ES2362671T3

ES2362671T3 - Procedimiento de determinación del fenotipo de células.

Info

Publication number: ES2362671T3
Application number: ES06256613T
Authority: ES
Inventors: Sicco H. Popma
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2011-07-11
Anticipated expiration: 2026-12-29
Also published as: AU2006252302A1; EP1813945B1; ATE504833T1; JP2007181462A; CA2572530A1; US20070243599A1; US20100203622A1; EP1813945A1; DE602006021131D1

Abstract

Un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes, en el que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2.

Description

Campo de la invención

La presente invención se dirige a procedimientos para la determinación rápida, eficaz y precisa del fenotipo de las células. En particular, esta invención se dirige a procedimientos que emplean anticuerpos.

Antecedentes

La superficie de cada célula del organismo está recubierta de proteínas. Estas proteínas de la superficie celular tienen varias funciones. Por ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ser receptores, que tienen la capacidad de unirse o adherirse selectivamente a otras moléculas de “señalización”. Alternativamente, estas proteínas pueden ser funcionales o estructurales. Por ejemplo, la proteína puede facilitar la adherencia de la célula a un sustrato, o la proteína puede facilitar la secreción de una molécula. Cada tipo celular, por ejemplo una célula hepática, tiene una determinada combinación de proteínas sobre su superficie que la hace distinguible de los otros tipos de células o sistemas celulares.

La expresión de las proteínas de la superficie celular de un tipo determinado de células puede variar, dependiendo de diversos factores. Puede incluir, por ejemplo, cambios como resultado de la proliferación y diferenciación celular, enfermedad, aislamiento de la célula del organismo y cultivo in vitro. Por ejemplo, se ha notificado que las proteínas de la superficie celular tienen funciones vitales en múltiples etapas de la metástasis del cáncer de próstata, como la separación de las células tumorales de la matriz extracelular, resistencia de las células tumorales a la apoptosis inducida por la separación, adhesión de las células tumorales a las células endoteliales y angiogénesis como apoyo al crecimiento tumoral. Puede que haya proteínas de la superficie celular expresadas de forma exclusiva o diferenciada tanto en células epiteliales como endoteliales que son importantes para los procesos individuales de la metástasis del cáncer de próstata.

Los investigadores han aprovechado la exclusividad biológica de las proteínas de la superficie celular y de propiedades celulares de determinados compuestos para etiquetas o "marcar" las células. Las células marcadas de esta forma pueden aislarse y caracterizarse fácilmente. En muchos casos, se usa una combinación de marcadores múltiples para identificar un tipo celular en particular.

Los anticuerpos se utilizan ampliamente como herramientas de diagnóstico en una amplia selección de análisis diferentes. Los anticuerpos monoclonales y recombinantes pueden utilizarse como sondas para etiquetar o marcar células. Los inmunoensayos a base de anticuerpos son el tipo de ensayo diagnóstico utilizado con mayor frecuencia y sigue siendo una de las tecnologías en más rápido crecimiento para el análisis de biomoléculas. Otro ejemplo con especial importancia en el diagnóstico que se ha convertido en rutinario durante la pasada década es el análisis por citometría de flujo. La citometría de flujo es un procedimiento para cuantificar componentes o características estructurales de las células principalmente mediante sistemas ópticos. Aunque realiza determinaciones de una célula cada vez, pueden procesarse miles de células en pocos segundos. Puesto que los diferentes tipos celulares pueden distinguirse cuantificando características estructurales, la citometría de flujo puede usarse para contar células de tipos diferentes en una mezcla. También pueden emplearse citómetros de flujo para seleccionar o "clasificar" células en base a su expresión de marcadores de la superficie celular.

Los componentes intracelulares también pueden ponerse de manifiesto mediante sondas fluorescentes, incluyendo el ADN total/célula (lo que permite el análisis del ciclo celular), el ADN recién sintetizado, secuencias de nucleótidos específicos en el ADN o ARNm, filamentos de actina y cualquier estructura para la cual se disponga de un anticuerpo. Con la citometría de flujo también se pueden controlar los cambios rápidos en el calcio libre intracelular, el potencial de membrana, el pH o las vías de señalización celular. Por ejemplo, Krutzik y col. (Journal of Immunology, 2005, 175: 2357-2365) establecen que “la citometría de flujo fosfoespecífica ha surgido como una herramienta poderosa para analizar los acontecimientos de señalización intracelular en poblaciones complejas de células debido a su capacidad para discriminar simultáneamente tipos celulares en función de la expresión de marcadores superficiales y de los niveles medidos de fosfoproteínas intracelulares. Esto ha proporcionado una introspección novedosa dentro de la naturaleza específica de la célula y de las vías de señalización inmune".

El análisis por citometría de flujo y los estudios de clasificación usando anticuerpos monoclonales para definir los marcadores superficiales en poblaciones celulares normales y neoplásicas crearon la base para los ensayos de diagnóstico clínico de rutina que ahora alcanzan desde la clasificación de la leucemia al control de la pérdida de células T CD4+ al tiempo que progresa la enfermedad por VIH.

A pesar de la versatilidad de la citometría de flujo, hay algunos inconvenientes. Por ejemplo, los anticuerpos elegidos como reactivos de citometría de flujo pueden no ser óptimos: Puede que no sean específicos, lo que produce una elevada tinción de fondo. Además, la eficacia de conjugación del fluorocromo al anticuerpo puede variar de un lote a otro. Por tanto, las comparaciones entre poblaciones de células pueden complicarse adicionalmente.

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Además, para evaluar parámetros múltiples en poblaciones celulares, es necesaria una inversión importante para comprar los anticuerpos requeridos. Por ejemplo, el análisis de 90 parámetros individuales requerirá comprar los 90 anticuerpos independientes, lo que pueden ascender a varias decenas de miles de dólares y un gran número de células por análisis. Esto es problemático si el número de células es finito y limitado. Por tanto, existe una necesidad significativa de reactivos y anticuerpos rentables, validados y reproducibles para el fenotipado o análisis de células.

Rosa y col. (Nature Medicine, 7, 245 - 248, 2001) identificaron células T vírgenes humanas usando citometría de flujo.

Borowitz y col. (Blood, 89:11, 3960-3966, 1997) usaron la citometría de flujo para medir la expresión de antígeno de la superficie de la membrana en pacientes diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B.

Hamann y col. (J. Exp. Med., 186:3, 1407-1418, 1997) caracterizaron células T CD8+ humanas de memoria y efectoras usando citometría de flujo.

En el documento WO 02/074789 (Escuela de Medicina de Baylor) se caracterizaron monocitos de sangre de pacientes con VIH usando citometría de flujo.

Sumario

La presente invención proporciona un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados

o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes, en la que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2.

La presente invención también proporciona un kit para comparar el estado fenotípico de una primera muestra de material desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido donde el material de la muestra no procede de un embrión humano que comprende:

a.: el panel de marcadores fenotípicos descritos en la Tabla 2 y

b.: anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en una materia de muestra.

La presente invención también proporciona un procedimiento para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende las etapas de:

a.: Obtener un primer material de muestra desconocido y;

b.: Poner en contacto el primer material de muestra desconocido con anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos del panel descrito en la Tabla 2 en el primer material de muestra desconocido y

c.: Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el primer material de muestra desconocido y;

d.: Obtener un material de muestra de un estado fenotípico conocido y

e.: Poner en contacto el material de muestra de un estado fenotípico conocido con dichos reactivos para detectar la presencia de dicho panel de marcadores fenotípicos donde el material de muestra no procede de un embrión humano en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y;

f.: Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y

g.: Notificar las diferencias entre el material de muestra desconocido y el material de muestra de un estado fenotípico conocido.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: esquema del procedimiento de la presente invención.

Figura 2: análisis del estado fenotípico de una población de células usando la selección de reactivos marcadores mostrada en la Tabla 2. Figura 3: análisis de los efectos del tratamiento enzimático sobre el estado fenotípico de diferentes muestras de

poblaciones de la célula X usando la selección de reactivos marcadores mostrada en la Tabla 2.

Figura 4: comparación del estado fenotípico de una muestra de la célula X con una muestra de fibroblastos dérmicos humanos, usando la selección de reactivos marcadores mostrada en la Tabla 2. Figura 5: análisis fenotípico de sangre completa. La Figura 5 A muestra el nivel de expresión de un epítope

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seleccionado en muestras de células heterogéneas. Las poblaciones de leucocitos, monocitos y granulocitos se seleccionaron en función del tamaño y la granularidad. Se evaluaron el porcentaje de acontecimientos positivos y la intensidad media de fluorescencia de todas las poblaciones celulares seleccionadas para cada epítope probado. Como ejemplo, se muestran los niveles de expresión de CD63 en todas las poblaciones celulares. En la Figura 5 B se muestra el porcentaje de acontecimientos positivos y los niveles de expresión de leucocitos, monocitos y granulocitos para la selección de epítopes de superficie mostrada. Las poblaciones celulares se seleccionan y analizan a partir de tres donantes sanos en 11 pruebas independientes (media ± ETM). En la Figura 5 C se muestran los niveles de expresión de los epítopes en la selección de reactivos mostrada en la tabla 1 para una población de leucocitos obtenida de un individuo sano.

Descripción detallada

Según la presente invención, se proporcionan los componentes y procedimientos del ensayo para la caracterización del fenotipo de las células. Como reconocerán los expertos en la materia, la invención tiene un enorme número de aplicaciones en las técnicas diagnósticas de ensayo. Los reactivos pueden prepararse, por ejemplo, de modo se detecte o analice cualquier de las diversas características de la muestra, enfermedades o reactivos. La presente invención proporciona un panel de reactivos que se seleccionan para cubrir diversas aplicaciones.

Los reactivos

Los reactivos adecuados para su uso en la presente invención son anticuerpos que reconocen marcadores fenotípicos. Los marcadores fenotípicos pueden ser proteínas expresadas en la superficie de las células o pueden ser proteínas que se expresan a nivel intracelular. Alternativamente, pueden ser proteínas que secreta la célula. Alternativamente, los marcadores fenotípicos pueden ser ácidos nucleicos, lípidos, polisacáridos o cualquier biomolécula.

Los reactivos adecuados para su uso en la presente invención son anticuerpos que reconocen específicamente los marcadores fenotípicos. En una realización, los reactivos están marcados con un marcador fluorescente. Alternativamente, el reactivo puede ser intrínsecamente fluorescente.

Los anticuerpos adecuados para su uso en la presente invención pueden obtenerse a partir de fuentes comerciales

o puede generarse mediante una aplicación específica. En una realización, los anticuerpos están marcados con un marcador fluorescente. Los ejemplos de anticuerpos y marcadores fenotípicos adecuados para su uso en la presente invención se muestran en la Tabla 2.

Los paneles de reactivos

La presente invención proporciona reactivos optimizados y rentables para el análisis reproducible de células. En una realización, el reactivo está en forma de kit, que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados o en otra configuración que permiten su transporte y conservación apropiados. Las placas multipocillo pueden tener formatos diferentes como de 6, 8, 12, 24, 96 o 384 pocillos y similares. Los anticuerpos se seleccionan según el análisis que se va a realizar. Los anticuerpos pueden seleccionarse para cubrir epítopes inmunes relacionados. Alternativamente, pueden seleccionarse para cubrir epítopes de cáncer o epítopes de células madre. Los anticuerpos pueden reconocer moléculas extracelulares o pueden reconocer moléculas intracelulares.

Los anticuerpos seleccionados pueden dispensarse dentro de placas multipocillo según las distribuciones marcadas en las Tablas 2 y 3. Las distribuciones son exclusivas del panel de marcadores fenotípicos específicos. Cada pocillo de la placa multipocillo puede contener un único anticuerpo o múltiples anticuerpos. Los anticuerpos seleccionados se proporcionan en grandes cantidades y se dispensan en un gran número de placas para reducir la variación entre muestras. Los anticuerpos pueden conservarse en las placas en solución antes del análisis. Alternativamente, los anticuerpos pueden conservarse liofilizados y reconstituirse antes del análisis.

El procedimiento

En una realización, el procedimiento de la presente invención comprende un sistema que conlleva las etapas de recogida del material de muestras de un estado fenotípico desconocido y recogida de material de muestra de un estado fenotípico conocido. El material de muestra puede comprender, por ejemplo, células, sangre o cualquier muestra biológica. El sistema analiza los materiales de muestra para identificar patrones de marcadores de epítopes en el material de muestra del estado fenotípico conocido que se usan como comparadores para el material de muestra de estado fenotípico desconocido. La identidad de los epítopes en el patrón identificado puede ser conocida. Alternativamente, más de un epítope en el patrón identificado puede ser desconocido. En la Figura 1 se muestra un esquema del procedimiento de la presente invención.

Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden usarse con fines de control de calidad. En este caso, el material de muestra de estado fenotípico conocido puede obtenerse a partir de una población de células control. A continuación, este material de muestra puede usarse como comparador para el material de muestra de estado fenotípico desconocido que consiste en poblaciones de células obtenidas de series de producción. Los cambios en los patrones de marcadores de epítopes en el material de muestra de fenotipos conocidos pueden usarse para rechazar o aceptar las series de producción. Un ejemplo de esto se muestra en el Ejemplo 1.

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Alternativamente, la presente invención puede usarse para notificar cambios en el patrón de marcadores de epítopes en una población de células tras el tratamiento con un factor o agente farmacéutico. Un ejemplo de esto se muestra en el Ejemplo 2. Alternativamente, la presente invención puede usarse para notificar cambios en el patrón de marcadores de epítopes entre poblaciones diferencias de células. Un ejemplo de esto se muestra en el Ejemplo 3.

En una realización, la presente invención también puede notificar cambios en el patrón de marcadores de epítopes en poblaciones diferencias de células en sangre completa. Las poblaciones celulares pueden ser de una muestra de sangre de un paciente. Alternativamente, pueden usarse muestras de más de un paciente.

Los procedimientos de la presente invención pueden emplearse para analizar una muestra o, alternativamente, más de una muestra. En una realización, puede realizarse el análisis de alto rendimiento de un número grande de muestras. Las etapas del procedimiento de la presente invención pueden realizarse manualmente. Alternativamente, al menos una de las etapas puede estar automatizada. Pueden hacerse múltiples copias de una placa con un reactivo marcador fenotípico y usarse para el análisis de muestras.

El análisis de las muestras puede realizarse mediante cualquier plataforma adecuada conocida por los expertos en la técnica. Entre estas plataformas pueden incluirse, por ejemplo, un equipo de citometría de flujo, un equipo de espectrometría de masas o un microscopio de fluorescencia y similares.

Los equipos de citometría de flujo dependen del flujo de células u otras partículas en una corriente de flujo líquido para determinar una o más características de las células estudiadas. Adicionalmente, el equipo de citometría de flujo es útil para identificar la presencia de determinadas células o partículas de interés, para la enumeración de estas células o partículas y, en determinadas circunstancias, para proporcionar una capacidad de clasificación de modo que se puedan recoger aquellas células o partículas de interés. En un equipo de citometría de flujo típico, una muestra líquida que contiene células es dirigida a través del equipo de citometría de flujo en una corriente líquida que se mueve rápidamente de modo que cada célula pasa de forma seriada, y básicamente una cada vez, a través de una región de detección. El volumen celular puede determinarse mediante los cambios en la impedancia eléctrica cada vez que una célula pasa a través de la región de detección. De forma similar, si se dirige un haz de luz incidente a la región de detección, las células en paso dispersan dicha luz mientras que pasan a su través. Esta luz dispersada sirve como función de la forma y tamaño de la célula, índice de refracción, opacidad, rugosidad y similares. Adicionalmente, la fluorescencia emitida por las células marcadas, o células fluorescentes, que se han excitado como resultado de su paso a través de la energía de excitación del rayo de luz incidente es detectable para la identificación de las células que tienen propiedades fluorescentes. Después de realizar el análisis de las células mediante el equipo de citometría de flujo, pueden separarse aquellas células que se han identificado como poseedoras de las propiedades deseadas si el equipo se ha diseñado con esta capacidad.

En las patentes de EE. UU. Nº 3.826.364 y 4.284.412 y en la publicación de Herzenberg y col., "Fluorescenceactivated Cell Sorting," Sci. Am. 234 (3):108, 1976 se describen equipos de citometría de flujo representativos.

La presente invención se ilustra adicionalmente, pero sin limitaciones, mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1: control de calidad, criterios de liberación

Preparación de placas originales: se diseñó un molde de anticuerpo para controlar los cambios de expresión a lo largo de una amplia selección de epítopes para establecer la consistencia del producto celular entre la producción y las series de expansión. Los anticuerpos se seleccionaron y dispensaron dentro de una placa multipocillo según la distribución de la Tabla 2. Los anticuerpos se obtuvieron a partir de las fuentes mostradas en la Tabla 1. Los anticuerpos se diluyeron en PBS en una placa original de 96 pocillos y se conservaron en un frigorífico antes de su análisis. Para cada ensayo se transfirieron 10 µl de la solución original de anticuerpos de la placa original a una nueva placa de 96 pocillos de modo que se creo una copia. La selección contenía anticuerpos marcados con fluoresceína ficoeritrina frente a un marcador específico por pocillo. Esto eliminaba la necesidad de compensación de la máquina, simplificaba el ensayo y reducía el sesgo por operador. Además, el protocolo de tinción se diseñó para minimizar el número de células necesarias para el ensayo y eliminar etapas, como la de lavado, que pueden causar errores.

Ensayo: se descongeló un vial de células, se lavó y finalmente se diluyó a 2x105 células por ml en PBS y se transfirieron 100 µl a cada pocillo (20.000 células/pocillo) que contenía los anticuerpos diluidos. La placa se incubó durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, se añadieron 100 µl de tampón de fijación (Cytofix BD, Nº de catálogo 554655) y se dejó durante 15 minutos. Se estableció en modo análisis un equipo FACSCalibur con un sistema de alto rendimiento y se adquirieron 10.000 acontecimientos por pocillo.

Análisis de los datos: en este estudio, los datos adquiridos se exportaron a un programa de análisis de software y se evaluó la intensidad media de fluorescencia (IMF) de cada pocillo de muestra. La IMF de la muestra no teñida se sustrajo de cada IMF de la muestra y se dibujó esta IMF delta para cada epítope. Esto se repitió ocho veces en experimentos independientes creando un patrón de expresión medio para nuestro producto celular.

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Resultados: las células obtenidas de series de producción/expansión diferentes se tiñeron de forma rutinaria usando la selección de la placa de 96 pocillos, se dibujo la IMF y se comparó frente al patrón de marcadores de epítopes obtenidos del material de muestra de estado fenotípico conocido. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 2: comparación de reactivos de disociación

Procedimiento: los procedimientos y el panel de reactivos utilizados para este ensayo son los mismos que los descritos en el Ejemplo 1. Las células se crecieron en 3 frascas de cultivo independientes en condiciones idénticas. Estos cultivos se recogieron cada uno con una mezcla de enzimas de disociación diferente. Las células se tiñeron a continuación usando el procedimiento de 96 pocillos y se determinó la intensidad media de fluorescencia para cada parámetro que se comparó con el patrón de marcadores de epítopes obtenido del material de muestra del estado fenotípico conocido.

Resultados: cada mezcla de enzimas mostró resultados diferentes cuando se comparó con el patrón de los marcadores de epítopes obtenido a partir del material de muestra del estado fenotípico conocido. La mezcla C (Acutasa) parece afectar a la expresión de un determinado marcador fenotípico más que las mezclas patrones A (Tripsina) y B (TripIE). Por ejemplo, el marcador de adhesión CD49f y la molécula de señalización CD63 muestran niveles de expresión bajos tras el procedimiento de recogida, lo que puede afectar a la función del producto celular. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Conclusión: este procedimiento permite una evaluación rápida de una amplia selección de proteínas expresadas sobre la superficie celular. Los cambios en el estado fenotípico que pueden ocurrir tras el tratamiento con enzimas pueden evaluarse fácilmente mediante este procedimiento. La disponibilidad de una placa original permite una evaluación rápida de los cambios fenotípicos a través de una amplia selección de marcadores fenotípicos debido al tratamiento de las células.

Ejemplo 3: comparación de estado fenotípico de dos poblaciones celulares diferenciadas

Procedimiento: los procedimientos y el panel de reactivos utilizados para esta prueba fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1. En este ensayo, se probaron los niveles de expresión mediante la placa original en un cultivo celular homogéneo diferente. El cultivo celular de interés se creció hasta la confluencia y se recogió según nuestro protocolo convencional. A continuación, ambos cultivos celulares se tiñeron en la placa original de 96 pocillos y se analizaron según los procedimientos descritos anteriormente. Se comparó el estado fenotípico de las poblaciones celulares y se identificaron las diferencias claves.

Resultados: los dos tipos celulares tienen niveles de expresión similares para la mayoría de los epítopes excepto, por ejemplo, CD11a y CD54. Estos epítopes se expresaban de forma diferencial. Seleccionamos un punto de corte arbitrario para una significancia a una delta de 25 IMF comparada con el material de muestra del estado fenotípico conocido. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Conclusión: hemos demostrado diferencias de expresión entre dos tipos celulares de nuestro panel. Estas diferencias pueden explorarse adicionalmente y pueden convertirse en puntos de partida importantes de una investigación adicional, especialmente si los cambios en el marcador fenotípico pueden ligarse a diferencias de eficacia in vivo.

Ejemplo 4: análisis fenotípico de la sangre completa

Procedimiento: los procedimientos y el panel de reactivo utilizados para esta ensayo fueron los mismos a los descritos en el Ejemplo 1. Se obtuvo sangre periférica heparinizada a partir de voluntarios sanos y se aislaron los leucocitos. Los leucocitos se lavaron y resuspendieron en PBS y se transfirieron a la placa de marcaje de 96 pocillos

(50.000 células por pocillo) y se adquirieron los datos según el protocolo convencional. Sin embargo, el análisis de datos es diferente puesto que la muestra contiene poblaciones celulares múltiples, cada una con su patrón de expresión específico para cada epítope. El análisis de las células como un todo puede oscurecer estos efectos. Por tanto, se seleccionaron tres poblaciones principales en función del tamaño y granularidad, y en cada una se analizó el porcentaje de acontecimientos positivos dentro de la puerta y los niveles de expresión de cada epítope probado (Figura 5 A, B y C).

Resultados: Usando la plataforma de 96 pocillos, somos capaces de evaluar rápidamente los niveles de expresión de nuestra selección de epítopes para tres poblaciones diferenciadas en sangre periférica (Figura 5).

Conclusión: la placa de 96 pocillos también puede usarse para una población celular heterogénea. Sin embargo, el procesamiento y la minería de los datos se hacen significativamente más complejos. Están en desarrollo novedosos procedimientos de análisis para simplificar el análisis, lo que es especialmente importante cuando este procedimiento se expande a citometría de flujo de color múltiple. Este procedimiento puede usarse para determinar el patrón de marcadores de epítopes en muestras de sangre periférica fácilmente accesibles para individuos sanos (fenotipo no enfermo) y esto se usa como un comparador para los citomas obtenidos de individuos con una enfermedad en particular. Las diferencias pueden explotarse para, pero sin limitaciones, el desarrollo de procedimientos diagnósticos, la determinación de la eficacia del fármaco y la selección de los regimenes de tratamiento.

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Tabla 1: descripción de los marcadores fenotípicos

Identificación del CD: MOLÉCULA Nombre del gen Fluorescenci a Compañía

CD3: Receptor del antígeno de la célula T/CD3 (TCR) CD3G/Z PE Caltag

CD4: OKT4, Leu 3a, T4 CD4 PE BD Pharmingen

CD5: T1, Leu1 CD5 PE BD Pharmingen

CD7: Leu 9, 3A1, gp40, antígeno de leucemia de células T CD7 PE BD Pharmingen

CD8: Receptor de MHC de clase I CD8 PE BD Pharmingen

CD9: proteína transmembrana de tipo III (agregación/activación de plaquetas) CD9 PE BD Pharmingen

CD10: CALLA, metaloendopeptidasa de membrana MME PE BD Pharmingen

CD11a: alfaL; LFA-1, gp180/95 ITGAL PE BD Pharmingen

CD13: Aminopeptidasa N, APN, gp150, EC 3.4.11.2 ANPEP PE BD Pharmingen

CD15: Fucosiltransferasa 4 (alfa (1,3) fucosiltransferasa, específica de línea mieloide) FUT4 PE BD Pharmingen

CD16: R Fc gamma III FCGR3A PE Caltag

CD16a: R Fc gamma IIIa FCGR3A PE BD Pharmingen

CD18: Cadena β2 de integrina, antígeno de macrófago 1 (mac-1) ITGB2 PE BD Pharmingen

CD19: B4, asociado con CD21, CD81, CD225, Leu-13, Lyn, Fyn, Vav, P13quinasa CD19 PE BD Pharmingen

CD20: 4 dominios que atraviesan la membrana, subfamilia A, miembro 1 MS4A1 PE BD Pharmingen

CD21: Receptor de C3d,CR2, gp140; receptor de EBV CR2 PE BD Pharmingen

CD22: Bgp135; BL-CAM, Siglec2 CD22 FITC BD Pharmingen

CD25: Receptor de interleuquina-2 (IL-2R, respuesta inflamatoria) IL2RA PE BD Pharmingen

CD29: Cadena β1 de integrina; GPlla de plaquetas; cadena beta de VLA (CD49) ITGB1 PE BD Pharmingen

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CD30: Miembro 8 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral. KI-1 TNFRSF8 PE BD Pharmingen

CD31: PECAM-1; GPIIa de plaquetas'; endocam PECAM1 PE BD Pharmingen

CD32: Receptor Fcgamma de tipo II (FcgRII), gp40 FCGR2A PE BD Pharmingen

CD33: gp67 CD33 PE BD Pharmingen

CD34: My10, gp105-120 CD34 PE BD Pharmingen

CD35: Receptor de C3b/C4b; receptor de complemento de tipo 1 (CR1) CR1 PE BD Pharmingen

CD36: GPIV, GPIIIb de plaquetas, antígeno OKM-5 CD36 PE BD Pharmingen

CD38: T10; gp45, ADP-ribosil ciclasa CD38 PE BD Pharmingen

CD40: Bp50, Receptor 5 de TNF TNFRSF5 PE BD Pharmingen

CD44: Pgp-1; gp80-95, antígeno Hermes, ECMR-III y HUTCH-I. CD44 PE BD Pharmingen

CD45: LCA, B220, proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, C PTPRC PE BD Pharmingen

CD49a: Cadena a1 de integrina, antígeno muy tardío, VLA 1a ITGA1 PE BD Pharmingen

CD49b: Cadena a2 de integrina, cadena alfa de VLA-2, gpla de plaquetas ITGA2 PE BD Pharmingen

CD49c: Cadena a3 de integrina, cadena alfa de VLA-3 ITGA3 PE BD Pharmingen

CD49d: Cadena a4 de integrina, cadena alfa de VLA-4 ITGA4 PE BD Pharmingen

CD49e: Cadena a5 de integrina, cadena alfa de VLA-5 ITGA5 PE BD Pharmingen

CD49f: Cadena a6 de integrina, cadena alfa de VLA-6, gplc de plaquetas ITGA6 PE BD Pharmingen

CD50: ICAM-3, molécula de adhesión intercelular 3 ICAM3 fitc BD Pharmingen

CD51: Cadena alfa de integrina, cadena a del receptor de vitronectina ITGAV PE BD Pharmingen

CD54: ICAM-1, molécula de adhesión intercelular 1 ICAM1 PE BD Pharmingen

CD55: Factor de aceleración de descomposición (DAF, previene el daño celular) DAF PE BD Pharmingen

CD56: Molécula de adhesión de célula neural 1 (NCAM1), NKH-1 (marcador de NCAM1 PE Caltag

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células NK)

CD58: Antígeno 3 asociado con la función linfocitaria (LFA-3, interacciona con CD2 durante la adhesión celular) CD58 PE BD Pharmingen

CD59: MACIF, MIRL, P-18, protectina CD59 PE BD Pharmingen

CD61: Glicoproteína IIIa, beta3 integrina ITGB3 PE BD Pharmingen

CD62E: E-selectina, LECAM-2, ELAM-1 SELE PE BD Pharmingen

CD62L: L-selectina, LAM-1, Mel-14 SELL PE Caltag

CD62P: P-selectina, proteína de membrana granular-140 (GMP-140) SELP PE BD Pharmingen

CD63: LIMP, gp55, antígeno neuroglandular LAMP-3, granulofisina CD63 PE BD Pharmingen

CD64: FcgR1, R1 Fc gamma (receptor de IgG) FCGR1A PE Caltag

CD69: Antígeno de activación de células T más temprano CD69 PE BD Pharmingen

CD71: Receptor de transferrina TFRC PE BD Pharmingen

CD73: Ecto-5'-nucleotidasa NT5E PE BD Pharmingen

CD79a: Antígeno CD79A (alfa asociado con inmunoglobulina), MB1 CD79A PE BD Pharmingen

CD79b: Antígeno CD79B (beta asociado con inmunoglobulina), B29 CD79B PE BD Pharmingen

CD80: B7-1; BB1 CD80 PE BD Pharmingen

CD81: Diana de un anticuerpo antiproliferativo (TAPA-1); M38 CD81 PE BD Pharmingen

CD83: HB15 CD83 PE BD Pharmingen

CD86: B7-2; B70 CD86 PE Caltag Laboratorie s

CD87: Activador de plasminógeno, receptor de uroquinasa (PLAUR), uPAR PLAUR PE BD Pharmingen

CD88: Receptor de C5a C5R1 PE BD Pharmingen

CD90: Thy-1 THY1 PE BD Pharmingen

CD95: APO-1, Fas, TNFRSF6 TNFRSF6 PE BD Pharmingen

CD100: SEMA4D SEMA4D PE Serotec

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CD103: Integrina, alfa E (antígeno 1 de linfocitos de mucosa humana; polipéptido alfa) ITGAE PE BD Pharmingen

CD104: Subunidad beta 4 de integrina, TSP1180 ITGB4 PE BD Pharmingen

CD105: Endoglina ENG PE Caltag

CD106: VCAM-1 (molécula de adhesión a la célula vascular 1), INCAM-110 VCAM1 PE BD Pharmingen

CD114: G-CSFR, HG-CSFR, CSFR3 CSF3R PE BD Pharmingen

CD117: SCFR, c-kit, receptor del factor de células madre KIT PE BD Biosciences

CD119: Cadena alfa del receptor de IFN (GIR208) IFNGR1 PE BD Pharmingen

CD120b: TNFRI; TNFRp55 TNFRSF1B PE BD Pharmingen

CD126: Cadena alfa del receptor de IL-6 IL6R PE BD Pharmingen

CD134: Receptor 4 del factor de necrosis tumoral, OX40 (promueve la expresión de BCL2/BCL-xL) TNFRSF4 PE Caltag

CD135: Tirosina quinasa relacionada con fms 3 FLT3 PE BD Pharmingen

CD140b: Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas b(PDGF) PDGFRB PE BD Pharmingen

CD141: Trombomodulina (TM), fetomodulina THBD PE BD Pharmingen

CD142: Factor tisular, tromboplastina, factor de coagulación III F3 PE BD Pharmingen

CD146: Muc 18, MCAM, Mel-CAM, s-endo MCAM PE BD Pharmingen

CD147: Basigina, M6, inductor de metaloproteinasa extracelular (EMMPRIN) BSG PE Serotec

CD151: Antígeno tetraspanina endotelial plaqueta (PETA)-3 CD151 PE BD Pharmingen

CD152: Antígeno asociado a linfocitos T citolíticos (CTLA-4) CTLA4 PE BD Pharmingen

CD163: M130, GHI/61, RM3/1 CD163 PE BD Pharmingen

CD164: MUC-24, MGC 24, proteína central multiglucosilada 24 CD164 PE BD Pharmingen

CD165: AD2, gp 37 PE BD Pharmingen

CD178: Ligando de FAS, ligando de CD95 TNFSF6 PE Caltag Laboratories

imagen9

CD181: CXCR1 CDw128a: receptor alfa de IL8, IL8RA PE BD Pharmingen

CD182: CXCR2 IL8RB PE BD Pharmingen

CD183: Receptor de quimiocina CXCR3, receptor 9 conjugado a proteína CXCR3 PE BD Pharmingen

CD184: Receptor de quimiocina CXCR4, Fusina CXCR4 PE BD Pharmingen

CD200: OX2 (regula la actividad de Mf) CD200 PE BD Pharmingen

CD273: B7DC, PDL2 PDCD1 LG2 PE BD Pharmingen

CD274: B7H1, PDL1 PDCD1LG1 PE BD Pharmingen

CD275: B7H2, ICOSL ICOSL

CD276: B7H3 N/A

CD277: BT3.1 BTN3A1

CD278: ICOS ICOS

CD279: PD1 PDCD1

CD280: ENDO180 MRC2

CD281: TLR1 TLR1

CD282: TLR2 TLR2

CD283: TLR3 TLR3

CD284: TLR4 TLR4

CD289: TLR9 TLR9

CD292: BMPR1A BMPR1A

CDw293: BMPR1B BMPR1B

CD294: CRTH2 GPR44

CD295: LeptinaR LEPR

CD296: ART1 ART1

CD297: ART4 DO

CD298: Na+/K+ -ATPasa b3 ATP1B3

CD299: Relacionado con DCSIGN CD209L

CD300a: CMRF35H

CD300c: CMRF35A

CD300e: CMRF35L1

CD301: MGL, CLECSF14 CLECSF14

CD302: DCL1 N/A

imagen10

CD303: BDCA2 CLECSF7

CD304: BDCA4, Neuropilina 1 NRP1

CD305: LAIR1 LAIR1

CD306: LAIR2 LAIR2

CD307: IRTA2 N/A

CD309: VEGFR2, KDR KDR

CD312: EMR2 EMR2

CD314: NKG2D KLRK1

CD315: CD9P1 PTGFRN

CD316: EWI2 IGSF8

CD317: BST2 BST2

CD318: CDCP1 N/A

CD319: CRACC SLAMF7

CD320: 8D6A N/A

CD321: JAM1 F11R

CD322: JAM2 JAM2

CD324: Cadherina E CDH1

CDw325: Cadherina N CDH2

CD326: Ep-CAM TACSTD1

CDw327: siglec6 SIGLEC6

CDw328: siglec7 SIGLEC7

CDw329: siglec9 SIGLEC9

CD331: FGFR1 FGFR1

CD332: FGFR2 FGFR2

CD333: FGFR3 FGFR3

CD334: FGFR4 FGFR4

CD335: NKp46 NCR1

CD336: NKp44 NCR2

CD337: NKp30 NCR3

CDw338: ABCG2, BCRP ABCG2

CD339: Jagged-1 JAG1

ABCG2

Fosfatasa alcalina

BCL-xL: Similar a BCL2-1 BCL2L1 PE Chemicon

bCL-2: LLC de linfocitos B /linfoma-2 BCL2 PE BD

imagen11

Pharmingen

CK 5: Citoqueratina 5

CK 6: Citoqueratina 6

CK 7: Citoqueratina 7

CK 8: Citoqueratina 8

CK 10: Citoqueratina 10

CK 13: Citoqueratina 13

CK 14: Citoqueratina 14

CK 15: Citoqueratina 15

CK 16: Citoqueratina 16

CK 18: Citoqueratina 18

CK 19: Citoqueratina 19

EGFr: Receptor del factor de crecimiento epidérmico (crecimiento y diferenciación) EGFR PE BD PharMingen

HGF-R: Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos HGFR

NGFr: NGFR (p75) NGFR PE BD Pharmingen

RANTES: Ligando 5 de CCL5 (quimiocina (motivo C-C) CCL5 PE Caltag

b2-microglobulina: Se asocia con el complejo antígeno HLA de clase I B2M PE BD Pharmingen

HLA-ABC: MHC de clase I ABC PE BD Pharmingen

HLA-DP: MHC II HLA-DP beta-1 HLA-DPB1 PE Serotec

HLA DR: PE BD Pharmingen

SSEA-1: Antígeno embrionarios de células madres 1 SSEA1

SSEA-3: Antígeno embrionarios de células madres 3 SSEA3

SSEA-4: Antígeno embrionarios de células madres 4 SSEA4

imagen12

Tabla 2: placa de selección de marcadores fenotípicos de células madre de la invención

imagen13

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir CD9 CD10 CD11a CD13 CD14 CD16

B: CD18 CD25 CD29 CD31 CD32 CD34 CD35 CD36 CD40 CD44 CD45 CD49a

C: CD49b CD49c CD49d CD49e CD49f CD51 CD54 CD55 CD58 CD59 CD61 CD62E

D: CD62L CD62P CD63 CD64 CD71 CD73 CD80 CD81 CD86 CD90 CD95 CD100

E: CD104 CD105 CD106 CD117 CD119 CD120a CD126 CD134 CD140a CD140b CD141 CD142

F: CD146 CD147 CD178 CD181 CD182 CD183 CD184 CD200 CD273 CD274 β2-microglobulina HLA-ABC

G: HLA-DP EGFR NGFR RANTES CD3 CD4 CD7 CD15 CD19 CD20 CD21 CD22

H: CD38 CD50 CD62L CD83 CD88 CD112 CD114 CD151 CD164 CD165 CD172 HLA-DR

Tabla 3. Ejemplo de placa de selección de marcadores fenotípicos de oncología

1: 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir Sin teñir CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD9

B: CD10 CD11a CD13 CD14 CD15 CD16 CD18 CD19 CD20 CD22 CD25 CD29

C: CD30 CD31 CD32 CD33 CD34 CD35 CD36 CD38 CD40 CD44 CD45 CD49a

D: CD49b CD49c CD49d CD49e CD49f CD51 CD54 CD55 CD56 CD58 CD59 CD61

E: CD62E CD62L CD62P CD63 CD64 CD69 CD71 CD73 CD79a CD79b CD80 CD81

F: CD86 CD87 CD90 CD95 CD100 CD103 CD104 CD105 CD106 CD117 CD119 CD120a

G: CD126 CD134 CD135 CD140a CD140b CD141 CD142 CD146 CD147 CD152 CD163 CD178

H: CD181 CD182 CD183 CD184 CD200 CD273 CD274 β2-microglobulina EGFR HLA-ABC HLA-1 (DP) RANTES

Claims

REIVINDICACIONES

1.

- Un kit que comprende una placa multipocillo que contiene anticuerpos liofilizados o configurados de otra forma para un transporte y conservación convenientes, en el que los anticuerpos son para detectar el panel de marcadores de fenotipo descritos en la Tabla 2.
2.

- Un kit para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende:

a. el panel de marcadores fenotípicos descritos en la Tabla 2 y

b. anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en un material de muestra.
3.

- El kit de la reivindicación 1 o 2 en el que los anticuerpos son anticuerpos liofilizados.
4.

- El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que los anticuerpos están marcados con un marcador fluorescente.
5.

- Un procedimiento para comparar el estado fenotípico de un primer material de muestra desconocido con un material de muestra de un estado fenotípico conocido que comprende las etapas de:

a. Obtener un primer material de muestra desconocido y;

b.

Poner en contacto el primer material de muestra desconocido con anticuerpos para detectar la presencia de los marcadores fenotípicos del panel descrito en la Tabla 2 en el primer material de la muestra desconocido y

c.

Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el primer material de muestra desconocido y;

d.

Obtener un material de muestra de un estado fenotípico conocido y

e.

Poner en contacto el material de muestra de un estado fenotípico conocido con dichos reactivos para detectar la presencia de dicho panel de marcadores fenotípicos de la Tabla 2 en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y

f.

Registrar la presencia de marcadores fenotípicos en el material de muestra de un estado fenotípico conocido y

g.

Notificar las diferencias entre el material de muestra desconocido y el material de muestra de un estado fenotípico conocido.
6.

- El procedimiento de la reivindicación 5 para su uso con fines de control de calidad.
7.

- El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o del procedimiento de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6 en el que el material de muestra son células.