanI/HindIII del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa), que contenía la porción 3’ del gen de Toxo P30del3, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 14). El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) se depositó en la ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo los términos del Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2002, y se le concedió el Nº de Acceso ATCC 4722.
El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se prepararon ADN plasmídicos de pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa) por métodos generales. Los plásmidos pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del3(52-300aa) se digirieron con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 747 pares de bases, que contenían el gen de Toxo P30, se purificaron en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases, que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, se purificó en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 747 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de 110 pares de bases, que contenía la porción 3’ del gen de Toxo P30del3, se purificó en un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y 110 pares de bases purificados se ligaron con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) contenía el gen de ToxoP30del3C clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 20] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) se muestra en la Fig. 15 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 21] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del3C(52-300aa) se muestra también en la Fig. 15, en la que los restos aminoacídicos 392-640 de la SEC ID Nº: 21 corresponden a los aminoácidos 52-300 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 22] de ToxoP30del3C(52-300aa) se muestra en la Fig. 16 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 23] de la proteína ToxoP30del3C(52-300aa) también se muestra en la Fig. 16, en la que los restos aminoacídicos 1-249 de la SEC ID Nº: 23 corresponden a los aminoácidos 52-300 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa F: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa), un intermedio en la construcción del plásmido pMBP-c2XToxoP30del4C(52-294aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 17). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1192 del gen de P30 (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 24]
5’-CAGGTCAAGCTTTCAGTGATGCTTCTCAGGCGATCCCC-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII, y el fragmento de ADN de 729 pares de bases que contenía el Toxo P30del4 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 729 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa) contenía el gen de Toxo P30del4 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X.
El análisis de la secuencia de ADN del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa) y el análisis de la secuencia de aminoácidos correspondiente pusieron de manifiesto cambios de bases en el gen de P30 que daban como resultado dos cambios de aminoácido de la secuencia publicada (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591). Estas mutaciones estaban localizadas cadena abajo del sitio EcoRI sintético (nucleótido 464) y cadena arriba de un sitio BanI (nucleótido 1100), siguiendo la convención de numeración de Burg et al. Las mutaciones en el plásmido pMBPc2X-ToxoP30del4(52-294aa) se corrigieron de la forma siguiente:
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) se construyó por clonación de un fragmento EcoRI/BanI del plásmido pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, y un fragmento BanI/HindIII del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa), que contenía la porción 3’ del gen de ToxoP30del4, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 18). El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) se depositó en la ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 bajo los términos del Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2002, y se le concedió el Nº de Acceso ATCC 4723.
El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se prepararon ADN plasmídicos de pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa) por métodos generales. Los plásmidos pMBP-p2X-ToxoP30(52-336aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del4(52-294aa) se digirieron con EcoRI/HindIII y los fragmentos de 855 y 729 pares de bases que contenían el gen de Toxo P30 se purificaron en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 855 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento EcoRI/BanI de 637 pares de bases, que contenía la porción corregida 5’ del gen de Toxo P30, se purificó en un gel de agarosa. El fragmento EcoRI/HindIII de 729 pares de bases se digirió con BanI y el fragmento BanI/HindIII de 92 pares de bases, que contenía la porción 3’ del gen de Toxo P30del4, se purificó en un gel de agarosa. Los fragmentos de 637 y 92 pares de bases purificados se ligaron con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C (52-294aa) contenía el gen de Toxo P30del4C clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 25] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) se muestra en la Fig. 19 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 26] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del4C(52-294aa) también se muestra en la Fig. 19, en la que los restos aminoacídicos 392-634 de la SEC ID Nº: 26 corresponden a los aminoácidos 52-294 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 27] de ToxoP30del4C(52-294aa) se muestra en la Fig. 20 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 28] de la proteína ToxoP30del4C(52-294aa) también se muestra en la Fig. 20, en la que los restos aminoacídicos 1-243 de la SEC ID Nº: 28 corresponden a los aminoácidos 52-294 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa G: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(-83-294aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 21). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 557 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1192 del gen de P30 (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 29]
5’-GGCGAATTCCCTAAAACAGCGCTCACAGAG-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 24]
5’-CAGGTCAAGCTTTCAGTGATGCTTCTCAGGCGATCCCC-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 636 pares de bases que contenía Toxo P30del4del8 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 636 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa) contenía el gen de ToxoP30del4del8 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 30] del plásmido pMBP-c2XToxoP30del4del8(83-294aa) se muestra en la Fig. 22 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 31] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del4del8(83-294aa) también se muestra en la Fig. 22, en la que los restos aminoacídicos 392-603 de la SEC ID Nº: 31 corresponden a los aminoácidos 83-294 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 32] de ToxoP30del4del8 (83-294aa) se muestra en la Fig. 23 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 33] de la proteína ToxoP30del4del8 (83-294aa) también se muestra en la Fig. 23, en la que los restos aminoacídicos 1-212 de la SEC ID Nº: 33 corresponden a los aminoácidos 83-294 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Etapa H: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 24). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1162 del gen de P30 (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 34]
5’-CAGGTCAAGCTTTCATCCAATAATGACGCTTTTTGACTC-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 699 pares de bases que contenía el Toxo P30del10 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 699 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) contenía el gen de Toxo P30del10 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 35] del plásmido pMBP-c2XToxoP30del10(52-284aa) se muestra en la Fig. 25 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 36] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del10(52-284aa) se muestra también en la Fig. 25, en la que los restos aminoacídicos 392-624 de la SEC ID Nº: 36 corresponden a los aminoácidos 52-284 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii, con la excepción de que el resto aminoacídico 546 de la SEC ID Nº: 36 es glicina en lugar de ácido glutámico. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 37] de ToxoP30del10(52-284aa) se muestra en la Fig. 26, y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 38] de la proteína ToxoP30del10(52-284aa) también se muestra en la Fig. 26, en la que los restos aminoacídicos 1-233 de la SEC ID Nº: 38 corresponden a los aminoácidos 52-284 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii, con la excepción de que el resto aminoacídico 155 de la SEC ID Nº: 38 es glicina en lugar de ácido glutámico.
Etapa I: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa) se construyó por clonación de un fragmento de ADN que contenía el Toxo P30, obtenido mediante amplificación por PCR del ADN de Toxo P30 contenido en el plásmido pToxo-P30, en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X (Fig. 27). El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/HindIII y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 952 del gen de P30 (Burg et al (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 39]
5’-CAGGTCAAGCTTTCACACGAGGGTCATTGTAGTGGG-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía el plásmido pToxo-P30. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 489 pares de bases que contenía el Toxo P30del11 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 489 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/HindIII durante una noche a 16°C. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa) contenía el gen de Toxo P30del11 clonado en los sitios EcoRI/HindIII de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 40] del plásmido pMBP-c2XToxoP30del11(52-214aa) se muestra en la Fig. 28 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 41] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30del11(52-214aa) también se muestra en la Fig. 28, en la que los restos aminoacídicos 392-554 de la SEC ID Nº: 41 corresponden a los aminoácidos 52-214 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 42] de ToxoP30del11(52-214aa) se muestra en la Fig. 29 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 43] de la proteína ToxoP30del11(52-214aa) también se muestra en la Fig. 29, en la que los restos aminoacídicos 1-163 de la SEC ID Nº: 43 corresponden a los aminoácidos 52-214 del antígeno P30 de Toxoplasma gondii.
Ejemplo 3 (comparativo)
Expresión de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 en E. coli
Etapa A: Expresión de genes clonados en E. coli
Los clones bacterianos pMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), pMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa), pMBP-c2XToxoP30del2(52-311aa), pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), pMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), pMBP-c2XToxoP30del4del8(83-294aa), pMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y pMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa) que expresan las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11 (52214aa) del Ejemplo 2 se cultivaron en medio “SUPERBROTH II” que contenía ampicilina 100 μg/ml hasta fase logarítmica, y la síntesis de las proteínas de fusión MBP-ToxoP30 se indujo por adición de IPTG como se ha descrito anteriormente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 629-635). Después de 4 horas post-inducción, las células se recogieron, y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de proteína.
Etapa B: Purificación de proteínas de fusión MBP-ToxoP30
Las proteínas de fusión solubles rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del1C(52-324aa), rpMBPc2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBPc2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa) se purificaron después de la lisis a partir de un concentrado de células siguiendo el manual de instrucciones de la Fusión y Purificación de Proteínas pMAL de New England Biolabs. Después de la lisis y de la centrifugación, los sobrenadantes brutos que contenían las proteínas de fusión se cargaron sobre una columna de afinidad de amilosa. Después del lavado de la columna, las proteínas de fusión se eluyeron de la columna con maltosa, se combinaron las fracciones de columna apropiadas y se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm y después se almacenaron a 2-8ºC hasta su recubrimiento sobre micropartículas.
Evaluación de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 en un inmunoensayo automático de IgG e IgM contra Toxo
Etapa A: Recubrimiento de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 sobre micropartículas
Antes de recubrir micropartículas, los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del1C(52324aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2XToxoP30del11 (52-214aa) se diluyeron hasta una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Después de la etapa de tratamiento térmico, los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 se recubrieron por separado sobre micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato (1-15% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES, pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotativo de tipo noria. Las micropartículas recubiertas se recogieron después por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón de almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro sódico, Tween 20, suero fetal de ternera (sin anticuerpos contra Toxo), azida sódica y sacarosa usando una jeringa y una aguja. Las micropartículas se diluyeron después con el tampón de almacenamiento de micropartículas hasta una concentración final de sólidos del 0,1-0,3% y se llenaron en frascos de plástico.
Etapa B: Descripción del paquete de reactivos, calibradores, controles, panel 6 y disquete de ensayo AxSYM® Toxo IgG v2
El paquete de reactivos para el ensayo automático AxSYM Toxo IgG v2 está diseñado para la detección de IgG anti-Toxo humana y consiste en los componentes siguientes. El frasco número uno contiene micropartículas recubiertas con antígenos Toxo recombinantes purificados (Ejemplo 4A) en un tampón de almacenamiento de micropartículas. Para evitar que los anticuerpos anti-MBP o anti-CKS humanos causen una reacción falsa positiva en el ensayo, puede añadirse MBP o CKS purificada al tampón de almacenamiento de micropartículas. El frasco número dos contiene el conjugado preferido, un conjugado de cabra anti-IgG humana con fosfatasa alcalina. Este conjugado se titula para determinar una concentración de trabajo de 0,5-5 μg/ml. El conjugado se diluye en un diluyente de conjugado que contiene tampón Tris, pH 7,4, cloruro de sodio, calcio, magnesio y cinc, Nipasept, A56620, leche en polvo desnatada, Brij-35, suero de ratón y manitol. El frasco número tres contiene el diluyente de ensayo preferido para minimizar la unión inespecífica a las micropartículas y a la matriz de ensayo. Este diluyente de ensayo consiste en un tampón Tris, pH, 7,5, que contiene cloruro sódico, EDTA sódico, leche en polvo desnatada, Nipasept, A56620, y Tween 20. El frasco número cuatro contiene un diluyente de línea de tampón fosfato.
Se obtienen seis calibradores de ensayo etiquetados A-F a partir de combinaciones de plasmas positivos para IgG contra Toxo o anticuerpos monoclonales IgG anti-Toxo humanos y son necesarios para calibrar el ensayo AxSYM®Toxo IgG v2. Estos calibradores se emparejan con calibradores previamente emparejados con el Patrón Internacional de la OMS TOX-S. El intervalo de concentración de estos calibradores es de 0-300 UI/ml. Son necesarios controles positivos y negativos para evaluar la calibración del ensayo y establecer la validez del ensayo. El control positivo se prepara a partir de combinaciones de plasmas positivos para IgG contra Toxo o anticuerpos monoclonales IgG anti-Toxo humanos. El control negativo se prepara a partir de combinaciones de plasmas negativos para IgG contra Toxo. El Panel 6 es una combinación de unidades de plasmas positivos para IgG e IgM contra Toxo obtenida de donadores de sangre con toxoplasmosis aguda.
El disquete de ensayo para el ensayo AxSYM® Toxo IgG v2 contiene el programa informático del protocolo de ensayo necesario para procesar el inmunoensayo automático en el instrumento Abbott “AxSYM®” (Abbott Laboratories Abbott Park, IL). Además del paquete de reactivos, de los calibradores de ensayo y de los controles descritos anteriormente del AxSYM® Toxo IgG v2, son necesarios los componentes de ensayo siguientes localizados en el instrumento para el procesamiento del ensayo: cubetas de muestra, diluyente de línea AxSYM®, tampón de MEIA, recipientes de reacción, MUP y celdas de matriz. La secuencia de acontecimientos para el ensayo automático es la siguiente: La sonda de pipeteo en el centro del ensamblaje suministra la muestra del paciente y el diluyente de línea al pocillo de muestra del recipiente de reacción; la sonda de pipeteo ensambla después los volúmenes apropiados de diluyente de ensayo, diluyente de línea y conjugado necesarios para el ensayo del paquete de reactivos a los pocillos del recipiente de reacción designados; esta sonda suministra después las micropartículas recubiertas con antígeno Toxo recombinante del paquete de reactivos y una alícuota de la muestra diluida al pocillo del recipiente de reacción designado; el recipiente de reacción se transfiere después al carrusel de proceso; los anticuerpos específicos de Toxo se unen a las micropartículas recubiertas con antígeno recombinante Toxo formando un complejo de antígeno-anticuerpo; se añade diluyente de ensayo a la mezcla de reacción y la celda de matriz y después se transfiere una alícuota de la mezcla de reacción a la matriz de fibra de vidrio en el carrusel auxiliar; las micropartículas se unen irreversiblemente a la matriz; la matriz se lava con tampón de MEIA y diluyente de línea para eliminar los anticuerpos no unidos; se añade conjugado de cabra anti-IgG humana con fosfatasa alcalina a la matriz y se une a la IgG específica de Toxo capturada por los antígenos recombinantes Toxo; la matriz se lava después con tampón de MEIA para eliminar cualquier conjugado de enzima-anticuerpo no unido; el sustrato enzimático MUP se añade a la matriz; la enzima fosfatasa alcalina presente en la matriz unida al anti-IgG humana de cabra cataliza la hidrólisis del resto fosforilo del MUP, produciendo un producto altamente fluorescente que se mide mediante el sistema óptico de MEIA AxSYM; la intensidad de señal (recuentos de tasa) es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgG específicos de Toxo presentes en la muestra.
Etapa C: Descripción del paquete de reactivos, calibrador de índice, controles y disquete de ensayo de AxSYM Toxo® IgM v2
El paquete de reactivos para el ensayo automático AxSYM Toxo IgM v2 está diseñado para la detección de IgM anti-Toxo humana y consiste en los componentes siguientes. El frasco número uno contiene micropartículas recubiertas con antígenos Toxo recombinantes purificados (Ejemplo 4A) en un tampón de almacenamiento de micropartículas. Para evitar que los anticuerpos anti-MBP o anti-CKS humanos causen una reacción falsa positiva en el ensayo, puede añadirse MBP o CKS purificada al tampón de almacenamiento de micropartículas. El frasco número dos contiene el conjugado preferido, un conjugado de cabra anti-IgM humana con fosfatasa alcalina. Este conjugado se titula para determinar una concentración de trabajo de 0,1-5 μg/ml. El conjugado se diluye en un diluyente de conjugado que contiene tampón Tris, pH 7,4, cloruro de sodio, calcio, magnesio y cinc, Nipasept, A56620, leche en polvo desnatada, Brij-35, suero de ratón y manitol. El frasco número tres contiene el diluyente de ensayo preferido para minimizar la unión inespecífica a las micropartículas y a la matriz de ensayo. Este diluyente de ensayo consiste en un tampón Tris, pH, 7,5, que contiene cloruro sódico, EDTA sódico, leche en polvo desnatada, Nipasept, A56620, y Tween 20. El frasco número cuatro contiene un diluyente de línea de tampón fosfato o tampón de neutralización RF.
El calibrador de índice procede de combinaciones de plasmas positivos para IgM contra Toxo o anticuerpos monoclonales IgM anti-Toxo humanos y es necesario para calibrar el ensayo AxSYM®Toxo IgM v2. Son necesarios controles positivos y negativos para evaluar la calibración del ensayo y establecer la validez del ensayo. El control positivo se prepara a partir de combinaciones de plasmas positivos para IgM contra Toxo o anticuerpos monoclonales IgM anti-Toxo humanos. El control negativo se prepara a partir de combinaciones de plasmas
5
10
15
20
25
30
35
negativos para IgM contra Toxo.
El disquete de ensayo para el ensayo AxSYM® Toxo IgM v2 contiene el programa informático del protocolo de ensayo necesario para procesar el inmunoensayo automático en el instrumento Abbott “AxSYM” (Abbott Laboratories Abbott Park, IL). Además del paquete de reactivos, del calibrador de índice y de los controles descritos anteriormente del AxSYM® Toxo IgM v2, son necesarios los componentes de ensayo siguientes localizados en el instrumento para el procesamiento del ensayo: cubetas de muestra, diluyente de línea AxSYM®, tampón de MEIA, recipientes de reacción, MUP y celdas de matriz. La secuencia de acontecimientos para el ensayo automático es la siguiente: La sonda de pipeteo en el centro del ensamblaje suministra la muestra del paciente y el diluyente de línea al pocillo de muestra del recipiente de reacción; la sonda de pipeteo ensambla después los volúmenes apropiados de diluyente de ensayo, diluyente de línea o tampón de neutralización RF y conjugado necesarios para el ensayo del paquete de reactivos a los pocillos del recipiente de reacción designados; esta sonda suministra después las micropartículas recubiertas con antígeno Toxo recombinante del paquete de reactivos y una alícuota de la muestra diluida al pocillo del recipiente de reacción designado; el recipiente de reacción se transfiere después al carrusel de proceso; los anticuerpos específicos de Toxo se unen a las micropartículas recubiertas con antígeno recombinante Toxo formando un complejo de antígeno-anticuerpo; se añade diluyente de ensayo a la mezcla de reacción y la celda de matriz y después se transfiere una alícuota de la mezcla de reacción a la matriz de fibra de vidrio en el carrusel auxiliar; las micropartículas se unen irreversiblemente a la matriz; la matriz se lava con tampón de MEIA y diluyente de línea o tampón de neutralización RF para eliminar los anticuerpos no unidos; se añade conjugado de cabra anti-IgM humana con fosfatasa alcalina a la matriz y se une a la IgM específica de Toxo capturada por los antígenos recombinantes Toxo; la matriz se lava después con tampón de MEIA para eliminar cualquier conjugado de enzima-anticuerpo no unido; el sustrato enzimático MUP se añade a la matriz; la enzima fosfatasa alcalina presente en la matriz unida al anti-IgM humana de cabra cataliza la hidrólisis del resto fosforilo del MUP, produciendo un producto altamente fluorescente que se mide mediante el sistema óptico de MEIA AxSYM®; la intensidad de señal (recuentos de tasa) es proporcional a la cantidad de anticuerpos IgM específicos de Toxo presentes en la muestra.
Etapa D: Evaluación de las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30(52-336aa), rpMBP-c2XToxoP30del1C(52-324aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del2(52-311aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2XToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa) en los inmunoensayos AxSYM® Toxo IgG v2 y Toxo IgM v2
Los paquetes de reactivos de AxSYM® Toxo IgG e IgM se ensamblaron como se ha descrito en los Ejemplos 4B y 4C usando las micropartículas recubiertas con los ansíenos Toxo descritas en el Ejemplo 4A. Los calibradores A y F de IgG contra Toxo (Acal y Fcal) y el Panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos de AxSYM Toxo IgG v2, y el control negativo de IgM contra Toxo (NC), calibrador de índice (IC) y panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos AxSYM® Toxo IgM v2. Los resultados se muestran en las Tablas 1 y 2.
TABLA 1
Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 en el ensayo AxSYM® Toxo IgG v2
Recuentos de tasa
Acal Fcal Fcal/ Acal PNL6 PNL6/Acal
rpMBP-c2X-ToxoP30 (52-336aa) 40 3495 87 643 16
rpMBP-c2X-ToxoP30 del1C(52-324aa) 29 2599 90 544 19
rpMBP-c2X-ToxoP30 del2(52-311aa) 28 3191 114 1129 40
rpMBP-c2X-ToxoP30 del3C(52-300aa) 29 3199 110 1112 38
rpMBP-c2X-ToxoP30 del4C(52-294aa) 29 3352 116 1302 45
rpMBP-c2X-ToxoP30 del10(52-284aa) 40 4277 107 1285 32
rpMBP-c2X-ToxoP30 del11(52-214aa) 48 4076 85 1118 23
rpMBP-c2X-ToxoP30 del4del8(83-294aa) 34 59 1,7 37 1,1
TABLA 2
Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 en el ensayo AxSYM® Toxo IgM v2
Recuentos de tasa
NC IC PNL6 PNL6/NC
rpMBP-c2X-ToxoP30 (52-336aa) 33 175 210 6,4
rpMBP-c2X-ToxoP30del1C (52-324aa) 48 189 250 5,2
rpMBP-c2X-ToxoP30del2 (52-311aa) 43 315 440 10,2
22 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50 Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30 en el ensayo AxSYM® Toxo IgM v2
Recuentos de tasa
NC IC PNL6 PNL6/NC
rpMBP-c2X-ToxoP30del3C (52-300aa) 49 187 459 9,4
rpMBP-c2X-ToxoP30del4C (52-294aa) 51 203 527 10,3
rpMBP-c2X-ToxoP30del10 (52-284aa) 39 158 370 9,5
rpMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa) 36 130 312 8,7
rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8 (83-294aa) 38 75 38 1,0
Como puede observarse en ambas Tablas 1 y 2, se obtuvo un resultado sorprendente. En particular, la deleción de aminoácidos del extremo C-terminal del antígeno ToxoP30 dio como resultado una inmunorreactividad a IgG e IgM específica de Toxo mejorada, según se midió por los recuentes de tasa aumentados para el Panel 6 y las proporciones de recuentos de tasa mejoradas para Fcal/Acal, Panel 6/Acal y Panel 6/NC hasta una deleción de 42 aminoácidos (compárese la proteína rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) con la proteína rpMBP-c2X-ToxoP30(52336aa) en las Tablas 1 y 2). La proteína rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) modificada por ingeniería genética produjo recuentos de tasa máximos para el Panel 6 y proporciones de recuentos de tasa máximas en ambos ensayos. Estos resultados sugieren que pequeñas deleciones del extremo C-terminal de ToxoP30 ponen de manifiesto o vuelven disponibles nuevos epítopos para la unión de IgG e IgM específicas de Toxo que están ocluidos en la proteína de longitud completa. La deleción de aminoácidos C-terminales adicionales (compárese la proteína rpMBP-c2X-ToxoP30del10(52-284aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa) con la proteína rpMBP-c2XToxoP30del4C (52-294aa) en las Tablas 1 y 2) dio como resultado una inmunorreactividad reducida, sugiriendo la pérdida de epítopos de IgG e IgM con deleciones C-terminales de mayor tamaño. Por el contrario, la introducción de una pequeña deleción de 30 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína óptima rpMBP-c2XToxoP30del4C, que generaba la proteína rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83-294aa), suprimía completamente la inmunorreactividad a IgG e IgM específica de Toxo. Estos resultados también sugieren que algunos de los restos de cisteína presentes en la porción C-terminal de la proteína ToxoP30 son prescindibles para una inmunorreactividad óptima a IgG e IgM contra Toxo. Por ejemplo, la proteína óptima rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) contiene 11 restos de cisteína y la proteína rpMBP-c2X-ToxoP30del11(52-214aa), que demostró una buena inmunorreactividad pero no óptima, contiene 7 restos de cisteína.
Ejemplo 5
Construcción de genes sintéticos de Toxo P30 que contienen mutaciones que cambian restos de cisteína a alanina
Basándose en los resultados obtenidos a partir del análisis de deleción del gen de Toxo P30 en el Ejemplo 4D, se construyó una nueva serie de proteínas de fusión MBP-ToxoP30. Puesto que hay 12 restos de cisteína presentes en la proteína Toxo P30 madura (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591; Velge-Roussel et al. (1994) Molec. Biochem. Parasitol. 66: 31-38), hay matemáticamente 212 o 4.096 proteínas Toxo P30 diferentes que pueden construirse que contienen diversas combinaciones de cambio de uno o más de los doce restos de cisteína a alanina. Ciertamente sería imposible intentar todas las 4.096 combinaciones de cisteína a alanina diferentes para optimizar adicionalmente la inmunorreactividad del antígeno Toxo P30. Por lo tanto, los resultados en el Ejemplo 4D se usaron para estrechar el número de genes de Toxo P30 mutantes diferentes a construir que tienen el potencial de una inmunorreactividad a IgG e IgM contra Toxo mejorada en un inmunoensayo automático. Se diseñaron oligonucleótidos mutantes para la síntesis in vitro de tres genes de Toxo P30 que contienen mutaciones que cambian diversos restos de cisteína a alanina, y también introducen la misma deleción 3’ en el gen de Toxo P30 presente en ToxoP30del3C(52-300aa) (SEC ID Nº: 22 y Fig. 16).
La síntesis de cada gen de Toxo P30 requería la síntesis y el ensamblaje de 16 oligonucleótidos solapantes. Estos oligonucleótidos variaban de 67-72 bases de longitud, solapándose los oligonucleótidos vecinos por 20-23 restos. Los genes de P30 se ensamblaron por PCR repetitiva seguida de amplificación por PCR de los genes ensamblados (Withers-Martinez et al. (1999) Protein Engr. 12: 1113-1120; Prytulla et al. (1996) FEBS Lett. 399: 283-289; Kataoka et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Comm. 250: 409-413) usando un cebador con sentido de P30 que contiene un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contiene un sitio HindIII. Después de la amplificación por PCR, el gen de P30 se digirió con EcoRI y HindIII, se purificó en un gel de agarosa y se ligó con la cadena principal del vector pMAL-c2X que se había digerido mediante EcoRI e HindIII, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 30.
Etapa A: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30MIX1
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se construyó por clonación de un fragmento de ADN sintético que contenía Toxo P30, obtenido mediante la síntesis y el ensamblaje de 16 oligonucleótidos, en los sitios EcoRI/HindIII de pMALc2X (Figura 30). Este plásmido difiere del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) del Ejemplo 2E en que la secuencia de ADN de Toxo P30 en el plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se ha cambiado de modo que cinco de los doce restos de cisteína de Toxo P30 (cisteínas nº 8-12) se han cambiado a alanina. El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/Hindlll y la cadena principal del vector se purificó en un gen de agarosa. Los oligonucleótidos siguientes se sintetizaron para la construcción del gen de ToxoP30MIX1:
P30.010Ala8 [SEC ID Nº: 53]
P30.011Ala8Ala9 [SEC ID Nº: 54]
P30.012Ala9Ala10 [SEC ID Nº: 55]
P30.014 [SEC ID Nº: 57]
P30.015Ala11Ala12 [SEC ID Nº: 58]
P30.016Ala12 [SEC ID Nº: 59]
En la primera etapa de síntesis génica, se mezclaron entre sí 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron usando PCR repetitiva de la forma siguiente: 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos seguido de un ciclo en remojo a 4ºC. En la segunda etapa de la síntesis génica, se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1210 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
5’-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3’
(El sitio EcoRI está subrayado.)
Cebador antisentido [SEC ID Nº: 60]
5’-CAGGTCAAGCTTTCACTCCAGTTTCACGGTAGCGTG-3’
(El sitio HindIII está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía los oligonucleótidos ensamblados de la primera etapa de síntesis génica. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía el Toxo P30MIX1 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/Hindlll durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN sintética de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 contenía el gen de Toxo P30MIX1 clonado en los sitios EcoRI/Hindlll de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 61] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se muestra en la Fig. 31, y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 62] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX1 también se muestra en la Fig. 31, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 21 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 62. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX1 se depositó en la ATCC 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 bajo los términos del Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 2002, y se le concedió el Nº de Acceso ATCC 4721. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 63] de ToxoP30MIX1, que no es parte de la presente invención se muestra en la Fig. 32, y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 64] de la proteína ToxoP30MIX1, que no es parte de la presente invención, también se muestra en la Fig. 32, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 164,179,187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 23 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 64.
Etapa B: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 se construyó por clonación de un fragmento de ADN sintético que contenía Toxo P30, obtenido mediante la síntesis y el ensamblaje de 16 oligonucleótidos, en los sitios EcoRI/Hindlll de pMAL
5 c2X (Figura 30). Este plásmido difiere del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) del EJEMPLO 2E en que la secuencia de ADN de Toxo P30 en el plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 se ha cambiado de modo que seis de los doce restos de cisteína de Toxo P30 (cisteínas nº 7-12) se han cambiado a alanina. El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/Hindlll, y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron los oligonucleótidos siguientes para la construcción del gen de ToxoP30MIX3:
10 P30.001 [SEC ID Nº: 44]
P30.009Ala7 [SEC ID Nº: 65]
P30.010Ala8 [SEC ID Nº: 53]
P30.011Ala8Ala9 [SEC ID Nº: 54]
P30.012Ala9Ala10 [SEC ID Nº: 55]
P30.015Ala11Ala12 [SEC ID Nº: 58]
P30.016Ala12 [SEC ID Nº: 59]
20 En la primera etapa de síntesis génica, se mezclaron entre sí 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron usando PCR repetitiva de la forma siguiente: 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos, seguido de un ciclo en remojo a 4ºC. En la segunda etapa de síntesis génica, se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el
25 nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI, y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1210 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1]
30 5'-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3' (El sitio EcoRI está subrayado.) Cebador antisentido [SEC ID Nº: 60] 5'-CAGGTCAAGCTTTCACTCCAGTTTCACGGTAGCGTG-3' (El sitio Hindlll está subrayado.)
35 Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía los oligonucleótidos ensamblados de la primera etapa de síntesis génica. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía el Toxo P30MIX3 se purificó en un
40 gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/Hindlll durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN sintética de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 contenía el gen de Toxo P30MIX3 clonado en los sitios EcoRI/Hindlll de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 66]
45 del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 se muestra en la Fig. 33 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 67] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX3 también se muestra en la Fig. 33, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 530, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 21 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 530, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 67. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 68] de ToxoP30MIX3 se muestra en la Fig. 34 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 69] de la proteína ToxoP30MIX3 también se muestra en la Fig. 34, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 139, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 23 son ahora
5 aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 139, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 69.
Etapa C: Construcción de pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativa)
El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 se construyó por clonación de un fragmento de ADN sintético que contenía
10 Toxo P30, obtenido mediante la síntesis y el ensamblaje de 16 oligonucleótidos, en los sitios EcoRI/Hindlll de pMALc2X (Figura 30). Este plásmido difiere del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa) del EJEMPLO 2E en que la secuencia de ADN de Toxo P30 en el plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 se ha cambiado de modo que seis de los doce restos de cisteína de Toxo P30 (cisteínas nº 2 y 8-12) se han cambiado a alanina. El plásmido pMAL-c2X se digirió con EcoRI/Hindlll y la cadena principal del vector se purificó en un gel de agarosa. Se sintetizaron los
15 oligonucleótidos siguientes para la construcción del gen de ToxoP30MIX5:
P30.002Ala2 [SEC ID Nº: 70]
P30.010Ala8 [SEC ID Nº: 53]
P30.011Ala8Ala9 (SEC ID Nº: 54]
P30.012Ala9Ala10 [SEC ID Nº: 55]
P30.014 [SEC ID Nº: 57] imagen1
P30.015Ala11Ala12 [SEC ID Nº: 58]imagen1
P30.016Ala12 [SEC ID Nº: 59]imagen1
En la primera etapa de síntesis génica, se mezclaron entre sí 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron
25 usando PCR repetitiva de la forma siguiente: 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos, seguido de un ciclo en remojo a 4ºC. En la segunda etapa de síntesis génica, se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1210 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra
30 a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1] 5'-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3' (El sitio EcoRI está subrayado.)
35 Cebador antisentido [SEC ID Nº: 60] 5'-CAGGTCAAGCTTTCACTCCAGTTTCACGGTAGCGTG-3' (El sitio Hindlll está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía los
40 oligonucleótidos ensamblados de la primera etapa de síntesis génica. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía Toxo P30MIX5 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/Hindlll durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de
45 minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN sintética de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 contenía el gen de Toxo P30MIX5 clonado en los sitios EcoRI/Hindlll de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 71] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 se muestra en la Fig. 35 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 72] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX5 también se muestra en la Fig. 35, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 422, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 21 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 422, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 72. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 73] de ToxoP30MIX5 se muestra en la Fig. 36 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 74] de la proteína ToxoP30MIX5 también se muestra en la Fig. 36, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 31, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 23 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 31, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 74.
Ejemplo 6
Expresión de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en E. coli
Etapa A: Expresión de genes clonados en E. coli
Los clones bacterianos pMBP-c2X-ToxoP30MIX1, pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 y pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 que expresaban las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativa) y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativa) del Ejemplo 5 se cultivaron en medio “SUPERBROTH II” que contenía ampicilina 100 μg/ml hasta fase logarítmica, y la síntesis de las proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX se indujo por adición de IPTG como se ha descrito anteriormente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 629-635). Después de 4 horas post-inducción, las células se recogieron y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de proteína.
Etapa B: Purificación de proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX
Las proteínas de fusión solubles rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativa) y rpMBP-c2XToxoP30MIX5 (comparativa) se purificaron después de la lisis a partir de un concentrado de células siguiendo el manual de instrucciones de Fusión y Purificación de Proteínas pMAL de New England Biolabs. Después de la lisis y de la centrifugación, los sobrenadantes brutos que contenían las proteínas de fusión se cargaron en una columna de afinidad de amilosa. Después del lavado de la columna, las proteínas de fusión se eluyeron de la columna con maltosa, se combinaron las fracciones de columna apropiadas y se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm, y después se almacenaron a 2-8ºC hasta su recubrimiento sobre micropartículas.
Ejemplo 7
Evaluación de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en un inmunoensayo automático de IgG e IgM contra Toxo
Etapa A: Recubrimiento de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX sobre micropartículas
Antes de recubrir las micropartículas, los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativo) y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativo) se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Después de la etapa de tratamiento térmico, los antígenos rpMBP-c2XToxoP30MIX se recubrieron por separado sobre micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato (1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a temperatura ambiente, y en un agitador rotativo de tipo noria. Las micropartículas recubiertas se recogieron después por centrifugación a
14.000 x g durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón de almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro sódico, Tween 20, suero fetal de ternera (sin anticuerpos contra Toxo), azida sódica y sacarosa, usando una jeringa y una aguja. Después, las micropartículas se diluyeron con tampón de almacenamiento de micropartículas hasta una concentración final de sólidos del 0,1-0,3%, y se llenaron en frascos de plástico.
Etapa B: Evaluación de las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 en los inmunoensayos AxSYM Toxo IgG v2 y Toxo IgM v2
Los paquetes de reactivos de AxSYM® Toxo IgG e IgM se ensamblaron como se ha descrito en los Ejemplos 4B y 4C usando las micropartículas recubiertas con los antígenos Toxo descritas en el Ejemplo 7A. Los calibradores A y F de IgG contra Toxo (Acal y Fcal) y el Panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos de AxSYM Toxo IgG v2 y el control negativo de IgM contra Toxo (NC), el calibrador de índice (IC) y el panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos AxSYM Toxo IgM v2. Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 3 y 4.
5
10
15
20
25
30
35
40
TABLA 3 Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en el ensayo AxSYM Toxo IgG v2 Recuentos de tasa
Antígeno recubierto
P30.015Ala11Ala12 [SEC ID Nº: 58]
P30.016Ala12 [SEC ID Nº: 59]
En la primera etapa de síntesis génica, se mezclaron entre sí 4 picomoles de cada oligonucleótido y se ensamblaron
25 usando PCR repetitiva de la forma siguiente: 1 ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos, seguido de un ciclo en remojo a 4ºC. En la segunda etapa de síntesis génica, se sintetizó un cebador con sentido que comenzaba en el nucleótido 464 del gen de P30 que contenía un sitio EcoRI y un cebador antisentido que contenía un sitio HindIII que comenzaba en el nucleótido 1210 del gen de P30 (Burg et al. (1988) J. Immunol. 141: 3584-3591), como se muestra
30 a continuación:
Cebador con sentido [SEC ID Nº: 1] 5'-GGCGAATTCCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC-3' (El sitio EcoRI está subrayado.)
35 Cebador antisentido [SEC ID Nº: 60] 5'-CAGGTCAAGCTTTCACTCCAGTTTCACGGTAGCGTG-3' (El sitio Hindlll está subrayado.)
Los cebadores con sentido y antisentido se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía los
40 oligonucleótidos ensamblados de la primera etapa de síntesis génica. Después de la amplificación por PCR y de la purificación de la mezcla de reacción con un kit de purificación de PCR Qiaquick, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI y HindIII y el fragmento de ADN de 747 pares de bases que contenía Toxo P30MIX5 se purificó en un gel de agarosa. El fragmento de 747 pares de bases purificado se ligó con pMAL-c2X/EcoRI/Hindlll durante una noche a 16ºC. La mezcla de ligación se usó para transformar células XL-1 Blue competentes. Se preparó ADN de
45 minipreparaciones a partir de los transformantes y se exploró para determinar la presencia de la secuencia de ADN sintética de P30 mediante análisis con enzimas de restricción. El plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 contenía el gen de Toxo P30MIX5 clonado en los sitios EcoRI/Hindlll de pMAL-c2X. La secuencia de ADN completa [SEC ID Nº: 71] del plásmido pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 se muestra en la Fig. 35 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 72] de la proteína de fusión MBP-ToxoP30MIX5 también se muestra en la Fig. 35, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 422, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 21 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 422, 555, 570, 578, 625, 635 de la SEC ID Nº: 72. La secuencia de ADN [SEC ID Nº: 73] de ToxoP30MIX5 se muestra en la Fig. 36 y la secuencia de aminoácidos correspondiente [SEC ID Nº: 74] de la proteína ToxoP30MIX5 también se muestra en la Fig. 36, en la que los restos aminoacídicos de cisteína localizados en las posiciones 31, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 23 son ahora aminoácidos de alanina localizados en las posiciones 31, 164, 179, 187, 234, 244 de la SEC ID Nº: 74.
Ejemplo 6
Expresión de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en E. coli
Etapa A: Expresión de genes clonados en E. coli
Los clones bacterianos pMBP-c2X-ToxoP30MIX1, pMBP-c2X-ToxoP30MIX3 y pMBP-c2X-ToxoP30MIX5 que expresaban las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativa) y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativa) del Ejemplo 5 se cultivaron en medio “SUPERBROTH II” que contenía ampicilina 100 μg/ml hasta fase logarítmica, y la síntesis de las proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX se indujo por adición de IPTG como se ha descrito anteriormente (Robinson et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 629-635). Después de 4 horas post-inducción, las células se recogieron y los sedimentos celulares se almacenaron a -80ºC hasta que se produjo la purificación de proteína.
Etapa B: Purificación de proteínas de fusión MBP-ToxoP30MIX
Las proteínas de fusión solubles rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativa) y rpMBP-c2XToxoP30MIX5 (comparativa) se purificaron después de la lisis a partir de un concentrado de células siguiendo el manual de instrucciones de Fusión y Purificación de Proteínas pMAL de New England Biolabs. Después de la lisis y de la centrifugación, los sobrenadantes brutos que contenían las proteínas de fusión se cargaron en una columna de afinidad de amilosa. Después del lavado de la columna, las proteínas de fusión se eluyeron de la columna con maltosa, se combinaron las fracciones de columna apropiadas y se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm, y después se almacenaron a 2-8ºC hasta su recubrimiento sobre micropartículas.
Ejemplo 7
Evaluación de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en un inmunoensayo automático de IgG e IgM contra Toxo
Etapa A: Recubrimiento de antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX sobre micropartículas
Antes de recubrir las micropartículas, los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 (comparativo) y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 (comparativo) se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Después de la etapa de tratamiento térmico, los antígenos rpMBP-c2XToxoP30MIX se recubrieron por separado sobre micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato (1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a temperatura ambiente, y en un agitador rotativo de tipo noria. Las micropartículas recubiertas se recogieron después por centrifugación a
14.000 x g durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón de almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro sódico, Tween 20, suero fetal de ternera (sin anticuerpos contra Toxo), azida sódica y sacarosa, usando una jeringa y una aguja. Después, las micropartículas se diluyeron con tampón de almacenamiento de micropartículas hasta una concentración final de sólidos del 0,1-0,3%, y se llenaron en frascos de plástico.
Etapa B: Evaluación de las proteínas de fusión con MBP rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1, rpMBP-c2X-ToxoP30MIX3 y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 en los inmunoensayos AxSYM Toxo IgG v2 y Toxo IgM v2
Los paquetes de reactivos de AxSYM® Toxo IgG e IgM se ensamblaron como se ha descrito en los Ejemplos 4B y 4C usando las micropartículas recubiertas con los antígenos Toxo descritas en el Ejemplo 7A. Los calibradores A y F de IgG contra Toxo (Acal y Fcal) y el Panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos de AxSYM Toxo IgG v2 y el control negativo de IgM contra Toxo (NC), el calibrador de índice (IC) y el panel 6 (PNL6) se ensayaron con los paquetes de reactivos AxSYM Toxo IgM v2. Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 3 y 4.
5
10
15
20
25
30
35
40
TABLA 3 Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en el ensayo AxSYM Toxo IgG v2 Recuentos de tasa
Antígeno recubierto
- Acal
- Fcal Fcal/Acal PNL6 PNL6/Acal
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX1 (Ala8-12)
- 34 3847 113 1445 43
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX3(Ala7-12)*
- 35 3704 106 1043 30
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX5(Ala2, Ala8-12)*
- 35 57 1,6 23 0,7
- *comparativo
TABLA 4 Evaluación de los antígenos rpMBP-c2X-ToxoP30MIX en el ensayo AxSYM Toxo IgM v2 Recuentos de tasa
Antígeno recubierto
- NC
- IC PNL6 PNL6/NC
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX1 (Ala8-12)
- 37 149 459 12,4
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX3(Ala7-12)*
- 44 111 368 8,4
- rpMBP-c2X-ToxoP30 MIX5(Ala2, Ala8-12)*
- 31 49 27 0,9
- *comparativo
Como puede observarse en las Tablas 3 y 4, el antígeno rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 modificado por ingeniería genética, que contenía cinco restos de cisteína C-terminales sustituidos con alanina, produjo la mejor inmunorreactividad a IgG e IgM contra Toxo según se midió por los mayores recuentos de tasa para el Panel 6 y las mayores proporciones de recuentos de tasa para Fcal/Acal, Panel 6/Acal y Panel 6/NC. Además, el antígeno rpMBPc2X-ToxoP30MIX1 produjo los mayores recuentos de tasa para el Panel 6 y la mayor proporción de recuento de tasa de Panel6/NC en el ensayo Toxo IgM v2 para cualquier antígeno rpMBP-c2X-ToxoP30 ensayado (véanse las Tablas 1 y 2). El antígeno rpMBP-c2X-ToxoP30MIX5 comparativo, que contenía cinco restos de cisteína C-terminales sustituidos con restos de alanina más la sustitución de la cisteína nº 2 con alanina, no era inmunorreactivo en ningún ensayo. Este resultado concuerda con los resultados obtenidos con el antígeno rpMBP-c2X-ToxoP30del4del8(83294aa) comparativo (véanse las Tablas 1 y 2), en el que la deleción de los dos primeros restos de cisteína de Toxo P30 daba como resultado una pérdida completa de inmunorreactividad. Por lo tanto, se obtuvo el resultado sorprendente de que la sustitución de varios restos de cisteína en la mitad C-terminal de Toxo P30 con alanina da como resultado una inmunorreactividad del antígeno a IgG e IgM contra Toxo superior, mientras que la sustitución de una sola cisteína con alanina en la mitad N-terminal de Toxo P30 suprime completamente la inmunorreactividad.
Ejemplo 8
Purificación y recubrimiento del antígeno rpToxoP35S
El antígeno rpToxoP35S descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 6.329.157 B1 se expresó en E. coli y se recogió un concentrado de células como se ha descrito en el Ejemplo 6A. Este antígeno se purificó después a partir del concentrado de células y se recubrió sobre micropartículas como se describe a continuación.
Etapa A: Purificación del antígeno rpToxoP35S
El antígeno rpToxoP35S se expresó en E. coli como una proteína de fusión insoluble. Después de la lisis del concentrado de células, los cuerpos de inclusión que contenían el antígeno rpToxoP35S se lavaron con agua, tampón fosfato, Triton X-100 y urea. El antígeno rpToxoP35S se solubilizó después en un tampón SDS/DTT y se aplicó a una columna Sephacryl S-300. Las fracciones de columna apropiadas se combinaron, se diluyeron a una concentración de 1 mg/ml y se filtraron a través de un filtro de 0,2 μm, y después se almacenaron a -80ºC hasta su recubrimiento.
Etapa B: Recubrimiento del antígeno rpToxoP35S sobre las micropartículas
El antígeno rpToxoP35S se descongeló y se llevó a solución por calentamiento suave seguido de centrifugación para eliminar el material particulado. Este antígeno se dializó después contra tres cambios de tampón MES, pH 6,2 a temperatura ambiente durante una noche y después se recubrió sobre micropartículas de poliestireno derivatizadas con sulfato (1-5% de sólidos) en un recipiente que contenía tampón MES pH 6,2 con EDAC durante 30 minutos a temperatura ambiente, en un agitador rotativo de tipo noria. Las micropartículas recubiertas se recogieron después por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante. Las micropartículas se resuspendieron en un tampón de almacenamiento de micropartículas que contenía tampón Tris, pH 7,5, EDTA, cloruro sódico, Tween 20, suero fetal de ternera (sin anticuerpos contra Toxo), azida sódica y sacarosa usando una jeringa y una aguja. Después, las micropartículas se diluyeron con tampón de almacenamiento de micropartículas a una concentración final de sólidos del 0,1-0,3% y se llenaron en frascos de plástico.
Ejemplo 9
Desarrollo de cócteles de antígeno que emplean los antígenos P30 modificados por ingeniería genética
En el ejemplo siguiente, todos los antígenos P30 y sus combinaciones con rpToxoP35S son comparativos con la excepción de rp-MBP-c2X-ToxoP30MIX1 y su combinación con rpToxoP35S.
Después de conseguir una mejora significativa en la inmunorreactividad del antígeno P30 a IgG e IgM contra Toxo a través de la modificación por ingeniería genética (Ejemplos 4 y 7), se realizó una reevaluación preliminar de micropartículas recubiertas con los antígenos Toxo descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 6.329.157 B1 en los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 e IgM v2. La evaluación de estas micropartículas recubiertas con antígeno junto con micropartículas recubiertas con los antígenos P30 rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2XToxoP30del4C(52-299aa) y rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 sugirió que una nueva combinación del antígeno rpMBP-c2XToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) o rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 con el antígeno rpToxoP35S podía mejorar el rendimiento del ensayo AxSYM® Toxo IgG v2. Además, los antígenos rpMBP-c2XToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa) o rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 en solitario podían mejorar el rendimiento del ensayo AxSYM® Toxo IgM v2. Para demostrar la utilidad diagnóstica de los antígenos P30 modificados por ingeniería genética y del nuevo cóctel de antígenos P30 modificado por ingeniería genética/P35, se ensayaron sueros humanos negativos para anticuerpos contra Toxo y sueros procedentes de pacientes con una toxoplasmosis aguda o crónica en los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 e IgM v2, como se describe a continuación.
Etapa A: Ensamblaje de paquetes de reactivos de AxSYM® Toxo IgG v2
Los antígenos Toxo purificados rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 y rpToxoP35S se recubrieron sobre micropartículas como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 4A y 7A. Después, las micropartículas se diluyeron hasta una concentración final de sólidos del 0,2% y se prepararon las tres mezclas de micropartículas siguientes: mezcla 2:1 v/v de micropartículas recubiertas con rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa):rpToxoP35S (marcadas como P30del3/P35); mezcla 2:1 v/v de micropartículas recubiertas con rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa):rpToxoP35S (marcadas como P30del4/P35); y una mezcla 2:1 v/v de micropartículas recubiertas con rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1:rpToxoP35S (marcadas como P30MIX1/P35). Estas tres mezclas de micropartículas se llenaron en frascos de plástico, se ensamblaron en kits de reactivos de AxSYM® Toxo IgG v2 individuales como se ha descrito en el Ejemplo 4B, y se marcaron como P30del3C/35, P30del4C/P35 y P30MIX1/P35.
Etapa B: Ensamblaje de paquetes de reactivos de AxSYM® Toxo IgM v2
Los antígenos Toxo purificados rpMBP-c2X-ToxoP30del3C(52-300aa), rpMBP-c2X-ToxoP30del4C(52-294aa), rpMBP-c2X-ToxoP30MIX1 y rpToxoP35S se recubrieron sobre micropartículas como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 4A y 7A. Después, las micropartículas se diluyeron hasta una concentración final de sólidos del 0,2% y se llenaron en frascos de plástico. Se ensamblaron kits de AxSYM® Toxo IgM v2 con cada micropartícula recubierta como se ha descrito en el Ejemplo 4C, y se marcaron como P30del3C, P30del4C y P30MIX1.
Etapa C: Sueros humanos para ensayo
Se ensayaron tres grupos de sueros humanos de una población francesa en esta evaluación: Grupo 1 (n = 100) sueros humanos negativos para anticuerpos IgG e IgM contra Toxo mediante los ensayos Abbott IMx® Toxo IgG e IgM, respectivamente (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL); Grupo 2 (n = 56) sueros humanos positivos para IgG contra Toxo y negativos para anticuerpos IgM contra Toxo mediante los ensayos Abbott IMx® Toxo IgG e IgM, respectivamente; Grupo 3 (n = 52) sueros humanos positivos para anticuerpos IgG contra Toxo mediante un ensayo de aglutinación directa de alta sensibilidad (HSDA) (Desmonts, G. y Remington, J. S. (1980) J. Clin. Microbiol. 11: 562-568) y positivos para anticuerpos IgM contra Toxo mediante un ensayo de inmunocaptura de IgM (IC-M) (Pouletty et al. (1985) J. Immunol. Methods 76: 289-298). Los calibradores de ensayo y los controles para los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 y Toxo IgM v2 se procesaron como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 4B
D. Los ensayos Abbott AxSYM® Toxo IgG e IgM (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que usan el antígeno de taquizoíto para la detección de IgG e IgM específicas de Toxo, se incluyeron como ensayos de referencia durante el ensayo de especímenes.
5
10
15
20
25
30
Etapa D: Evaluación de los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2
Todos los especímenes en los Grupos 1-3 se ensayaron mediante los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 (P30del3C/35, P30del4C/P35 y P30MIX1/P35) y mediante el ensayo AxSYM® Toxo IgG. El mismo límite de ensayo de 3 UI/ml para el ensayo AxSYM Toxo IgG se empleó para los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2, con una zona equívoca de 2-3 UI/ml. El rendimiento de los ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 basados en antígeno recombinante se comparó con el ensayo AxSYM® Toxo IgG basado en antígeno de taquizoíto y se muestra en las Tabla 5-7.
TABLA 5
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgG v2 P30del3C/P35
AxSYM® Toxo IgG
AxSYM® Toxo POS EQV NEG TOTAL
lgG v2 POS 1080 0 108
P30del3C/P35 EQV 001 1
NEG 0 099 99
TOTAL 108 0 100 208
Sensibilidad: 108/108 = 100% Especificidad: 99/99 = 100% Concordancia: 207/207 = 100% Coeficiente de correlación: r = 0,9751
TABLA 6
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgG v2 P30del4C/P35
AxSYM® Toxo IgG
AxSYM® Toxo POS EQV NEG TOTAL
lgG v2 POS 1080 0 108
P30del4C/P35 EQV 001 1
NEG 0 099 99
TOTAL 108 0 100 208
Sensibilidad: 108/108 = 100% Especificidad: 99/99 = 100% Concordancia: 207/207 = 100% Coeficiente de correlación: r = 0,9778
TABLA 7
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgG v2 P30MIX1/P35
AxSYM® Toxo IgG
AxSYM® Toxo POS EQV NEG TOTAL
lgG v2 POS 1080 0 108
P30MIX1/P35 EQV 001 1
NEG 0 099 99
TOTAL 108 0 100 208
Sensibilidad: 108/108 = 100% Especificidad: 99/99 = 100% Concordancia: 207/207 = 100% Coeficiente de correlación: r = 0,9563
Como puede observarse a partir de las Tablas 5-7, el ensayo AxSYM® Toxo IgG v2 usando la combinación de un antígeno P30 modificado por ingeniería genética (P30del3C, P30del4C o P30MIX1) con el antígeno P35 es un ensayo tanto sensible como específico para la detección de IgG específica de Toxoplasma, según se demostró por la sensibilidad (100%), especificidad (100%) y concordancia (100%) de diagnóstico globales relativas elevadas. Los tres ensayos AxSYM® Toxo IgG v2 tenían una concordancia excelente cuantitativamente con el ensayo AxSYM® Toxo IgG, según se midió por los coeficientes de correlación, siendo todos de 0,95 o mayores. El cóctel de antígeno recombinante Toxo compuesto por el antígeno Toxo P30 modificado por ingeniería genética (P30del3C, P30del4C o P30MIX1) y el antígeno P35, en combinación con el ensayo AxSYM® Toxo IgG v2, es tanto necesario como suficiente para sustituir al taquizoíto para la detección de anticuerpo IgG específico de Toxoplasma.
5 Además, existen varias ventajas del cóctel de antígeno recombinante sobre el antígeno de taquizoíto para su uso en la detección de anticuerpos IgG. En primer lugar, los antígenos están purificados y la cantidad de cada antígeno cargada en el inmunoensayo puede determinarse con precisión y normalizarse, por ejemplo, la concentración de proteína. Esto minimiza las diferencias entre lotes observadas comúnmente en kits fabricados con diferentes lotes
10 de antígenos de taquizoítos. Por lo tanto, diferentes lotes de kits fabricados con diferentes lotes de cócteles de antígenos serán muy uniformes de un lote a otro. En segundo lugar, se usan anticuerpos monoclonales de ratón o humano contra los antígenos Toxo recombinantes individuales para controlar el recubrimiento de las proteínas en la fase sólida. Esto asegura adicionalmente que cada lote producido sea uniforme. En tercer lugar, la verdadera sensibilidad clínica del ensayo que usa los antígenos purificados será superior en virtud del hecho de la mayor
15 actividad específica de los antígenos purificados. Por último, los kits fabricados con el cóctel de antígenos son más estables durante el almacenamiento con el tiempo, y el rendimiento del ensayo usando estos antígenos permanece uniforme durante la vida útil del ensayo. Los kits fabricados con el antígeno de taquizoíto no son tan estables y su rendimiento puede variar con el tiempo.
20 Además, existen muchas ventajas del uso de un cóctel sobre el uso de un único antígeno en solitario. Por ejemplo, la respuesta inmune contra una infección varía por individuo. Algunos individuos producen anticuerpos contra P35 y no contra P30 de forma temprana en la infección (toxoplasmosis aguda), mientras que algunos individuos producen anticuerpos contra P30 y no contra P35 posteriormente en la infección (toxoplasmosis crónica). Por lo tanto, el cóctel de antígenos de la presente invención detectará ambos grupos de individuos.
25 Además, las respuestas inmunes varían con el tiempo. Por ejemplo, un individuo puede producir anticuerpos contra P35 primero y después producir posteriormente anticuerpos contra P30 solamente. Por lo tanto, el presente cóctel detectará ambos tipos de individuos “positivos”.
30 Además, los individuos pueden infectarse con diferentes serotipos, cepas o aislados de Toxo. Por lo tanto, la respuesta inmune puede ser tal que sean necesarios múltiples antígenos para detectar la presencia de todos los anticuerpos que se están produciendo. De nuevo, el presente cóctel permite dicha detección.
Además, se sabe a partir de experimentos previos de transferencia de Western con proteínas de taquizoíto que la
35 repuesta inmune contra Toxoplasma se dirige contra varios antígenos. De nuevo, el presente cóctel de antígenos permitirá la detección de todos los anticuerpos producidos en respuesta a estos antígenos.
Etapa E: Evaluación de los ensayos AxSYM® Toxo IgM v2
40 Todos los especímenes en los Grupos 1-3 se ensayaron mediante los ensayos AxSYM® Toxo IgM v2 (P30del3C, P30del4C y P30MIX1) y mediante el ensayo AxSYM® Toxo IgM. Se usó una característica de operador receptor (ROC) para contribuir a la determinación del límite preliminar para los ensayos AxSYM® Toxo IgM v2 (valor de índice ≥ 0,6) (Zweig, HM (1993) Clin. Chem. 39: 561-577). Además, se introdujo una zona equívoca de valor de índice de 0,500-0,599 para representar la imprecisión del ensayo. El rendimiento de los ensayos AxSYM® Toxo IgM
45 v2 basados en antígeno recombinante se comparó con el ensayo AxSYM® Toxo IgM basado en antígeno de taquizoíto, y se muestra en las Tablas 8-10. TABLA 8
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgM v2 P30del3C
AxSYM® Toxo IgM
AxSYM® Toxo
POS EQV NEG TOTAL
lgM v2 POS 332 7 42
P30del3C EQV
5 13 9
NEG
0 2 155 157
TOTAL 38 5 165 208
Sensibilidad: 33/33 = 100%
50 Especificidad: 155/162 = 95,7% Concordancia: 188/195 = 96,4%
5
10
15
20
25
30
35 TABLA 9
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgM v2 P30del4C
AxSYM® Toxo IgM
AxSYM® Toxo POS EQV NEG TOTAL
lgM v2 POS 342 9 45
P30del4C EQV 422 8
NEG 0 1 154 155
TOTAL 38 5 165 208
Sensibilidad: 34/34 = 100%
Especificidad: 154/163 = 94,5%
Concordancia: 188/197 = 95,4%
TABLA 10
Evaluación del ensayo AxSYM® Toxo IgM v2 P30MIX1
AxSYM® Toxo IgM
AxSYM® Toxo POS EQV NEG TOTAL
lgM v2 POS 352 8 45
P30MIX1 EQV 203 5
NEG 1 3 154 158
TOTAL 38 5 165 208
Sensibilidad: 35/36 = 97,2%
Especificidad: 154/162 = 95,1%
Concordancia: 189/198 = 95,5%
Como puede observarse a partir de las Tablas 8-10, el ensayo AxSYM® Toxo IgM v2 usando el antígeno P30 modificado por ingeniería genética (P30del3C, P30del4C o P30MIX1) es un ensayo tanto sensible como específico para la detección de IgG específica de Toxoplasma, según se demostró por la sensibilidad (intervalo = 97,2%100%), especificidad (intervalo de 94,5%-95,7%) y concordancia (intervalo = 95,4%-96,4%) de diagnóstico globales relativas elevadas. El antígeno P30 recombinante Toxo modificado por ingeniería genética (P30del3C, P30del4C o P30MIX1), en combinación con el ensayo AxSYM® Toxo IgM v2, es tanto necesario como suficiente para sustituir al taquizoíto para la detección de anticuerpo IgM específico de Toxoplasma.
Además, existen varias ventajas del antígeno Toxo P30 recombinante modificado por ingeniería genética sobre el antígeno de taquizoíto para su uso en la detección de anticuerpos IgM. En primer lugar, el antígeno está purificado, y la cantidad de antígeno cargada en el inmunoensayo puede determinarse con precisión y normalizarse, por ejemplo, la concentración de proteína. Esto minimiza las diferencias entre lotes comúnmente observadas en kits fabricados con diferentes lotes de antígeno de taquizoíto. Por lo tanto, diferentes lotes de kits fabricados con diferentes lotes de antígeno recombinante serán muy uniformes de un lote a otro. En segundo lugar, se usan anticuerpos monoclonales de ratón o humano contra el antígeno Toxo recombinante para controlar el recubrimiento de las proteínas en la fase sólida. Esto asegura adicionalmente que cada lote producido sea uniforme. En tercer lugar, la verdadera sensibilidad clínica del ensayo usando los antígenos purificados será mayor en virtud del hecho de la mayor actividad específica del antígeno purificado. Por último, los kits fabricados con el antígeno recombinante son más estables durante el almacenamiento con el tiempo, y el rendimiento del ensayo usando este antígeno permanece uniforme durante la vida útil del ensayo. Los kits fabricados con el antígeno de taquizoíto no son tan estables y su rendimiento puede variar con el tiempo.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Abbott Laboratories Maine, Gregory T. Patel, Chandu B. Ginsburg, Sanford R. Bliese, Timothy R.
<120> ANTÍGENO P30 MODIFICADO POR INGENIERÍA GENÉTICA, CÓCTEL DE ANTÍGENO MEJORADO Y USOS DE LOS MISMOS
<130> 6984WOO1
<140> No recibido todavía
<141> 02-10-2003
<150> 10/263.153
<151> 02-10-2002
<160> 74
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador con sentido
<400> 1 ggcgaattcc ttgttgccaa tcaagttgtc ace 33
<210> 2
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido
<400> 2 cgctgaagct ttcacgcgac acaagctgcg a 31
<210> 3
<211> 7478
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1528)...(3555)
<223> pMBP-c2X-ToxoP30 (52-336aa)
<400> 3
<210> 4
<211> 676
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30 (52-336aa)
<400> 4
<210> 5
<211> 855
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(855)
<223> ToxoP30 (52-336aa) 10 <400> 5
<210> 6
<211> 285
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30 (52-336aa)
<400> 6
10 <210> 7
<211> 7553
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220> 15 <221> CDS
<222> (1528)...(3630)
<223> pMBP-p2X-ToxoP30 (52-336aa)
<400> 7
<210> 8
<211> 701
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-p2X-ToxoP30 (52-336aa)
<400> 8
- <210> 9
- <211> 39
- <212> ADN
- 5
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador antisentido
- <400> 9
- 10
- caggtcaagc tttcacacca tggcaaaaat ggaaacgtg <210> 10 39
- <211> 7442
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- 15
- <221> CDS
- <222> (1528)...(3519)
- <223> pMBP-c2X-ToxoP30del1C (52-324aa)
- <400> 10
<210> 11
<211> 664
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del1C (52-324aa)
<400> 11
<210> 12
<211> 819
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(819)
<223> ToxoP30del1 C (52-324aa) 10 <400> 12
<210> 13
<211> 273
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del1 C (52-324aa)
<400> 13
- <210> 14
- <211> 41
- <212> ADN
- 5
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador antisentido
- <400> 14
- 10
- caggtcaagc tttcaagccg attttgctga ccctgcagcc c <210> 15 41
- <211> 7403
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- 15
- <221> CDS
- <222> (1528)...(3480)
- <223> pN3BP-c2X-ToxoP30del2 (52-311aa)
- <400> 15
<210> 16
<211> 651
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del2 (52-311aa)
<400> 16 <210> 17
<211> 780
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(780)
<223> ToxoP30del2 (52-311aa) 10 <400> 17
<210> 18
<211> 260
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del2 (52-311 aa)
<400> 18
- <210> 19
- <211> 36
- <212> ADN
- 5
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador antisentido
- <400> 19
- 10
- caggtcaagc tttcactcca gtttcacggt acagtg <210> 20 36
- <211> 7370
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- 15
- <221> CDS
- <222> (1528)...(3447)
- <223> pMBP-c2X-Toxo30del3C (52-300aa)
- <400> 20
<210> 21
<211> 640
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-Toxo30del3C (52-300aa)
<400> 21 <210> 22
<211> 747
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(747)
<223> Toxo30del3C (52-300aa) 10 <400> 22
<210> 23
<211> 249
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> Toxo30del3C (52-300aa)
<400> 23
- <210> 24
- <211> 38
- <212> ADN
- 5
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador antisentido
- <400> 24
- 10
- caggtcaagc tttcagtgat gcttctcagg cgatcccc <210> 25 38
- <211> 7352
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- 15
- <221> CDS
- <222> (1528)...(3429)
- <223> pMBP-c2X-ToxoP30del4C (52-294aa)
- <400> 25
<210> 26
<211> 634
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del4C (52-294aa)
<400> 26 <210> 27
<211> 729
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(729)
<223> ToxoP30del4C (52-294aa) 10 <400> 27
<210> 28
<211> 243
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del4C (52-294aa)
<400> 28
<210> 29
<211> 30
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador con sentido
<400> 29
ggcgaattcc ctaaaacagc gctcacagag 30 10 <210> 30
<211> 7259
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220> 15 <221> CDS
<222> (1528)...(3336)
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del4del8 (83-294aa)
<400> 30
<210> 31
<211> 603
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del4del8 (83-294aa)
88
<400> 31
<210> 32
<211> 636
<212> ADN 5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(636)
<223> ToxoP30del4del8 (83-294aa) 10 <400> 32
<210> 33
<211> 212
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del4del8 (83-294aa)
<400> 33
- <210> 34
- <211> 39
- <212> ADN
- 5
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- <223> Cebador antisentido
- <400> 34
- 10
- caggtcaagc tttcatccaa taatgacgct ttttgactc <210> 35 39
- <211> 7322
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- 15
- <221> CDS
- <222> (1528)...(3399)
- <223> pMBP-c2X-ToxoP30del10 (52-284aa)
- <400> 35
<210> 36
<211> 624
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del10 (52-284aa)
<400> 36
<210> 37
<211> 699
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(699)
<223> ToxoP30del10 (52-284aa)
<400> 37
<210> 38
<211> 233
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del10 (52-284aa)
<400> 38
- 10
- <210> 39
- <211> 36
- <212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220>
- 15
- <223> Cebador antisentido
- <400> 39
- caggtcaagc tttcacacga gggtcattgt agtggg
- 36
- <210> 40
- <211> 7112
- 20
- <212> ADN
- <213> Toxoplasma gondii
- <220>
- <221> CDS
- 25
- <222> (1528)...(3189) <223> pMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa)
- <400> 40
<210> 41
<211> 554
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30del11 (52-214aa)
<400> 41 <210> 42
<211> 489
<212> ADN
5 <213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(489)
<223> ToxoP30del11 (52-214aa) 10 <400> 42
<210> 43
<211> 163
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30del11 (52-214aa)
<400> 43
<210> 44
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.001
<400> 44
10 <210> 45
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cebador P30.002
<400> 45
<211> 67 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.003
<400> 46
25
<210> 47
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 30 <220>
<223> Cebador P30.004
<400> 47
<210> 48
<211> 73
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.005
<400> 48
<210> 49
<211> 72
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.006
<400> 49
<210> 50
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.007
<400> 50
<210> 51
<211> 71
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.0038
<400> 51
<210> 52
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.009
<400> 52
<210> 53
<211> 71
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.010Ala8
<400> 53
<210> 54
<211> 71
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.011Ala8Ala9
<400> 54 <210> 55
<211> 71
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.012Ala9Ala10
<400> 55
<210> 56
<211> 71
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.013
<400> 56
<210> 57
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.014
<400> 57
<210> 58
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.015Ala11Ala12
<400> 58
<210> 59
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador P30.016Ala12
<400> 59
<210> 60
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador antisentido
<400> 60 caggtcaagc tttcactcca gtttcacggt agcgtg 36
<210> 61
<211> 7370
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1528)...(3447)
<223> pMBP-c2X-ToxoP30MIX1
<400> 61
<210> 63
<211> 747
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220> <221> CDS
<222> (1)...(747)
<223> ToxoP30MIX1
<400> 63
<210> 64
<211> 249
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30MIX1
<400> 64
10 <210> 65
<211> 70
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cebador P30.009Ala7
<400> 65
<210> 66
<211> 7370 20 <212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1528)...(3447)
<223> pMBP-c2X-ToxoP30MIX3
<400> 66
<210> 67
<211> 640
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30MIX3
<400> 67
<210> 68
<211> 747
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(747)
<223> ToxoP30MIX3
<400> 68
<210> 69
<211> 249
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30MIX3
<400> 69
10 <210> 70
<211> 69
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Cebador P30.002Ala2
<400> 70
<210> 71
<211> 7370 20 <212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (1528)...(3447)
<223> pMBP-c2X-ToxoP30MIX5
<400> 71
<210> 72
<211> 640
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> pMBP-c2X-ToxoP30MIX5
<400> 72
<210> 73
<211> 747
<212> ADN
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (11)...(747)
<223> ToxoP30MIX5 <400> 73
<210> 74
<211> 249
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<223> ToxoP30MIX5
<400> 74
Claims (26)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
-
- 2.
- Una secuencia de nucleótidos aislada que comprende, o es complementaria a, la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.
-
- 3.
- Un plásmido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 61.
-
- 4.
- Una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
-
- 5.
- La composición de la reivindicación 4, que comprende además P35 de Toxoplasma gondii.
-
- 6.
- La composición de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha composición es un reactivo de diagnóstico.
-
- 7.
- La composición de la reivindicación 4, en la que dicho polipéptido se produce por medios recombinantes o sintéticos.
-
- 8.
- Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; yb) detectar la presencia de complejos de polipéptido/anticuerpo IgM, en el que la presencia de dichos complejos indica la presencia de dichos anticuerpos IgM en dicha muestra de ensayo. - 9. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con una composición que comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM;b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; yc) detectar la presencia de anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 10. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35; yb) detectar la presencia de complejos de antígeno/anticuerpo IgG, indicando la presencia de dichos complejos la presencia de dichos anticuerpos IgG en dicha muestra de ensayo.
- 11. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgG;b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y c) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 12. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM;b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; yc) detectar los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 13. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgG con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG;b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; yc) detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de la presencia de una señal generada por cada uno de dichos compuestos generadores de señal.
- 14. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgM;
- (b)
- añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una al anticuerpo IgM unido, comprendiendo dicho antígeno un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y
- (c)
- añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgM/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y
- (d)
- detectar los anticuerpos IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 15. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgG con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgG;
- (b)
- añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgG resultantes durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una al anticuerpo IgG unido, comprendiendo dicho antígeno una mezcla de 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35;
- (c)
- añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y
- (d)
- detectar los anticuerpos IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 16. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM e IgG con una composición que comprende 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35, durante un tiempo y en condiciones suficientes para la formación de complejos de antígeno/anticuerpo IgM y complejos de antígeno/anticuerpo IgG;b) añadir un conjugado a los complejos de antígeno/anticuerpo IgM y a los complejos de antígeno/anticuerpo IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo IgM e IgG unido, en el que dicho conjugado comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; yc) detectar la presencia de anticuerpos IgG e IgM que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 17. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:a) poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener dichos anticuerpos IgM e IgG con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM y dichos anticuerpos IgG durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM y complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgG;b) añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/anticuerpo IgM resultantes y a los complejos de antianticuerpo/anticuerpo IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho conjugado se una al anticuerpo unido, en el que dicho conjugado comprende una composición que comprende 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; yc) detectar los anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 18. Un método para detectar la presencia de anticuerpos IgM e IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto dicha muestra de ensayo sospechosa de contener anticuerpos IgM e IgG con un antianticuerpo específico para dichos anticuerpos IgM y con un anti-anticuerpo específico para dichos anticuerpos IgG, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la formación de complejos de anti-anticuerpo IgM y complejos de anti-anticuerpo/IgG;
- (b)
- añadir un antígeno a los complejos de anti-anticuerpo/IgM resultantes y a los complejos de antianticuerpo/IgG resultantes, durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho antígeno se una a un anticuerpo IgM unido, comprendiendo dicho antígeno: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) P35; y
- (c)
- añadir un conjugado a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno y a los complejos de anti-anticuerpo/IgG/antígeno resultantes, comprendiendo dicho conjugado una composición que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable; y
- (d)
- detectar los anticuerpos IgM e IgG que puedan estar presentes en dicha muestra de ensayo por detección de una señal generada por dicho compuesto generador de señal.
- 19. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; yb) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
- 20. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62; y 2) p35; yb) un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
- 21. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; yb) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62.
- 22. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgM contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgM; yb) un conjugado que comprende: 1) una composición que comprende un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, unido a 2) un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
- 23. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG; yb) una composición que comprende: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35.
- 24. Un kit para determinar la presencia de anticuerpos IgG contra Toxoplasma gondii en una muestra de ensayo, que comprende:a) un anti-anticuerpo específico para anticuerpo IgG; yb) un conjugado que comprende: 1) un polipéptido, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62 y 2) P35, cada uno unido a un compuesto generador de señal capaz de generar una señal detectable.
-
- 25.
- Una vacuna que comprende:
a) al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62, y 2) P35; y b) un adyuvante farmacéuticamente aceptable. -
- 26.
- Un método de producción de anticuerpos monoclonales contra el polipéptido en la SEC ID Nº: 62, que comprende las etapas de:
a) inyectar a un mamífero no humano un polipéptido, en el que dicho polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 62;b) fusionar esplenocitos de dicho mamífero no humano con células de mieloma para generar hibridomas; yc) cultivar dichos hibridomas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que dichos hibridomas produzcan dichos anticuerpos monoclonales.
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