ES2365962A1 - Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico. - Google Patents
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Abstract
Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico. La presente invención describe plantas transgénicas que han sido transformadas con un vector de expresión que codifica para el factor de transcripción CDF3. Las plantas transgénicas de la invención presentan una mayor tolerancia y/o resistencia a diferentes tipos de estrés abiótico, simultáneamente, como por ejemplo exceso de salinidad, temperaturas extremas, sequía, etc. Además, la presente invención describe el procedimiento de obtención de las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3. La sobreexpresión del gen CDF3 en plantas transgénicas es muy útil para su utilización en la transformación de plantas de interés agronómico, mejorando así la tolerancia de los cultivos de las mismas frente a condiciones ambientales adversas.
Description
Plantas transgénicas que presentan mayor
tolerancia a estrés abiótico.
La presente invención puede englobarse dentro
del campo de la ingeniería genética y de la fisiología vegetal. Se
refiere al desarrollo de nuevas herramientas genéticas para la
mejora de plantas de interés agronómico frente a condiciones
ambientales adversas que limitan su rendimiento. De forma más
concreta esta invención se fundamenta en la utilización del factor
de transcripción, CDF3, para generar plantas transgénicas que
presenten mayor tolerancia simultánea a diferentes tipos de estrés
abiótico.
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Las plantas durante su desarrollo tienen que
enfrentarse a condiciones ambientales adversas que afectan
negativamente tanto a su crecimiento como a su productividad, y que
provocan cambios muy importantes en diferentes aspectos de las
plantas: fisiológicos, morfológicos, bioquímicos y moleculares. En
términos generales, los tipos de estrés abiótico más comunes, a los
que se enfrentan las plantas son, las temperaturas extremas, la
sequía y los suelos salinos. De hecho se estima que, a nivel global,
el 22% de la tierra cultivable presenta problemas de salinidad (FAO
2004) y además en la actualidad se está observando que las áreas
afectadas por la sequía y las temperaturas extremas se están
expandiendo de una forma rápida y se presume que seguirán creciendo
debido en parte a los efectos del cambio climático (Burke et
al 2006). Por otro lado, el impacto de los distintos tipos de
estrés abiótico sobre los cultivos de interés agronómico es muy
complejo porque, a menudo, ocurren de forma simultánea varios tipos
de estrés y usualmente afectan a todos los estados de desarrollo de
la planta. De forma general, además, los mecanismos de resistencia
de las plantas a los diferentes tipos de estrés abiótico, dependen
de caracteres poligénicos (Fernández-Muñoz, 2005,
Tuberosa and Salvi, 2006), lo que implica, a su vez, también una
mayor complejidad a la hora de comprender los mecanismos genéticos
ligados a la respuesta a dicho estrés.
Cuando una planta es sometida a un estrés de
tipo abiótico, se ha observado que una gran cantidad de genes
cambian sus niveles de expresión, lo que provoca, de forma general,
cambios en los niveles de proteínas y metabolitos, muchos de los
cuales tienen una función protectora frente al estrés (Fernie et
al 2006; Vij and Tyagi, 2007). Estos genes se pueden catalogar,
de forma general, en dos grupos: 1) genes que codifican para
proteínas que están implicadas en el desarrollo de la tolerancia y
2) genes que codifican proteínas con función reguladora. Entre los
primeros cabría destacar genes implicados en la biosíntesis de
chaperonas y osmolitos compatibles y en la producción de compuestos
con función protectora. Entre los genes que codifican proteínas de
función reguladora destacan, por su abundancia y variedad, los
factores de transcripción, que tienen la capacidad de controlar a
grupos más o menos grandes de genes implicados directamente en la
respuesta al estrés, o de actuar en la biosíntesis de moléculas
reguladoras como la fitohormona ácido abscísico (ABA).
Los distintos programas para la mejora de la
tolerancia de plantas de interés agronómico a diferentes tipos de
estrés abióticos han tenido un éxito reducido. Esto se debe a que la
tolerancia a condiciones adversas está basada en caracteres
complejos, con herencia poligénica,
(Fernández-Muñoz, 2005). Los intentos iniciales para
desarrollar plantas de interés agronómico más tolerantes a las
condiciones ambientales adversas mediante una estrategia basada en
la "transformación genética", utilizaron un procedimiento que
se basa en la utilización de genes de función protectora de
"acción única", como por ejemplo genes responsables de la
modificación de un metabolito que confiere resistencia a la sal o la
sequía. Sin embargo, esta estrategia se está abandonado, debido a
que, como numerosos programas de mejora e investigación han
demostrado, la respuesta al estrés abiótico es compleja y en general
involucra la acción de muchos genes al mismo tiempo (es de carácter
poligénico) y que por tanto, la utilización de solo uno de ellos
tiene un efecto menor (Fernández-Muñoz, 2005,
Tuberosa and Salvi, 2006).
Una solución que se ha desarrollado
recientemente para obtener plantas más tolerantes a las condiciones
ambientales adversas, ha sido utilizar, para los programas de mejora
de plantas, genes que codifiquen para proteínas con función
reguladora (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2005;
Chinnusamy et al 2005). La utilización de este tipo de genes
tiene como principal ventaja el poder regular simultáneamente la
acción de muchos otros genes implicados en la resistencia al estrés
y, por tanto, conseguir una eficacia mayor en el desarrollo de la
tolerancia. Diferentes tipos de análisis de expresión han permitido
identificar numerosos tipos de factores de transcripción cuyos
niveles de expresión cambian en respuesta a diferentes tipos de
estrés abiótico (Riechman et al 2000; Chen et al
2002). La mayoría de ellos pertenecen a grandes familias de factores
de transcripción de plantas como son el tipo bZIP, AP2/ERF, MYC,
NAC, HSF, WRKY y DOF (Qu and Zhu, 2006; Shinozaki and
Yamaguchi-Shinozaki 2006), lo que sugiere que
participan distintos mecanismos de regulación transcripcional de la
respuesta al estrés mediado por la salinidad, la deshidratación y
las temperaturas extremas. En este sentido, las patentes americanas
US2008/0229448 y US2008/0163397 divulgan plantas transgénicas
transformadas con diferentes vectores de expresión que comprenden
secuencias de polinucleótidos recombinantes que codifican para un
factor de transcripción mutado de tipo AP2 y para diferentes
factores de transcripción que se unen a regiones CCAA,
respectivamente. Las plantas transgénicas descritas en ambas
patentes americanas muestran una mayor tolerancia a diferentes tipos
de estrés de tipo abiótico (baja concentración de nitrógeno en el
medio, sequía, desecación, salinidad, congelación y temperaturas
altas y bajas) que las plantas silvestres no transformadas.
En Arabidopsis, se han identificado 36 factores
transcripcionales del tipo "DNA-Binding with One
Finger" (DOF). Éstos se han dividido en cuatro grupos
(A-D) en función de su homología de secuencia
(Riechmann y col., 2000; Lijavetzky y col., 2003). Distintos
análisis de secuencia han puesto de manifiesto que dentro del grupo
D se incluyen los denominados "Cycling Dof Factors" (CDF),
llamados así porque su expresión oscila con el ritmo circadiano.
Hasta el momento, la función conocida de los CDF ha sido su
implicación en los procesos de floración dependientes del
fotoperiodo, a través de la represión del factor de transcripción
CONSTANS (CO), que promueve la floración cuando los días se hacen
más largos (Imaizumi y col, 2005; Fornara y col., 2009). Por otro
lado, se han descrito en otras plantas genes que codifican para
ciertos factores de transcripción pertenecientes a la familia DOF
cuyos niveles de expresión aumentan en respuesta a diferentes tipos
de estrés abiótico (factores de transcripción tipo DOF en plantas de
trigo, taDof14, taDof15 y taDof1), sin embargo hasta la fecha, no se
ha probado su relación funcional con la adaptación a dichas
condiciones ambientales adversas (Sawh LM y col.; 2009, Yanagisawa
S.; 2002).
En la presente invención se ha descubierto que
la sobreexpresión en plantas del gen CDF3 de Arabidopsis
thaliana, que codifica para un factor de transcripción del tipo
DOF, hace que dichas plantas presenten una mayor tolerancia a
distintas condiciones ambientales adversas simultáneamente, tales
como una mayor tolerancia a la deshidratación, al exceso de sales en
el medio y a temperaturas extremas (frío y calor). Por lo tanto,
estos resultados demuestran que el factor de transcripción de tipo
DOF, CDF3, puede utilizarse como una nueva herramienta para
la mejora de la tolerancia a diversos tipos de estrés a la vez. Así
la presente invención describe plantas transgénicas que
sobreexpresan el gen CDF3 de A. thaliana y que
presentan una mejora de la tolerancia a diversos tipos de estrés
abiótico simultáneamente. Las plantas transgénicas pueden ser de
cualquier género y especie, preferentemente que tengan interés
agronómico, tales como maíz, arroz, tomate, patata, etc.
Además, en la presente invención también se
describe el procedimiento para la obtención de las plantas
transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 de A. thaliana, y
que presentan esa mejora en la tolerancia simultánea al estrés, que
las plantas control no transformadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe plantas
transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 (Nº Acceso
GenBank:
AT3G47500.1) de A. thaliana (SEQ ID NO:4), de aquí en adelante las llamaremos plantas transgénicas de la invención, al ser transformadas con el vector de expresión CECT 7674 portador de dicha secuencia génica. El análisis detallado de la expresión del factor de transcripción CDF3 en plantas de Arabidopsis no transformadas con el vector de la invención (WT), indica que sus niveles aumentan de forma destacable en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico, tales como, la sequía, la salinidad o las temperaturas extremas (frío y calor), así como a tratamientos con la fitohormona ácido abscísico (ABA), poniendo de manifiesto que el factor de transcripción CDF3 presenta funciones relacionadas con la tolerancia a dichos tipos de estrés (Figura 1). El análisis fenotípico de las plantas transgénicas de la invención indica que son más resistentes que las plantas control no transformadas, tanto a condiciones de deshidratación, como a condiciones extremas de temperaturas de congelación.
AT3G47500.1) de A. thaliana (SEQ ID NO:4), de aquí en adelante las llamaremos plantas transgénicas de la invención, al ser transformadas con el vector de expresión CECT 7674 portador de dicha secuencia génica. El análisis detallado de la expresión del factor de transcripción CDF3 en plantas de Arabidopsis no transformadas con el vector de la invención (WT), indica que sus niveles aumentan de forma destacable en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico, tales como, la sequía, la salinidad o las temperaturas extremas (frío y calor), así como a tratamientos con la fitohormona ácido abscísico (ABA), poniendo de manifiesto que el factor de transcripción CDF3 presenta funciones relacionadas con la tolerancia a dichos tipos de estrés (Figura 1). El análisis fenotípico de las plantas transgénicas de la invención indica que son más resistentes que las plantas control no transformadas, tanto a condiciones de deshidratación, como a condiciones extremas de temperaturas de congelación.
Además la presente invención describe el
procedimiento para la obtención de dichas plantas transgénicas que
sobreexpresan el gen CDF3 (AT3G47500) de A. thaliana
(SEQ ID NO: 4) al ser transformadas con el vector de expresión CECT
7674, que codifica para dicho factor de transcripción, y que
presentan una mayor tolerancia simultánea a diferentes tipos de
estrés abiótico. Cabe destacar que también entra dentro del alcance
de la presente invención, cualquier secuencia génica ortóloga del
gen CDF3 de A. thaliana, entendiéndose por secuencia
génica ortóloga, aquella/s que son semejantes en distintas especies
que tienen un antepasado común.
A efectos de la presente invención se hacen
constar los siguientes términos:
- \bullet
- Tolerancia: es la capacidad de un individuo, en la presente invención, plantas, para soportar el estrés abiótico sin apenas consecuencias para su correcto funcionamiento fisiológico (crecimiento, apariencia y rendimiento).
- \bullet
- CDF3: gen que codifica para un factor de transcripción de la familia DOF. En la presente invención se utiliza el gen CDF3 (No de Acceso al GenBank: AT3G47500.1) de A. thaliana. Incluye: secuencias génicas que se produzcan por degeneración del código genético; secuencias capaces de hibridar, bajo "stringent conditions" con la secuencia de la invención, pueden ser, por ejemplo, las variantes de dicha secuencia, incluidas las variantes alélicas o empalme; secuencias que codifican genes ortólogos o genes parálogos del gen de la invención, secuencias génicas con al menos un 70% de identidad en homología con la secuencia génica de CDF3 y que lleven a cabo idéntica función; métodos de hibridación de ácidos nucleicos se den a conocer en detalle en Kashima et al. (1985) y en Haymes et al. (1985) Numerosas variaciones conocidas para un experto medio en la materia, son posibles en las condiciones y los medios por los cuales la hibridación de ácidos nucleicos puede realizarse para aislar secuencias de polinucleótidos relacionados con similitud con secuencias conocidas en el estado de la técnica y no se limitan a mencionadas aquí.
\newpage
- \bullet
- Stringent conditions: a los efectos de la presente invención, se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de las cadenas de ADN cuyas secuencias son altamente complementarias.
- \bullet
- Genes Parálogos: a los efectos de la presente invención se refiere a genes estructuralmente relacionadas dentro de una única especie, que se derivan de un evento de duplicación.
- \bullet
- Genes Ortólogos: a efectos de la presente invención se refiere a genes estructuralmente relacionados, pero que provienen de especies diferentes y que se derivan de un evento de especiación.
- \bullet
- Homología de secuencia: a los efectos de la presente invención, se entiende como secuencias de bases que den lugar a cambios conservativos de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Análisis de expresión de CDF3
en respuesta a diferentes tipos de estrés abiótico. Análisis de
expresión mediante experimentos tipo Northern. Plantas control no
transformadas de Arabidopsis thaliana de 3 semanas crecidas
en condiciones de fotoperiodo 16:8 (16 horas de luz y 6 de
oscuridad), a 20ºC (C). Posteriormente, dichas plantas fueron
sometidas a diferentes tipos de tratamiento: 4ºC durante 24 h (4ºC),
38ºC durante 5 h (38ºC), tratamiento con 100 \muM de ABA, 5 h
(ABA), deshidratadas hasta una pérdida del 50% peso fresco (DH), y
regadas con 250 mM NaCl durante 24 h (NaCl). Se han utilizado sondas
específicas para el gen CDF3 (SEQ ID NO:3) y para el gen
LTI78, utilizado como control.
Figura 2. Análisis de la expresión del gen
CDF3 en plantas transformadas que sobreexpresan el gen
CDF3. La figura muestra los resultados obtenidos mediante
experimentos de Northern blot, en los que se ha utilizado hojas de
plantas control que no sobreexpresan el gen CDF3 (WT) y en
tres líneas independientes de plantas transformadas que
sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3). Ambos grupos de
plantas han sido cultivados durante 3 semanas en condiciones de
fotoperiodo 16:8, a una temperatura de 20ºC.
Figura 3. Tolerancia de las plantas transgénicas
35S::CDF3 a condiciones de sequía frente a las plantas
control no transformadas.
(A) Fotografía que muestra el fenotipo de
plantas control no transformadas (WT) y de plantas
transgénicas
35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) después de crecerse durante 4 semanas en tierra bajo condiciones óptimas de riego y posteriormente ser sometidas a un déficit de riego durante 10 días.
35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) después de crecerse durante 4 semanas en tierra bajo condiciones óptimas de riego y posteriormente ser sometidas a un déficit de riego durante 10 días.
(B) Comparación de la velocidad en la pérdida de
agua de hojas de plantas control no transformadas con el gen
CDF3 (WT) (línea discontinua) y de hojas de plantas
transgénicas 35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3
(35S::CDF3) (línea continua). Las hojas de ambos grupos (WT y
35S::CDF3) de plantas de 4 semanas se dejaron secar al aire y
se estimó el peso fresco en los tiempos indicados. La perdida de
agua se estimó como porcentaje del peso fresco inicial. En el eje de
abscisas se representa el tiempo expresado en minutos y en el eje de
ordenadas se representa el porcentaje de peso fresco.
Figura 4. Análisis de la conductancia estomática
(A) y de la eficiencia en el uso del agua (B) en las plantas
transgénicas de la invención (35S::CDF3) frente a las plantas
control no transformadas (WT), después de crecerse durante cuatro
semanas en tierra bajo condiciones óptimas de riego. La conductancia
estomática se expresa como molH_{2}O/m^{2}s y la eficiencia en
el uso del agua se expresa como \mumol CO_{2}/mmol H_{2}O.
Figura 5. Tolerancia a las temperaturas de
congelación de las plantas transgénicas 35S::CDF3, que
sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3). Plantas control
no transformadas (WT) y plantas transformadas (35S::CDF3) de
2 semanas crecidas en condiciones de día largo (16 horas de luz/8 h
de oscuridad) y a una temperatura de 20ºC, fueron sometidas a
diferentes temperaturas de congelación durante 6 h. La tolerancia a
las temperaturas de congelación se estimó como porcentaje de
supervivencia a cada temperatura específica y después de un periodo
de recuperación de las plantas de 7 días. (A) Tolerancia de plantas
control no transformadas (WT, barras negras) y plantas transgénicas
35S::CDF3, que sobreexpresan el gen CDF3
(35S::CDF3, barras blancas), que no han sido sometidas a
periodo previo de aclimatación, a temperaturas de -5ºC y -6ºC. En el
eje de abscisas se representa la temperatura en ºC y en el eje de
ordenadas se representa el % de supervivencia. (B) Fotografía que
muestra un ejemplo representativo de plantas control no
transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, que
sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3), 7 días después
de ser expuestas a una temperatura de -6ºC durante 6 h. (C)
Tolerancia de plantas control no transformadas (WT, barras negras) y
plantas transformadas que sobreexpresan el gen CDF3
(35S::CDF3, barras blancas), después de ser sometidas a
temperaturas de -9ºC y -10ºC, las cuales han sido sometidas a un
tratamiento previo de aclimatación de 7 días a una temperatura de
4ºC. En el eje de abscisas se representa la temperatura en ºC y en
el eje de ordenadas se representa el % de supervivencia. (D)
Fotografía que muestra un ejemplo representativo de plantas control
no transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, que
sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3) 7 días después
de ser expuestas a una temperatura de -10ºC durante 6 h.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe plantas
transgénicas caracterizadas por haber sido transformadas con un
vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica para el factor de transcripción CDF3.
En una realización preferida, las plantas
transgénicas de la invención se caracterizan porque son
transformadas con el vector de expresión es Agrobacterium
tumefaciens CECT 7674.
En otra realización preferida, las plantas
transgénicas de la invención se caracterizan porque la secuencia
nucleotídica que codifica para el factor de transcripción CDF3 es la
SEQ ID NO: 4, que se elige preferentemente del género
Arabidopsis, preferentemente de la especie A.
thaliana.
Las plantas transgénicas de la invención se
caracterizan porque presentan mayor tolerancia a múltiples tipos de
estrés abiótico simultáneamente, en comparación con las plantas
control sin transformar.
En otra realización preferida, las plantas
transgénicas de la invención se caracterizan porque el estrés
abiótico se selecciona preferentemente entre: exceso de salinidad,
sequía, temperaturas extremas de frío o de calor y tratamiento con
fitohormonas.
En otra realización preferida, las plantas
transgénicas de la invención se caracterizan porque se seleccionan
preferentemente entre plantas del género Arabidopsis,
preferentemente Arabidopsis thaliana y entre cualquier planta
de interés agronómico tanto hortícolas: lechuga, pimiento, tomate,
melón, patata etc.; cereales: arroz, maíz, trigo, cebada etc,
frutales: melocotón, albaricoque, ciruela, cereza, pera, manzana,
etc.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al procedimiento de obtención de las plantas transgénicas tolerantes
a múltiples tipos de estrés abiótico, simultáneamente, que se
caracteriza por la transformación de la planta silvestre con un
vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que
codifica para el factor de transcripción CDF3.
En una realización preferida, el procedimiento
de la invención se caracteriza porque el vector de expresión es
Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.
En otra realización preferida, el procedimiento
de la invención se caracteriza porque la secuencia nucleotídica
comprendida en el vector de expresión Agrobacterium
tumefaciens CECT 7674 es la SEQ ID NO: 4, que se selecciona
preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la
especie A. thaliana.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT 7674
caracterizado por comprender el plásmido p35S::CDF3, es cual
comprende la secuencia SEQ ID NO:4, que codifica para el factor de
transcripción CDF3. Dicha secuencia SEQ ID NO:4 se selecciona
preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la
especie A. thaliana.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al uso del vector de expresión Agrobacterium tumefaciens CECT
7674 para la transformación de plantas y que presenten una mayor
tolerancia a diferentes tipos de estrés abiótico, simultáneamente,
en comparación con las plantas control sin transformar.
Otro objeto de la presente invención, se refiere
al uso de una secuencia nucleotídica codificante para el factor de
transcripción CDF3, preferentemente SEQ ID NO:4, en la producción de
plantas transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés
abiótico, simultáneamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos utilizados en la presente
invención fueron depositados el 29 de enero de 2010 en la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Edificio de
Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot,
Burjassot 46100 (Valencia, España), con nº de depósito:
CECT 7674: A. tumefaciens cepa C58C1
transformada con el plásmido p35S::CDF3, que porta la
secuencia del gen CDF3.
Los ejemplos que se detallan a continuación
tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de
la misma.
\newpage
Mediante técnicas rutinarias de clonación y
manipulación del DNA (Maniatis y cols 1989), se clonó el cDNA del
gen CDF3 de A. thaliana (No de Acceso al GenBank:
AT3G47500.1) (SEQ ID NO:4) en el vector de expresión pROK2
(Baulcombe y cols 1986), flanqueado por el promotor del mosaico de
la coliflor (CaMV) (Cauliflower Mosaic Virus) y por una secuencia de
poliadenilación. El vector de expresión obtenido contiene:
a) Resistencia al antibiótico kanamicina (para
seleccionar en E. coli y A. tumefaciens).
b) Resistencia a kanamicina para selección de la
línea transgénica.
c) Secuencias de T-DNA, son las
secuencias que se van a transferir y se integrarán en la planta.
d) El sitio de clonaje flanqueado por el
promotor 35S de CaMV y una secuencia de poliadenilación.
\vskip1.000000\baselineskip
El gen CDF3 se amplificó mediante
técnicas de PCR utilizando los cebadores específicos definidos por
las secuencias SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. El producto de PCR
obtenido fue clonado en el vector pGEM-T easy
(Promega) dando lugar al plásmido p35S::CDF3 (Esquema 1).
Posteriormente se secuenció el gen CDF3 para verificar la
integridad de su secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
1
Plásmido
p35S::CDF3
LB: Borde izquierdo; NPTII: Neomicina
Fosfotransferasa II; RB: Borde derecho.
\vskip1.000000\baselineskip
Obtenido el plásmido p35S::CDF3, se procedió a
la transformación de bacterias del género Agrobacterium
tumefaciens, cepa C58C1 con dicho plásmido. Posteriormente las
bacterias transformadas se utilizaron para transformar plantas del
género Arabidopsis thaliana mediante infiltración (Clough and
Bent 1998). Las semillas de las plantas transformadas se
seleccionaron en placas que contienen medio de cultivo GM (Murashige
and Skoog, 1% sacarosa) y kanamicina. La selección se repitió hasta
obtener plantas T3 homocigotas, correspondientes a la tercera
generación después de la selección de las mismas. Se obtuvieron
diferentes líneas de plantas transgénicas transformadas con el
vector de expresión CECT 7674 y que sobreexpresan el gen
CDF3.
Para analizar los niveles de expresión del gen
CDF3 en las líneas de plantas transgénicas transformadas con
el vector CECT 7674, se realizaron ensayos de tipo Northern blot.
Mediante técnicas bioquímicas convencionales se extrajo el RNA total
de las distintas líneas de plantas transgénicas que sobreexpresan el
gen CDF3 (35S::CDF3) y de las plantas control no
transformadas (WT). La sonda del gen CDF3 utilizada para la
hibridación de la membrana del Northern blot con las muestras del
RNA extraído, corresponde con los últimos 150bp del cDNA del gen
CDF3 (SEQ ID NO: 3).
Como se observa en la figura 2 los niveles de
expresión del gen CDF3 son mucho mayores en las líneas de
plantas que han sido transformadas con el plásmido 35S::CDF3
(línea 5.4 y línea 2.1), que en las plantas control no transformadas
(WT), por lo que para el resto de estudios posteriores se utilizaron
plantas transformadas con el vector de expresión CECT 7674 de las
líneas 5.4 y 2.1.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de analizar si la sobreexpresión
del gen CDF3 confiere a las plantas transgénicas de la
invención un aumento en la tolerancia de las mismas a condiciones de
deshidratación frente a las plantas control no transformadas, se
realizaron 3 tipos de ensayos:
a) En primer lugar, se sometieron plantas
control no transformadas (WT) y plantas transgénicas 35S::CDF3, de 4
semanas a un déficit hídrico que se mantuvo durante un periodo de 10
días. En este caso, las plantas transgénicas de la invención
(35S::CDF3) solo muestran leves síntomas de estrés por
sequía, mientras que las plantas control no transformadas (WT)
presentan severos síntomas de deshidratación (Figura 3A),
demostrándose que las plantas transgénicas de la invención
(35S::CDF3) muestran una tolerancia mejorada frente a la
deshidratación que las plantas control no transformadas (WT).
b) En segundo lugar, se analizó la velocidad de
pérdida de agua de plantas control no transformadas (WT) y de
plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3). Para lo
cual se cortaron hojas de plantas transgénicas (35S::CDF3) y
de plantas control (WT) de 3 semanas y se dejaron secar a una
temperatura de 20ºC, determinándose posteriormente el peso fresco de
las mismas a diferentes intervalos de tiempo. Como se observa en la
figura 3B, cuando se exponen las plantas a condiciones de
deshidratación, la planta control no transformada (WT) pierde agua
más rápidamente que la planta transgénica de la invención, que
sobreexpresa el gen CDF3, lo que se traduce en que las
plantas control no transformadas (WT, línea discontinua) presentan
una mayor sensibilidad a la deshidratación que las plantas
transgénicas de la invención (35S::CDF3, línea continua).
c) En tercer lugar, se midieron dos procesos
internos de las plantas, la fotosíntesis y la conductancia
estomática, tanto en plantas control no transformadas (WT), como en
las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3). Para
medir ambos parámetros se utilizó una máquina LI-COR
Li-6400. Las mediciones tanto de la fotosíntesis
como de la conductancia estomática, fueron realizadas entre las
10-11 horas de la mañana con unas condiciones
ambientales de 400 p.p.m. CO2, una temperatura de 22ºC y una humedad
del 70%. Los resultados obtenidos indican que mientras la tasa de
fotosíntesis de ambas líneas de plantas presenta valores similares
(datos no mostrados), los valores de conductancia estomática de las
plantas transformadas de la invención (35S::CDF3) son
significativamente menores que los valores que presentan las plantas
control no transformadas (WT) (Figura 4A). En consecuencia, la
eficiencia del uso del agua es mayor en las líneas que sobreexpresan
el gen CDF3 (35S::CDF3) que en las plantas control que
no sobreexpresan dicho gen (WT) (Figura 4B).
En resumen estos resultados indican que las
plantas que sobreexpresan el factor de transcripción CDF3 son
más resistentes a la deshidratación. Esto es debido en parte, a que
presentan menores pérdidas de agua a través de sus estomas y por
tanto hacen un uso más eficiente de dicha agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la respuesta de las plantas
transformadas de la invención frente a temperaturas extremas,
preferentemente temperaturas de congelación, se utilizaron plantas
de dos semanas, que se dividieron en dos grupos. Uno de los grupos
fue sometido a un proceso previo de aclimatación a bajas
temperaturas, que consistió en exponer a dicho grupo de plantas
transgénicas a temperaturas de 4ºC durante 7 días. Este proceso de
aclimatación previo a bajas temperaturas favorece que las plantas
adapten su metabolismo a esas condiciones adversas, para que
posteriormente si son sometidas a condiciones más extremas, muestren
una respuesta de aclimatación positiva, es decir, presenten mayor
resistencia a esas condiciones adversas, que plantas que no han sido
sometidas al proceso previo de aclimatación.
Los tratamientos a los que fueron sometidas las
plantas transgénicas de la invención (aclimatadas o no aclimatadas)
y las plantas control no transformadas, consistieron en 6 horas de
exposición a diferentes temperaturas de congelación (desde -5ºC
hasta -10ºC). Pasadas las 6 horas las plantas se sometieron a un
proceso de recuperación que consistió en una semana a una
temperatura de 20ºC. Posteriormente se determinó el porcentaje de
supervivencia a cada temperatura específica.
La comparación de los porcentajes de
supervivencia de las plantas transgénicas de la invención no
sometidas al proceso de aclimatación a bajas temperaturas, frente a
las plantas control no transformadas ni sometidas al proceso de
aclimatación previo, indica que los valores de supervivencia
obtenidos para las plantas transgénicas de la invención son
superiores a los valores obtenidos en las plantas control no
transformadas. En la figura 5A se observa que tanto a la temperatura
de -5ºC como a la temperatura de -6ºC, el porcentaje de
supervivencia de las plantas transformadas de la invención (barras
blancas) es mayor que el porcentaje de supervivencia de las plantas
control no transformadas (barras negras) (98% de supervivencia de
las plantas transgénicas de la invención frente a un 89% de
supervivencia de las plantas control no transformadas a la
temperatura de -5ºC y un 63% de supervivencia de las plantas
transgénicas de la invención frente a un 46% de supervivencia de las
plantas control no transformadas a la temperatura de -6ºC). En la
figura 5B, se muestran fotografías representativas de plantas
transgénicas de la invención que sobreexpresan el gen CDF3
(35S::CDF3) y plantas control no transformadas (WT), ambos
grupos de plantas no fueron sometidos al proceso previo de
aclimatación a bajas temperaturas. Estos resultados indican que la
tolerancia intrínseca a temperaturas de congelación de las plantas
transgénicas de la invención que sobreexpresan el gen CDF3,
es superior a la tolerancia intrínseca de las plantas control no
transformadas con el gen CDF3.
De una forma similar, se analizó la tolerancia
de las plantas transgénicas de la invención y de las plantas control
no transformadas, pero en este caso ambos grupos de plantas fueron
aclimatados a condiciones de bajas temperaturas como se ha
mencionado anteriormente. Se observa que las plantas transgénicas de
la invención que sobreexpresan el gen CDF3 (35S::CDF3,
barras blancas), son más resistentes a temperaturas de congelación
(-9ºC) que las plantas control no transformadas (WT, barras negras)
(Figura 5C). Cabe destacar que cuando las plantas que habían sido
sometidas a un proceso previo de aclimatación son sometidas a -10ºC,
las plantas no transformadas (WT) no se recuperan, mientras que las
plantas transgénicas de la invención (35S:CDF3) sobreviven
alrededor de un 45% de las mismas (Figura 5C). En las figura 5D se
muestran fotografías representativas de plantas aclimatadas
sometidas a temperaturas de congelación. Dichas fotografías ponen de
manifiesto la mayor tolerancia a las temperaturas de congelación de
las plantas transgénicas de la invención (35S::CDF3) frente a
las plantas control no transformadas. Por tanto, las plantas
transgénicas que sobreexpresan el gen CDF3 presentan una
tolerancia superior a temperaturas extremas de congelación que las
plantas control no transformadas, aumentando tanto la tolerancia
intrínseca (plantas no aclimatadas) como la tolerancia adquirida por
el proceso de aclimatación a las temperaturas bajas (plantas
aclimatadas).
Estos resultados demuestran que el factor de
transcripción CDF3 puede ser utilizado como una nueva
herramienta para la mejora de la tolerancia simultánea a condiciones
ambientales adversas tales como la deshidratación y las temperaturas
extremas, preferentemente temperaturas de congelación. La aplicación
más directa es su utilización para la mejora de la tolerancia
simultánea a diferentes tipos de estrés de cultivos de interés
agronómico. Por ello la presente invención debe cubrir cualquier
planta transgénica de interés agronómico que se genere empleando el
gen CDF3 de Arabidopsis thaliana.
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletBaulcombe, D.C.,
Saunders, G.R., Bevan, M.W., Mayo, M.A. and
Harrison, B.D. (1986) Expression of
biologically-active viral satellite RNA from the
nuclear genome of transformed plants. Nature, 321,
446-449.
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\hskip1cmUniversidad Politécnica de Madrid (UPM)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE PRESENTAN
MAYOR TOLERANCIA A ESTRÉS ABIÓTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-03338
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo del gen CDF3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatcttaat gatgatggag actagagat
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso del gen CDF3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgagctaa atctgttcat cgaaa
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(151)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda para la hibridación del gen
CDF3 en experimentos de Northern
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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<210> 4
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<211> 1347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1347)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante del gen
CDF3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Planta transgénica caracterizada por
haber sido transformadas con un vector de expresión que comprende
una secuencia nucleotídica que codifica para el factor de
transcripción CDF3.
2. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque el vector de expresión es
Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.
3. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia nucleotídica que codifica
para el factor de transcripción CDF3 es la SEQ ID NO: 4.
4. Planta transgénica según la reivindicación 3
caracterizada porque la secuencia SEQ ID NO: 4 se selecciona
preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la
especie A. thaliana.
5. Planta transgénica según las reivindicaciones
1 a 4 caracterizada por presentar mayor tolerancia, a
múltiples tipos de estrés abiótico en comparación con las plantas
control sin transformar.
6. Planta transgénica según la reivindicación 5
caracterizada porque el estrés abiótico se selecciona
preferentemente entre: exceso de salinidad, sequía, temperaturas
extremas de frío o calor.
7. Planta transgénica según las reivindicaciones
1 a 6 caracterizadas porque se selecciona preferentemente
entre plantas del género Arabidopsis, preferentemente
Arabidopsis thaliana y entre cualquier planta de interés
agronómico, preferentemente hortícolas, cereales y frutales.
8. Procedimiento para la obtención de plantas
transgénicas tolerantes a múltiples tipos de estrés abiótico
caracterizado por la transformación de la planta silvestre
con un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica
que codifica para el factor de transcripción CDF3.
9. Procedimiento según la reivindicación 8
caracterizado porque el vector de expresión es
Agrobacterium tumefaciens CECT 7674.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 8 o
9 caracterizado porque la secuencia nucleotídica comprendida
en el vector de expresión utilizado para transformar la planta
silvestre es la SEQ ID NO: 4.
11. Procedimiento según la reivindicación 10
caracterizado porque la secuencia SEQ ID NO: 4 se selecciona
preferentemente del género Arabidopsis, preferentemente de la
especie A. thaliana.
12. Vector de expresión Agrobacterium
tumefaciens CECT 7674 caracterizado por comprender el
plásmido
p35S::CDF3 que comprende la secuencia SEQ ID NO:4, que codifica para el factor de transcripción CDF3.
p35S::CDF3 que comprende la secuencia SEQ ID NO:4, que codifica para el factor de transcripción CDF3.
13. Vector de expresión según la reivindicación
12 caracterizado porque la secuencia SEQ ID NO:4 se
selecciona preferentemente del género Arabidopsis,
preferentemente de la especie A. thaliana.
14. Uso del vector de expresión Agrobacterium
tumefaciens CECT 7674 para la transformación de plantas y que
presenten una mayor tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico
en comparación con las plantas control sin transformar.
15. Uso de una secuencia nucleotídica
codificante para el factor de transcripción CDF3, preferentemente
SEQ ID NO:4, en la producción de plantas transgénicas tolerantes a
múltiples tipos de estrés abiótico.
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ES201030360A ES2365962B1 (es) | 2010-03-11 | 2010-03-11 | Plantas transgénicas que presentan mayor tolerancia a estrés abiótico. |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002016655A2 (en) * | 2000-08-24 | 2002-02-28 | The Scripps Research Institute | Stress-regulated genes of plants, transgenic plants containing same, and methods of use |
WO2007064724A2 (en) * | 2005-12-01 | 2007-06-07 | Cropdesign N.V. | Plants having improved growth characteristics and methods for making the same |
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2010
- 2010-03-11 ES ES201030360A patent/ES2365962B1/es not_active Expired - Fee Related
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