ES2357187T3

ES2357187T3 - Bacterias gram positivas desprovistas de actividad de proteasa htra y sus utilizaciones.

Info

Publication number: ES2357187T3
Application number: ES99961158T
Authority: ES
Inventors: Isabelle Poquet; Alexandra Gruss; Alexandre Bolotine; Alexei Sorokine
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2011-04-19
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: AU1786300A; WO2000039309A1; DE69942984D1; CA2356740A1; EP1141337A1; PT1141337E; US6994997B1; CA2356740C; EP1141337B1; FR2787810A1; US20060228377A1; DK1141337T3; ATE489468T1; FR2787810B1

Abstract

Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende el cultivo de una bacteria que expresa dicha proteína de interés y la obtención de dicha proteína de interés exportada por dicha bacteria, caracterizado por que dicha bacteria es una bacteria gram positiva seleccionada entre Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Bacillaceae, de los géneros Staphylococcus y Listeria, y Enterococcaceae, del género Enterococcus, cuya proteasa de superficie HtrA está inactivada por mutación.

Description

La invención se refiere a la producción, en bacterias Gram positivas, de proteínas exportadas.

Se designa con la expresión general de: “proteínas exportadas”, a proteínas que son 5 transportadas a través de la membrana citoplasmática. En el caso de las bacterias Gram positivas, este transporte desemboca en la secreción de la proteína al medio, o en su asociación con la superficie celular.

Uno de los principales problemas que se plantea durante la producción de proteínas de interés exportadas por bacterias huésped, reside en la degradación de estas proteínas durante y/o 10 después de su exportación, a nivel de la envuelta o de la superficie de la célula. Esta degradación conlleva a menudo una disminución del rendimiento, y/o una alteración de la estructura y de la actividad de la proteína.

Las enzimas responsables de esta degradación de las proteínas exportadas, son proteasas bacterianas exportadas a su vez a la envuelta; se trata de proteínas llamadas: “constitutivas”, 15 que tienen normalmente entre sus funciones principales un papel de degradación de proteínas exportadas anormales o mal plegadas que se acumulan en el medio o en la envuelta, particularmente en condiciones de estrés, así como un papel de reciclado de las proteínas exportadas.

Las proteínas heterólogas, que son a menudo reconocidas de forma imperfecta por las proteínas chaperonas que intervienen en el plegamiento de las proteínas en la bacteria huésped son 20 particularmente sensibles al ataque de estas proteasas.

La proteasa constitutiva exportada caracterizada con más antigüedad es la serina proteasa HtrA/DegP de E. coli. Se trata de una proteasa de localización periplasmática, que se expresa bajo el control de un promotor inducible a alta temperatura; BECKWITH y STRAUCH (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1576-1580, 1988) observaron que ésta intervenía en la proteolisis de proteínas de 25 fusión entre proteínas exportadas de E. coli y el informador de la exportación PhoA. Propusieron inactivar esta proteasa en E. coli para limitar la degradación de las proteínas heterólogas exportadas.

De este modo se obtuvieron cepas mutantes de E. coli, en las que el gen que codifica la proteasa HtrA/DegP se había inactivado [BECKWITH y STRAUCH, publicación mencionada anteriormente, y Solicitud PCT W088/05821]; sin embargo se ha constatado que esta inactivación se 30 traduce en una ralentización de la cinética de degradación, pero no es suficiente para suprimirla, debido a la existencia en la envuelta de otras proteasas que degradan a las proteínas exportadas.

En E. coli, se han caracterizado varias proteasas constitutivas de la envuelta, que aseguran funciones similares a las de HtrA/DegP: se trata particularmente de las proteasas HhoA/DegQ y HhoB/DegS, estructuralmente homólogas a HtrA/DegP, y de proteasas de estructura diferente pero 35 funcionalmente comparables (ApeA/proteasa I, OmpT, OmpP, Prc/Tsp, SppA/proteasa IV, PrtIII y SohB).

Estudios concernientes a otras bacterias también permitieron demostrar la existencia en cada especie estudiada, de varias proteasas constitutivas exportadas. Por ejemplo, muchas especies bacterianas poseen varias proteasas de la familia HtrA (PALLEN y WREN, Mol. Microbiol. 19: 209-21), tres homólogos de HtrA se identificaron en B. subtilis (YyxA, YkdA y YvtB/Yirf), Synechocystis (HtrA, HhoA y HhoB), Pseudomonas aueruginosa y Aquifex aeolicus, dos en Haemophilus influenzae 5 (HtoA y HhoB), Campylobacter jejuni, Brucella abortus y Yersinia enterolitica, y cuatro en Mycobacterium tuberculosis. Diversas bacterias Gram positivas también poseen serina proteasas consideradas como emparentadas con la familia HtrA, en base a una homología a nivel del dominio catalítico: EtA, EtB, V8/StsP de S. aureus, GseP de Bacillus licheniformis y Spro de Mycobacterium paratuberculosis (KOONIN et al., Cap 117 en Escherichia coli and Salmonella typhimurium, 2203-17, 10 1997). Finalmente, proteasas exportadas no emparentadas con HtrA, también se han descubierto, por ejemplo en B. subtilis (MARGOT y KARAMATA, Microbiology, 142: 3437- 44, 1996; STEPHENSON y HARWOOD Appl. Environn. Microbiol. 64: 2875-2881, 1998; WU et al. J. Bacteriol. 173: 4952-58, 1991).

Se ha propuesto, por lo tanto, combinar mutaciones que afectan a varias proteasas 15 exportadas, para conseguir una reducción efectiva de la degradación de las proteínas heterólogas exportadas.

Por ejemplo, una cepa de E. coli mutada en los genes degP/htrA, ompT, prt y prc (MEERMAN y GEORGIOU, Bio/technology 12: 1107-10, 1994), y una cepa de B. subtilis deficiente en las seis proteasas extracelulares (WU et al., 1991, publicación mencionada anteriormente), se 20 construyeron con este fin. Sin embargo, la utilización de estas cepas no permite eliminar totalmente la proteolisis de las proteínas exportadas. Por ejemplo, en el caso de la cepa de B. subtilis descrita por WU et al., aunque la actividad de proteasa extracelular residual sea despreciable (<1%), la degradación de las proteínas heterólogas exportadas sigue siendo importante. Para paliar este problema, este mismo equipo aportó modificaciones suplementarias a esta cepa, para hacerla sobreproducir diversas 25 chaperonas (WU et al., J. Bacteriol. 180: 2830-35, 1998). Además, aunque la inactivación del gen de una de estas proteasas constitutivas exportadas no tenga consecuencias notables sobre la bacteria, el cúmulo de las mutaciones puede afectar a la viabilidad de las cepas; MEERMAN y GEORGIOU, (1994, publicación mencionada anteriormente) observan de este modo una disminución de la tasa de crecimiento que puede llegar hasta el 50%. 30

En las bacterias lácticas, solamente algunas proteasas exportadas han sido objeto de estudios; la mejor caracterizada actualmente es la proteasa denominada PrtP (KOK, FEMS Microbiol. Reviews 87: 15-42, que se localiza en la superficie celular, donde está anclada al peptidoglicano. Esta proteasa está presente en muchas bacterias lácticas, particularmente Lactococcus lactis, donde su gen es plasmídico. Ésta participa de la nutrición nitrogenada de las bacterias, degradando las caseínas de la 35 leche. Otras proteasas de superficie se purificaron a partir de dos especies de bacterias lácticas, Lactobacillus delbrueckeii subesp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus, pero su función no se ha determinado. (STEFANITSI et al., FEMS Microbiol. Lett. 128: 53-8, 1995; STEFANITSI y GAREL,

Lett. Appl. Microbiol. 24: 180-84, 1997; YAMAMOTO, et al., J. Biochem. 114: 740-45, 1993). Recientemente, un gen inducible por el estrés que codifica una proteína fuertemente homóloga a las proteasas de la familia HtrA se ha descubierto en Lactobacillus helveticus (SMEDS et al., J. Bacteriol. 180: 6148-53, 1998). Se ha observado que este gen era necesario para la supervivencia a temperatura elevada; se construyó una cepa mutante de Lactobacillus helveticus en la que el gen htrA se ha 5 inactivado mediante la inserción de un gen informador (gusA, que codifica -glucuronidasa) bajo el control del promotor htrA. El estudio de la expresión del gen gusA en este mutante permitió demostrar una inducción de la transcripción de este gen en las mismas condiciones que la del gen htrA en las cepas silvestres; por el contrario, no se observó ninguna actividad de -glucuronidasa.

Durante trabajos anteriores que pretenden caracterizar proteínas exportadas de 10 Lactococcus lactis mediante el estudio de proteínas de fusión con el informador de exportación SPNuc (POQUET et al., J. Bacteriol. 180: 1904-12, 1998), el equipo de los inventores observó una importante proteolisis extracelular, aunque los experimentos se habían realizado en una cepa de L. lactis subesp. cremoris desprovista de cualquier plásmido, y por lo tanto en particular del que porta prtP.

Los Inventores decidieron buscar las proteasas extracelulares responsables de esta 15 proteolisis.

De este modo descubrieron, en L. lactis, la existencia de un gen de la familia htrA. Este gen, encontrado en el genoma de la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis, codifica una proteína de 408 aminoácidos, denominada en lo sucesivo HtrALI cuya secuencia nucleotídica y secuencia de aminoácidos se representan en la figura 1, y figuran en la lista de secuencias en el anexo (SEC ID Nº 20 1). Esta proteína es muy homóloga de HtrA de E. coli, y de diversos otros miembros conocidos de la familia HtrA, como muestra la Tabla I a continuación, que ilustra los porcentajes de identidad y de similitud entre HtrALI y diferentes proteínas de la familia HtrA:

TABLA I

Proteína: Organismo % de identidad % de similitud

HtrA/DegP/proteasa Do: E. coli 31,5 38,2

HhoA/DegQ: E. coli 34,0 40,8

HhoB/DegS: E. coli 29,9 37,3

HtrA: S. typhymurium 32,4 39,1

HtoA: H. influenzae 31,9 39,2

HhoB/DegS: H. influenzae 31,2 40,0

spHtrA: S. pneumoniae 55,6 62,0

HtrA: Lb. helveticus 46,9 54,1

YyxA: B. subtilis 43,5 52,0

YkdA: B. subtilis 42,5 49,4

25

La proteína HtrA de la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis posee los tres aminoácidos Ser, His y Asp, que definen el sitio catalítico característico de las serina proteasas emparentadas con la tripsina, entre las cuales la familia HtrA; además esta proteína presenta, en torno a estos tres aminoácidos, los tres motivos siguientes: DAYVVTNYH127VI, D157LAVLKIS, y GNS239GGALINIEGQVIGIT, que corresponden a los consensos definidos por PALLEN y WREN 5 (Mol. Microbiol. 19: 209-21, 1997) para el dominio catalítico de las proteasas HtrA: GY--TN-HV-, D-AV---- y GNSGG-L-N-G--IGIN.

Ésta posee en su extremo N-terminal una secuencia de aminoácidos hidrófobos L10LTGVVGGAIALGGSAI26 que corresponde a un supuesto segmento transmembrana. La proteína HtrALI de L. lactis subesp. lactis sería, por lo tanto, una proteína integrante de la membrana 10 citoplasmática. De acuerdo con la regla llamada “de la parte positiva en el interior” concerniente a la topología de estas proteínas (VON HEIJNE, Nature, 341: 456-8, 1989) su topología corresponde al tipo “C-out”, es decir que su parte C-terminal, que comprende en particular su sitio catalítico, estaría expuesta al exterior de la membrana plasmática. Al igual que la proteasa HtrA de E. coli, HtrALI de L. lactis subesp. lactis aparece por lo tanto como una proteasa de la envuelta, que puede degradar 15 proteínas exportadas. Los aminoácidos del dominio catalítico y del dominio transmembrana están enmarcados en la figura 1.

Los Inventores procedieron a la inactivación de este gen mediante mutación; a temperatura óptima (30ºC), la cepa mutante de L. lactis subesp. lactis obtenida de este modo es viable y crece normalmente; por el contrario su crecimiento y su viabilidad resultan afectados a temperaturas 20 más altas (a partir de 37ºC), tanto en placa como en medio líquido.

Además, los Inventores estudiaron el efecto de esta mutación sobre la exportación de diferentes proteínas de fusión, y constataron que la inactivación de la proteasa HtrALI en L. lactis bastaba para suprimir totalmente la degradación de las proteínas exportadas; este efecto es sorprendente, teniendo en cuenta la proteolisis residual observada anteriormente en otras bacterias 25 después de la inactivación de proteasas de la familia HtrA.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento para la producción de una proteína de interés, caracterizado por que comprende el cultivo de una bacteria que expresa dicha proteína de interés, y la obtención de dicha proteína de interés exportada por la bacteria, caracterizado por que dicha bacteria es una bacteria gram positiva seleccionada entre Streptococcaceae, 30 Lactobacillaceae. Bacillaceae, del género Listeria, y Enterococcaceae, del género Enterococcus, cuya proteasa de superficie HtrA está inactivada por mutación. Ventajosamente, dicha bacteria se selecciona entre los lactococos.

Ventajosamente, dicha cepa bacteriana también puede comprender una o más modificaciones diferentes de su genoma, que pretenden mejorar la producción y/o la secreción de 35 proteínas expresadas en dicha bacteria, y/evitar su degradación. De acuerdo con el tipo de proteína que se desee obtener, puede utilizarse por ejemplo una cepa bacteriana en la que la actividad de proteasa PrtP se haya inactivado, y/o una cepa bacteriana que sobre-produzca una proteína que permite

estabilizar las proteínas exportadas, tal como la proteína Nlp4 de Lactococcus lactis, o uno de sus homólogos (POQUET et al. 1998, publicación mencionada anteriormente).

La presente invención también tienen por objeto cualquier cepa bacteriana, que pueda obtenerse a partir de una bacteria gram positiva, tal como se ha definido anteriormente, mediante una mutación que inactiva la proteasa de superficie HtrA de dicha bacteria, y que comprende además al 5 menos una casete de expresión de un gen de interés, a excepción de una cepa de Lactobacillus helveticus que comprende una sola casete de expresión, constituida por la secuencia que codifica el gen informador gusA insertada en el gen htrA de dicha cepa, bajo el control transcripcional del promotor de dicho gen.

Se entiende por: “casete de expresión” cualquier construcción de ADN recombinante 10 que comprende un gen de interés que se desea expresar, o un sitio que permite la inserción de dicho gen, situado bajo el control de secuencias de regulación de la transcripción (promotor, terminador) funcionales en la bacteria huésped en cuestión.

En el sentido de la presente invención, se entiende por: “proteasa HtrA” cualquier serina proteasa de tipo tripsina, que presenta similitudes funcionales y estructurales suficientes con la 15 proteasa HtrA de E. coli, para poder agruparse en la misma familia, es decir:

- un sitio catalítico formado por los tres aminoácidos Ser, His y Asp;

- la presencia, alrededor de este sitio catalítico, de las regiones consenso: -GY--TN-HV-, D-AV---- y GNSGG-LN-G-IGIN;

- una señal de exportación que permite a la proteasa ser transportada hasta la superficie celular 20 de la bacteria (puede tratarse, por ejemplo, de un péptido señal, de un dominio transmembrana, de una señal de anclaje a la pared, etc.).

Para la realización de la presente invención, pueden obtenerse bacterias mutantes desprovistas de actividad HtrA realizando una o más mutaciones, particularmente a nivel de la secuencia que codifica la proteasa HtrA y/o a nivel de las secuencias de regulación que permiten la 25 expresión del gen htrA, para impedir la expresión de una proteasa HtrA funcional. Estas mutaciones pueden realizarse de manera convencional, mediante deleción, inserción, o sustitución de al menos un nucleótido o una secuencia nucleotídica en el gen HtrA; éstas pueden dar como resultado la ausencia de producción de HtrA, o la producción de una proteasa HtrA en la que al menos un aminoácido necesario para la actividad se ha delecionado o ha sido sustituido. 30

Las técnicas de mutagénesis apropiadas son conocidas por sí mismas; ventajosamente, se utilizarán técnicas de mutagénesis dirigida, en la medida en que los datos disponibles sobre las proteasas de la familia HtrA permiten, incluso aunque no dispongamos de informaciones más precisas sobre la secuencia específica del gen que se desea inactivar, dirigir a la o las mutaciones a dominios conservados necesarios para la actividad (por ejemplo el dominio catalítico). 35

La presente invención puede aplicarse en muchos ámbitos.

En primer lugar, la presente invención puede utilizarse en el ámbito de la producción de proteínas de interés (por ejemplo enzimas, proteínas humanas, etc.) mediante ingeniería genética a

partir de cultivos de bacterias transformadas con un gen de interés. En este ámbito, la presente invención permite mejorar el rendimiento en proteínas exportadas (y en particular secretadas), y evitar su contaminación con productos de proteolisis, inactivos: esto permite purificarlas fácilmente y a un menor coste.

Para esta aplicación se utilizarán preferiblemente cepas mutantes obtenidas a partir de 5 bacterias no patógenas, tales como Lactococcus spp., Lactobacillus spp., así como estreptococos alimentarios, Streptococcus thermophilus.

Las cepas mutantes obtenidas a partir de bacterias habitualmente utilizadas en la industria agroalimentaria, tales como las bacterias lácticas (particularmente, lactococos, lactobacilos y estreptococos termófilos), pueden utilizarse ventajosamente en este mismo ámbito. Por ejemplo, 10 pueden utilizarse en la composición de fermentos, para producir proteínas heterólogas que permitan mejorar la calidad del producto fermentado acabado; de este modo, la exportación de enzimas extrañas producidas por una cepa mutante de L. lactis de acuerdo con la invención, a quesos fermentados por L. lactis puede mejorar su maduración y sus cualidades organolépticas.

Estas cepas mutantes también pueden utilizarse para la obtención de productos 15 dietéticos o de medicamentos. En este ámbito pueden utilizarse, por ejemplo, cepas mutantes de acuerdo con la invención para expresar, previamente a la ingesta del producto, y/o después de su ingesta, proteínas con efecto profiláctico o terapéutico, tales como enzimas (que permiten por ejemplo facilitar la digestión), proteínas que permitan estimular el sistema inmunitario, antígenos de vacunas, etc. En la mayor parte de los casos, se preferirá, para las utilizaciones en este ámbito, y para garantizar 20 una inocuidad máxima, cepas mutantes obtenidas a partir de bacterias no patógenas, y ventajosamente, de bacterias utilizadas habitualmente para alimentación. Sin embargo, en el marco de utilizaciones en vacunas, pueden utilizarse cepas mutantes obtenidas a partir de bacterias (particularmente estreptococos, estafilococos, enterococos o listeria) patógenas, y preferiblemente, de variantes de estas bacterias que ya portan una o más mutaciones que atenúan su poder patógeno; la inactivación de la 25 proteína HtrA, que limita las capacidades de supervivencia de estas bacterias en condiciones de estrés, puede contribuir a atenuar su virulencia, como se ha observado anteriormente en el caso de algunas bacterias gram negativas.

En el marco de algunas aplicaciones, en las que la bacteria huésped debe ser viable y capaz de producir proteínas a temperaturas del orden de 35 a 40ºC, por ejemplo la producción en 30 fermentador de algunas proteínas, o la producción después de la ingesta, en el tacto digestivo del ser humano o de un animal, de proteínas con actividad terapéutica o profiláctica, se utilizarán ventajosamente cepas mutantes obtenidas a partir de bacterias termófilas, tales como Streptococcus thermophilus.

La presente invención se entenderá mejor con ayuda de la siguiente descripción, que se 35 refiere a ejemplos no limitantes, que ilustran la obtención de mutantes de L. lactis en los que la proteasa de superficie HtrA es inactiva, y las propiedades de estos mutantes.

EJEMPLO 1: INACTIVACIÓN DEL GEN htrA DE L. lactis

El gen htrA, portado por el cromosoma de la cepa IL1403 (CHOPIN et al. Plasmid, 11, 260-263, 1984) de L. lactis subesp. lactis, se inactivó mediante integración de un plásmido suicida que porta un fragmento interno del gen (FA) de 665 pb.

Como control positivo de integración, se utilizó un plásmido suicida que porta un 5 fragmento truncado en 3' (GA) de 902 pb, cuya integración en el cromosoma restituye una copia silvestre del gen.

Estos fragmentos se obtuvieron previamente mediante amplificación por PCR, a partir del ADN genómico de la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis, utilizando los pares de cebadores F/A y G/A: 10

- F [5'-GGAGCCA(G/T)(A/C/T)GC(A/G/C/T)(C/T)T(A/G/T)GG-3'] localizado cadena abajo del codón de inicio ATG

- G [5'-GTTTCCACTTTTCTGTGG-3'] localizado cadena arriba del promotor de htrA

- A [5'-TT(A/T)CC(A/T)GG(A/G)TT(A/G/T)AT(A/G/C/T)GC-3'] localizado cadena arriba del codón de la serina del sitio catalítico. 15

El emplazamiento de los cebadores, F, G, y A, se indica en la figura 1.

La amplificación se realizó en las siguientes condiciones:

- mezcla de reacción: 0,2 mM de cada dNTP, 5 M de cada oligonucleótido, aproximadamente 500 ng de ADN cromosómico, 2 mM de MgCl2, 1,25 unidades de Taq-DNA-pol (BOEHRINGER MANNHEIM) en el tampón Taq suministrado por el fabricante; 20

- condiciones de temperatura: 5 minutos a 94ºC, 30 ciclos (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 46ºC y 30 segundos a 72ºC), y 4ºC.

Los fragmentos amplificados se ligaron al plásmido lineal pGEMT (PROMEGA). Después de la transformación de E. coli TG1 con los productos de ligamiento, se seleccionan los clones resistentes a ampicilina, y desprovistos de actividad de -galactosidasa. Los plásmidos obtenidos, que 25 portan respectivamente los fragmentos FA y GA, se denominan pES1.1 y pES2.1.

Los insertos FA y GA se sub-clonaron en un vector suicida que porta un gen de resistencia a cloranfenicol. Al ser este vector incapaz de replicarse solo en ausencia de la proteína RepA que es necesaria para el inicio de su replicación, se crearon cointegrantes mediante ligamiento entre cada uno de los plásmidos pES1.1 y pES2.1, y el vector suicida, previamente linealizados. 30

Después de la transformación de la cepa TG1 de E. coli, y selección de los clones que resisten a cloranfenicol, se delecionó la parte de pGEMT de los cointegrantes, y los vectores se re-circularizaron. Los plásmidos obtenidos se multiplican en la cepa de E. coli TG1 repA+; después de la selección de los clones resistentes a cloranfenicol, se obtienen los plásmidos suicidas denominados pVS6.1 y pVS7.4. 35

pVS6.1 contiene el fragmento FA, y pVS7.4 contiene el fragmento GA del gen htrALI de la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis.

Estos plásmidos se utilizaron para transformar la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis; los clones que habían integrado estos plásmidos en el locus htrA en el cromosoma se seleccionaron en presencia de cloranfenicol.

En los dos casos, se obtuvieron varios clones independientes resistentes a cloranfenicol. Cinco clones de cada clase, indicados como A a E en el caso de la integración de 5 pVS6.1, y 17 a 22 en el caso de la integración de pVS7.4, se seleccionaron para el análisis.

Para cada uno de estos clones, la integración en el locus htrA se confirmó mediante transferencia de Southern.

Dos clones, A y 17, se seleccionaron para los siguientes análisis; estos constituyen los dos prototipos de las cepas mutantes, que se denominarán en lo sucesivo: 10

- htrA (mutación nula del gen htrALI, CmR); esta cepa no expresa ninguna proteasa HtrA activa;

- htrA+/htrA (copia silvestre + copia truncada del gen htrALI, CmR); esta cepa expresa una proteasa HtraLI activa.

EJEMPLO 2: PAPEL DEL GEN htrALI DE L. lactis EN LA SUPERVIVENCIA A ALTA 15 TEMPERATURA

Las dos cepas htrA y htrA+/htrA se cultivaron, en cultivo líquido, en las condiciones habituales de cultivo de L. lactis, es decir a 30ºC y en presencia de oxígeno pero sin agitación, y en presencia de cloranfenicol.

El comportamiento de la cepa htrA de L. lactis subesp. lactis a 30ºC y a 37ºC, se 20 estudió utilizando como controles a la cepa htrA+/htrA, así como a la cepa parental IL403 (cultivada en ausencia de cloranfenicol).

Las bacterias se cultivaron durante 1 noche a temperatura ambiente, en medio M17 que contenía el 1% de glucosa (+2,5 g/ml de cloranfenicol para las dos cepas htrA y htrA+/htrA). Los cultivos se diluyeron a la 1/1001ª por la mañana en el mismo medio, y se dividieron en dos lotes 25 colocados en semi-anaerobiosis a 30ºC o a 37ºC. El crecimiento se supervisó mediante la medición de la DO600.

Los resultados se ilustran mediante la figura 2.

A 30ºC (figura 2A), se constata que la cepa htrA+/htrA (), la cepa htrA (), y la cepa silvestre IL1403 () presentan tiempos de generación muy próximos: 65 minutos para la cepa 30 silvestre, 70 minutos para htrA+/htrA, y 75 minutos para htrA; finalmente, para los 3 cultivos, los valores de DO600 que corresponden a la fase estacionaria son muy comparables (DO600 = 2,1 a 2,2).

Estos resultados indican que no hay diferencia de crecimiento significativa entre estas tres cepas a 30ºC.

A 37ºC (figura 2B), la cepa htrA+/htrA () tiene un tiempo de generación de 100 35 minutos, y la DO600 de la fase estacionaria es menor que a 30ºC (DO600 = 1,25). Un menor crecimiento a 37ºC que a 30ºC también se observa para la cepa silvestre IL1403 (); el tiempo de generación es de 65 minutos, pero la DO600 de la fase estacionaria es menor que a 30ºC (DO600 = 1,9). En el caso de la

cepa htrA () el crecimiento es muy reducido, incluso nulo, y la DO600 no supera 0,1 incluso después de 7 horas de cultivo.

De estos resultados se deduce que la cepa htrA de L. lactis subesp. lactis es termosensible, y que la mutación htrA es letal a 37ºC.

5

EJEMPLO 3: PAPEL DEL GEN htrALI DE L. LACTIS EN LA PROTEOLISIS DE SUPERFICIE

Se ensayó el efecto de la mutación htrALI sobre la estabilidad de cinco proteínas exportadas. Estas proteínas son:

i) una proteína heteróloga, la nucleasa secretada de S. aureus, Nuc; esta proteína es expresada 10 por el plásmido pNuc3 (LE LOIR et al., J. Bacteriol. 176: 5135-5139, 1994; LE LOIR et al., J. Bacteriol. 180: 1895-903 1998);

ii) tres proteínas híbridas (Usp-SPNuc, Nlp4-SPNuc, y Exp5-SPNuc) que resultan de la fusión entre el informador SPNuc y fragmentos de proteínas exportadas de L. lactis: la proteína secretada Usp45 (VAN ASSELDONK et al., Gene 95: 155-60, 1990), la 15 lipoproteína Nlp4, y la proteína Exp5 (que es, a su vez, una proteína de fusión entre una proteína exportada y una proteína citoplasmática); estas proteínas, así como los plásmidos pVE8009, pVE8024 y pVE8021 que las expresan respectivamente, son descritas por POQUET et al. (1998, publicación mencionada anteriormente);

iii) una proteína exportada de forma natural de L. lactis, AcmA. 20

En la cepa silvestre MG1363 de L. lactis subesp. cremoris, se secreta Usp-SPNuc, Nlp4-SPNuc está asociada a las células; para estas 2 proteínas, se detectan en el medio, al lado de la forma madura, diferentes productos de degradación, entre los cuales el péptido NucA procedente de la parte SPNuc de la fusión; en cuanto a la fusión tripartita Exp5-SPNuc, ésta es muy inestable y no se detecta la forma madura en el medio sino solamente los productos de degradación, entre los cuales el 25 péptido NucA. La forma madura, así como los productos de degradación de estas tres proteínas híbridas pueden detectarse con ayuda de anticuerpos anti-NucA.

La proteína exportada de forma natural de L. lactis seleccionada es la bacteriolisina AcmA (BUIST et al., J. Bacteriol. 177: 1554-1563, 1995). Esta proteína que degrada el peptidoglicano es a la vez secretada y asociada a la superficie, probablemente por afinidad con su sustrato. Presenta, 30 tanto en la cepa MG1363 de L. lactis subesp. cremoris como en la cepa IL1403 de L. lactis subesp. lactis, productos de proteolisis activos y por lo tanto detectables, como la proteína intacta, mediante zimograma.

Las cepas transformadas con los plásmidos que expresan estas diferentes proteínas se cultivan a 30ºC durante varias horas, al menos hasta la mitad de la fase exponencial o hasta el 35 comienzo de la fase estacionaria.

Para cada plásmido, se utilizaron cultivos de las tres cepas IL1403, htrA, y htrA+/htrA, que hubieran alcanzado DO600 comparables para extraer muestras proteicas: a) del cultivo total, b) de

las células, c) del medio, de acuerdo con el protocolo descrito por POQUET et al., (1998, publicación mencionada anteriormente).

Estas muestras se someten a una electroforesis (SDS-PAGE) en gel desnaturalizante.

Para detectar las proteínas Nuc, Usp-SPNuc, Nlp4-SPNuc, Exp5-SPNuc, y sus productos de degradación, se procede a una transferencia de las proteínas sobre membrana, y a 5 continuación a una revelación inmunológica gracias a anticuerpos anti-NucA, que se detectan con ayuda un conjugado proteico G/peroxidasa (BIO-RAD), y de un kit de quimioluminiscencia (DUPONT-NEN).

AcmA se detecta mediante zimograma (BUIST et al., 1995, publicación mencionada anteriormente): micrococos cuya pared es sensible a AcmA se incluyen en el gel de electroforesis a la 10 concentración del 0,2%, lo que le hace opaco; después de la electroforesis, el gel se trata a 37ºC durante una noche en un tampón que contiene 50 mM de Tris/HCl a pH 7 y el 0,1% de Triton X100, lo que permite la lisis de los micrococos por AcmA o sus productos de proteolisis activos. El gel se tiñe a continuación con azul de metileno al 0,1% en KOH al 0,01%: las bandas correspondientes a la actividad de AcmA aparecen como halos de hidrólisis transparentes sobre fondo azul. 15

Para cada proteína, se compararon los perfiles de degradación en las cepas IL1403, htrA, y htrA+/htrA, observando el contenido proteico acumulado durante varias horas de cultivo.

Las figuras 3 a 6 presentan respectivamente los resultados de detección inmunológica, para las proteínas Nuc, Usp-SPNuc, Nlp4-SPNuc y Exp5-SPNuc. Para las proteínas Nuc, (figura 3) y Usp-SPNuc, (figura 4). 20

La figura 7 representa un zimograma de la actividad de bacteriolisina de AcmA; la detección se realizó en el conjunto del cultivo (T), solamente las células (C) o el medio (M).

En la cepa IL1403:

Para las proteínas secretadas Nuc y Usp-SPNuc (figuras 3 y 4: tres primeros pocillos), y para la lipoproteína Nlp4-SPNuc (figura 5: primer pocillo), se detecta un perfil de tres bandas, como 25 se ha observado anteriormente en la cepa MG1363 (LE LOIR et al., 1994; POQUET et al., 1998, publicaciones mencionadas anteriormente):

a) la de mayor peso molecular es el precursor cuyo péptido señal no se ha escindido, lo que se confirma mediante su presencia exclusiva en las células (figuras 3 y 4);

b) la banda intermedia es la forma madura después de la escisión del péptido señal, y está presente 30 exclusivamente en el medio en el caso de las proteínas secretadas Nuc y Usp-SPNuc (figuras 3 y 4);

c) la banda de menor peso molecular es el péptido NucA que migra prácticamente de forma conjunta con la forma comercial NucA purificada a partir de S. aureus (debiéndose la ligera diferencia de migración a las distintas especificidades de escisión en S. aureus y L. lactis), y que se 35 encuentra a la vez libre en el medio y asociado a las células.

Para la proteína Exp5-SPNuc (figura 6: primer pocillo) solamente se detectan con mucha dificultad dos formas, una de alto peso molecular, y una de escaso peso molecular, NucA, que

migra prácticamente de forma conjunta con la forma purificada comercial; la proteolisis en IL1403 es, por lo tanto, prácticamente total.

Para la proteína AcmA (figura 7: los tres primeros pocillos), se detecta como se ha observado anteriormente en la cepa MG1363 (BUIST et al., 1995, publicación mencionada anteriormente), un perfil de cuatro bandas: 5

a) la de mayor peso molecular es el precursor cuyo péptido señal no se ha escindido, que está presente exclusivamente en las células;

b) la banda de peso molecular ligeramente inferior es la forma madura después de la escisión del péptido señal, que está a la vez secretado en el medio y asociado a la superficie de las células por afinidad por su sustrato; 10

c y d) las dos bandas de menor peso molecular son productos de proteolisis activos, a la vez secretados en el medio y asociados a la superficie de las células por afinidad por su sustrato.

En la cepa htrA+/htrA:

(Figuras 3 y 4: tres últimos pocillos, figuras 5 y 6: último pocillo, y figura 7: tres últimos pocillos). Los perfiles observados son absolutamente idénticos a los observados en la cepa 15 silvestre. La cepa htrA+/htrA presenta, por lo tanto, un fenotipo de proteolisis silvestre, que se explica por la copia silvestre del gen htrALI que posee.

En la cepa htrA:

(Figuras 3 y 4: tres pocillos centrales, figuras 5 y 6: pocillo central, y figura 7: tres pocillos centrales). 20

En todos los casos, no se detecta ninguno de los productos de proteolisis; simultáneamente, la cantidad de proteína madura (o de alto peso molecular en el caso de Exp5-SPNuc) aumenta.

Estos resultados muestran que el producto del gen htrALI es, en efecto, responsable de la degradación de las proteínas secretadas, y que su inactivación conlleva la supresión total de esta 25 degradación.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA) 30

POQUET, Isabelle

GRUSS, Alexandra

BOLOTINE, Alexandre

SOROKINE, Alexei

<120> BACTERIAS GRAM POSITIVAS DESPROVISTAS DE ACTIVIDAD DE PROTEASA HtrA, Y SUS UTILIZACIONES

<130> MJPcb539/89

5

<140>

<141>

<150> FR9816462

<151> 24-12-1998 10

<160> 2

<170> PatentIn Ver. 2.1

15

<210> 1

<211> 1740

<212> ADN

<213> Lactococcus lactis

20

<220>

<221> CDS

<222> (230)..(1453)

<400> 1 25

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende el cultivo de una bacteria que expresa dicha proteína de interés y la obtención de dicha proteína de interés exportada por dicha bacteria, caracterizado por que dicha bacteria es una bacteria gram positiva seleccionada entre Streptococcaceae, Lactobacillaceae, Bacillaceae, de los géneros Staphylococcus y 5 Listeria, y Enterococcaceae, del género Enterococcus, cuya proteasa de superficie HtrA está inactivada por mutación.
2. Procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado por que dicha bacteria gram positiva se selecciona entre el grupo constituido por Lactococcus spp., Lactobacillus spp., y Streptococcus thermophilus. 10
3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicha bacteria gram positiva se selecciona entre el grupo constituido por Lactococcus spp., y está desprovista de actividad de proteasa PrtP.
4. Bacteria gram positiva tal como se define en las Reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que comprende al menos una casete de expresión de un gen de interés, a excepción de una cepa de 15 Lactobacillus helveticus que comprende una sola casete de expresión, constituida por la secuencia que codifica el gen informador gusA insertada en el gen htrA de dicha cepa de Lactobacillus helveticus bajo el control transcripcional del promotor de dicho gen htrA.
5. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 3, para la preparación de un producto fermentado. 20
6. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 2 a 3, para la preparación de un alimento dietético.
7. Utilización de una bacteria tal como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un medicamento.
8. Utilización de acuerdo con la Reivindicación 7, caracterizada por que dicho 25 medicamento es una vacuna.