ES2364565A1 - Procedimiento para analizar esteroles en aceites comestibles. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para analizar esteroles en aceites comestibles.La invención define un procedimiento para analizar los esteroles totales en aceites comestibles que comprende las etapas de:(a) someter la fracción insaponificable del aceite a cromatografía líquida de alta eficacia para separar la fracción de esteroles;(b) someter a la fracción de esteroles separada en la etapa (a) a una reacción de derivatización, y(c) analizar la fracción de esteroles derivatizados obtenidos en (b) mediante cromatografía de gases;en el que el acoplamiento entre la cromatografía líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption); y en el que la reacción de derivatización de la etapa (b) se efectúa en el material de retención comprendido en dicha interfase. Este procedimiento permite analizar esteroles totales en aceites de modo rápido, sencillo, reproducible, fiable y sin apenas manipulación de la muestra, realizando una etapa de derivatización en línea, con una repetibilidad satisfactoria.
Description
Procedimiento para analizar esteroles en aceites
comestibles.
La invención se refiere al campo de los métodos
de análisis aplicados a alimentos. En particular, la invención se
refiere a un procedimiento para analizar esteroles en aceites
comestibles.
Los aceites vegetales están constituidos
principalmente por triglicéridos (95-98%) y una
mezcla compleja de compuestos minoritarios (2-5%) de
diversa naturaleza química. El análisis de estos componentes
minoritarios es esencial porque son usados como referencia para
regulaciones oficiales de aceites comestibles y para el
aseguramiento analítico de su calidad, origen, método de extracción
y posible adulteración de los aceites (Grob, K.; Lanfranchi, M.
& Mariani, C. Evaluation of olive oils through the fatty
alcohols, the sterols and their esters by coupled
LC-GC. J. Am. Oil Chem. Soc. 1990,
67, 626-634).
La Unión Europea ha establecido limites legales
(EEC 2568/91) en el contenido de ciertos componentes con el objetivo
de evitar adulteraciones. Por ejemplo, el análisis de los
dialcoholes triterpénicos, eritrodiol y uvaol, es usado para
distinguir entre aceites de oliva de diferentes calidades, como el
obtenido por presión en frío (oliva virgen) y aceites extraídos con
disolventes (Grob, K.; Biedermann, M. & Läubli, T. Determination
of free erythrodiol in olive oil by coupled LC-GC.
J. High Resolut. Cromatogr. 1989, 12,
49-50). En aceites obtenidos por extracción con
disolventes, la concentración de estos dialcoholes triterpénicos es
mayor que en aceites obtenidos por presión. Es por ello que se ha
establecido un límite legal para la suma de eritrodiol y uvaol en
aceite de oliva virgen. La fracción de esteroles se analiza
normalmente para identificar una grasa o un aceite, para la
detección de adiciones fraudulentas de aceites baratos a otros más
caros (Grob, et al. 1989, supra), para
establecer diferentes calidades del mismo tipo de aceite (Blanch,
G.P.; Villén, J. & Herraiz, M. Rapid analysis of free
erythrodiol and uvaol in olive oils by coupled reversed phase liquid
chromatography-gas chromatography. J. Agric. Food
Chem. 1998, 46, 1027-1030) y para
tipificar aceites de determinados orígenes geográficos (Rivera del
Alamo, R.M.; Fregapane, G.; Aranda, F.;
Gómez-Alonso, S. & Salvador, M.D. Sterol and
alcohol composition of Cornicabra virgin olive oil: the campesterol
content exceeds the upper limit of 4% established by EU regulations.
Food Chem. 2004, 84(4),
533-537; Sánchez-Casas, J.;
Osorio-Bueno, E.; Montaño-García,
A.M. & Martínez-Cano, M. Sterol and erythrodiol
+ uvaol content of virgin olive oils from cultivars of Extremadura
(Spain). Food Chem. 2004, 87(2),
225-230).
Los métodos analíticos más empleados para el
análisis de diferentes fracciones del aceite de oliva comprenden
varias etapas: 1) Saponificación del aceite para eliminar
triglicéridos; 2) Extracción con disolventes de la fracción
insaponificable; 3) Fraccionamiento de la fracción insaponificable
en varios grupos de compuestos por cromatografía en capa fina (TLC)
o por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC); 4)
Derivatización para obtener trimetilsililderivados; y 5) Análisis de
los derivatizados por cromatografía de gases empleando columnas
capilares apolares, en los que no hay un acoplamiento directo entre
la cromatografía de líquidos (LC) y la cromatografía de gases (GC)
(Lercker, G. & Rodríguez-Estrada, M.T.
Chromatographic analysis of unsaponifiable compounds of olive oils
and fat-containing foods. J. Chromatogr. A
2000, 881, 105-129). Estos métodos
están descritos en diferentes regulaciones oficiales (Codex
Alimentarius Commission Fats, oils and derivatives, issued by Joint
FAO/WHO Food Standards Program, Rome, 1993; Vol. 8, pp.
41-46; International Olive Oil Council. Norma
comercial aplicable al aceite de oliva y al aceite de orujo de
oliva. COI/ T. 20/ Documento nº 10, Madrid, Spain. 2001).
Está ampliamente reconocido que estos métodos
convencionales son tediosos, requieren mucho tiempo de dedicación
del analista y pueden provocar la pérdida de analitos durante la
manipulación, así como introducir sustancias que pueden interferir
en el análisis. El acoplamiento directo LC-GC es una
técnica que combina la elevada eficiencia de la separación por HPLC,
que se emplea como etapa de preparación de la muestra, sustituyendo
las etapas de extracción y limpieza, con el alto poder de separación
y la elevada sensibilidad de la etapa de cromatografía de gases
(Grob, K. On line coupled LC-GC. Hüthig, Heidelberg.
1991; Vreuls, J.J.; De Jong, G.J.; Ghijsen, R.T. &
Brinkman, U.A.Th. Liquid chromatography coupled
on-line with gas chromatography: state of the art.
J. AOAC Int. 1994, 77, 306-327;
Mondello, L.; Dugo, G. & Bartle, K.D. In-line
microbore high performance liquid
chromatography-capillary gas chromatography for food
and water analyses. A review. J. Microcol. Sep. 1996,
8, 275-310; Dugo, P.; Dugo, G. &
Mondello, L. On-line coupled LC-GC:
Theory and application. LC-GC Europe
2003, 16, 35-43). Esta técnica elimina
casi todo el trabajo manual, lo que permite que un analista lleve a
cabo un mayor número de determinaciones en menos tiempo, y disminuye
sustancialmente la probabilidad de introducir sustancias que
pudieran interferir durante la preparación de la muestra.
Grob y colaboradores propusieron métodos de
análisis de componentes minoritarios en aceites comestibles mediante
acoplamiento directo LC-GC (Grob, K.; Lanfranchi, M.
& Mariani, C. Evaluation of olive oils through the fatty
alcohols, the sterols and their esters by coupled
LC-GC. J. Am. Oil Chem. Soc. 1990,
67, 626-634; Grob et al. 1989,
supra; Grob, K.; Lanfranchi, M.; Mariani, C. Determination of
free sterols and esterified sterols and wax esters in olive oil by
coupled liquid chromatography-gas chromatography.
J. High Resolut. Chromatogr. 1989, 471,
397-405; Grob, K.; Kaelin, I. & Artho, A.
Coupled LC-GC: The capacity of silica gel HPLC
columns for retaining fat. J. High Resolut. Chromatogr.
1991, 14, 373-376). En estos métodos,
la etapa de LC se lleva a cabo en fase normal y los analitos son
previamente derivatizados. El aceite así derivatizado se inyecta,
filtrado y diluido, en el sistema LC-GC, en el que
los analitos son separados del resto de los componentes del aceite
en la etapa de LC, y transferidos a GC, en el que se lleva a cabo su
determinación.
La interfase empleada en estos métodos, basada
en el empleo de un capilar sin fase en el que se produce la
eliminación del disolvente (eluyente de LC) y la retención de los
analitos, no permitía emplear fase inversa en la etapa de LC debido
a la elevada tensión superficial y al elevado volumen de vapor por
unidad de volumen de líquido de los disolventes polares empleados en
HPLC en fase inversa (Cercaci, L.;
Rodríguez-Estrada, M.T. & Lercker, G.
Solid-phase
extraction-thin-layer
chromatography-gas chromatography method for the
detection of hazelnut oil in olive oils by determination of
esterified sterols. J. Chromatogr. A 2003, 985,
211-220; Villén, J.; Blanch, G.P.; Ruiz del
Castillo, M.L. & Herraiz, M. Rapid and simultaneous analysis of
free sterols, tocopherols and Squalene in edible oils by coupled
reversed phase liquid chromatography-gas
chromatography. J. Agric. Food Chem. 1998, 46,
1419-1422).
Herraiz y colaboradores desarrollaron métodos de
análisis de estas fracciones por acoplamiento directo
LC-GC en el que la etapa de LC se llevaba a cabo en
fase inversa (RPLC-GC), empleando como inferfase un
inyector PTV. Publicaron tres artículos presentando un método de
análisis de esteroles (Señoráns, F.J.; Tabera, J. & Herraiz, M.
Rapid separation of free sterols in edible oils by
on-line coupled reversed phase liquid
chromatography-gas chromatography. J. Agric. Food
Chem. 1996, 44, 3189-3192), de
alcoholes triterpénicos (Blanch, 1998, supra) y de
esteroles, tocoferoles y escualeno en una misma determinación
cromatográfica (Villén, 1998, supra). El empleo de un
inyector PTV como interfase permitió llevar a cabo el acoplamiento
RPLC-GC, pero hacía necesario desconectar y conectar
la columna de GC en cada análisis, lo que impedía su
automatización.
El grupo de investigación cuyos componentes son
los autores de la presente invención desarrolló una interfase para
el acoplamiento directo LC-GC, que denominó
interfase TOTAD en la literatura científica. La interfase TOTAD es
un inyector con temperatura programable (PTV) ampliamente modificado
que permite la inyección de grandes volúmenes de disolventes,
polares o apolares, en cromatografía de gases capilar así como el
acoplamiento en línea de cromatografía de líquidos, tanto en fase
normal como en fase inversa, y cromatografía gaseosa. Se ha
utilizado en el análisis de residuos de plaguicidas en agua por
introducción de grandes volúmenes de muestra (Alario, J.; Pérez, M.;
Vázquez, A. & Villén, J. Very Large Volume Sampling of Water in
GC using the TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption)
Interface for Pesticide Residue Analysis. J. Chromatogr.
Sci., 2001, 39(2), 65-69) y en el
análisis de residuos de plaguicidas en agua por acoplamiento directo
de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases (Pérez, M.;
Alario, J.; Vázquez A. & Villén, J. On-line
reversed phase LC-GC by using the new TOTAD (Through
Oven Transfer Adsorption Desorption) Interface: Application to
Parathion Residue Analysis. Journal of Microcol. Sep.
1999, 11(8), 582-589; Pérez, M;
Alario, J.; Vázquez A. & Villén, J. Pesticide Residue Analysis
by Off-Line SPE and On-Line Reversed
Phase LC-GC using the Through Oven Transfer
Adsorption/Desorption Interface. Anal. Chem. 2000,
72(4), 846-852). Igualmente, se ha utilizado
en el análisis de residuos de plaguicidas en aceite de oliva
(Sánchez, R.; Vázquez, A.; Andini, J.C. & Villén, J. Automated
multiresidue analysis of pesticides in olive oil by
on-line reversed-phase liquid
chromatography-gas chromatography using the through
oven transfer adsorption-desorption interface. J.
Chromatogr. A. 2004, 1029(1-2),
167-172; Sánchez, R.; Cortés, J.M.; Villén J. &
Vázquez A. Determination of organophosphorus and triazine pesticides
in olive oil by on-line coupling
reversed-phase liquid chromatography/gas
chromatography with nitrogen-phosphorus detection
and an automated through oven transfer
adsorption-desorption interface. J. AOAC Int.
2005, 88(4), 1255-1260 y
Díaz-Plaza, E.M.; Cortés, J.M.; Vázquez, A. &
Villén, J. Automated determination of pesticide residues in olive
oil by on-line reversed-phase liquid
chromatography-gas chromatography using the through
oven transfer adsorption-desorption interface with
electrón capture and nitrogen-phosphorus detectors
operating simultaneously. J. Chromatogr. A 2007,
1174(1-2), 145-150).
La interfase TOTAD se ha empleado también para
el análisis de componentes minoritarios de aceites comestibles
(Cortés, J.M.; Sánchez, R.; Villén, J. & Vázquez, A. Analysis of
unsaponifiable compounds of edible oils by automated
on-line coupling reversed-phase
liquid chromatography-gas chromatography using the
through oven transfer adsorption desorption interface. J. Agric.
Food Chem. 2006, 54(19),
6963-6968). Como se recoge en este artículo, es
posible analizar esteroles libres, escualeno, y eritrodiol y uvaol
en un sólo análisis, o bien analizar esteroles libres junto con
tocoferoles, o bien escualeno, eritrodiol y uvaol. No se necesita
otra preparación previa de la muestra que una simple filtración del
aceite como la que se realiza previamente a la inyección de
cualquier muestra en LC. La muestra se inyecta en LC. En esta etapa
se separan los compuestos minoritarios del aceite de los
triglicéridos. La fracción en la que se eluyen los compuestos de
interés es transferida a GC, empleando para ello la interfase TOTAD.
En la interfase se elimina el disolvente que ha sido empleado como
eluyente en LC (metanol:agua) y se retienen los analitos, que son
posteriormente transferidos a la columna de GC. Se emplea un
detector de ionización de llama. El método es totalmente automático:
la muestra se inyecta en LC y, en menos de 60 minutos, se obtiene el
cromatograma de GC y el sistema está preparado para un nuevo
análisis.
No obstante, el citado método analítico
desarrollado por el grupo de investigación de la Universidad de
Castilla-La Mancha (UCLM) sólo permite la
determinación de los esteroles libres, mientras que en el método
oficial se determinan los esteroles totales, es decir, la suma de
los esteroles libres y los esteroles esterificados.
Los presentes autores proponen ahora un método
de análisis de esteroles totales en aceites comestibles que supone
una disminución sustancial de la laboriosidad del método oficial.
Dicho método consiste en llevar a cabo una etapa de obtención de la
fracción insaponificable, mediante saponificación seguida de
extracción de los insaponificables, por ejemplo. Este extracto, sin
concentrar, se inyecta después en el sistema LC-GC
y la derivatización de los esteroles se lleva a cabo cuando estos se
encuentran en el material de retención que se encuentra en el
interior de la camisa de vidrio de la interfase TOTAD empleada en el
acoplamiento directo LC-GC.
Dicha reacción de derivatización se produce en
fase heterogénea, ya que el disolvente se elimina en la interfase
antes de añadir el agente derivatizante. Sin embargo, en contra de
lo que cabría esperar, la reacción se produce con un rendimiento
cuantitativo, lo que resulta corroborado al desaparecer del
cromatograma los picos correspondientes a los esteroles sin
derivatizar, que son sustituidos por los picos correspondientes a
los esteroles derivatizados. Además, la reacción es prácticamente
instantánea, por lo que el tiempo total del análisis apenas se
alarga un par de minutos al incorporar esta reacción. Otra ventaja
del método es el bajo consumo tanto de muestra como de disolventes y
de reactivo derivatizante. Por último, también hay que indicar que
los resultados concuerdan con los datos de muestras de aceite
certificadas, que han sido analizados por numerosos laboratorios
siguiendo el método oficial, permitiendo así el análisis rápido,
económico y fiable de los esteroles totales.
Así pues, los presentes autores han desarrollado
un procedimiento alternativo de análisis de los esteroles totales en
aceites comestibles que es más rápido, sencillo, reproducible,
fiable, con menos manipulación de la muestra, y que proporciona
resultados cuantitativos coherentes con una repetibilidad
satisfactoria.
Por otra parte, el procedimiento de la invención
permite analizar otros componentes minoritarios de los aceites
comestibles como son los dialcoholes triterpénicos y, en particular,
el eritrodiol y el uvaol. De este modo el procedimiento de la
invención, además de las ventajas previamente mencionadas, es un
método versátil adecuado para el control de adulteraciones de los
aceites comestibles (para distinguir entre aceites de oliva de
diferentes calidades o para detectar adiciones fraudulentas de
aceites baratos a otros más caros, por ejemplo), así como para la
tipificación de aceites de determinados orígenes geográficos o para
el establecimiento de diferentes calidades del mismo tipo de
aceite.
La presente invención, por tanto, tiene por
objeto proporcionar un procedimiento para analizar los esteroles
totales en un aceite comestible.
La Figura 1a muestra el cromatograma de gases
obtenido al analizar una muestra de aceite comestible, consistente
en un 60% de aceite de oliva virgen y un 40% de aceite de girasol,
mediante el procedimiento de la invención pero sin la etapa de
derivatización.
La Figura 1b muestra el cromatograma de gases
obtenido al analizar una muestra de aceite comestible, consistente
en un 60% de aceite de oliva virgen y un 40% de aceite de girasol,
mediante el procedimiento de la invención.
La presente invención proporciona un
procedimiento para analizar los esteroles totales en un aceite
comestible, en adelante "procedimiento de la invención", que
comprende las etapas de:
- (a)
- someter la fracción insaponificable del aceite a cromatografía líquida de alta eficacia para separar la fracción de esteroles;
- (b)
- someter a la fracción de esteroles separada en la etapa (a) a una reacción de derivatización, y
- (c)
- analizar la fracción de esteroles derivatizados obtenidos en (b) mediante cromatografía de gases;
en el que el acoplamiento entre la cromatografía
líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase
TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption); y en el que la
reacción de derivatización de la etapa (b) se efectúa en el material
de retención comprendido en dicha interfase.
\vskip1.000000\baselineskip
La cromatografía líquida de alta eficacia puede
efectuarse en fase normal o en fase inversa, si bien es preferible
llevarla a cabo en fase normal para facilitar la derivatización
posterior, ya que los reactivos derivatizantes se descomponen en
presencia de agua.
En una realización particular del procedimiento
de la invención, la fracción insaponificable del aceite se obtiene
mediante las etapas de:
- (i)
- saponificar el aceite comestible mediante la adición de una base;
- (ii)
- someter el producto de reacción de la etapa (i) a extracción con disolventes para separar la fracción insaponificable.
\vskip1.000000\baselineskip
Así pues, en una realización preferida del
procedimiento de la invención, este comprende las siguientes
etapas:
- (1)
- saponificar el aceite comestible mediante la adición de una base;
- (2)
- someter el producto de reacción de la etapa (1) a extracción con disolventes para separar la fracción insaponificable;
- (3)
- someter el extracto obtenido en la etapa (2) a cromatografía líquida de alta eficacia en fase normal;
- (4)
- someter el extracto eluido obtenido en la etapa (3) a derivatización en línea mediante la adición de un reactivo derivatizante, y
- (5)
- someter los componentes derivatizados en la etapa (4) a cromatografía gaseosa;
en el que el acoplamiento entre la cromatografía
líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase
TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption), al igual que la
derivatización, que tiene lugar en el material de retención
comprendido en la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Los aceites comestibles que pueden ser
analizados mediante el procedimiento de la invención con el fin de
determinar su contenido en esteroles pueden ser cualquier aceite
comestible conocido. Así, en una realización particular del
procedimiento de la invención, el aceite comestible se selecciona de
entre distintos materiales de referencia: aceite de oliva lampante
(100%), mezcla de aceite de oliva refinado (aproximadamente un 80%)
y aceite de palma (aproximadamente un 20%), aceite de orujo
refinado, y mezcla de aceite de oliva virgen extra (aproximadamente
un 60%) y aceite de girasol (aproximadamente un 40%). En una
realización preferida, el aceite comestible a analizar es una mezcla
de aceite de oliva virgen extra (aproximadamente un 60%) y aceite de
girasol (aproximadamente un 40%).
Antes de llevar a acabo la etapa (a) se obtiene
la fracción insapopnificable del aceite. Así en una realización
preferida del procedimiento de la invención, el aceite es sometido a
una saponificación con una base, preferiblemente una solución
etanólica de hidróxido potásico, liberando de este modo los
esteroles que se encontraban esterificados. Posteriormente a esta
saponificación, es necesario realizar varias extracciones con un
disolvente adecuado, preferiblemente éter dietílico, seguidas de
lavados del extracto y eliminación de humedad con un desecante.
El extracto obtenido, una vez filtrado, se
somete después a la cromatografía líquida de alta eficacia de la
etapa (a). Así, el extracto filtrado se inyecta directamente en el
cromatógrafo de líquidos de modo que se separe la fracción que
contiene los esteroles del resto de los otros componentes del aceite
extraídos.
La fracción que contiene los esteroles se
transfiere entonces automáticamente mediante la interfase TOTAD al
cromatógrafo de gases (GC), una vez efectuada la derivatización de
la etapa (b), donde finalmente se efectúa el análisis cromatográfico
de la etapa (c). Así, en una realización particular del
procedimiento de la invención, las etapas (a), (b) y (c) de análisis
son totalmente automáticas.
El procedimiento de la invención emplea el
dispositivo de interfase denominada interfase TOTAD (Through Oven
Transfer Adsorption Desorption) para el acoplamiento directo de la
cromatografía de líquidos y la cromatografía de gases (patente
española ES 2 152 153; patente en EE.UU. 6,402,947 licenciada a la
empresa KONIK Tech, Sant Cugat del Vallés, Barcelona); o bien el
sistema mejorado (patente española ES 2 263 387). Dicha interfase
TOTAD es totalmente automática y se maneja desde el software del
ordenador.
Finalmente, el cromatógrafo de gases va acoplado
a un detector adecuado de modo que se obtiene un cromatograma de la
fracción de los esteroles derivatizados que se ha transferido al
mismo.
Previamente a la realización del procedimiento
de la invención, se procede a determinar la fracción de la
cromatografía de líquidos que hay que transferir al cromatógrafo de
gases. Igualmente, el experto determinará el tipo de columna de GC y
ajustará el programa de temperaturas para conseguir una buena
separación, así como otros parámetros habituales en el análisis
cromatográfico, en función del tipo de muestra a analizar. Dichos
ajustes, en cualquier caso, no será necesario efectuarlos en cada
análisis.
Así pues, para determinar la fracción de la
cromatografía de líquidos que hay que transferir al cromatógrafo de
gases, se procede a calcular el tiempo de elución de los esteroles
en la cromatografía de líquidos.
Para ello, se trabaja exclusivamente con
cromatografía de líquidos y se debe obtener un cromatograma de
líquidos que asegure una buena separación entre los esteroles y el
resto del material insaponificable del aceite.
Así, se inyecta en el cromatógrafo de líquidos
distintos patrones de esteroles a una concentración lo
suficientemente alta como para ser detectada en cromatografía de
líquidos. Con este fin, se habrá seleccionado la columna a utilizar
y se habrán optimizado los parámetros de la técnica (disolventes,
temperatura, flujos, etc.) que permitan obtener una buena separación
cromatográfica entre los esteroles y el resto del material
insaponificable del aceite.
A partir del cromatograma obtenido se fija el
tiempo de elución de los esteroles y la fracción de líquidos a
transferir al cromatógrafo de gases.
Para llevar a cabo el análisis de esteroles en
aceites comestibles propiamente dicho, se procede a la preparación
del insaponificable. Para ello, en una realización preferida del
procedimiento de la invención, en la etapa (1) se saponifica el
aceite comestible en cuestión mediante la adición al mismo de una
base adecuada (una solución etanólica de hidróxido potásico, por
ejemplo). Con ese fin se toma una cantidad suficiente de muestra de
aceite que permita la representatividad de la misma. Una vez
saponificado el aceite, se procede a la extracción del material
insaponificable. Para ello, en la etapa (2) se realizan varias
extracciones con un disolvente orgánico adecuado tal como, por
ejemplo, éter dietílico, y después se lava dicho extracto hasta
obtención de pH neutro. De esta manera se separa el material
insaponificable de los ácidos grasos y el glicerol.
Después, en la etapa (3) se procede a inyectar
el extracto obtenido en la etapa (2) en la columna del cromatógrafo
de líquidos para someterlo a cromatografía líquida de alta eficacia
en fase normal (NPLC), tal y como se ha señalado. A continuación,
dicho extracto se eluye de la columna de modo que se transfiera a
cromatografía de gases la fracción determinada previamente que
contiene los esteroles. En una realización particular del
procedimiento de la invención, el eluyente empleado en la
cromatografía líquida se selecciona de entre
n-hexano, acetato de etilo,
terc-butilmetileter, éter dietílico,
n-heptano, n-pentano, isooctano,
ciclohexano, ciclopentano, tetracloruro de carbono, tolueno,
diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de metilo y
mezclas de los mismos. En una realización preferida, el eluyente
empleado en la cromatografía líquida de la etapa (a) es una mezcla
de n-hexano y acetato de etilo. El experto en la
materia determinará la proporción adecuada de cada eluyente.
El caudal al cual se produce la transferencia
puede ser diferente al caudal de elución de la etapa de
cromatografía de líquidos.
Para proceder a dicha transferencia, el detector
del cromatógrafo de líquidos se conecta directamente a otra válvula
de inyección, donde se inyectará el agente derivatizante, y ésta se
conecta a la válvula de seis vías de la interfase TOTAD mediante un
tubo, y la válvula de seis vías se conecta mediante otro tubo al
interior de la camisa de vidrio de la interfase TOTAD, de forma que
se introduzca una longitud mayor que el extremo de la columna
capilar que se ha introducido por este mismo extremo.
El interior del tubo de la interfase,
normalmente un tubo de vidrio, está relleno con un material de
retención de una determinada longitud y sujeto por ambos extremos
para impedir su desplazamiento. Dicho material de retención puede
ser cualquier material de relleno del estado de la técnica que
retenga los esteroles y que permita el paso del gas portador
utilizado en el cromatógrafo de gases y del eluyente utilizado en el
cromatógrafo de líquidos. En una realización particular, dicho
material de retención se selecciona de entre un material inerte, un
material adsorbente y un material absorbente. En una realización
preferida, se selecciona de entre fibra de vidrio, volaspher y
chromosorb (entre otros materiales inertes), tenax, carbón activo,
gaschrom (entre otros materiales adsorbentes), polidimetilsiloxano
sobre volaspher, OV-17 sobre volaspher y
polietilenglicol sobre chromosorb (entre otros materiales
absorbentes). En una realización más preferida, el material de
retención de la interfase TOTAD es tenax TA.
De este modo, el material de retención de la
interfase retiene a los esteroles y el eluyente es eliminado, tanto
en estado líquido como en estado de vapor, arrastrado por la
corriente de gas a través del tubo o capilar conectado al extremo
opuesto del tubo de vidrio. Una vez que los esteroles se encuentran
retenidos, se introduce el agente derivatizante que "empapa" el
material de relleno en el que se encuentran los esteroles
produciéndose la reacción de derivatización. Durante la etapa de
retención de los esteroles y de derivatización de los mismos se
introducen flujos de gas controlados por ambas entradas de gas de la
interfase TOTAD. Una vez eliminado el disolvente, los esteroles
derivatizados se desorben térmicamente. Durante esta etapa de
desorción, el flujo controlado de gas entra exclusivamente por la
entrada convencional de gas en un inyector con temperatura
programable (PTV) y este flujo de gas arrastra a los esteroles
derivatizados desorbidos conduciéndolos a la columna del
cromatógrafo de gases donde tiene lugar el análisis cromatográfico.
El control de los tiempos de apertura y cierre de las diferentes
válvulas de apertura y cierre y de la válvula de seis vías, que
forman parte de la interfase TOTAD, así como de los flujos de gas
por ambas entradas de gas de la interfase TOTAD, es fundamental para
el correcto funcionamiento del procedimiento de análisis.
En la etapa (3), por tanto, el extracto obtenido
en la etapa (2) se somete a cromatografía líquida de alta eficacia
en fase normal, para lo cual se inyecta en el cromatógrafo de
líquidos y el flujo del eluyente se mantiene en el valor fijado con
anterioridad hasta que comienza la elución de los esteroles. En ese
momento, se puede cambiar el flujo con el fin de mejorar la
retención de los esteroles en el material inerte de relleno y se
mantiene dicho flujo hasta que termina la etapa de
transferencia.
En la etapa (4) el extracto eluido de la
cromatografía de líquidos de la etapa (3) se somete a
derivatización. Para ello se añade un agente derivatizante adecuado,
particularmente un agente de sililación, preferiblemente un reactivo
derivatizante que se selecciona de entre hexametildisilazano,
trimetilclorosilano,
N,O-bis(trimetilsilil)acetamida,
N,O-bis(trimetilsilil)trifluoro-acetamida,
N-trimetilsililimidazol,
clorometildimetil-clorosilano,
N-metil-N-trimetilsililhepta-fluorobutiramida,
dimetilclorosilano y mezclas de los mismos y, más preferiblemente,
una mezcla de hexametildisilazano y trimetilclorosilano disueltos en
piridina. La reacción de derivatización se lleva a cabo a una
temperatura adecuada durante un tiempo apropiado. Así, en una
realización particular, la reacción de derivatización se efectúa a
una temperatura de 30-200ºC durante un tiempo de 0,1
a 10 min. En una realización preferida, la reacción de
derivatización se efectúa a una temperatura de 125ºC durante un
tiempo de 0,8 min.
Por último, en la etapa (5) los componentes ya
derivatizados se someten a cromatografía de gases. Para ello, al
cromatógrafo de gases se acopla un detector adecuado de modo que se
obtiene un cromatograma de la fracción de los esteroles, ya
derivatizados, que se ha transferido al mismo. En una realización
particular del procedimiento de la invención, el sistema de
detección del cromatógrafo de gases es un detector seleccionado de
entre un detector de ionización de llama y un espectrómetro de
masas.
Como se ha indicado previamente, el
procedimiento de análisis de la invención permite realizar el
análisis de distintas fracciones del aceite, siendo posible
determinar conjuntamente los esteroles y los dialcoholes
triterpénicos (eritrodiol y uvaol). Dependiendo del tipo de análisis
que se quiera llevar a cabo, se modifica la fracción de líquidos que
hay que transferir, así como los tiempos de apertura y cierre de las
válvulas que componen la interfase.
Durante el análisis se distinguen cinco etapas
en el funcionamiento de la interfase:
1) Estabilización: Antes de iniciar la
inyección, se estabiliza la interfase TOTAD a la temperatura a la
que se va a llevar a cabo la transferencia, que debe ser la adecuada
para que los esteroles queden retenidos en el material de retención
que rellena el tubo interior de la interfase TOTAD. El gas circula a
través de dicho tubo en modo adsorción. El eluyente procedente del
cromatógrafo de líquidos es enviado al desecho.
2) Transferencia: Cuando el principio de
la fracción que contiene los esteroles alcanza la válvula de seis
vías, esta cambia su posición automáticamente. Al mismo tiempo, se
puede modificar el flujo de la cromatografía de líquidos. El flujo
de gas que atraviesa el material de retención empuja al eluyente
procedente del cromatógrafo de líquidos a través del mismo en el que
los esteroles son retenidos, mientras que el eluyente es eliminado,
total o parcialmente evaporado, por el tubo de salida.
3) Derivatización: Cuando los esteroles
han alcanzado el material de retención que rellena el tubo de la
interfase, se acciona la válvula que contiene el agente
derivatizante, de modo que éste también alcance el material de
retención que rellena el tubo de la interfase donde se encuentran
retenidos los esteroles, produciéndose en ese instante la reacción
de derivatización.
4) Eliminación de los restos del
disolvente: Una vez que la etapa de transferencia ha finalizado,
y el agente derivatizante ha alcanzado el material de relleno, la
válvula de seis vías cambia automáticamente su posición, con lo que
el eluyente procedente del cromatógrafo de líquidos se envía al
desecho. Al mismo tiempo se eliminan los restos de eluyente y de
derivatizante que se encuentran en el interior del tubo de la
interfase TOTAD y en el capilar por el que ha circulado el eluyente
desde la válvula de seis vías hasta dicho tubo. Estas condiciones se
mantienen el tiempo necesario para que la eliminación del disolvente
sea tal que el remanente no interfiera en la cromatografía de
gases.
gases.
5) Desorción térmica: Pasado el tiempo
necesario para la eliminación del eluyente, las electroválvulas de
apertura y cierre, que forman parte de la interfase TOTAD, se
cierran. Se cierra también la entrada de flujo de helio por la
entrada que atraviesa el material de retención, y se modifica el
flujo por la otra entrada al valor adecuado, de modo que la
interfase funciona en modo de desorción. En este momento se calienta
rápidamente el inyector hasta la temperatura necesaria para producir
la desorción térmica de los esteroles derivatizados, que son
arrastrados por la corriente de helio a la columna cromatográfica de
gases, donde tiene lugar el análisis cromatográfico en las
condiciones previamente programables.
\vskip1.000000\baselineskip
Las ventajas que presenta el procedimiento de la
invención son las siguientes:
- -
- El procedimiento de la invención puede ser utilizado para el análisis de diferentes aceites.
- -
- El procedimiento de la invención permite el análisis de esteroles en aceites sin más tratamiento previo que la saponificación, extracción con disolventes y lavados.
- -
- El procedimiento de la invención no requiere el empleo de cantidades elevadas de disolventes orgánicos perjudiciales para la salud del analista y para el medio ambiente.
- -
- El procedimiento de la invención solo necesita manipulación de la muestra por parte del analista en la etapa de saponificación, extracción y lavados, por lo que reduce los errores y contaminaciones causados en dicha manipulación.
- -
- El procedimiento de la invención incluye una etapa de saponificación que es rápida y una etapa de análisis que es totalmente automática, por lo que es especialmente adecuado para el análisis de esteroles en controles de rutina.
\newpage
- -
- El procedimiento de la invención permite la inyección en el sistema cromatográfico de volúmenes de extracto saponificado superiores a los habitualmente inyectados en cromatografía de gases, que pueden ser variables, lo que permite eliminar la etapa de concentración del extracto sin pérdida de sensibilidad.
- -
- El procedimiento de la invención permite utilizar numerosas veces el tubo interior de la interfase TOTAD relleno del material de retención, sin que tenga que ser sustituido.
- -
- En el procedimiento de la invención no se produce el deterioro del sistema de cromatografía de gases que en otros sistemas es causado por la transferencia de componentes lipídicos de la muestra.
- -
- En el procedimiento de la invención no se produce el deterioro del sistema de cromatografía de gases causado por la introducción en el mismo de disolventes ya que éstos son previamente eliminados en la interfase.
- -
- El procedimiento de la invención permite utilizar diferentes sistemas de detección en cromatografía de gases.
- -
- El tiempo total del análisis por el procedimiento de la invención es significativamente menor que el tiempo que se requiere cuando se utiliza el método convencional, que consume mucho tiempo en las etapas de cromatografía en capa fina, rascado de la muestra, redisolución, concentración y derivatización.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo ilustra la invención y no
debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de aceites fue facilitada por el
laboratorio agroalimentario de Córdoba.
Los patrones de los esteroles fueron obtenidos
de Sigma-Aldrich, (Steinheim, Alemania). Los
esteroles usados para la experimentación fueron: estigmasterol,
\beta-sitosterol y colesterol.
El n-hexano y el acetato de
etilo, usados como eluyentes, el etanol, usado para saponificar los
aceites, y el éter dietílico y el agua, usados como agentes de
lavado, fueron de grado HPLC (LabScan, Dublín, Irlanda). El sulfato
de sodio anhidro, usado como agente desecante y el hidróxido de
potasio, usado para saponificar los aceites, fue obtenido de Merck
(Darmstadt, Alemania).
El agente derivatizante empleado fue
Silan-esterol-1-GC
(piridina:hexametildisililazano:trimetilclorosilano; 9:3:1) que se
obtuvo de Panreac (Montcada, España).
Como material de retención adsorbente dentro de
la camisa de vidrio en la interfase se usó Tenax TA,
80-100 mesh (Chrompack, Middelburg, Holanda). En la
camisa de vidrio se colocó 1 cm de Tenax TA, sujeto a ambos lados
por lana de vidrio, éste se acondicionó bajo una corriente de helio,
aumentando la temperatura 50ºC/10 min hasta 350ºC manteniendo esta
temperatura final durante una hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pesaron 500 mg de colestanol (patrón interno)
al 0,2% en peso/volumen, se evaporó el disolvente bajo una corriente
de nitrógeno y se pesaron 5 g de la mezcla de aceites en el mismo
matraz. Se añadieron 50 ml de disolución etanólica de hidróxido
potásico 2N, se puso en marcha el refrigerante de reflujo y se
calentó al baño María con ligera ebullición, en agitación hasta que
se produce la saponificación (la solución se vuelve límpida).
Después se añadió por cabeza de reflujo 50 ml de agua. Se llevó todo
el volumen a un embudo de extracción añadiendo otros 50 ml de agua,
y se realizaron tres extracciones con 80, 60 y 60 ml de éter
dietílico, respectivamente. Luego se lavó el extracto con 50 ml de
agua hasta pH neutro, se eliminaron humedades con sulfato de sodio
anhidro. Se recogió el extracto etéreo y se filtró a través de un
filtro de 0,20 \mum (Millex-GN SLGN 013 NL). Este
extracto obtenido fue el que se introdujo en el cromatógrafo de
líquidos para realizar el análisis por NPLC-GC.
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis se realizaron por acoplamiento
NPLC-GC realizando una derivatización en línea.
Para ello se empleó un inyector automático
(Konik Robokrom) con dos válvulas de inyección, una para la muestra
y la otra para el agente derivatizante, con volúmenes de lazo de 2,5
y 10 \mul respectivamente, un sistema HPLC (modelo Konik 550)
compuesto por una bomba cuaternaria, un horno de columna, y un
detector diodo-array ultravioleta (UV).
El cromatógrafo de gases fue Konik 4000B
(Konik-Tech, Sant Cugat del Vallés, Barcelona,
España) equipado con una interfase TOTAD (patentada, con derechos
exclusivos asignados a Konik-Tech) y un detector
FID (detector de ionización de llama).
El software usado para obtener y procesar los
datos de LC y GC, así como para automatizar el proceso fue Konikrom
Plus (Konik-Tech, Sant Cugat del Vallés, Barcelona,
España).
La preseparación en LC se llevó a cabo en una
columna Lichrospher 5 \mum Si 60 (Hichrom, Berks, Reino Unido) de
250 x 4,0 mm de diámetro interno mantenida a 25ºC.
La columna utilizada en GC, fue 5% Fenil Metil
Silicona (60 m x 0,25 mm d.i., 0,25 \mum de espesor) (Hichrom,
Berks, Reino Unido), con helio como gas portador (presión en cabeza
de columna 53 psi (0,36 MPa).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el tiempo de elución de los
esteroles que se iban a transferir al GC, se inyectaron 20 \mul de
una disolución en éter a 1000 mg/1 de colesterol, estigmasterol y
\beta-sitosterol. El eluyente (hexano:acetato de
etilo; 80:20 (v/v)) a un flujo de 2 ml/min se mantuvo durante 15
minutos. El detector UV se mantuvo a 205 nm. En el análisis por
NPLC-GC, la composición inicial del eluyente,
hexano:acetato de etilo (80:20), se mantuvo constante. El flujo
inicial fue de 2 ml/min hasta que comenzó a eluir la fracción de
interés. Durante la etapa de transferencia, el flujo cambió a 0,5
ml/min y se mantuvo constante hasta que terminó la transferencia,
tanto de los esteroles como del agente derivatizante. Después de la
transferencia el flujo cambió a 2 ml/min y la composición de la fase
móvil al 100% acetato de etilo en 1 minuto y se mantuvo durante
quince minutos para asegurar la eliminación de los compuestos
retenidos en la columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante las cinco etapas de operación de la
interfase TOTAD, las condiciones usadas fueron las siguientes:
\lozengeEstabilización. La interfase y
el horno del cromatógrafo de gases se estabilizaron a 125ºC y 80ºC
respectivamente. El helio, utilizado como gas portador entraba en el
PTV modificado de la interfase tanto por el lado del horno como por
el lado opuesto, a un flujo de 500 ml/min.
\lozengeTransferencia. El inyector
automático introdujo la muestra en el sistema. Cuando los compuestos
de interés llegaron a la válvula de seis vías, ésta giró
automáticamente, transfiriéndose los compuestos de interés al GC. El
caudal de transferencia utilizado fue de 0,5 ml/min. El tiempo de
transferencia fue de 12 minutos. El helio empujó el extracto a
través del adsorbente quedando los analitos retenidos y el
disolvente enviado al desecho.
\lozengeDerivatización. Una vez
transcurridos los 12 minutos de la etapa anterior, la válvula que
contenía el agente derivatizante giró, con lo que dicho agente
derivatizante fue empujado por el eluyente de LC hasta la camisa de
vidrio, donde se encontraban los esteroles retenidos en el
adsorbente. El agente derivatizante fue empujado por el mismo
eluyente empleado en la transferencia. Se mantuvo durante 50
segundos. El caudal de transferencia utilizado fue de 0,5
ml/min.
\lozengeEliminación de los restos de
disolvente. Una vez que terminó la introducción del agente
derivatizante, la válvula de seis vías volvió a girar
automáticamente de manera que la fase móvil que provenía del HPLC se
envió de nuevo al desecho. El disolvente que permanecía en el tubo
de transferencia también fue empujado al desecho por el helio. Estas
condiciones se mantuvieron durante dos minutos para asegurar la
completa eliminación de los restos de disolvente y del agente
derivatizante tanto de la interfase TOTAD como del tubo de
transferencia.
\lozengeDesorción térmica. Después de
la eliminación del disolvente, se cerraron las válvulas de apertura
y cierre de la interfase. Se interrumpió el flujo de helio que
atravesaba el adsorbente y se cambió el flujo por la otra entrada a
una presión de 53 psi (0,36 MPa). El PTV se calentó rápidamente
hasta 350ºC, manteniéndose esta temperatura durante 5 minutos para
asegurar la desorción de los solutos retenidos, que son transferidos
a la columna de cromatografía de gases.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante las etapas de transferencia y de
eliminación de disolvente la temperatura del horno fue de 80ºC.
Durante el análisis, la temperatura del horno se mantuvo a 80ºC
durante 1 minuto, se calentó a 40ºC/min hasta 220ºC, después a
20ºC/min hasta 295ºC durante 25 min. La temperatura del detector
FID fue de 330ºC.
La Figura 1 muestra el cromatograma de gases
obtenido, en el que se identifican los picos indicados
correspondientes a los esteroles totales de la mezcla de aceites:
(1) colesterol, (2) colestanol (patrón interno), (3)
24-metilencolesterol, (4) campesterol, (5)
campestanol, (6) estigmasterol, (7)
\Delta-7-campesterol, (8)
\Delta-5,23-estigmastadienol, (9)
clerosterol, (10) \beta-sitosterol, (11)
sitostanol, (12)
\Delta-5-avenasterol, (13)
\Delta-5,24-estigmastadienol, (14)
\Delta-7-estigmastenol, (15)
\Delta-7-avenasterol.
La Figura 1a muestra el cromatograma de gases de
la muestra cuando no fue derivatizada previamente al análisis
mediante cromatografía de gases. La Figura 1b muestra el
cromatograma de gases de la muestra cuando fue derivatizada
previamente al análisis mediante cromatografía de gases
(procedimiento de la invención).
Los picos que aparecen en el cromatograma
presentado en la Figura 1b se corresponden con los esteroles totales
de la muestra de aceite analizada. La cuantificación de cada uno de
los esteroles se realiza comparando el área del pico correspondiente
al patrón interno (colestanol, indicado con el número 2). Los datos
obtenidos se compararon con las concentraciones de la muestra de
referencia analizada. Dichas concentraciones de la muestra de
referencia corresponden a la media de los resultados obtenidos por
numerosos laboratorios que analizaron dicha muestra mediante el
método oficial, eliminando aquellos datos que se desviaban
excesivamente de los restantes valores. Los resultados se expresan
como porcentaje de cada uno de los esteroles del total de todos los
esteroles, como suelen presentarse los resultados de estas
determinaciones. Los resultados obtenidos son coherentes con los
valores certificados de la muestra de referencia analizada. En
efecto, la concentración de colesterol obtenida por el presente
método fue el 0,25%, mientras que el indicado en la muestra
certificada era 0,12%. Para el 24-metilencolesterol,
dichas concentraciones eran 0,13% y 0,15% respectivamente. Para el
campesterol, 5,99% y 6,4%. Para el campestanol, 0,35% y 0,1%. Para
el estigmasterol, 3,99% y 4,5%. Para el
\Delta-7-campesterol, 0,78% y
1,6%. Para el
\Delta-5,23-estigmastadienol, 1,06
y 0,22%. Para el clerosterol, 0,79% y 0,9%. Para el
\beta-sitosterol, 71,48% y 68,26%. Para el
sitostanol, 1,01% y 0,5%. Para el
\Delta-5-avenasterol, 4,35% y
4,3%. Para el
\Delta-5,24-estigmastadienol,
1,45% y 1,2%. Para el
\Delta-7-estigmastenol, 7,30% y
8,5%. Y para el
\Delta-7-avenasterol 1,21% y 2,9%.
Por otra parte, en cuanto a la suma de concentraciones de todos los
esteroles, empleando el presente método se obtiene un resultado de
2242, 3 mg/1 mientras que el valor certificado es de 1940 mg/1
totales. Si bien a primera vista parece que los resultados obtenidos
para algunos esteroles difieren mucho, hay que tener en cuenta que
aquellos en los que se encuentran diferencias elevadas corresponden
a esteroles que se encuentran en muy baja concentración, por lo que
la integración de los picos para calcular el área provoca errores,
pero que son de magnitud semejante a los que se producen cuando la
muestra se analiza siguiendo el método oficial, por lo que se puede
considerar que los resultados son satisfactorios.
En cuanto a la repetibilidad, la desviación
estándar relativa (RSD) de las áreas absolutas de los picos
cromatográficos, que por tanto no están corregidos en relación al
patrón interno, obtenida tras 5 inyecciones consecutivas del mismo
extracto, varía entre el 3,7% y el 16,1%. Sin embargo, es de
resaltar que los valores más altos corresponden a los picos de los
esteroles que se encuentran en menor concentración, a los que les
afecta el problema de integración relacionado con el tamaño del pico
anteriormente comentado. En efecto, el mayor RSD (16.1%) corresponde
al campestanol, cuya concentración certificada es el 0.1%, seguido
del colesterol (RSD 13,4%) que tiene el mismo valor certificado. El
valor más bajo de RSD (3,7%) corresponde al
24-metilencolesterol, cuya concentración certificada
también es muy baja (0,15%), pero obviamente se trata de una
casualidad. Si se tienen en cuenta sólo los picos cuya concentración
certificada supera el 2%, los valores del RSD oscilan entre 4,9% del
\beta-sitosterol, el esterol que se encuentra en
mayor concentración, y el 6,5% del campesterol. Si además se tiene
en cuenta que se trata del RSD de las áreas absolutas y que esta
variabilidad incluye la separación por HPLC de los esteroles del
resto de componentes coextraídos, la derivatización y el análisis
por GC, se puede afirmar que el presente método tiene una excelente
repetibilidad, lo cual es lógico si se tiene en cuenta que todo este
proceso se lleva a cabo de modo automático.
Además, la derivatización se produce con un
rendimiento cuantitativo ya que en dicha Figura 1b no aparecen los
picos correspondientes a los esteroles sin derivatizar (mostrados en
la Figura 1a).
Si se analiza el tiempo total que necesita todo
el análisis, habría que distinguir entre el tiempo necesario para la
preparación de la muestra, y el tiempo necesario para el análisis
cromatográfico en el equipo LC-GC. La preparación de
la muestra requiere aproximadamente una hora y media, si bien en
esta etapa no es necesaria una atención continua, por lo que es
posible realizar la preparación de una batería de muestras. Por otra
parte el tiempo de análisis cromatográfico, que incluye
cromatografía de líquidos, derivatización en línea y cromatografía
de gases es inferior a 45 minutos. Por tanto, se puede afirmar que
el método de análisis es muy rápido, sobre todo si se compara con el
método oficial.
Así pues, puede concluirse que el procedimiento
de la invención ilustrado es un método sencillo, reproducible,
fiable, con menos manipulación de la muestra, y que proporciona
resultados cuantitativos coherentes y con una repetibilidad
satisfactoria.
Claims (13)
1. Procedimiento para analizar los esteroles
totales en un aceite comestible caracterizado porque
comprende las etapas de:
- (a)
- someter la fracción insaponificable del aceite a cromatografía liquida de alta eficacia para separar La fracción de esteroles;
- (b)
- someter a la fracción de esteroles separada en la etapa (a) a una reacción de derivatización, y
- (c)
- analizar la fracción de esteroles derivatizados obtenidos en (b) mediante cromatografía de gases;
en el que el acoplamiento entre la cromatografía
líquida y la cromatografía de gases se efectúa mediante la interfase
TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption); y en el que la
reacción de derivatización de la etapa (b) se efectúa en el material
de retención comprendido en dicha interfase.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fracción insaponificable del aceite
se obtiene mediante las etapas de:
- (i)
- saponificar el aceite comestible mediante la adición de una base;
- (ii)
- someter el producto de reacción de la etapa (i) a extracción con disolventes para separar la fracción insaponificable.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el material de retención de la interfase
TOTAD se selecciona de entre materiales inertes, materiales
adsorbentes y materiales absorbentes.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el material de retención de la interfase
TOTAD se selecciona de entre fibra de vidrio, volaspher, chromosorb,
tenax, carbón activo, gaschrom, polidimetilsiloxano sobre volaspher,
OV-17 sobre volaspher y polietilenglicol sobre
chromosorb.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque el material de retención de la interfase
TOTAD es tenax TA.
6. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el reactivo derivatizante se selecciona
de entre hexametildisilazano, trimetilclorosilano,
N,O-bis(trimetilsilil)acetamida,
N,O-bis(trimetilsilil)trifluoro-acetamida,
N-trimetilsililimidazol,
clorometildimetil-clorosilano,
N-metil-N-trimetilsililheptafluorobutiramida,
dimetilclorosilano y mezclas de los mismos.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el reactivo derivatizante es una mezcla
de hexametildisilazano y trimetilclorosilano disueltos en
piridina.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la reacción de derivatización se efectúa
a una temperatura de 30-200ºC durante un tiempo de
0,1 a 10 min.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la reacción de derivatización se efectúa
a una temperatura de 125ºC durante un tiempo de 0,8 min.
10. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el eluyente empleado en la cromatografía
líquida de la etapa (a) se selecciona de entre
n-hexano, acetato de etilo, metiltercbutiléter, éter
dietílico, n-heptano, n-pentano,
isooctano, ciclohexano, ciclopentano, tetracloruro de carbono,
tolueno, diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, acetato de
metilo y mezclas de los mismos.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el eluyente empleado en la cromatografía
líquida de la etapa (a) es una mezcla de n-hexano y
acetato de etilo.
12. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque las etapas (a) a (c) son totalmente
automáticas.
13. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el sistema de detección del cromatógrafo
de gases es un detector seleccionado de entre un detector de
ionización de llama y un espectrómetro de masas.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201030281A ES2364565B1 (es) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | Procedimiento para analizar esteroles en aceites comestibles |
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Citations (4)
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| ES2152153B1 (es) * | 1998-05-22 | 2001-08-16 | Consejo Superior Investigacion | Dispositivo de interfase para el acoplamiento directo de cromatografia de liquidos y cromatografia de gases. |
| ES2265284B1 (es) * | 2005-07-11 | 2008-02-01 | Universidad De Castilla-La Mancha | Metodo de analisis de residuos de plaguicidas en muestras vegetales. |
| ES2276622B1 (es) * | 2005-12-12 | 2008-03-01 | Univ Castilla La Mancha | Sistema y metodo de cromatografia de gases |
| ES2327198B1 (es) * | 2008-04-23 | 2010-08-10 | Universidad De Castilla-La Mancha | Procedimiento para analizar plaguicidas en frutos secos. |
-
2010
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CORTES SIMARRO, J. M. ¿Empleo de la interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) en el desarrollo de métodos de análisis.¿ Tesis doctoral de la Universidad de Castilla La Mancha (España) 11.03.2009 [Recuperado el 30.11.2010] Recuperado de internet Páginas 32-, 66-68 y 107-11 y figuras 15-20 y 34-37 * |
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