ES2355578T3 - Elemento regulador preferido del pericarpio. - Google Patents

Abstract

Un elemento regulador aislado que puede dirigir la transcripción de manera preferida en el pericarpio que comprende la SEC ID Nº: 1 o las bases 530 a 1157 de la SEC ID Nº: 1 o que consiste en las bases 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de biología molecular en plantas, más particularmente a la regulación la expresión de genes en plantas. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La expresión de secuencias de ADN heterólogas en una planta hospedadora depende de la presencia de elementos reguladores unidos operativamente que son funcionales dentro de la planta hospedadora. La elección del elemento regulador determinará cuándo y dónde se expresará la secuencia de ADN heteróloga, en el organismo. Cuando se desea la expresión continua a través de las células de una planta y/o a través del desarrollo, se utilizan 10 promotores constitutivos. Por el contrario, cuando se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, el elemento regulador de elección son los promotores inducibles. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, pueden usarse promotores específicos de tejidos. Es decir, estos pueden conducir la expresión en tejidos u órganos específicos. Dichos promotores específicos de tejidos pueden ser temporalmente constitutivos o inducibles. En cualquier caso, las secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas abajo a partir de una secuencia promotora núcleo 15 pueden incluirse en construcciones de expresión de vectores de transformación para efectuar diversos niveles de expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.

A medida que se desarrolla este campo y que más genes se hacen accesibles, existe una mayor necesidad de plantas transformadas con genes múltiples. Sin embargo, estos genes exógenos múltiples necesitan típicamente controlarse por secuencias reguladoras individuales. Adicionalmente, algunos genes deben regularse de manera 20 constitutiva mientras que otros genes deben expresarse en determinadas etapas del desarrollo o localizaciones en el organismo transgénico. Por consiguiente, se necesita una diversidad de secuencias reguladoras con diversos efectos.

También se necesitan diversas secuencias reguladoras ya que usando la misma secuencia reguladora para controlar más de un gen, pueden obtenerse interacciones bioquímicas no deseadas. Por ejemplo, la transformación con copias múltiples de un elemento regulador puede ocasionar problemas, de manera que puede verse afectada la 25 expresión de uno o más genes.

La expresión de secuencias de ADN heterólogas en una planta hospedadora depende de la presencia de un promotor unido operativamente que es funcional dentro de la planta hospedadora. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde se expresará la secuencia de ADN heteróloga, en el organismo. Por tanto, cuando se desea la expresión en un tejido preferido de una planta, se utilizan promotores preferidos de tejidos. Por el 30 contrario, cuando se desea la expresión génica a través de las células de una planta, el elemento regulador de elección son los promotores constitutivos. Pueden incluirse secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas abajo a partir de la secuencia promotora núcleo en construcciones de expresión de vectores de transformación para efectuar diversos niveles de expresión constitutiva o preferida de tejidos de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica. 35

El aislamiento y la caracterización de promotores y terminadores preferidos del pericarpio, que pueden servir como elementos reguladores para la expresión de secuencias de nucleótidos de interés aisladas, de una manera preferida del pericarpio, son necesarios para impactar en diversos rasgos en plantas y durante el uso con marcadores puntuables. Los inventores han aislado precisamente un promotor y terminador de este tipo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 40

La Figura 1A muestra la secuencia del promotor de ZM-LTP1 de 1,2 kb (SEC ID Nº: 1) mostrando la versión 0.8 hasta el área sombreada y mostrando la versión 0.6 hasta las secuencias en cursiva; la Figura 1B muestra las secuencias del transcrito ZM-LTP1 (SEC ID Nº: 3) con la fase de lectura abierta en todos los extremos; y la Figura 1C muestra la región terminadora (SEC ID Nº: 2).

La Figura 2 es el promotor de LTP1 que muestra la localización de motivos como se describe en la Tabla 1, y 45 mostrando también la caja TATA en negrita.

La Figura 3 muestra la secuencia del promotor de LTP1 con seis puntos de deleción y la correspondencia de cada uno de los motivos de la Tabla 1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la invención, se describen secuencias de nucleótidos que permiten la regulación de la 50 transcripción en el pericarpio. Los elementos reguladores de plantas de la invención comprenden secuencias de nucleótidos asociadas con la formación del pericarpio y tejidos pericárpicos. Por lo tanto, los elementos reguladores de plantas de la presente invención comprenden nuevas secuencias de nucleótidos asociadas naturalmente con las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de transferencia de lípidos de Zea mays, identificada en este

documento como ZM-LTP1.

En una realización, el elemento regulador dirige la transcripción de una manera preferida en el pericarpio, en el que dicho elemento regulador comprende un nucleótido de la SEC ID Nº: 1; o las bases 530 a 1157 de la SEC ID Nº: 1 (“1er truncamiento); o consiste en las bases 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1 (“2º truncamiento”).

Realizaciones adicionales son para plantas y células de plantas que comprenden las secuencias de nucleótidos 5 anteriores. La invención se refiere adicionalmente a métodos para el uso de la secuencia en plantas y en células de plantas.

En este documento también se describen los casetes de expresión, vectores de transformación y el pericarpio de plantas que comprenden las secuencias de nucleótidos anteriores.

Por lo tanto, la invención también proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una 10 planta de una manera preferida en el pericarpio que comprende:

(i) transformar una célula de planta con un casete de expresión; y

(ii) cultivar la célula de planta para proporcionar una planta que tenga el casete de expresión de manera que la secuencia de nucleótidos se exprese preferencialmente en el pericarpio de la planta;

comprendiendo dicho casete de expresión una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador 15 que puede conducir la transcripción de una manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de:

(i) la SEC ID Nº: 1 o bases 530 a 1157 o 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1;

(ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1 que conserva la capacidad de conducir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos; 20

y

(iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1, que dirige la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio y

una célula de planta que comprende una secuencia heteróloga que es un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador que puede conducir la transcripción de una 25 manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de:

(i) la SEC ID Nº: 1 o bases 530 a 1157 o 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1;

(ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1 que conserva la capacidad de conducir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos;

y 30

(iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1, que dirige la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio y

una planta que comprende una secuencia heteróloga que es un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador que puede conducir la transcripción de una manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de: 35

(i) la SEC ID Nº: 1 o bases 530 a 1157 o 707 a 1157 de la SEC ID N: 1;

(ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1, que conserva la capacidad de conducir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos;

y

(iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1, que dirige la expresión de productos 40 endógenos o exógenos en el pericarpio.

Durante el proceso de reproducción, las angiospermas producen un ovario, que, junto con sus semillas, se desarrolla dentro de un fruto, es decir, un ovario u ovarios maduros, y partes adyacentes que pueden fusionarse a este. La pared del ovario maduro es el pericarpio e incluye las semillas. La manipulación de propiedades del pericarpio, la expresión de proteínas en el pericarpio y la expresión de marcadores en el pericarpio tiene numerosos usos en la 45 industria de plantas. Un promotor que exprese proteínas en la capa del pericarpio, es valioso para una diversidad de aplicaciones en la expresión de proteínas heterólogas incluyendo la expresión controlada de dichas proteínas en el tejido pericárpico. La unión del promotor con genes biosintéticos de la pared celular para regular la expresión de dichos

genes es útil en una amplia diversidad de situaciones.

Dicho promotor también es útil para dirigir secuencias que codifiquen proteínas para resistencia a enfermedades en el pericarpio. Adicionalmente, la unión de un promotor, que se expresa preferencialmente en el pericarpio, con un marcador, y particularmente, con un marcador visual, es útil durante el seguimiento de la expresión de un gen de interés unido. 5

Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos aislada en una planta usando las secuencias reguladoras descritas en este documento. El método comprende transformar una célula de planta con un vector de transformación que comprende una secuencia de nucleótidos aislada unida operativamente a una o más de las secuencias reguladoras de la planta de la presente invención y regenerar una planta establemente transformada a partir de la célula de planta transformada. De esta manera, las secuencias reguladoras son útiles para controlar la 10 expresión de productos endógenos así como exógenos de una manera preferida en el pericarpio.

Frecuentemente se desea tener expresión preferente de una secuencia de ADN en un tejido de un organismo. Por ejemplo, la resistencia aumentada de una planta contra el ataque de insectos puede conseguirse por manipulación genética del genoma de la planta para comprender un promotor específico de tejidos unido operativamente a un gen insecticida heterólogo de tal manera que las sustancias repelentes contra insectos se expresen específicamente en los 15 tejidos susceptibles de la planta. La expresión preferencial de la secuencia de nucleótidos heteróloga en el tejido apropiado reduce el drenaje sobre las fuentes de la planta que se produce cuando un promotor constitutivo inicia la transcripción de una secuencia de nucleótidos heteróloga a través de las células de la planta.

Como alternativa, podría desearse inhibir la expresión de una secuencia de ADN natural en los tejidos de la planta para conseguir un fenotipo deseado. En este caso, dicha inhibición podría conseguirse con la transformación de 20 la planta para comprender un promotor específico de tejidos unido operativamente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de manera que la expresión específica de tejidos de la secuencia antisentido produce un transcrito de ARN que interfiere con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN natural en un subconjunto de las células de la planta.

Bajo la regulación de los elementos reguladores específicos del pericarpio estará una secuencia de interés, que proporcionará la modificación del fenotipo del pericarpio. Dicha modificación incluye modular la producción de un 25 producto endógeno, como la cantidad, distribución relativa, o similar, o la producción de un producto de expresión exógeno para proporcionar una nueva función o producto en el pericarpio.

Definiciones

La expresión “preferida en el pericarpio” se refiere a expresión favorecida en el pericarpio, en la pared del ovario de una planta y similar. 30

“Ovario” se refiere a un ovario u ovarios maduros y partes adyacentes que pueden fusionarse a este.

"Elemento regulador” se refiere a secuencias de expresión responsables de la secuencia codificante asociada que incluye, pero sin limitación, promotores, terminadores, amplificadores, intrones y similares.

“Terminador” se refiere a secuencias que son necesarias para la terminación de la transcripción: una región reguladora de ADN que hace que la ARN polimerasa se disocie del ADN, produciendo la terminación de la transcripción. 35

“Promotor” se refiere a una región reguladora de ADN que puede regular la transcripción de una secuencia unida a la misma. Normalmente esto comprende una caja TATA que puede dirigir la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de inicio de la transcripción apropiado para una secuencia codificante particular.

Adicionalmente, un promotor puede comprender otras secuencias de reconocimiento generalmente situadas aguas arriba o en dirección 5’ de la caja TATA, denominadas elementos promotores aguas arriba, que influyen en la 40 velocidad de inicio de la transcripción y además incluyen elementos que impactan en la expresión espacial y temporal de la secuencia de nucleótidos unida. Se reconoce que habiendo identificado las secuencias de nucleótidos de la región promotora descrita en este documento, se encuentra dentro del estado de la técnica aislar e identificar elementos reguladores adicionales en la región 5’ aguas arriba desde la región promotora particular identificada en este documento. Por lo tanto la región promotora descrita en este documento puede comprender elementos reguladores 45 aguas arriba tales como los responsables de la expresión de tejidos y temporal de la secuencia codificante y puede incluir amplificadores, el elemento de respuesta de ADN para una proteína reguladora transcripcional, sitios de unión a ribosomas, secuencias de inicio y detención transcripcionales, secuencias de inicio y detención traduccionales, secuencia activadora y similar.

De la misma manera, los elementos promotores que permiten la expresión en el tejido deseado, tal como el 50 pericarpio, pueden identificarse, aislarse, y usarse con otros promotores núcleo para confirmar la expresión preferida en el pericarpio. Promotor núcleo se refiere a la secuencia mínima necesaria para iniciar la transcripción, tal como la secuencia denominada caja TATA, que es común para promotores en genes que codifican proteínas. Por lo tanto, el promotor aguas arriba de ZM-LTP1 puede usarse opcionalmente junto con sus propios promotores o promotores núcleo de otras fuentes. El promotor puede ser natural o no natural en la célula en la que este se encuentra. 55

La secuencia promotora aislada de la presente invención puede modificarse para proporcionar una diversidad de niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos aislada. Puede utilizarse menos que toda la región promotora y conservarse la capacidad de conducir la expresión preferida en el pericarpio. Se reconoce que pueden modularse niveles de expresión de ARNm con deleciones específicas de partes de la secuencia promotora. Por tanto, el promotor puede modificarse para ser un promotor débil o fuerte. Generalmente, “promotor débil” se refiere a un promotor que 5 dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Un “nivel bajo” se refiere a niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.000 transcritos. De manera inversa, un promotor fuerte dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel alto o a aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos. Generalmente, para conducir la expresión de una secuencia de nucleótidos, se usarán al menos aproximadamente 20 nucleótidos de una secuencia 10 promotora aislada.

Se reconoce que, para aumentar los niveles de transcripción pueden utilizarse amplificadores, en combinación con las regiones promotoras de la invención. Los amplificadores son secuencias de nucleótidos que actúan para aumentar la expresión de una región promotora. En la técnica se conocen amplificadores e incluyen la región amplificadora del SV40, el elemento amplificador 35S y similares. 15

El promotor de la presente invención puede aislarse de la región 5’ de su región codificante natural o de la región 5’ no traducida (UTR 5’). Del mismo modo el terminador puede aislarse de la región 3’ que flanquea su codón de terminación respectivo. El término “aislado” se refiere a material, tal como una proteína o un ácido nucleico, que: (1) carece sustancial o esencialmente de componentes que normalmente acompañan o interaccionan con el material como se observa en su entorno de origen natural o (2) si el material se encuentra en su entorno natural, el material se ha 20 modificado por intervención humana deliberada para una composición y/o se ha colocado en un locus en una célula distinto al locus natural del material. En la técnica se conocen métodos para aislar regiones promotoras.

El promotor de ZM-LTP1 mostrado en la SEC ID Nº: 1 tiene 1157 nucleótidos de longitud y se muestra en la Figura 1A (SEC ID Nº: 1). El promotor de ZM-LTP1 se aisló de la región codificante de ZM-LTP1 de Zea mays y el transcrito de ZM-LTP1 se muestra en la Figura 1B, (SEC ID Nº: 3) con el sitio de inicio de transcripción subrayado y la 25 región terminadora se muestra en la Figura 1C (SEC ID NO: 2). Esta se aisló basándose en tecnología MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing (secuenciación de firma masivamente paralela)) a partir de análisis de expresión LINX (véase Brenner et al., Nature Biotechnology, 18:630-634 (2000)) mostrando fuerte expresión en el pericarpio del maíz a los 10-40 DDP (días después de la polinización). El promotor de ZM-LTP1 puede tratar problemas de expresión proporcionando este modelo de expresión. 30

Se descubrieron motivos de aproximadamente seis u ocho bases dentro de la secuencia del promotor de ZM-LTP1 buscando secuencias de tamaño similar y dentro de las 100 bases de la posición en las que se localizaron. Como se representa en la Tabla 1 y de acuerdo con la Figura 2, en el promotor de ZM-LTP1 se encontraron los siguientes motivos. En la Figura 2 se subrayan las bases correspondientes a los motivos indicados a continuación. También se muestra la caja TATA en negrita y sin subrayar. La referencia “Deleción Nº” se refiere a la deleción correspondiente 35 realizada en la variante del promotor de LTP1 como se describe a continuación en el Ejemplo 7 y en la Figura 3.

Tabla 1

Motivo de LTP1/ Deleción Número

Elemento Regulador Conocido Nombre Descripción

CCAACAAAC Delección Nº 1

AACAAAC AACACOREOSGLUB1 Núcleo de motivos AACA encontrados en genes de glutelina del arroz. (Oryza sativa), implicados en el control de la expresión específica del endospermo. También asociados con el motivo GCN4 en genes de glutelina del arroz y juntos confieren potenciación específica del endospermo para el promotor truncado-90 CaMV35S (véase Wu et al., Plant J., 23 de agosto del 2000, 23 (3) 415-21).

AGCTAGCT Deleción Nº 2

TTCCCCTAGCTAGA TACTTCATT Itp1D1, elemento preferente de epidermis

Motivo de LTP1/ Deleción Número

Elemento Regulador Conocido Nombre Descripción

CTAGCTGCA Deleción Nº 3

TTCCCCTAGCTAGA TACTTCATT Itp1D1. elemento preferente de epidermis

CTCTCTCTCT Deleción Nº 4

TTTCTCTCTCTCTC Tramo 5UTR rico en Pi Elemento que actúa en cis que confiere elevados niveles de transcripción

CATTCGT Deleción Nº 5

TAAAATACTATCCA TTCGTTAATAGTAA AATACT secuencia rica en AT, secuencia rica en AT Elemento para máxima activación mediada por inductor (2 parejas)

ATCCAC Deleción Nº 6

AATCCACA Motivo GT1 Elemento sensible a luz

GTGCACA Deleción Nº 6

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Los elementos reguladores de la invención pueden aislarse de cualquier planta, incluyendo, pero sin limitación, maíz, (Zea mays), colza (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum), semilla de soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), mijo (Panicum spp.), patata (Solanum tuberosum), 5 cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batalus), yuca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucifera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), avena (Avena sativa), cebada (Hordeum vulgare), hortalizas, plantas ornamentales y coníferas. Preferiblemente, las plantas incluyen maíz, semilla de soja, 10 girasol, cártamo, colza, trigo, cebada, arroz, alfalfa y sorgo.

Secuencias promotoras de otras plantas pueden aislarse de acuerdo con técnicas bien conocidas basándose en su homología de secuencia con respecto a la región homóloga codificante de las secuencias codificantes indicadas en este documento. En estas técnicas, toda o parte de la secuencia codificante conocida se usa como una sonda que se hibrida selectivamente con otras secuencias presentes en una población de fragmentos de ADN genómicos clonados 15 (es decir, genotecas) a partir de un organismo seleccionado. Existen métodos fácilmente disponibles en la técnica para la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos. Una amplia orientación con respecto a la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 “Overview principles of hibridization an the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, Nueva York (1993) y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel, et al., Eds., Greene 20 Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1995).

Los métodos de la presente invención pueden emplear secuencias que tienen una identidad de 90% con la SEC ID Nº: 1, que dirigen la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio. Dichas variantes funcionales incluyen, por ejemplo, las secuencias reguladoras naturales de la invención que tienen una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. Pueden crearse variantes funcionales de la invención mediante 25 mutagénesis dirigida, mutación inducida o pueden producirse como variantes alélicas (polimorfismos).

Como se usa en este documento, un “fragmento funcional” es una variante de secuencia reguladora formada por una o más deleciones a partir de un elemento regulador más grande. Por ejemplo, la parte 5’ de un promotor hasta la caja TATA cerca del sitio de inicio de la transcripción puede delecionarse sin anular la actividad promotora, como describen Opsahl-Sorteberg, H-G et al., “Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2 promoter directing aleurone 30 cell specific expression” Gene 341:49-58 (2004). Dichas variantes deben conservar la actividad promotora, particularmente la capacidad de conducir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos. La actividad puede medirse por análisis de transferencia de Northern, por mediciones de actividad indicadora cuando se usan fusiones transcripcionales y similares. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989): Molecular Clonning: A Laboratory Manual (2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). 35

Pueden obtenerse fragmentos funcionales usando enzimas de restricción para escindir las secuencias de

nucleótidos de elementos reguladores de origen natural descritas en este documento; sintetizando una secuencia de nucleótidos a partir de la secuencia de ADN de origen natural o pueden obtenerse mediante el uso de tecnología PCR, véase particularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol 155:335-350 y Erlich, ed. (1989) PCR Technology (Stockton Press, Nueva York).

Por ejemplo, una forma rutinaria para eliminar parte de una secuencia de ADN es usar una exonucleasa en 5 combinación con amplificación de ADN para producir deleciones anidadas unidireccionales de clones de ADN monocatenario. Un kit comercial para este propósito se comercializa con el nombre comercial Exo-Size (New England Biolabs, Beverly, Mass.). Brevemente, este procedimiento supone incubar exonucleasa III con ADN para eliminar progresivamente nucleótidos en dirección 3’ a 5’ en salientes 5’, terminaciones romas o mellas en el molde de ADN. Sin embargo, la exonucleasa III no puede eliminar nucleótidos en salientes 3’ de 4 bases. Digestiones temporalizadas de un 10 clon con esta enzima produce deleciones unidireccionales anidadas.

Como una sonda que puede hibridarse específicamente con secuencias promotoras correspondientes, puede usarse toda la secuencia promotora o partes de la misma. Para conseguir la hibridación específica en una diversidad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas y que tienen preferiblemente al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos aproximadamente de 20 nucleótidos de 15 longitud. Dichas sondas pueden usarse para amplificar secuencias promotoras correspondientes de un organismo seleccionado mediante el proceso bien conocido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta técnica puede usarse para aislar secuencias promotoras adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de la secuencia promotora en un organismo. Los ejemplos incluyen la exploración de hibridación de genotecas de ADN sembradas en placas (tanto placas como colonias; véase, por ejemplo, Innis et al. 20 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, eds., Academic Press). Los cebadores usados en el aislamiento del promotor de la presente invención se muestran en las SEC ID Nºs: 9, 10, 11 y 12.

Los elementos reguladores preferidos del pericarpio descritos en la presente invención, así como sus variantes y fragmentos, son útiles en la manipulación genética de cualquier planta cuando están unidos operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés aislada cuya expresión va a controlarse para conseguir una respuesta fenotípica 25 deseada.

Por “unido operativamente” se entiende una unión funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en el que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. El casete de expresión incluirá secuencias reguladoras 5’ y 3’ unidas operativamente al menos a una de las secuencias de la invención. 30

En una realización típica, en el contexto de un casete de sobre-expresión usado en el método de, o encontrado en la célula de la planta o planta de la invención, unido operativamente significa que las secuencias de nucleótidos que se unen son contiguas y, en las que es necesario unir dos o más regiones codificantes de proteínas, contiguas y en la misma fase de lectura. En el caso en que el casete de expresión usado en el método de, o encontrado en la célula de la planta o planta de la invención contenga dos o más regiones codificantes de proteínas unidas de una manera contigua 35 en la misma fase de lectura, el polipéptido codificado se define aquí, como un “polipéptido heterólogo” o un “polipéptido quimérico” o un “polipéptido de fusión”. El casete usado en el método de, o encontrado en la célula de la planta o planta de la invención puede contener adicionalmente al menos una secuencia codificante adicional a co-transformarse en el organismo. Como alternativa, la secuencia (o secuencias) codificante adicional puede proporcionarse en casetes de expresión múltiples. 40

Los elementos reguladores de la invención pueden unirse operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés aislada de cualquiera de las diversas maneras conocidas por un experto en la materia. La secuencia de nucleótidos de interés aislada puede insertarse dentro de un sitio en el interior del genoma que esté en 3’ con respecto al promotor de la invención usando integración específica de sitio como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 6.187.994. 45

Los elementos reguladores de la invención pueden unirse operativamente en casetes de expresión junto con secuencias de nucleótidos de interés aisladas para la expresión en el pericarpio de la planta deseada. Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de nucleótidos de interés bajo el control transcripcional de los elementos reguladores.

Los nucleótidos de interés aislados expresados por los elementos reguladores de la invención pueden usarse 50 para dirigir la expresión de una secuencia en la semilla o en la planta. Esto puede conseguirse aumentando la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio. Como alternativa, los resultados pueden conseguirse proporcionando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, particularmente enzimas o cofactores en el pericarpio. Esta regulación negativa puede conseguirse mediante cualquiera de las muchas estrategias diferentes conocidas por un experto en la materia, que incluyen antisentido, cosupresión, el uso de formaciones en 55 horquilla, u otras, y como se descrito anteriormente. La importación o exportación de un cofactor también permite el control de la composición del pericarpio. Se reconoce que los elementos reguladores pueden usarse con sus secuencias naturales u otras secuencias codificantes para aumentar o disminuir la expresión de una secuencia unida operativamente en la planta o semilla transformada.

Las categorías generales de genes de interés para los fines de la presente invención incluyen por ejemplo, los genes implicados en información, tales como dedos de zinc; los implicados en la comunicación, tales como quinasas; y los implicados en el mantenimiento, tales como proteínas de choque térmico. Las categorías más específicas de transgenes incluyen genes que codifican rasgos importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas y características del grano. Otras categorías más de transgenes incluyen genes 5 para inducir la expresión de productos exógenos tales como enzimas, cofactores y hormonas de plantas y otros eucariotas así como de organismos procariotas.

Las modificaciones que influyen en los rasgos del grano incluyen el aumento del contenido de ácido oleico, o modificación de niveles de ácidos grasos saturados o insaturados. Del mismo modo, puede aumentarse el nivel de proteínas del pericarpio, particularmente de proteínas del pericarpio modificadas que mejoran el valor nutricional del 10 pericarpio. Esto se consigue por la expresión de dichas proteínas que tienen potenciado el contenido de aminoácidos.

Puede desearse aumentar los niveles de lisina y de aminoácidos que contienen azufre así como la modificación del tipo de almidón y contenido en la semilla. En los documentos WO 9416078 presentado el 10 de abril de 1997; WO 9638562 presentado el 26 de marzo de 1997; WO 9638563 presentado el 26 de marzo de 1997 y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.703.409 expedida el 30 de diciembre de 1997 se describen modificaciones de la proteína 15 hordotionina. Otro ejemplo es lisina y/o la proteína pericárpica rica en azufre codificada por la albúmina 2S de semilla de soja descrita en el documento WO 9735023 presentada el 20 de marzo de 1996 y el inhibidor de quimotripsina de cebada, Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106.

Los rasgos agronómicos en pericarpios pueden mejorarse modificando la expresión de genes que: influyen en la respuesta del crecimiento del pericarpio o de la semillas y en el desarrollo durante el estrés ambiental, Cheikh-N et al 20 (1994) Plant Physiol. 106 (1):45-51) y en genes que controlan el metabolismo de hidratos de carbono para reducir el aborto de granos en maíz, Zinselmeier et al (1995) Plant Physiol. 107(2): 385-391.

Se reconoce que cualquier gen de interés, incluyendo la secuencia codificante natural, puede unirse operativamente a los elementos reguladores de la invención y expresarse en el pericarpio.

1. Transgenes que confieren resistencia contra insectos o enfermedades y que codifican: 25

(A) genes de resistencia a enfermedades de plantas. Las defensas de las planta a menudo se activan por interacción específica entre el producto de un gen de resistencia a enfermedades (R) en la planta y el producto de un gen de avirulencia correspondiente (Avr) en el patógeno. Una diversidad de plantas pueden transformarse con genes de resistencia clonados para modificar por ingeniería genética plantas que son resistentes a cepas patógenas específicas. Véase, por ejemplo Jones et al., Science 266: 789 (1994) 30 (clonación del gen Cf-9 del tomate para resistencia a Cladosporium fulvum); Martin et al., Science 262: 1432 (1993) (gen Pto del tomate para resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato que codifica una proteína quinasa); Mindrinos et al., Cell 78: 1089 (1994) (gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae); McDowell y Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4): 178-83 y Toyoda et al., (2002) Transgenic Res. 11 (6): 567-82. Una planta resistente a una enfermedad es una que es más resistente a un 35 patógeno en comparación con la planta de tipo silvestre.

(B) Una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma o un polipéptido sintético modelado en ella. Véase, por ejemplo, Geiser et al., Gene 48: 109 (1986), que describen la clonación y secuencia de nucleótidos de un gen delta-endotoxina de Bt. Además, pueden adquirirse moléculas de ADN que codifican genes delta-endotoxina procedentes de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD), por 40 ejemplo, con los Nos de acceso ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998. En las siguientes patentes y solicitudes de patentes: 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; WO 91/14778; WO 99/31248; WO 01/2731; WO 99/24581; WO 97/40162 y Nºs de Serie de Solicitud de Estados Unidos 10/032.717 (publicada como documento US 2002-0151709); 10/414.637 (publicada como documento US 2003-0177528 ) y 10/606,320 (publicada como documento US 2005-0260722) se proporcionan otros ejemplos de transgenes de Bacillus thuringiensis que 45 se modifican por ingeniería genética.

(C) Una hormona o feromona específica de insectos, tal como un

ecdiesteroide y hormona juvenil, una de sus variantes, un mimético basado sobre ella o uno de sus antagonistas o agonistas. Véase, por ejemplo, la descripción de Hammock et al., Nature 344: 458 (1990), de la expresión de baculovirus de la hormona esterasa juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil. 50

(D) Un péptido específico de insectos que, después de la expresión, modifica la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véase las descripciones de Regan, J. Biol. Chem. 269: 9 (1994) (la clonación de la expresión proporciona ADN que codifica el receptor de la hormona diurética de insectos); Pratt et al., Biochem. Biophys. Res Comm.163: 1243 (1989) (en Diploptera puntata se identifica una alostatina); Chattopadhyay et al (2004) Critical Reviews in Microbiology 30 (1): 33-54 2004; Zjawiony (2004) J Nat Prod 55 67 (2): 300-310; Carlini y Grossi-de-Sa (2002) Toxicon, 40 (11): 1515-1539; Ussuf et al (2001) Curr Sci. 80 (7): 847-853; y Vasconcelos y Oliveira (2004) Toxicon 44 (4): 385-403. Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.266.317 de Tomalski et al, que describe genes que codifican toxinas específicas de insectos.

(E) Una enzima responsable de una hiperacumulación de un monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxicinámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteína con actividad insecticida.

(F) Una enzima implicada en la modificación, incluyendo la modificación post-traduccional de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glucolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una quinasa, una 5 fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, tanto natural como sintética. Véase la Solicitud de patente PCT WO 93/02197 a nombre de Scott et al., que describe la secuencia de nucleótidos de un gen de calasa. Las moléculas de ADN que contienen secuencias que codifican quitinasa pueden obtenerse, por ejemplo, en la ATCC con los números de acceso 39637 y 67152. Véase también Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23: 691 (1993), que enseñan la secuencia de nucleótidos de un ADNc que 10 codifica quitinasa del anquilostoma del tabaco y Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21: 673 (1993), que proporciona la secuencia de nucleótidos del gen de poliubiquitina ubi4-2 del perejil y el Documento de Patente de Estados Unidos 6.563.020.

(G) Una molécula que estimula la transducción de señal. Por ejemplo, véase la descripción por Botella et al, Plant Molec. Biol. 24: 757 (1994), de secuencias de nucleótidos para clones de ADNc de calmodulina de 15 semilla de lenteja negra y Griess et al., Plant Physiol.104: 1467 (1994), que proporciona la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina del maíz.

(H) Un momento hidrófobo de un péptido. Véase la Solicitud PCT WO 95/16776 y el documento US 5.580.852 (descripción de derivados de péptidos de Taquiplesina que inhiben patógenos vegetales fúngicos) y la Solicitud PCT WO 95/18855 y el documento US 5.607.914) (que describe péptidos antimicrobianos 20 sintéticos que confieren resistencia a enfermedades).

(I) Una permeasa de membrana, un canal formador o un canal bloqueador. Por ejemplo, véase la descripción de Jaynes et al, Plant Sci. 89: 43 (1993), de expresión heteróloga de un péptido lítico beta-cecropina análogo para hacer que las plantas del tabaco transgénicas sean resistentes a Pseudomonas solanacearum.

(J) Una proteína invasiva viral o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de 25 proteínas de cubierta virales en células de plantas transformadas confiere resistencia a infección viral y/o al desarrollo de enfermedades ocasionadas por el virus a partir del cual deriva el gen de la proteína de cubierta, así como por virus relacionados. Véase Beachy et al., Ann Rev. Phytopathol. 28: 451 (1990). La resistencia mediada por proteínas de cubierta se ha conferido después de transformar plantas contra el virus del mosaico de la alfalfa, virus del mosaico del pepino, virus rayado del tabaco, virus X de la patata, virus Y de la 30 patata, virus del grabado del tabaco, virus del estriado necrótico del tabaco y virus del mosaico del tabaco. Anteriormente.

(K) Un anticuerpo específico de insectos o una inmunotoxina derivada del mismo. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido a una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, destruyendo el insecto. Consultar Taylor et al., Resumen Nº 497, Seventh Int’l Symposium on Molecular 35 Plant-microbe Interactions (Edimburgh, Scotland, 1994) (inactivación enzimática en tabaco transgénico mediante la producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios).

(L) Un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki et al., Nature 366: 469 (1993) que muestra que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes se protegen del ataque de virus. 40

(M) Una proteína producida en la naturaleza por un patógeno o un parásito, que detenga el desarrollo. Por ejemplo, las endo alfa-1,4-D-poligalacturonasa fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes de plantas al solubilizar la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared celular de la planta. Véase Lamb et al., BiolTechnology 10: 1436 (1992). Toubart et al., Plant J. 2: 367 (1992), describen la clonación y caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de endopoligalacturonasa de judía. 45

(N) Una proteína producida en la naturaleza por una planta que detenga el desarrollo. Por ejemplo, Logemann et al., BiolTechnology 10: 305 (1992), han demostrado que las plantas transgénicas que expresan el gen inactivador de ribosomas en cebada, tienen una resistencia aumentada a enfermedades fúngicas.

(O) Genes implicados en la Respuesta de Resistencia Adquirida Sistémica (SAR) y/o los genes relacionados con la patogénesis. Briggs, S., Current Biology, 5 (2): 128-131 (1995), Pieterse y Van Loon (2004) Curr. 50 Opin. Plant Bio. 7 (4): 456-64 y Somssich (2003) Cell 113 (7): 815-6.

(P) Genes antifúngicos (Cornelissen y Melchers, PI. Physiol. 101:709-712, (1993) y Parijs et al., Planta 183:258-264, (1991) y Bushnell et al., Can. J. of Plant Path. 20 (2): 137-149 (1998).

(Q) Genes desintoxicadores, tales como para furmonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados estructuralmente relacionados. Por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.792.931. 55

(R) Inhibidores de cistatina y cisteína proteinasas.

(S) Genes de defensina. Véase el documento WO03000863 y la Solicitud de Estados Unidos Nº de Serie 10/178.213 (publicada como documento US 2003-0041348).

(T) Genes que confieren resistencia a nematodos. Véase, el documento WO 03/033651 y Urwin et. al., Planta 204:472-479 (1998), Williamson (1999) Curr Opin Plant Bio. 2 (4): 327-31. 5

(U) Genes que confieren resistencia a la podredumbre radicular de fitóptora (Phytoptora Root Rot), tales como Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2, Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 y otros genes Rps. Véase, por ejemplo, Shomaker et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, CA (1995).

(V) Genes que confieren resistencia a la podredumbre marrón del tallo, como se describe en el documento 10 US 5.689.035.

2. Transgenes que confieren resistencia a un herbicida tales como:

(A) Un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tal como una imidazolinona o una sulfonilurea. Genes ejemplares en esta categoría que codifican enzimas mutantes ALS y AHAS se describen, por ejemplo, en Lee et al., EMBO J. 7: 1241 (1988) y Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80: 449 (1990), 15 respectivamente. Véanse también, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 y 5.378.824 y la publicación Internacional WO 96/33270.

(B) Glifosato (genes de resistencia conferida por un mutante 5-enolpiruvil-3-fosfiquitimato sintasa (EPSP) y aroA, respectivamente) y otros compuestos de fosforados tales como glufosinato (genes de fosfinotricina 20 acetil transferasa (PAT) y fosfinotricina acetil transferasa (bar) de Streptomyces hygroscopicus) y ácidos piridinoxi o fenoxi propriónicos y ciclohexonas (genes que codifican inhibidores de ACCasas). Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.940.835 de Shah et al., que describen la secuencia de nucleótidos de una forma de EPSP que puede conferir resistencia a glifosato. La Patente de Estados Unidos Nº 5.627.061 de Barry et al., también describe genes que codifican enzimas EPSP. Véanse también las 25 Patentes de Estados Unidos Nº 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876 B1; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 B1; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re 36.449; RE 37.287 E y 5.491.288; y las publicaciones internacionales EP1173580; WO 01/66704; EP1173581 y EP1173582. La resistencia a glifosato también se confiere a plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxido-reductasa como se describe 30 con más detalle en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.776.760 y 5.463.175. Además la resistencia a glifosato puede conferirse a plantas mediante la sobre-expresión de genes que codifican glifosato N-acetil transferasa. Una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante puede obtenerse de la ATCC con el nº de acceso 39256 y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.769.061 de Comai. La solicitud de Patente Europea Nº 0 333 033 de Kumada et al y la Patente 35 de Estados Unidos Nº 4.975.374 de Goodman et al., describen secuencias de nucleótidos de genes glutamina sintasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de fosfinotricina-acetil transferasa se proporciona en las Patentes Europeas Nº 0 242 246 y 0 242 236 de Leemans et al. De Greef et al., BiolTechnology 7: 61 (1989), describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad fosfinotricina acetil 40 transferasa. Véanse también, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616 B1 y 5.879.903. Genes ejemplares que confieren resistencia a ácidos fenoxi propiónicos y ciclohexonas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1-S1, Acc1-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall et al, Theor. Appl. Genet. 83: 435 (1992).

(C) Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de 45 la nitrilasa). Przibilla et al., Plant Cell 3: 169 (1991), describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes mutantes psbA. Las secuencias de nucleótidos de genes de la nitrilasa se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.810.648 de Stalker y las moléculas de ADN que contienen estos genes se encuentran disponibles en la ATCC con los Nos de acceso 53435, 67441 y 67442. Hayes et al, Biochem. J. 285: 173 (1992), describen la clonación y expresión de ADN que codifica una glutatión S-50 transferasa.

(D) El ácido acetohidroxi sintasa, que se ha descubierto que hace que las plantas que expresan esta enzima sean resistentes a tipos de herbicidas múltiples, se ha introducido en una diversidad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori et al (1995) Mol Gen Genet 246:419). Otros genes que confieren resistencia a herbicidas incluyen: un gen que codifica una proteína quimérica del citocromo de rata P4507A1 y una NADPH 55 oxidorreductasa del citocromo P450 en levaduras (Shiota et al (1994) Plant Physiol. 106:17), genes que codifican glutatión reductasa y superóxido dismutasa (Aono et al (1995) Plant Cell Physiol 36:1687, y genes que codifican diversas fosfotransferasas (Datta et al (1992) Plant Mol Biol 20:619).

(E) La protoporfirinógeno oxidasa (protox) es necesaria para la producción de clorofila, que es necesaria para la supervivencia de todas las plantas. La enzima protox sirve como la diana para una diversidad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las especies de plantas diferentes presentes, causando su destrucción total. El desarrollo de plantas que contienen actividad protox modificada que son resistentes a estos herbicidas se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 5 6.288.306 B1; 6.282.837 B1 y 5.767.373 y en la Publicación Internacional WO 01/12825.

3. Transgenes que confieren o contribuyen a una característica modificada del grano, tales como:

(A) Ácidos grasos modificados, por ejemplo, por

(1) Regulación por disminución de la estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624 (1992) y el documento 10 WO99/64579 (Genes for Desaturases to Alter Lipid Profiles in Corn),

(2) Aumento del ácido oleico mediante la modificación del gen FAD-2 y/o disminución del ácido linolénico mediante la modificación del gen FAD-3 (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y el documento WO 93/11245),

(3) Modificación del contenido del ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento WO 15 01/12800,

(4) Modificación de genes LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1ps, diversos Ipa tales como, Ipa1, Ipa3, hpt o hggt. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 02/42424, WO 98/22604, WO 03/011015, US 6.423.886. US 6.197.561. US 6.825.397. US2003/0079247, US2003/0204870, WO02/057439, WO03/011015 y Rivera-Madrid, R. et. al. Proc. National Acad. Sci. 92:5620-5624 (1995). 20

(B) Contenido de fósforo modificado, por ejemplo, por

(1) La introducción de un gen que codifica una fitasa potenciaría la degradación del fitato, añadiendo más fosfato libre en la planta transformada. Véase, por ejemplo, Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993), para una descripción de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger.

(2) Regulación por aumento de un gen que reduce el contenido del fitato. En el maíz, por ejemplo, esto 25 podría conseguirse clonando y después reintroduciendo ADN asociado con uno o más de los alelos, tales como los alelos de LPA, identificados en mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico, tales como en Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990) y/o modificando la actividad inositol quinasa como en los documentos WO 02/059324; US2003/0009011, WO 03/027243, US2003/0079247, WO 99/05298; US6197561, US6291224, US6391348, WO2002/059324, US2003/0079247, WO98/45448, WO99/55882 30 WO01/04147.

(C) Modificaciones del contenido en carbohidratos efectuado, por ejemplo, modificando un gen que codifica una enzima que influye en el modelo de ramificación del almidón o un gen que modifica tiorredoxina (véase el documento US 6.531.652). Véase Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (secuencia de nucleótidos del gen de fructosiltransferasa de mutantes de Streptococcus), Steinmetz et al., Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) 35 (secuencia de nucleótidos del gen de levansacarasa de Bacillus subtilis), Pen et al., BiolTechnology 10: 292 (1992) (producción de plantas transgénicas que expresan alfa-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993) (secuencias de nucleótidos de genes que codifican una invertasa del tomate), Sogaard et al., J. Biol. Chem. 274: 22480 (1993) (mutagénesis dirigida del gen que codifica la alfa-amilasa de la cebada) y Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (enzima II de ramificación del almidón del 40 endospermo del maíz), documento WO 99/10498 (digestibilidad mejorada y/o extracción del almidón mediante la modificación de la UDP-D-xilosa 4-epimerasa, Fragile 1 y 2, Ref1, HCHL, C4H), el documento US 6.232.529 (método de producción de semillas con elevado contenido en aceite por modificación de los niveles de almidón (AGP)). Los genes de modificación de ácidos grasos mencionados anteriormente también pueden usarse para influenciar en el contenido y/o composición del almidón mediante la interrelación de rutas del almidón y del 45 aceite.

(D) Contenido o composición antioxidante modificados, tal como la modificación de tocoferol o tocotrienoles. Por ejemplo, véanse los documentos US 6.787.683, US2004/0034886 y WO 00/68393, que implican la manipulación de niveles antioxidantes mediante la modificación de una fitil prenil transferasa (ppt), el documento WO 03/082899 mediante la modificación de una homogentisata geranil geranil transferasa (hggt). 50

(E) Aminoácidos esenciales en semillas modificados. Por ejemplo, véanse los documentos US 6.127.600 (método para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), US 6.080.913 (métodos binarios para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en semillas), US5990389 (alto contenido en lisina), WO 99/40209 (modificación de composiciones de aminoácidos en semillas), WO 99/29882 (métodos para modificar el contenido de aminoácidos de proteínas), US 5.850.016 (modificación de 55 composiciones de aminoácidos en semillas), WO98/20133 (proteínas que potencian los niveles de

aminoácidos esenciales), US 5.885.802 (alto contenido en metionina), US 5.885.801 (alto contenido en treonina), US 6.664.445 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), US6459019 (aumento de lisina y treonina), US 6.441.274 (subunidad beta triptófano sintasa en plantas), US 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), US 5.939.599 (alto contenido en azufre), US 5.912.414 (metionina aumentada), WO 98/56935 (enzimas biosintéticas de aminoácidos de plantas), WO98/45458 (proteínas de semillas modificadas por 5 ingeniería genética que tienen mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), WO98/42831 (lisina aumentada), US 5.633.436 (aumento del contenido de aminoácidos de azufre), US 5.559.223 (proteínas de almacenamiento sintéticas con estructura definida que contienen niveles programables de aminoácidos esenciales para mejorar el valor nutricional de las plantas), WO 96/01905 (treonina aumentada), WO 95/15392 (lisina aumentada), US2003/0163838, US2003/0150014, US2004/0068767, US 6.803.498, 10 WO01/79516 y WO00/09706 (Ces A: celulosa sintasa), US 6.194.638 (hemicelulosa), US 6.399.859 y US2004/0025203 (UDPGdH), US 6.194.638 (RGP).

4. Genes que controlan la androesterilidad.

Existen diversos métodos para conferir androesterilidad genética disponible, tales como genes mutantes múltiples en distintas localizaciones dentro del genoma que confieren androesterilidad, como se describe en 15 las Patentes de Estados Unidos Nº 4.654.465 y 4.727.219 de Brar et al. y translocaciones cromosómicas como describe Patterson en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.861.709 y 3.710.511. Además de estos métodos, Albertsen et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.432.068, describen un sistema de androesterilidad nuclear que incluye: identificar un gen que es crítico para la androfertilidad; silenciar este gen natural que es crítico para la androfertilidad; eliminar el promotor natural del gen androfértil esencial y 20 sustituirlo por un promotor inducible; insertar de nuevo este gen, modificado por ingeniería genética, en la planta y así crear una planta que sea androestéril ya que el promotor inducible está “inactivado” dando como resultado que el gen androfértil no se transcrita. La fertilidad se restablece induciendo, o “activando”, el promotor, que a su vez permite transcribirse al gen que confiere la androfertilidad.

(A) Introducción de un gen deacetilasa bajo el control de un promotor específico del tapete y con la 25 aplicación de la química N-Ac-PPT (documento WO 01/29237).

(B) Introducción de diversos promotores específicos del estambre (documentos WO 92/13956, WO 92/13957).

(C) Introducción del gen barnasa y barstar (Paul et al. Plant Mol. Biol. 19:611-622, 1992).

Para ejemplos adicionales de genes y sistemas nucleares de andro- y gino- esterilidad, véanse también los 30 documentos US 5.859.341; US 6.297.426; US 5.478.369; US 5.824.524; US 5.850.014 y US 6.265.640.

5. Genes que crean un sitio para la integración de ADN específica de sitio. Esto incluye la introducción de sitios FRT que pueden usarse en el sistema FLP/FRT y/o sitios Lox que pueden usarse en el sistema Cre/Loxp. Por ejemplo, véase Lyznik, et al., Site-Specific Recombination for Genetic Engineering in Plants, Plant Cell Rep (2003) 21:925-932 y el documento WO 99/25821, que se incorporan en este documento como 35 referencia. Otros sistemas que pueden usarse incluyen la recombinasa Gin del fago Mu (Maeser et al., 1991, Mol Gen Genet.; 230(1-2):170-6); Vicki Chandler, The Maize Handbook ch. 118 (Springer-Verlag, 1994), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto et al., 1983) y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki et al., 1992. J Mol Biol. 5; 225 (1): 25-37.

6. Genes que influyen en la resistencia al estrés abiótico (que incluyen pero sin limitación floración, desarrollo 40 de mazorcas y semillas, potenciación de la eficacia en la utilización del nitrógeno, sensibilidad al nitrógeno modificada, resistencia o tolerancia a la sequía, resistencia o tolerancia al frío y resistencia o tolerancia a la salinidad) y producción aumentada bajo estrés. Por ejemplo, véase: el documento WO 00/73475 en el que la eficacia en cuanto al uso del agua está modificada mediante la modificación del malato; los documentos US 5.892.009, US 5.965.705, US 5.929.305, US 5.891.859, US 6.417.428, US 6.664.446, US 6.706.866, US 45 6.717.034, US 6.801.104, WO2000/060089, WO2001/026459, WO2001/035725, WO2001/034726, WO2001/035727, WO2001/036444, WO2001/036597, WO2001/036598, WO2002/015675, WO2002/017430, WO2002/077185, WO2002/079403, WO2003/013227, WO2003/013228, WO2003/014327, WO2004/031349, WO2004/076638, WO98/09521 y WO99/38977 describen genes, que incluyen genes CBF y factores de transcripción eficaces en el alivio de efectos negativos de congelación, elevada salinidad y sequía en 50 plantas, así como en conferir otros efectos positivos en el fenotipo de las plantas; los documentos US 2004/0148654 y WO 01/36596, en los que el ácido abscísico está modificado en plantas dando como resultado el fenotipo mejorado en plantas tal como producción aumentada y/o tolerancia aumentada frente al estrés abiótico; los documentos WO2000/006341, WO04/090143, y la Solicitud de Estados Unidos Nº 10/817483 y 09/545.334, en los que la expresión de citoquinina está modifica dando como resultando plantas 55 con tolerancia al estrés aumentada, tales como tolerancia a la sequía y/o producción aumentada. Véanse también los documentos WO 02/02776, WO2003/052063, JP2002281975, US 6.084.153, WO 0164898, US 6.177.275 y US 6.107.547 (potenciación de la utilización del nitrógeno y sensibilidad al nitrógeno modificada). Para la modificación del etileno, véanse los documentos US20040128719, US20030166197 y

WO2000/32761. Para factores de transcripción o reguladores transcripcionales del estrés abiótico en plantas, véanse por ejemplo los documentos US20040098764 o US20040078852.

Otros genes y factores de transcripción que influyen en el crecimiento de las plantas y en los rasgos agronómicos tales como producción, floración, crecimiento de las plantas y/o estructura de la planta, pueden introducirse o puede realizarse la introgresión en plantas, véanse por ejemplo los documentos WO97/49811 (LHY), 5 WO98/56918 (ESD4), WO97/10339 y US 6.573.430 (TFL), US 6.713.663 (FT); WO96/14414 (CON), WO96/38560, WO01/21822 (VRN1), WO 00/44918 (VRN2), WO99/49064 (GI), WO00/46358 (FRI), WO97/29123, US 6.794.560, US 6.307.126 (GAI), WO99/09174 (D8 y Rht) y WO2004/076638 y WO2004/031349 (factores de transcripción).

Para la producción de papel, textiles, etanol, polímeros u otros materiales con usos industriales, pueden crearse rasgos comerciales en las plantas mediante la expresión de genes que modifican el almidón o las proteínas. 10

Un experto en la materia conoce los medios para aumentar o inhibir una proteína y, como ejemplo, pueden incluir métodos de expresión transgénica, supresión antisentido, cosupresión, incluyendo pero sin limitación: interferencia de ARN, activación o supresión de genes usando factores y/o represores de transcripción, mutagénesis que incluyen marcación de transposones, mutagénesis dirigida y específica, modificación de cromosomas por ingeniería genética (véase Nobrega et. al., Nature 431:988-993 (04)), recombinación homóloga, TILLING (lesiones locales diana 15 inducidas en genomas) y competición biosintética para manipular la expresión de proteínas.

Un experto en la materia conoce bien muchas técnicas de silenciamiento génico, que incluyen pero sin limitación, knock-outs (inactivaciones) (tales como por inserción de un elemento transposable tal como Mu, Vicki Chandler, The Maize Handbook cap. 118 (Springer-Verlag 1994) u otros elementos genéticos tales como una FRT, Lox u otro sitio de integración específica de sitio; interferencia de ARN (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Patente de 20 Estados Unidos Nº 5.034.323, Sharp (1999) Genes Dev. 13: 139-141, Zamore et al (2000) Cell 101: 25-33 y Montgomery et al (1998) PNAS USA 95: 15502-15507); silenciamiento génico inducido por virus (Burton, et al (2000) Plant Cell 12: 691-705 y Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2: 109-113); ribozimas específicas de ARN diana (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); estructuras en horquilla (Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320; documentos WO 99/53050 y WO 98/53083); MicroARN (Aukerman y Sakai (2003) Plant Cell 15: 2730-2741); ribozimas 25 (Steinecke et al (1992) EMBO J. 11: 1525; y Perriman et al (1993) Antisense Res. Dev. 3: 253); modificación dirigida mediada por oligonucleótidos (por ejemplo, los documentos WO 03/076574 y WO 99/ 25853); moléculas diana de dedos de cinc (por ejemplo, documentos WO 01/52620; WO 03/048345 y WO 00/42219); y otros métodos o combinaciones de los métodos anteriores conocidos por los expertos en la materia.

En la presente invención puede usarse cualquier método para aumentar o inhibir una proteína. Con fines 30 ilustrativos, se muestran varios ejemplos con más detalle a continuación.

La secuencia de nucleótidos unida operativamente a los elementos reguladores descritos en este documento puede ser una secuencia antisentido para un gen diana. (Véase, por ejemplo, Sheehy et al. (1988) PNAS USA 85:8805-8809; y las Patentes de Estados Unidos 5.107.065; 5.453.566 y 5.759.829). Una “secuencia de nucleótidos de ADN antisentido” significa una secuencia que está orientada al revés de la orientación normal 5’ a 3’ de una secuencia de 35 nucleótidos. Cuando se administra en una célula de una planta, la expresión de la secuencia de ADN antisentido impide la expresión normal de la secuencia de nucleótidos de ADN para el gen diana. La secuencia de nucleótidos antisentido codifica un transcrito de ARN que es complementario a y que puede hibridarse con el ARN mensajero (ARNm) endógeno producido por transcripción de la secuencia de nucleótidos de ADN para el gen diana. En este caso, la producción de la proteína natural codificada por el gen diana se inhibe para conseguir una respuesta fenotípica 40 deseada. Por tanto, las secuencias reguladoras descritas en este documento pueden unirse operativamente a secuencias de ADN antisentido para reducir o inhibir la expresión de una proteína natural en el pericarpio de la planta.

Como se ha observado, otras posibles estrategias para conferir la expresión de proteínas en el pericarpio incluyen cosupresión tradicional, es decir, inhibición de expresión de un gen endógeno mediante la expresión de un gen estructural idéntico o un fragmento génico introducido mediante transformación (Goring, D.R., Thomson, L., Rothstein, 45 S. J. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1770-1774 co-suppression; Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech 8(12): 340-344; Flavell (1994) PNAS USA 91:3490-3496; Finnegan et al (1994) BiolTechnology 12: 883-888 y Neuhuber et al (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230-241)). En un ejemplo, la cosupresión puede conseguirse uniendo el promotor a un segmento de ADN de manera que los transcritos del segmento se producen en orientación con sentido y en el que los transcritos tienen una identidad de secuencia de al menos el 65% con los transcritos del gen de interés 50 endógeno, suprimiendo por lo tanto la expresión del gen endógeno en dicha célula de la planta. (Véase, la Patente de Estados Unidos Nº 5.283.184). El gen endógeno diana para la cosupresión puede ser un gen que codifica cualquier proteína que acumula en la planta especies de interés. Por ejemplo, cuando el gen endógeno que dirige la cosupresión es el gen gamma-zeina de 50 kD, la cosupresión se consigue usando un casete de expresión que comprende la secuencia del gen de gamma-zeina de 50 kD o una variante o un fragmento del mismo. 55

En la técnica se conocen métodos adicionales de cosupresión y pueden aplicarse de manera similar a la presente invención. Estos métodos implican el silenciamiento de un gen diana por corte y empalme de los ARN en horquilla y métodos similares denominados también interferencia de ARN y silenciamiento del promotor (véase Smith et al. (2000) Nature 407:319-320, Waterhouse y Helliwell (2003)) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38; Waterhouse et al (1998) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964; Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al (2002) Plant Phystiol 129:1723-1731; y las Solicitudes de Patente WO 99/53050; WO 99/49029; WO 99/61631; WO 00/49035 y la Patente de Estados Unidos Nº 6.506.559.

Para la interferencia del ARNm, el casete de expresión se diseña para expresar una molécula de ARN que está modelada sobre un gen de ARNmi endógeno. Este gen de ARNmi codifica un ARN que forma una estructura en 5 horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria a otro gen endógeno (secuencia diana). Las moléculas de ARNmi son muy eficaces inhibiendo la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen la heredan las siguientes generaciones de plantas.

En una realización, el polinucleótido que se introduce en la planta comprende una secuencia inhibidora que codifica una proteína de dedo de zinc que se une a un gen que codifica una proteína de la invención dando como 10 resultado la expresión reducida del gen. En realizaciones particulares, la proteína de dedo de zinc se une a una región reguladora de un gen de la invención. En otras realizaciones, la proteína de dedo de zinc se une a un ARN mensajero que codifica una proteína e inhibe su traducción. Por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.453.242 se han descrito métodos de sitios de selección dirigidos por proteínas de dedos de zinc, y en la Patente de Estados Unidos Nº 20030037355 se describen métodos para usar proteínas de dedos de zinc para inhibir la expresión de genes en plantas. 15

El casete de expresión usado en los métodos de la invención también puede incluir, en el extremo 3’ de la secuencia de nucleótidos de interés aislada, una región de terminación transcripcional y traduccional funcional en plantas. La región de terminación puede ser natural con la secuencia de nucleótidos promotora de la presente invención, puede ser natural con la secuencia de ADN de interés o puede derivar de otra fuente.

El terminador de ZM-LTP1 indicado en la SEC ID Nº: 2 y mostrado en la Figura 2C tiene 486 nucleótidos de 20 longitud. La región codificante se identificó de acuerdo con el procedimiento descrito en Woo et al, Journal Plant Cell 13(10), 2297-2317 (2001) incorporado en este documento como referencia. El terminador puede aislarse con los cebadores de las SEC ID Nos: 4 y 5. El terminador, con el promotor apropiado, puede proporcionar expresión durante un desarrollo aproximadamente de 10-40 DDP (días después de la polinización). El terminador de ZM-LTP1 puede usarse con el promotor de ZM-LTP1 en un casete de expresión o puede usarse con otro promotor apropiado para proporcionar 25 una expresión preferida en semillas de una región codificante.

Junto con el promotor de la invención, puede usarse cualquiera de las regiones de terminación convenientes y se encuentran disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véase también: Guerineau et al (1991) Mol. Gen. Genet 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; 30 Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:9627-9639.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5’. Dichas secuencias líder pueden actuar para potenciar la traducción. En la técnica se conocen líderes traduccionales e incluyen: líderes del picornavirus, por ejemplo, el líder del EMCV (región 5’ no codificante de encefalomiocarditis), Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. 35 Acad. Sci. USA 86:6126-6130; líderes de potivirus, por ejemplo, líder del TEV (virus del grabado del tabaco), Allison et al. (1986); líder del MDMV (virus del mosaico enano del maíz), Virology 154:9-20; proteína de unión de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), Macejak et al (1991) Nature 353:90-94; líder no traducida del ARNm de proteína de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4), Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), Gallie et al. (1989), Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; y líder del virus moteado 40 clorótico del maíz (MCMV), Lommel et al (1991) Virology 81:382-385. Véase también Della-Cioppa et al (1987) Plant Physiology 84:965-968. El casete también puede contener secuencias que potencien la traducción y/o estabilidad del ARNm tales como intrones.

En estos casos cuando se desea tener un producto expresado de una secuencia de nucleótidos aislada dirigido a un orgánulo en particular, particularmente al plástido, amiloplasto o al retículo endoplásmico, o que se secrete en la 45 superficie de la célula o extracelularmente, el casete de expresión puede comprender adicionalmente una secuencia codificante para un péptido de tránsito. Dichos péptidos de tránsito se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación: el péptido de tránsito para la proteína transportadora de acilo, la pequeña subunidad de RUBISCO, la sintasa EPSP en plantas y similares.

Durante la preparación del casete de expresión, pueden manipularse diversos fragmentos de ADN, para 50 proporcionar las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, si es apropiado, en la fase de lectura apropiada. Con este fin, para unir los fragmentos de ADN pueden emplearse adaptadores o enlazadores o pueden implicarse otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar sitios de restricción o similares. Con este fin, puede implicarse mutagénesis in vivo, reparación de cebadores, digestiones por restricción, hibridación y resustituciones tales como transiciones y transversiones. 55

Como se ha observado en este documento, los métodos de la presente invención usan vectores que pueden expresar genes de interés bajo el control de los elementos reguladores. En general, los vectores deben ser funcionales en las células de la planta. Al mismo tiempo, puede preferirse tener vectores que sean funcionales en E. coli (por

ejemplo, producción de proteínas para producir anticuerpos, análisis de secuencias de ADN, construcción de insertos, obtener cantidades de ácidos nucleicos). En Sambrook et al. (anteriormente), se describen vectores y procedimientos para la clonación y expresión en E. coli.

El vector de transformación que comprende las secuencias reguladoras de la presente invención unido operativamente a una secuencia de nucleótidos aislada en un casete de expresión, también puede contener al menos 5 una secuencia de nucleótidos adicional para que un gen a co-transformar en el organismo. De manera alternativa, la secuencia (o secuencias) adicional puede proporcionarse en otro vector de transformación.

Los vectores que son funcionales en plantas pueden ser plásmidos binarios derivados de Agrobacterium. Dichos vectores pueden transformar células de plantas. Estos vectores contienen secuencias límite derecha e izquierda que son necesarias para la integración en el cromosoma del hospedador (planta). Como mínimo, entre estas secuencias 10 límite se encuentra el gen a expresar bajo el control de los elementos reguladores de la presente invención. En una realización, también se incluye un gen marcador de selección y un gen indicador. Para facilitar la obtención de cantidades suficientes del vector, puede usarse un origen bacteriano que permita la replicación en E. coli.

En los vectores de transformación pueden incluirse genes indicadores. Ejemplos de genes indicadores adecuados conocidos en la técnica pueden encontrarse, por ejemplo: en Jefferson et al (1991) Plant Molecular Biology 15 Manual, ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), págs. 1-33; DeWet et al (1987). Mol. Cell. Biol. 7:725-737; Goff et al. (1990) EMBO J. 9:2517-2522; Kain et al (1995) BioTechniques 19:650-655; y Chiu et al. (1996) Current Biology 6:325-330.

En los vectores de transformación usados en los métodos de la presente invención pueden incluirse genes marcadores de selección para la selección de células o tejidos transformados. Estos pueden incluir genes que confieren 20 resistencia a antibióticos o resistencia a herbicidas. Los ejemplos de genes marcadores de selección adecuados incluyen, pero sin limitación: genes que codifican resistencia a cloramfenicol, Herrera Estrella et al. (1993) EMBO J. 2:987-992; metotrexato, Herrera Estrella et al. (1993) Nature 303:209-213; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820; higromicina, Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219-227; estreptomicina, Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91; espectinomicina, Bretagne-Sagnard et al. (1996) 25 Transgenic Res. 5:131-137; bleomicina, Hille et al. (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176; sulfonamida, Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136; bromoxinil, Stalker et al. (1988) Science 242:419-423; glifosato, Shaw et al. (1986) Science 233:478-481; fosfinotricina DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513-2518.

Además, cuando un promotor del pericarpio de la invención se une con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína detectable, la expresión de una secuencia unida puede rastrearse en el pericarpio, proporcionando 30 por lo tanto una utilidad denominada marcador de exploración o puntuable. La expresión de la proteína unida puede detectarse sin necesidad de destruir el tejido. Más recientemente, ha aumentado el interés en cuanto a la utilización de marcadores de exploración o puntuables. Como ejemplo, sin limitación, el promotor puede unirse a marcadores de detección que incluyen un gen de la -glucoronidasa o uidA (GUS), que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (Jefferson, R. A. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8447-8451); cloramfenicol 35 acetil transferasa; fosfatasa alcalina; un gen de locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., págs. 263-282 (1998); Ludwig et al. (1990) Science 247:449); un gen de p-lactamasa (Sutclife, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3737 (1987)), que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica), un gen de xylE (Zukowsky et 40 al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1101 (1983)), que codifica una catecol dioxigenasa que puede transfomar catecoles cromogénicos; un gen -amilasa (Ikuta et al., Biotech. 8:241 (1990)); un gen tirosinasa (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129:2703 (1983)), que codifica una enzima que puede oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez se condensa para formar el compuesto melanina fácilmente detectable un gen de proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. 8(5):777-84 (1995)); un gen lux, que codifica una luciferasa, cuya presencia puede detectarse usando, por 45 ejemplo, una película de rayos X, recuento por centelleo, espectrofotometría fluorescente, videocámaras con poca luz, cámaras de recuento fotónico o luminometría multipocillo (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); DS-RED EXPRESS (Matz, M. V. et al. (1999) Nature Biotech. 17:969-973, Bevis B. J. et al. (2002) Nature Biotech 20:83-87, Haas, J. et al. (1996) Curr. Biol. 6:315-324); proteína fluorescente amarilla de Zoanthus sp. (Zs Yellow) que se ha modificado por ingeniería genética para obtener una fluorescencia más luminosa (Matz et al. (1999) Nature Biotech. 17:969-973, 50 disponible de BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA, catálogo número K6100-1); y una proteína fluorescente cian (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato et al. (2002) Plant Physiol 129:913-42.

Para transformar cualquier planta puede usarse un vector de transformación que comprende las secuencias reguladoras particulares de la presente invención, unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés aislada en un casete de expresión. De esta manera, pueden obtenerse plantas, células de plantas, tejidos de plantas, 55 pericarpios y similares modificados genéticamente. Los protocolos de transformación pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para transformación. Los métodos adecuados de transformación de células de plantas incluyen microinyección, Crossway et al. (1994) Biotechniques 4:320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606; transformación mediada por Agrobacterium; véase, por ejemplo, Townsend et al. Patente de Estados Unidos 5.563.055; transferencia directa de 60 genes, Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722; y aceleración balística de partículas, véase por ejemplo, Sanford

et al. Patente de Estados Unidos 4.945.050, Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); y McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926. Véase también Weissinger et al. (1998) Annual Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:736-740 (semilla de soja); McCabe et al. (1988) BiolTechnology 6:923-926 (semilla de soja); Datta et al. (1990) Bio/Technology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) 5 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839; Hooydaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G. P. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 10 (transformación mediada por pelos); D. Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou et al. (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjada et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz mediante Agrobacterium tumefaciens).

Las células que se han transformado pueden crecer en las plantas de acuerdo con métodos convencionales. Véase, por ejemplo McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas después pueden crecer y 15 polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes. Después, la planta resultante con expresión preferida en el pericarpio de la característica fenotípica deseada puede identificarse. Para asegurar que la expresión preferida en el pericarpio, de la característica fenotípica deseada, se mantiene establemente y se transmite por herencia, pueden cultivarse dos o más generaciones.

EJEMPLOS 20

Se aislaron regiones reguladoras de ZM-LTP1 (proteína 1 de transferencia de lípidos de Zea mays) de plantas de maíz y se clonaron. Basándose en la expresión espacial y temporal de sus productos, la ZM-LTP1 del maíz se seleccionó como una fuente de elementos reguladores preferidos del pericarpio. A continuación se describe el método para realizar su aislamiento.

Ejemplo 1: Predicción de la Expresión mediante Lynx MPSS 25

Para identificar la región codificante de ZM-LTP1 del maíz, se usó tecnología de perfilado de expresión génica LynxTM como candidato para el aislamiento del promotor. La secuenciación de firma masivamente paralela (MPSS, véase Brenner et al, Nature Biotechnology 18:630-634, 2000) indicó expresión en diversos genotipos aproximadamente 10 DDP (días después de la polinización) en el pericarpio, con un máximo de aproximadamente 40 k ppm. En la siguiente Tabla 2 se indica un resumen los resultados. No fue sorprendente encontrar que la expresión detectable en un 30 pericarpio rojo era menor, ya que este fenotipo es el resultado de la presencia de antocianinas, que se sabe que dificultan el aislamiento del ARN. La expresión se observó en el tejido pericárpico rojo, pero con este método, debido a las dificultades en cuanto al aislamiento del ARN, asociadas con este fenotipo, se inhibió la capacidad para medir completamente el ARN presente. Los datos obtenidos por MPSS no mostraron expresión significativa de ZM-LTP1 del maíz en el tejido de floración o vegetativo. 35

Tabla 2

PPM Adj

Tejido Título

0

mazorca Mazorca inmadura (5-10 mm), punta

12

embrión 21 DDP embrión

3

embrión 24 DDP embrión

36

embrión 30 DDP embrión

21

embrión 35 DDP embrión

16

embrión 40 DDP embrión

8

embrión 45 DDP embrión

25

endospermo 12 DDP endospermo

240

endospermo 21 DDP endospermo

32

endospermo 30 DDP endospermo

61

hoja Hojas, V2

5001

pericarpio 15 DDP pericarpio

177

pericarpio 22 DDP pericarpio, rojo, Co63P1-rr

39492

pericarpio 22 DDP pericarpio, blanco, Co63P1-ww

8476

pericarpio 22 DDP pericarpio

9

tallo-vaina Tallo, vaina de maíz, V7-8

Ejemplo 2: Predicción del Modelo de Expresión mediante RT PCR

Se realizó RT-PCR en granos completos de maíz de 1-46 DDP así como en grupos de tejidos embrionarios, del endospermo, del pericarpio, de la hoja, de brote, de raíz y de antera. Como se muestra por electroforesis en gel, los resultados coinciden con los datos obtenidos por MPSS. Los datos de la RT-PCR indicaron expresión aproximadamente 5 a los 10 DDP hasta al menos aproximadamente 40 DDP. No se detectó señal ni en el tejido vegetativo ni en el de floración.

Ejemplo 3: Aislamiento de Secuencia Reguladoras

Usando tres marcadores LINX diferentes (GATCTGTATTAAAAAAA, GATCTCGAAATGGCTGC, GATCGGGACCTCTATAT; SEC ID Nos: 6, 7 y 8 respectivamente) y las EST que contienen estos marcadores, se 10 ensambló una secuencia cóntigo que representó el transcrito de LTP1. La secuencia promotora se obtuvo mediante el programa informático BLAST en la secuencia transcrita frente una genoteca de genes de maíz disponibles en la Universidad del Estado de Iowa (denominada MAGI). Esta es una colección de secuencias del maíz procedente de la GSS (Secuencia de Supervivencia Genómica) en la que las secuencias solapantes se han ensamblado dentro de los cóntigos. En la colección, MAGI_37138 fue el máximo acierto obtenido por BLAST. Este cóntigo contenía una región 15 significativa de secuencia aguas arriba y secuencia aguas abajo. Diseñando cebadores en esta secuencia, se amplificaron tres versiones del promotor (de diversa longitud) y una versión del terminador a partir de ADN genómico B73 usando PCR. Para facilitar la clonación, se añadieron secuencias adicionales al final de cada cebador para crear sitios de restricción enzimática. Una vez amplificados, los fragmentos de PCR se secuenciaron y se ensamblaron en casetes de expresión usando la región codificante DS-RED EXPRESS (anteriormente) como el gen marcador. 20

Ejemplo 4: Datos de Expresión Usando Secuencias Promotoras

Se prepararon cinco construcciones de fusión promotor:: DS-RED EXPRESS:: terminador como se explica a continuación. DS-RED EXPRESS es el marcador puntuable (Matz, M. V. et al 91999) Nature Biotech. 17:969-973, Bevis B. J. et al. (2002) Nature Biotech. 20:83-87, Haas, J. et al. (1996) Curr. Biol. 6:315:324). La referencia “ubi” indica un promotor de ubiquitina (véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 342 926B1; US 6.020.109) usado como el control, el 25 término “ZM-LTP1” se refiere al terminador de ZM-LTP1 y “pinII” es el terminador de la transcripción del inhibidor II de proteinasa (An et al, (1989) Plant Cell 1:115-122). Todos los vectores se construyeron usando técnicas de biología molecular convencionales (Sambrook et al., anteriormente).

(a) UBI:UBI INTRON: DS-RED EXPRESS: PINII) (Control positivo)

(b) ZM-LTP1 PRO (0,6): DS-RED EXPRESS: ZM-LTP1 TERM 30

(c) ZM-LTP1 PRO (0,8): DS-RED EXPRESS: ZM-LTP1 TERM.

(d) ZM-LTP1 (1,2 kb): DS-RED EXPRESS: ZM-LTP1 TERM.

(e) ZM-LTP1 PRO (1,2 KB): ADH1 INTRON1 (PHI): DS-RED EXPRESS: ZM-LTP1 TERM

El éxito de la subclonación se confirmó por análisis de restricción. La transformación y la expresión se confirmaron como se describe más adelante. 35

Ejemplo 5: Transformación del Maíz por Bombardeo de Partículas

Preparación de Partículas

Se pesaron 60 mg de partículas de oro BioRad de 0,6 u y se colocaron en un microtubo de centrífuga de 2 ml. Se añadió 1 ml de EtOH al 100% a las partículas de oro y se expuso brevemente a ultrasonido (Modelo Branson Sonifier 450, emisión al 40%, coeficiente de utilización constante), se sometió a agitación vorticial elevada durante 1 minuto. Las 40 partículas de oro se sedimentaron por centrifugación a 10.000 rpm (Biofuge) durante 1 minuto y se extrajo el EtOH. Este lavado de EtOH se repitió dos veces más. Después de la última centrifugación, se extrajo el 100% del EtOH y se sustituyó por 1 ml de agua estéril desionizada y se expuso brevemente a ultrasonido. Después se realizaron alícuotas de la solución en alícuotas de 250 l, y se añadieron, a cada alícuota, 750 l de agua estéril desionizada.

Preparación de la Asociación de ADN Plasmídico-Partículas 45

100 ul de la solución de partículas de tungsteno (partículas de oro de 0,6 u) se expuso brevemente a ultrasonido. Se añadieron 10 ul de ADN plasmídico (100 ng/ul), 100 l de CaCl2 2,5 M y 10 l de espermidina 0,1 M y se sometió a agitación vorticial durante 10 minutos a una velocidad media.

Después del periodo de asociación, los tubos se centrifugaron brevemente, se eliminó el líquido, se lavó con 500 l de etanol al 100% por exposición a ultrasonido durante 3 segundos y se centrifugó durante 30 segundos. De 5 nuevo se eliminó el líquido y al sedimento final de tungsteno se añadieron 105 l de etanol al 100%. Las partículas/ADN asociadas, se expusieron brevemente a ultrasonido y se salpicaron 10 l sobre el centro de cada macro-transportador y se dejó secar durante  2 minutos antes de realizar el bombardeo.

Preparación de Granos Diana

Los granos se cultivaron en el invernadero hasta que alcanzaron 12 DDP (Días Después de la Polinización). 10 Las plantas usadas pertenecían a una línea del maíz con alto contenido en aceite, que producía mazorcas con buena polinización y que tenían granos ligeramente mayores a los del tipo silvestre. Todos los granos se eliminaron de la mazorca por el pedicelo y se colocaron hacia debajo de los embriones en un medio de cultivo de saco embrionario (586M) que contenía Sales MS, Vitaminas MS, Tiamina-HCL, Asparagina, BAP y Sacarosa.

Bombardeo de Partículas 15

Para efectuar el bombardeo de partículas del pericarpio de los granos, los aglomerados de partículas-ADN se aceleraron usando un dispositivo de aceleración de partículas DuPont PDS-1000. La aglomeración de partículas-ADN se expuso brevemente a ultrasonido, sobre los macro-transportadores se depositaron 10 l y se dejó evaporar el etanol. El macro-transportador se aceleró sobre un filtro de detención de acero inoxidable mediante la rotura de un diagrama polimérico (disco de rotura). La rotura se efectuó mediante helio presurizado. La velocidad de la aceleración de 20 partículas-ADN se determinó basándose en la presión de rotura del disco de rotura. Se usó una presión de disco de rotura de 1100 psi.

El anaquel que contenía la placa con los granos de 12 DDP se colocó a una distancia de 5,1 cm por debajo del fondo de la plataforma de micro-transportadores (anaquel Nº 3). Para efectuar el bombardeo de partículas de los granos, en el dispositivo se instaló un disco de rotura y un macro-transportador con aglomerados de partículas-ADN 25 secos. La presión del He suministrada al dispositivo se ajustó a 200 psi por encima de la presión de rotura del disco de rotura. Se colocó una placa de Petri con los granos diana en la cámara de vacío y se situó en la trayectoria proyectada de las partículas aceleradas. Se creó un vacío en la cámara, preferiblemente de aproximadamente 28 Hg. Tras el funcionamiento del dispositivo, se liberó el vacío y se retiró la placa de Petri.

El bombardeo de los granos se analizó para determinar la expresión de DS-RED EXPRESS 30 horas después 30 del bombardeo. La capacidad del promotor de ZM-LPT1 para conducir la expresión en el pericarpio del maíz se confirmó por detección de DS-RED EXPRESS en el pericarpio de los granos bombardeados. En el pericarpio se visualizó microscópicamente una fuerte señal. La DS-RED EXPRESS se visualizó usando una fuente lumínica de Xenon y los filtros apropiados para excitar a la proteína y capturar la luz emitida (Excitación: 557 nm. Emisión: 579 nm).

Ejemplo 6: Transformación y Regeneración de Callos del Maíz mediante Agrobacterium 35

Las construcciones usadas fueron las indicadas anteriormente para el bombardeo de microproyectiles, con la excepción de que en este experimento no se empleó el control y que también se incluyó el marcador de selección para PAT (fosfinotricin acetil transferasa) optimizado en el maíz. Jayne et al., Patente de Estados Unidos Nº 6.096.947.

Preparación de la Suspensión de Agrobacterium

Se sembró Agrobacterium a partir de una alícuota congelada a -80ºC sobre una placa que contenía medio PHI-40 L y se cultivó a 28ºC en la oscuridad durante 3 días. El medio PHI-L comprendía 25 ml/l de Solución Madre A, 25 ml/l de Solución Madre B, 450,9 ml/l de Solución Madre C y se añadió espectinomicina (Sigma Chemicals) hasta una concentración de 50 mg/ml en ddH2O estéril (solución madre A: K2HPO4 60,0 g/l, NaH2PO4 20,0 g/l, pH ajustado a 7,0 p/KOH y esterilizada en autoclave; solución madre B: NH4Cl 20,0 g/l, MgSO4.7H2O 6,0 g/l, KCl 3,0 g/l, CaCl2 0,20 g/l, FeSO4.7H2O 50,0 mg/l, esterilizada en autoclave; solución madre C: glucosa 5,56 g/l, agar 16,67 g/l (número A-7049, 45 Sigma Chemicals, St. Louis, MO) y esterilizada en autoclave).

La placa pudo almacenarse a 4ºC y usarse normalmente durante aproximadamente 1 mes. Se recogió una sola colonia de la placa madre y se sembró sobre una placa que contenía medio PHI-M [extracto de levadura (Difco) 5,0 g/l; peptona (Difco) 10,0 g/l; NaCl 5,0 g/l; agar (Difco) 15,0 g/l; pH 6,8; que contenía 50 mg/l de espectinomicina] y se incubó a 28ºC en la oscuridad durante 2 días. 50

Se añadieron 5 ml de PHI-A [sales basales CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0 g/l, mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina. HCl 0,5 mg/l (Sigma); ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, Sigma) 1,5 mg/l; L-prolina (Sigma) 0,69 g/l; sacarosa (Mallinckrodt) 68,5 g/l; glucosa (Mallinckrodt) 36,0 g/l; pH 5,2] para el sistema del medio básico PHI o PHI-I [sales MS (GIBCO BRL) 4,3 g/l; ácido nicotínico (Sigma) 0,5 mg/l; piridoxina. HCl (Sigma) 0,5 mg/l; tiamina. HCl (Sigma) 1,0 mg/l; mio-inositol (Sigma) 0,10 g/l; ácidos casamino para ensayo de vitaminas (Lab Difco) 55

1 g/l; 2,4-D 1,5 mg/l; sacarosa 68,50 g/l; glucosa 36,0 g/l; pH ajustado a 5,2 p/KOH y esterilizado mediante filtro] para el sistema del medio PHI combinado y se añadieron 5 ml de (3’-5’-Dimetoxi-4’-hidroxiacetofenona, Aldrich chemicals) 100mM a un tubo Falcon de 14 ml en una campana. Se recogieron aproximadamente 3 bucles completos (tamaño del bucle 5 mm) de Agrobacterium de la placa y se suspendió en el tubo y después, para preparar una suspensión homogénea, el tubo se sometió a agitación vorticial. Se transfirió 1 ml de la suspensión a un tubo de espectrofotometría 5 y se ajustó la DO de la suspensión de 0,72 a 550 nm añadiendo o más Agrobacterium o más del mismo medio de suspensión, para obtener una concentración de Agrobacterium de aproximadamente 0,5 x 109 ufc/ml a 1 x 109 ufc/ml. Se realizaron alícuotas con la suspensión final de Agrobacterium en tubos de microcentrífuga de 2 ml, conteniendo cada uno, 1 ml de la suspensión. Después las suspensiones se usaron tan pronto como fuera posible.

Aislamiento, infección y co-cultivo de embriones: 10

Se añadieron aproximadamente 2 ml del mismo medio (en este caso PHI-A o PHI-I) que se usó para la suspensión de Agrobacterium a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Se asilaron embriones inmaduros de una mazorca esterilizada con una espátula estéril (Baxter Scientific Products S1565) y se dejaron caer directamente por goteo en el tubo con el medio. En el tubo se introdujo un total de aproximadamente 100 embriones. El tamaño óptimo de los embriones era de aproximadamente 1,0-1,2 mm. Después se cerró la parte superior del tubo y el tubo se sometió a 15 agitación vorticial con un Mezclador Vortex (Baxter Scientific Products S8223-1) durante 5 segundos a velocidad máxima. El medio se retiró y se añadieron 2 ml de medio recién preparado y se repitió la agitación vorticial. Todo el medio se extrajo y se añadió 1 ml de suspensión de Agrobacterium a los embriones y el tubo se sometió a agitación vorticial durante 30 segundos. Se dejó reposar el tubo durante 5 minutos en la campana. La suspensión de Agrobacterium y los embriones se vertieron en una placa de Petri que contenía o bien medio PHI-B [sales basales 20 CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0 g/l; mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina. HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-prolina 0,69 g/l; nitrato de plata 0,85 mg/l; gelrite (Sigma) 3,0 g/l; sacarosa 3,0 g/l; acetosiringona 100 mM; pH 5,8], para el sistema en medio básico PHI o bien medio PHI-J [sales MS 4,3 g/l; ácido nicotínico 0,5 mg/l; piridoxina HCl 0,50 mg/l; tiamina.HCl 1,0 mg/l; mio-inositol 100,0 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; sacarosa 20,0 g/l; glucosa 10,0 g/l; L-prolina 0,70 g/l; MES (Sigma) 0,50 g/l; 8,0 g/l de agar (Sigma A-7049, purificada) y acetosiringona 100 mM con un 25 pH final de 5,8] para el sistema del medio PHI combinado. Todos los embriones dejados en el tubo se transfirieron a la placa usando una espátula estéril. La suspensión de Agrobacterium se extrajo y los embriones se colocaron en el lado del eje debajo del medio. La placa se selló con cinta de Parafilm o Cinta Combinada Vegetativa Pylon (producto denominado “E.G.CUT” y está disponible en secciones de 18 mm x 50 m, Kyowa LTD., Japón) y se incubó en la oscuridad a 23-25ºC durante aproximadamente 3 días de co-cultivo. 30

Etapas de reposo, selección y regeneración:

Para la etapa de reposo, todos los embriones se transfirieron a una nueva placa que contenía medio PHI-C [sales basales CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0 g/l, mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina. HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-prolina 0,69 g/l; sacarosa 30,0 g/l; tampón MES (Sigma) 0,5 g/l; agar (Sigma A-7049, purificado) 8,0 g/l; nitrato de plata 0,85 mg/l; carbanicilina 100 mg/l; pH 5,8]. La placa se selló con cinta Parafilm o Pylon 35 y se incubó en la oscuridad a 28ºC durante 3-5 días.

Periodos de co-cultivo más largos podían compensar la ausencia de una etapa de reposo ya que la etapa de reposo, al igual que la etapa de co-cultivo, proporciona un periodo de tiempo para cultivar el embrión en ausencia de un agente selectivo. Los expertos habituales en la materia pueden ensayar fácilmente combinaciones de co-cultivo y tiempos de reposo para optimizar o mejorar la transformación. 40

Para la selección, todos los embriones se transfirieron después desde el medio PHI-C a nuevas placas que contenían medio PHI-D como un medio de selección [sales basales CHU(N6) (Sigma C-1416) 4,0 g/l, mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma-1511) 1,0 ml/l; tiamina. HCl 0,5 mg/l; 2,4-D 1,5 mg/l; L-prolina 0,69 g/l; sacarosa 30,0 g/l; tampón MES (Sigma) 0,5 g/l; agar (Sigma A-7049, purificado) 8,0 g/l; nitrato de plata 0,85 mg/l; carbanicilina (ICN, Costa Mesa, CA) 100 mg/l; bialafos (Meiji Seika K. K., Tokio, Japón) 1,5 mg/l para las primeras dos semanas 45 seguido de 3 mg/l para el tiempo restante; pH 5,8] colocando aproximadamente 20 embriones sobre cada placa.

Las placas se sellaron como se ha descrito anteriormente y se incubaron en la oscuridad a 28ºC durante las dos primeras semanas de selección. Los embriones se transfirieron al medio de selección recién preparado a intervalos de dos semanas. El tejido se subcultivó transfiriendo al medio de selección recién preparado durante un total de aproximadamente dos meses. Después, los callos resistentes a herbicida se “desarrollaron a granel” mediante cultivo en 50 el mismo medio durante otras dos semanas hasta que el diámetro de los callos fuera de aproximadamente 1,5-2 cm.

Para la regeneración, los callos se cultivaron después sobre medio PHI-E [sales MS 4,3 g/l; mio-inositol 0,1 g/l; ácido nicotínico 0,5 mg/l; tiamina.HCl 0,1 mg/l; Piridoxina.HCl 0,50 mg/l; Glicina 2,0 mg/l, Zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60,0 g/l. Agar (Sigma A-7049) 8,0 g/l, ácido indolacético (IAA, Sigma) 1,0 g/l, ácido Abscísico (ABA, Sigma) 0,1 mM, Bialafos 3 mg/l, carbanicilina 100 mg/l ajustado a un pH de 5,6] en la oscuridad a 28ºC durante 1-3 semanas para dejar 55 madurar los embriones somáticos. Los callos se cultivaron después en medio PHI-F (sales MS 4,3 g/l; mio-inositol 0,1 g/l; tiamina.HCl 0,1 mg/l; Piridoxina.HCl 0,50 mg/l; Glicina 2,0 mg/l, ácido nicotínico 0,5 mg/l; sacarosa 40,0 g/l; gelrite 1,5 mg/l; pH 5,6] a 25ºC en un programa de luz natural de 16 horas de luz (270 uE m-2sec-1) y 8 horas de oscuridad hasta desarrollar brotes y raíces. Cada pequeña plántula se transfirió después a un tubo de 25x150 mm que contenía

medio PHI-F y se desarrolló en las mismas condiciones durante aproximadamente otra semana. Las plantas se trasplantaron a macetas con mezcla de suelo en un invernadero. Se determinaron los eventos DS-RED EXPRESS en la fase de callo o estado de planta regenerada.

La capacidad del promotor de ZM-LTP1 y de la variante truncada para dirigir la expresión en el pericarpio de maíz de 10-40 DDP se confirmo por detección de DS-RED EXPRESS en el tejido pericárpico de la planta mediante los 5 procedimientos indicados anteriormente. En la versión del promotor de 1,2 kb, se observó una expresión preferida en el pericarpio, junto con bajos niveles de expresión en el polen. En las versiones 0.8 y 0.6 del promotor, se observó la expresión preferida en el pericarpio sin observarse ninguna expresión en el polen.

Ejemplo 7: Construcción de la Variante del Promotor

Se realizaron variantes de deleción eliminando la secuencia del promotor en diversas posiciones de la región 10 promotora, con las deleciones indicadas en la Figura 3. La Figura 3 también indica la correspondencia de cada deleción con los motivos de la Tabla 1.

Las construcciones se prepararon como en el Ejemplo 4, usando la variante truncada, unida al marcador DS-RED EXPRESS y la región terminadora de LPT1. El éxito de la subclonación se confirmó por análisis de restricción. La transformación de los granos 12 DDP se realizó usando el método de bombardeo con microproyectiles indicado 15 anteriormente. El promotor de ubiquitina de control demostró expresión constitutiva como se probó por observación de fluorescencia roja debido a la expresión del marcador DS-RED EXPRESS unido

Se ensayaron variaciones de tres longitudes en la transformación estable con Agrobacterium: 1) 1,2 kb (bases 1 a 1157 de la SEC ID Nº: 1), 2) 0,8 kb (bases 370 a 1157 de la SEC ID Nº: 1), y 3) 0,6 kb (bases 556 a 1157 de la SEC ID Nº: 1). Las tres pudieron conducir la expresión preferencial en el pericarpio, sin embargo, los dos fragmentos más 20 largos también presentaron expresión débil en el polen.

Las deleciones de los motivos se ensayaron de manera transitoria usando el método de bombardeo con microproyectiles como se ha descrito anteriormente. La deleción 1 se creó dentro de la versión de 0,8 kb, mientras que las deleciones 2-6 se crearon dentro de la versión de 0,6 kb. La delección 3 (bases 959 a 967 de la SEC ID Nº: 1), la deleción 4 (bases 729 a 738 de la SEC ID Nº: 1) y la deleción 6 (bases 743 a 749 de la SEC ID Nº: 1) correspondieron a 25 una reducción considerable, hasta una expresión no detectable. La deleción 1 (bases 486 - 491 de la SEC ID Nº: 1), la delección 2 (bases 1074 - 1081 de la SEC ID Nº: 1) y la deleción 5 (bases 743 – 749 de la SEC ID Nº: 1) tuvieron efecto mínimo en la expresión en el pericarpio.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Pioneer Hi-Bred Internacional, Inc. 30

<120> ELEMENTO REGULADOR PREFERIDO DEL PERICARPIO

<130> 1912-PCT

<150> 60/676.616

<151> 29-04-2005

<160> 12 35

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1157

<212> ADN

<213> Zea mays 40

<220>

<221> promotor

<222> (1)…(1157)

<223> promotor de ZM-Ltp1

<221> promotor 45

<222> (530)…(1157)

<223> truncamiento 0,8

<221> promotor

<222> (707)…(1157)

<223> truncamiento 0,6

<400> 1 5

<210> 2

<211> 486

<212> ADN

<213> Zea mays 10

<220>

<221> terminador

<222> (1)…(486)

<223> región terminadora de ZM-Ltp1

<400> 2 15

<210> 3

<211> 852

<212> ADN

<213> Zea mays 20

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(852)

<223> transcrito de ZM-Ltp1

<400> 3 5

<210> 4

<211> 38

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> cebador 838 term. de ZM-Ltp1

<400> 4

<210> 5 10

<211> 45

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 839 term. de ZM-Ltp1 15

<400> 5

<210> 6

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Marcador LYNX 1 5

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> ADN 10

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Marcador LYNX 2

<400> 7

15

<210> 8

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 20

<223> Marcador LYNX 3

<400> 8

<210> 9

<211> 28 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 826 promotor de ZM-Ltp1

<400> 9 30

<210> 10

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 35

<220>

<223> cebador 827 promotor de ZM-Ltp1

<400> 10

<210> 11 5

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 828 promotor de ZM-Ltp1 10

<400> 11

<210> 12

<211> 28

<212> ADN 15

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador 829 promotor de ZM-Ltp1

<400> 12

20

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un elemento regulador aislado que puede dirigir la transcripción de manera preferida en el pericarpio que comprende la SEC ID Nº: 1 o las bases 530 a 1157 de la SEC ID Nº: 1 o que consiste en las bases 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1.
2. 2. Un método para expresar una secuencia de nucleótidos en una planta de manera preferida en el pericarpio que 5 comprende:

   (i) transformar una célula de la planta con un casete de expresión; y

   (ii) cultivar la célula de la planta para proporcionar una planta que tenga un casete de expresión de manera que la secuencia de nucleótidos se exprese preferencialmente en el pericarpio de la planta;

   comprendiendo dicho casete de expresión una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador 10 que puede dirigir la transcripción de manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de:

   (i) la SEC ID Nº: 1 o las bases 530 a 1157 ó 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1;

   (ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1 que conserva la capacidad de dirigir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos; y

   (iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1 que dirige la expresión de productos 15 endógenos o exógenos en el pericarpio.
3. 3. Una célula de planta que comprende una secuencia heteróloga que es un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador que puede conducir la transcripción de manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de:

   (i) la SEC ID Nº: 1 o las bases 530 a 1157 o 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1; 20

   (ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1 que conserva la capacidad de dirigir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos; y

   (iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1 que dirige la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio.
4. 4. Una planta que contiene una secuencia heteróloga que es un casete de expresión que comprende una 25 secuencia de nucleótidos unida operativamente a un elemento regulador que puede dirigir la transcripción de manera preferida en el pericarpio y que comprende una secuencia seleccionada de:

   (i) la SEC ID Nº: 1 o las bases 530 a 1157 o 707 a 1157 de la SEC ID Nº: 1;

   (ii) un fragmento funcional de la SEC ID Nº: 1 que conserva la capacidad de dirigir la expresión en el pericarpio o en los tejidos pericárpicos; y 30

   (iii) una secuencia que tiene una identidad del 90% con la SEC ID Nº: 1 que dirige la expresión de productos endógenos o exógenos en el pericarpio.